Implication de MEK1 et MEK2 dans l'initiation et la progression du cancer colorectal

Une dérégulation de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 est observée dans plus de 30% des cancers et des mutations activatrices de RAS sont observées dans 30% à 50% des adénomes colorectaux. À la suite d’une analyse extensive de biopsies de tumeurs colorectales humaines par micromatrices tissulaires (TMA), nous avons observé que 44% des tissus cancéreux exprimaient MEK1/2 phosphorylés, contre 10% des tissus normaux. L'analyse des TMA a également révélé que 79% des tumeurs arboraient un marquage nucléaire de MEK1/2 phosphorylés, contre 4 % pour les tissus normaux. Bien que la voie MEK/ERK1/2 soit fréquemment activée dans les cancers, le rôle précis des isoformes de MEK1 et de MEK2 n'a jamais été clairement établie. De même, l'impact de cette localisation nucléaire aberrante de phospho-MEK1/2, dans l'initiation et la progression des cancers colorectaux, est inconnu. Lors d'un premier projet, nous avons démontré, que l’expression de MEK1 ou MEK2 activé est suffisante pour transformer in vitro des cellules intestinales épithéliales de rat (IEC-6). L'expression des mutants actifs de MEK1 ou MEK2 est suffisante pour induire une dérégulation de la prolifération cellulaire et engendrer la formation d'adénocarcinomes invasifs dans un modèle de greffe orthotopique du côlon chez la souris. Nous avons également démontré que l'inhibition de MEK2 par shRNA supprime complètement la prolifération des lignées humaines de cancer du côlon, alors que la suppression de MEK1 a peu d'effet sur la capacité de prolifération. Le deuxième projet, nous a permis d'observer que l'expression d'un mutant nucléaire de MEK1 dans les cellules IEC-6 transforme drastiquement les cellules. Une augmentation de prolifération, une résistance à l'anoikose, un dérèglement du cycle cellulaire, de l'instabilité chromosomique (CIN), de la tétra/aneuploïdie sont observés. La caractérisation des mécanismes responsables de cette localisation aberrante de MEK1/2 phosphorylés, a permis d'identifier la protéine Sef, un régulateur de la localisation cytoplasmique de MEK/ERK1/2. Nous avons démontré que l'expression d'une forme oncogénique de Ras (H-RasV12) inhibe l'expression de Sef, engendrant alors une accumulation nucléaire de MEK1/2 activés. Plus encore, la réexpression de Sef restaure la localisation cytoplasmique de MEK1/2 et renverse les propriétés tumorigéniques ainsi que l'aneuploïdie induite par Ras activé. Un troisième projet, visant la caractérisation des mécanismes associés à la CIN et à l'aneuploïde engendrés par l'activation aberrante de la voie de Ras-ERK1/2, a permis d'observer que l'hyperactivation de ERK1/2 induit des anomalies mitotiques menant à la binucléation. Une localisation erronée et une surexpression de la kinase Aurora A, de même que des protéines de passage du complexe chromosomique (CPC), Aurora B, Survivine et INCENP, sont observées. L'inhibition partielle de l'activation de ERK1/2 par de faible dose de PD184352, un inhibiteur de MEK1/2, est suffisante pour renverser la surexpression de ces régulateurs mitotiques, de même que corriger les anomalies de la mitose et réduire la tétra/aneuploïdie engendrée par Ras oncogénique. Ainsi, nous avons démontré, pour la première fois, que la voie des MAP kinases ERK1/2 est impliquée dans la CIN, la tétraploïdie et l'aneuploïdie. Nos résultats suggèrent que la perte de Sef est un événement oncogénique précoce, qui contribue à la localisation nucléaire aberrante de MEK1/2 qui est observée dans les tumeurs colorectales. Cette localisation anormale de MEK1/2 est associée à l'initiation de la transformation, la progression tumorale et la CIN, via l'activité soutenue de ERK1/2. Ces informations sont capitales et démontrent l’importance de la voie de signalisation Ras/Raf/MEK/ERK1/2 dans le processus de tumorigénèse colorectale.

Régulation des processus de réparation de l’épithélium bronchique sain et Fibrose Kystique par le TNF-alpha

La Fibrose Kystique, causée par des mutations du canal CFTR, mène à la dysfonction du transport des fluides et des ions causant la déshydratation du liquide de surface des voies aériennes et ainsi une défaillance de la clairance mucocilliaire. Ce défaut entraine l’accumulation et l’épaississement du mucus au niveau des bronches qui devient alors un environnement idéal pour le développement d’infections chroniques et d’inflammation qui sont associées à la destruction progressive de l’épithélium chez les patients Fibrose Kystique. Même si leur rôle dans les processus lésionnels est très bien connu, l’impact de médiateurs inflammatoires sur la capacité de réparation ne l’est cependant pas. L’objectif de ma maitrise était donc d’étudier la régulation des mécanismes de réparation de l’épithélium bronchique sain et Fibrose Kystique par le facteur de nécrose tumoral (TNF)-alpha, une cytokine pro-inflammatoire cruciale dans l’initiation et la propagation de la réponse inflammatoire chez les patients FK. À l’aide d’un modèle de plaies mécaniques, nous avons montré que le TNF-alpha stimule la réparation de l’épithélium bronchique sain (NuLi-1) et Fibrose Kystique (CuFi-1). De façon surprenante, l’exposition chronique au TNF-alpha augmente cette stimulation tout comme le taux de migration cellulaire pendant la réparation. Cette augmentation de réparation semble être médiée par l’activation de la métalloprotéinase MMP-9, la relâche d’EGF par les cellules épithéliales et ainsi l’activation de la voie d’EGFR. De plus, l’activation de la réparation par le TNF-alpha semble aussi impliquer l’activation des canaux K+, dont nous avons démontré le rôle important dans la réparation. Contrairement à son effet sur la migration cellulaire et sur la réparation, le TNF-alpha diminue la prolifération cellulaire. En somme, en plus de son rôle dans les processus lésionnels, le TNF-alpha semble avoir un rôle complexe dans les processus de réparation puisqu’il stimule la migration et ralentit la prolifération cellulaire.

Rôle différentiel des cellules épithéliales intestinales et pulmonaires dans le recrutement des cellules Th17 vers les sites de réplication du virus de l'immunodéficience humaine de type 1

L’infection à VIH-1 est associée à une forte déplétion des lymphocytes T CD4+ à polarisation Th17 au niveau des tissus lymphoïdes associés aux muqueuses intestinales (GALT, gut-associated lymphoid tissues). Ceci conduit à la translocation microbienne, qui est une cause d’activation immunitaire chronique et de progression de la maladie. Les cellules épithéliales (CE) jouent un rôle critique dans le maintien de l’intégrité et de l’homéostasie au niveau des muqueuses intestinales via le recrutement des cellules de l’immunité innée (e.g., neutrophiles) et adaptative (e.g., cellules Th17). Les neutrophiles produisent des molécules antivirales (e.g., défensines-) et ont la capacité de limiter la réplication virale au niveau des muqueuses. Les cellules Th17 jouent un double rôle lors de l’infection à VIH. Elles contribuent d’une part à la défense contre différents pathogènes opportunistes en augmentant, via la production d’IL-17, la capacité des CE à attirer les cellules Th17 et les neutrophiles. D’autre part, les cellules Th17 jouent un rôle délétère en tant que cibles de réplication virale et sources de cytokines pro-inflammatoires. La fréquence des cellules Th17 est diminuée dans les GALT mais pas dans les poumons des patients infectés par le VIH, suggérant qu’il existe des mécanismes différents par lesquels les cellules Th17 sont recrutées vers ces sites anatomiques. Nous avons testé l’hypothèse selon laquelle le VIH interfère avec la capacité des CE intestinales et non pas pulmonaires à produire des chimiokines (CK) responsables de l’attraction des cellules Th17 et des neutrophiles. Nous avons démontré que les CE intestinales et pulmonaires produisent des CK spécifiques pour les cellules Th17 (CCL20) et les neutrophiles (CXCL8) en réponse à des stimuli pro-inflammatoires tels que l’IL-1 et le TNF-. Le TNF- agit en synergie avec l’IL-17, un « signal de danger » récemment identifié, et augmente la capacité des CE intestinales mais pas pulmonaires à produire la chimiokine CCL20. Cette synergie s’explique par l’augmentation préférentielle de l’expression du récepteur à l’IL-17 à la surface des CE intestinales suite à la stimulation par le TNF-. L’exposition au VIH n’affecte pas la production de CCL20 et de CXCL8 par les CE intestinales, mais altère la capacité des CE alvéolaires à produire ces chimiokines en accord avec la permissivité sélective de ces dernières à l’infection par le VIH. En conclusion, nos résultats démontrent que (i) le VIH n’interfère pas directement avec la capacité des CE intestinales à recruter des cellules Th17 et des neutrophils et que (ii) la production de CCL20 par ces cellules est dépendantes de la synergie entre le TNF- et l’IL-17. Ainsi, la déplétion des cellules Th17 et la pénurie en IL-17 dans les GALT des sujets infectés pourrait causer de façon préférentielle des altérations fonctionnelles au niveau des CE intestinales, se traduisant par l’altération du recrutement des cellules Th17 en réponse au CCL20.

Étude fonctionnelle du cotransporteur Na+/glucose (hSGLT1) : courant de fuite, vitesse de cotransport et modélisation cinétique

Les résultats présentés dans cette thèse précisent certains aspects de la fonction du cotransporteur Na+/glucose (SGLT1), une protéine transmembranaire qui utilise le gradient électrochimique favorable des ions Na+ afin d’accumuler le glucose à l’intérieur des cellules épithéliales de l’intestin grêle et du rein. Nous avons tout d’abord utilisé l’électrophysiologie à deux microélectrodes sur des ovocytes de xénope afin d’identifier les ions qui constituaient le courant de fuite de SGLT1, un courant mesuré en absence de glucose qui est découplé de la stoechiométrie stricte de 2 Na+/1 glucose caractérisant le cotransport. Nos résultats ont démontré que des cations comme le Li+, le K+ et le Cs+, qui n’interagissent que faiblement avec les sites de liaison de SGLT1 et ne permettent pas les conformations engendrées par la liaison du Na+, pouvaient néanmoins générer un courant de fuite d’amplitude comparable à celui mesuré en présence de Na+. Ceci suggère que le courant de fuite traverse SGLT1 en utilisant une voie de perméation différente de celle définie par les changements de conformation propres au cotransport Na+/glucose, possiblement similaire à celle empruntée par la perméabilité à l’eau passive. Dans un deuxième temps, nous avons cherché à estimer la vitesse des cycles de cotransport de SGLT1 à l’aide de la technique de la trappe ionique, selon laquelle le large bout d’une électrode sélective (~100 μm) est pressé contre la membrane plasmique d’un ovocyte et circonscrit ainsi un petit volume de solution extracellulaire que l’on nomme la trappe. Les variations de concentration ionique se produisant dans la trappe en conséquence de l’activité de SGLT1 nous ont permis de déduire que le cotransport Na+/glucose s’effectuait à un rythme d’environ 13 s-1 lorsque le potentiel membranaire était fixé à -155 mV. Suite à cela, nous nous sommes intéressés au développement d’un modèle cinétique de SGLT1. En se servant de l’algorithme du recuit simulé, nous avons construit un schéma cinétique à 7 états reproduisant de façon précise les courants du cotransporteur en fonction du Na+ et du glucose extracellulaire. Notre modèle prédit qu’en présence d’une concentration saturante de glucose, la réorientation dans la membrane de SGLT1 suivant le relâchement intracellulaire de ses substrats est l’étape qui limite la vitesse de cotransport.

Étude de la biogenèse de l'autotransporteur AIDA-I d'Escherichia coli

Les autotransporteurs monomériques, appartenant au système de sécrétion de type V, correspondent à une famille importante de facteurs de virulence bactériens. Plusieurs fonctions, souvent essentielles pour le développement d’une infection ou pour le maintien et la survie des bactéries dans l’organisme hôte, ont été décrites pour cette famille de protéines. Malgré l’importance de ces protéines, notre connaissance de leur biogenèse et de leur mécanisme d’action demeure relativement limitée. L’autotransporteur AIDA-I, retrouvé chez diverses souches d’Escherichia coli, est un autotransporter multifonctionnel typique impliqué dans l’adhésion et l’invasion cellulaire ainsi que dans la formation de biofilm et d’agrégats bactériens. Les domaines extracellulaires d’autotransporteurs monomériques sont responsables de la fonctionnalité et possèdent pratiquement tous une structure caractéristique d’hélice β. Nous avons mené une étude de mutagenèse aléatoire avec AIDA-I afin de comprendre la base de la multifonctionnalité de cette protéine. Par cette approche, nous avons démontré que les domaines passagers de certains autotransporteurs possèdent une organisation modulaire, ce qui signifie qu’ils sont construits sous la forme de modules fonctionnels. Les domaines passagers d’autotransporteurs peuvent être clivés et relâchés dans le milieu extracellulaire. Toutefois, malgré la diversité des mécanismes de clivage existants, plusieurs protéines, telles qu’AIDA-I, sont clivées par un mécanisme qui demeure inconnu. En effectuant une renaturation in vitro d’AIDA-I, couplée avec une approche de mutagenèse dirigée, nous avons démontré que cette protéine se clive par un mécanisme autocatalytique qui implique deux acides aminés possédant un groupement carboxyle. Ces résultats ont permis la description d’un nouveau mécanisme de clivage pour la famille des autotransporteurs monomériques. Une des particularités d’AIDA-I est sa glycosylation par une heptosyltransférase spécifique nommée Aah. La glycosylation est un concept plutôt récent chez les bactéries et pour l’instant, très peu de protéines ont été décrites comme glycosylées chez E. coli. Nous avons démontré que Aah est le prototype pour une nouvelle famille de glycosyltransférases bactériennes retrouvées chez diverses espèces de protéobactéries. La glycosylation d’AIDA-I est une modification cytoplasmique et post-traductionnelle. De plus, Aah ne reconnaît pas une séquence primaire, mais plutôt un motif structural. Ces observations sont uniques chez les bactéries et permettent d’élargir nos connaissances sur la glycosylation chez les procaryotes. La glycosylation par Aah est essentielle pour la conformation d’AIDA-I et par conséquent pour sa capacité de permettre l’adhésion. Puisque plusieurs homologues d’Aah sont retrouvés à proximité d’autotransporteurs monomériques putatifs, cette famille de glycosyltranférases pourrait être importante, sinon essentielle, pour la biogenèse et/ou la fonction de nombreux autotransporteurs. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse apportent de nouvelles informations et permettent une meilleure compréhension de la biogenèse d’une des plus importantes familles de protéines sécrétées chez les bactéries Gram négatif.

Implications des canaux K+ sur la régulation génique du canal ENaC, et impact de l'hyperglycémie sur le transport ionique et la réparation de l'épithélium respiratoire

Dans mon projet de doctorat, j’ai étudié des fonctions primordiales de l’épithélium respiratoire telles que la régulation du transport ionique, la clairance liquidienne et la réparation épithéliale. J’ai particulièrement mis l’emphase sur le rôle des canaux potassiques qui interviennent dans ces trois fonctions de l’épithélium respiratoire. J’ai tout d’abord prouvé que la modulation des canaux potassiques régulait l’activité du promoteur de αENaC, en partie via la voie de signalisation ERK1/2, dans des cellules alvéolaires. Cette régulation entraîne une variation de l’expression génique et protéique du canal ENaC. Physiologiquement, il en résulte une augmentation du phénomène de clairance liquidienne suite à l’activation des canaux K+, tandis que l’inhibition de ces canaux la diminue sévèrement. J’ai aussi pu démontrer que l’absence de canal KvLQT1 entraînait une diminution du courant (ENaC) sensible à l’amiloride, dans les cellules de trachée en culture primaire, isolées de souris KO pour kcnq1. Dans la seconde partie de mon étude, j’ai évalué l’impact de l’hyperglycémie sur la capacité de transport ionique et de réparation de cellules épithéliales bronchiques saines ou Fibrose Kystique. Mes résultats montrent que l’hyperglycémie diminue le transport transépithélial de chlore et le transport basolatéral de potassium. Des études préalables du laboratoire ayant montré que les canaux K+ et Cl- contrôlent les processus de réparation, j’ai donc évalué si ceux-ci étaient modifiés par l’hyperglycémie. Et en effet, l’hyperglycémie ralentit la vitesse de réparation des cellules issues des voies aériennes (CFBE-wt et CFBE-ΔF508). J’ai donc démontré que le transport de potassium intervenait dans des fonctions clés de l’épithélium respiratoire, comme dans la régulation génique de canaux ioniques, le contrôle de la clairance liquidienne alvéolaire, et que l’hyperglycémie diminuait le transport ionique (K+ et Cl-) et la réparation épithéliale.

Syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) : étude de mécanismes impliqués dans la phase exsudative

Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) se développe suite à une atteinte pulmonaire lésionnelle, induisant un œdème et une inflammation excessive, généralement suivis d’une réparation atypique menant à la fibrose. Malgré de signifiants progrès dans les traitements, la mortalité reste élevée : ~ 40 %. Mon hypothèse de travail est que l’atténuation de l’œdème ou de la réponse inflammatoire pourrait freiner le développement ou la sévérité de la phase exsudative. Nous avons évalué cette hypothèse à l’aide d’un modèle de phase exsudative du SDRA, i.e. instillation intra-trachéale de bléomycine, chez les souris.  La modulation des fluides alvéolaires est étudiée avec des souris transgénique (Tg) pour le canal ENaC, qui sont sensibles à la formation d’un œdème. Cependant, ces souris Tg ne sont pas plus sensibles au développement de la phase exsudative en condition lésionnelle (bléomycine). Nous avons déterminé par une étude électrophysiologique des cellules épithéliales alvéolaires de type II (AT II) que ce n’est pas lié à une inhibition par la bléomycine de la fonction du canal ENaC.  Le traitement de la réponse inflammatoire associée au SDRA par des glucocorticoïdes est une thérapie potentielle mais controversée. Les glucocorticoïdes dans notre modèle murin ne réduisent pas la sévérité des lésions. Nous avons pu déterminé lors d’expériences in vitro que ce serait dû à une réduction de la capacité de réparation des AT II. En résumé :  La modulation du canal ENaC ne modifie pas le développement de la phase exsudative, suggérant que la régulation de l’œdème n’est pas suffisante pour modifier l’évolution du SDRA.  La modulation de l’inflammation par les glucocorticoïdes est ineffective, possiblement à cause d’une altération de la réparation. Mon étude suggère que le traitement de la phase exsudative du SDRA est complexe. En effet, la régulation de l’œdème ou de l’inflammation de façon isolée ne peut pas modifier l’évolution du SDRA. L'hétérogénéité des sources du SDRA et la redondance des mécanismes cellulaires impliqués dans l’évolution des lésions pulmonaires suggèrent que le traitement nécessitera une approche visant plusieurs cibles mécanistiques afin d’en accélérer la résolution.

Stress oxydatif, fonction mitochondriale et maladie inflammatoire de l'intestin

CONTEXTE: Bien que la dysfunction mitochondriale et le stress oxydant jouent des rôles prépondérants dans plusieurs conditions pathologiques, ils n’ont pas été étudiés de façon extensive au niveau du tube digestif qui est constamment exposé aux oxydants (provenant de l’alimentation) et à divers agents pathogènes. L’ingestion simultanée de sels ferreux et d’acide ascorbique peut causer le dommage des macromolécules par oxydation. Le ‘’Nuclear factor erythroid 2 related factor’’ (Nrf2) est un important facteur de transcription sensible au potentiel redox et qui protège contre le stress oxydant en induisant des gènes anti-oxydants et de detoxification par sa liaison à l’élément de réponse antioxydante (ARE). Les fonctions anti-oxydantes et anti-inflammatoires de Nrf2 ont été décrites dans une variété de types cellulaires et de tissus. Cependant son rôle est très peu connu au niveau du tube digestif. OBJECTIFS: Les objectifs sont d’évaluer comment la peroxydation lipidique médiée par le fer/ascorbate (FE/ASC) affecte les fonctions mitochondriales dans les cellules Caco-2/15, et de déterminer l’ampleur de l’implication de Nrf2. MÉTHODES: Le stress oxydant a été induit dans les cellules Caco2/15 en les traitant avec 0.2mm/2mm de FE/ASC. L’augmentation de l’expression de Nrf2 a été obtenue suite au prétraitement des cellules Caco2/15 avec 50 μM d’Olitpraz (OPZ), un puissant activateur. L’invalidation du gène de Nrf2 a été réalisée dans les cellules par transfection avec un vecteur lentiviral contenant un shRNA contre Nrf2. RÉSULTATS: Nos résultats montrent que le traitement des cellules Caco-2/15 avec du FE/ASC (0.2 mm/2 mm) augmente les niveaux du malondialdehyde (MDA), réduit la production d’ATP, entraîne une surcharge mitochondriale de calcium, active l’expression protéique du cytochrome C et de l’AIF (apoptotic inducing factor), réduit l’activité des complexes I, II, 2 III et IV de la chaîne respiratoire mitochondriale, augmente les niveaux de 8-OHdG, un marqueur des dommages à l’ADN mitochondrial, diminue la DNA glycosylase, et altère les expressions génique et protéique des facteurs de transcription mitochondriaux (mtTFA, mtTFB1, mtTFB2). De plus, nos observations montrent que l’induction et l’activation de Nrf2 dans les cellules Caco-2/15 résultent en: une augmentation des enzymes anti-oxydantes endogènes (catalase, glutathion peroxydase, et superoxyde dismutase), une réduction du facteur nucléaire NFκβ et de TNF-α, une augmentation de la production d’ ATP et de l’activité des complexes respiratoires (I, II, III, IV) et de PGC-1α, et une régulation des niveaux de la prohibitine mitochondriale, du Bcl-2 anti-apoptotique et de l’occludine. CONCLUSION: Dans l’ensemble, nos résultats montrent que l’exposition aigüe des cellules Caco-2/15 à la peroxydation par le FE/ASC entraîne des effets pathologiques sur les fonctions mitochondriales et l’intégrité de l’ADN, qui sont abolis par l’induction de Nrf2. Il en ressort que Nrf2 joue un rôle majeur dans la protection de l’épithélium intestinal contre le stress oxydant.

L’entérotoxine STb d’Escherichia coli affecte les jonctions serrées des cellules intestinales épithéliales

La toxine thermostable d’E.coli (STb) est une cause de diarrhée chez l’homme et l’animal. STb se lie au sulfatide, son récepteur, puis s’internalise. Dans le cytoplasme, par une cascade d’événements, STb déclenche l’ouverture des canaux ioniques permettant la sécrétion des ions et la perte d’eau menant à la diarrhée. Les jonctions serrées forment une barrière physique intercellulaire dans les cellules épithéliales intestinales, contrôlant ainsi le flux paracellulaire des ions et de l’eau. Les jonctions serrées sont affectées par divers pathogènes et par leurs toxines. À ce jour, l’effet de STb sur les jonctions serrées n’a pas été étudié. L’étude entreprise visait à explorer l’effet de STb sur les jonctions serrées et la barrière épithéliale des cellules intestinales. Des cellules épithéliales intestinales du colon humain (T84) ont été traitées pendant 24h soit avec la toxine STb purifiée soit avec une souche d’E.coli exprimant STb. La résistance transépithéliale (TER), le flux de marqueurs paracellulaires et la microscopie confocale ont été utilisés pour analyser les effets de STb sur les jonctions serrées. Les monocouches traitées par la souche E.coli exprimant STb et la toxine STb purifiée ont manifesté une forte réduction de TER (p<0.0001) parallèlement à une augmentation significative de la perméabilité paracellulaire à l’Albumine de Sérum Bovin marqué avec l’IsoThioCyanate Fluoroscéine, BSA-FITC (p<0.0001) comparativement aux cellules non traitées et aux cellules traitées par une souche d’E.coli commensale non-toxinogène. L’augmentation de la perméabilité paracellulaire induite par STb a été associée à une dissolution générale et une condensation des fibres de stress centrales des filaments d’actine. Le réarrangement des filaments d’actine a été accompagné par une redistribution et une fragmentation des protéines des jonctions serrées dont l’occludine, la claudine-1 et la Zonula Occludens-1. Les mêmes modifications on été observées après l’intoxication des cellules T84 avec un octapeptide synthétique retrouvé dans la séquence de STb correspondant à une séquence consensus de la toxine ZOT de Vibrio cholerae, impliquée dans la réorganisation des jonctions serrées. Cet effet n’a pas été observé lorsque les cellules ont été traitées avec un octapeptide synthétique comportant les mêmes acides aminés mais distribués de façon aléatoire ou avec la toxine mutée (D30V). Nos résultats montrent pour la première fois que STb induit le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale en modifiant la distribution des protéines des jonctions serrées. Ces résultats ouvrent une nouvelle voie pour la compréhension de la pathogenèse de diarrhée causée par la toxine STb.

L’étude de l’impact des protéines non structurales NS1 et NS2 du virus respiratoire syncitial sur la réponse immunitaire innée

Le virus respiratoire syncytial (RSV) est un virus à ARN de polarité négative. Les études démontrent que toute la population sera infectée par ce virus au moins deux fois avant l’âge de 3 ans. Le RSV peut provoquer plusieurs pathologies respiratoires telles que la bronchiolite aiguë et la pneumonie. Les infections sévères corrèlent avec le développement de l’asthme. Lors d’une infection virale, les particules du RSV sont détectées par le senseur RIG-I qui induit l’activation des facteurs de transcription NF-κB et IRF-3. Respectivement, les facteurs de transcription activeront les réponses inflammatoire et antivirale. Au coeur des pathologies induites par le RSV se trouve une réponse immunitaire mal adaptée. Plus précisément, par l’entremise de NF-κB, le RSV provoque une production exagérée de cytokines et chimiokines qui induisent une réponse inflammatoire démesurée provoquant du dommage tissulaire. Paradoxalement, le RSV est capable d’échapper à la réponse antivirale. Ces deux phénomènes sont contrôlés par l’entremise des protéines non structurales NS1 et NS2. Le mécanisme délimitant le mode d’action de NS1 et NS2 sur la réponse antivirale reste à être déterminé. Avec pour objectif d’élucider comment NS1 et NS2 inhibent la réponse antivirale, nous avons investigué le mécanisme de reconnaissance de l’hôte vis-à-vis de RSV. Nous démontrerons, pour la première fois, que le senseur cytosolique MDA5 est impliqué dans la réponse antivirale contre le RSV. Nous présenterons des résultats préliminaires qui suggèrent que le rôle de MDA5 est non redondant à RIG-I. À l’aide d’ARN interférant dirigé contre RIG-I et de transfection de MDA5, nous démontrerons que MDA5 ne contribue pas à la phosphorylation d’IRF-3, mais plutôt qu’elle régit la stabilité du facteur de transcription. Nous démontrerons aussi que, contrairement à l’hypothèse actuelle sur le fonctionnement de NS1 et NS2, l’inhibition de ces derniers ne provoque pas une augmentation de la cytokine antivirale IFN−β. Cependant, l’expression ectopique de NS1 et NS2 réduit l’activité du promoteur de l’IFN-β et de la protéine cytoplasmic antivirale ISG56 lorsqu’elle est mesurée par essai luciférase.

Les bactéries exprimant AIDA-I interagissent avec l'apolipoprotéine A-I cellulaire

AIDA-I (adhesin involved in diffuse adherence) est une importante adhésine autotransporteur exprimée par certaines souches de Escherichia. coli impliquée dans la colonisation des porcelets sevrés causant la diarrhée post-sevrage et la maladie de l’œdème. Une précédente étude de notre laboratoire a identifié l’apolipoprotéine AI (ApoAI) du sérum porcin, la protéine structurale des lipoprotéines à haute densité, comme récepteur cellulaire putatif de AIDA-I. L’interaction entre ces deux protéines doit être caractérisée. Ici, nous montrons par ELISA que AIDA-I purifiée est capable d’interagir avec l’ApoAI humaine, mais également avec les apolipoprotéines B et E2. L’ApoAI est rencontrée sous deux formes, soit libre ou associée aux lipides. Nous montrons que la forme libre n’interagit pas avec les bactéries AIDA-I+ mais s’associe spécifiquement à l’ApoAI membranaire de cellules épithéliales HEp-2. Afin d’étudier le rôle de l’ApoAI dans l’adhésion des bactéries, nous avons infecté des cellules HEp-2 en présence d’anticorps dirigés contre l’ApoAI, mais l’adhésion des bactéries AIDA I+ n’a jamais été réduite. De plus, l’induction de l’expression de l’ApoAI par fénofibrate et GW7647 chez les cellules Caco 2 polarisée et Hep G2, n’a pas permis l’augmentation de l’adhésion cellulaire des E. coli exprimant AIDA-I. Notre étude suggère davantage que l’interaction entre AIDA-I et ApoAI n’intervient pas dans les mécanismes d’adhésion cellulaire.

Role of NOX2 and DUOX2 in the antiviral airway responses

Les voies respiratoires sont exposées à une panoplie de pathogènes. Lors d’une infection virale respiratoire les cellules qui recouvrent ces voies participent activement à la défense immunitaire contre ces derniers en limitant la propagation du virus et en engendrant une réponse proinflammatoire. Un évènement clef dans ces processus est l’activation des facteurs de transcription, notamment le « Nuclear Factor » (NF)-κB et l’« Interferon Regulatory Factor -3 » (IRF-3), qui régulent l’expression des cytokines antivirales et proinflammatoires. Des données récentes démontrent que les dérivés actifs de l’oxygène (ROS), produits suite à une infection virale, ont la capacité de réguler les voies de signalisation enclenchées par NF-κB et IRF-3. Une source importante de ROS est la famille de NADPH oxydases (NOX), qui contient les membres NOX1-5 et DUOX1 et 2. L’objectif de notre étude était d’identifier la NOX qui régule les mécanismes antiviraux et proinflammatoires suite à l’infection avec le virus respiratoire syncytial (RSV), qui cause des complications respiratoires majeures, et le virus Sendai (SeV), un modèle viral non-pathogène. Nos travaux ont permis d’identifier que NOX2 est une molécule clef dans la réponse proinflammatoire suite à l’infection virale. Plus spécifiquement, NOX2 est important pour l’activation de NF-κB et la sécrétion des cytokines régulées par ce dernier. De plus, nous avons observé une forte augmentation de la présence de DUOX2 dans les cellules de voies respiratoires humaines infectées par SeV. Une étude plus approfondie nous a permis de caractériser qu’une synergie entre deux cytokines secrétées lors de l’infection, soit l’interféron (IFN)β et le TNFα est responsable de l’induction de DUOX2. Nous avons aussi découvert que DUOX2 confère une activité antivirale et est nécessaire pour maintenir les taux des cytokines antivirales tardives IFNβ et IFNλ. Lors d’une infection avec RSV, l’induction de DUOX2 n’est pas détectable. Nous avons mis en évidence que RSV interfère avec l’expression de DUOX2 ce qui pourrait suggérer sa pathogénicité. En conclusion, nos travaux démontrent pour la première fois une implication spécifique des NADPH oxydase NOX2 et DUOX suite aux infections virales respiratoires.

Étude de la régulation des activités transcriptionnelle, réplicative et de l’instabilité de la protéine régulatrice E2 des papillomavirus

Les papillomavirus sont de petits virus à ADN double brin qui infectent les cellules de l’épithélium de la peau et des muqueuses d’une variété de vertébrés causant des lésions bénignes telles des verrues. Certains de ces virus sont également associés au développement de lésions malignes, notamment le cancer du col utérin. La protéine régulatrice E2 des papillomavirus est impliquée dans diverses fonctions contribuant à l’établissement de l’infection par ces virus. Entre autre, E2 régule la transcription des gènes viraux, participe à l’initiation de la réplication de l’ADN viral en s’associant à l’hélicase virale E1 et est responsable du maintien et de la ségrégation de l’épisome viral au cours de la division cellulaire. Toutes ces activités sont attribuables à la capacité de E2 à s’associer au génome viral et à interagir avec des protéines virales et cellulaires. De plus, ces fonctions sont elles-mêmes régulées par des modifications post-traductionnelles de la protéine E2. Plusieurs études ont été réalisées afin de découvrir les mécanismes de régulation des fonctions de E2 mais le rôle exact des différents domaines de E2 dans ces contrôles reste à être défini. En premier lieu, nous nous sommes intéressés à l’interaction entre E2 et Brd4(L) qui avait été définie comme étant essentielle à la ségrégation de l’épisome. Plusieurs caractéristiques associées à la protéine Brd4(L) telles que sa capacité à lier les lysines acétylées des histones, son interaction avec le complexe Mediator et sa participation à l’activation de la transcription en formant un complexe avec pTEFb, nous ont permis d’émettre l’hypothèse que l’interaction E2-Brd4(L) est nécessaire à l’activité transcriptionnelle de E2. Nous avons démontré que la protéine Brd4(L) interagit avec le domaine de transactivation de E2 de divers types de papillomavirus. De plus, cette interaction implique les résidus de E2 essentiels à son activité transcriptionnelle. Ainsi, ces résultats proposent que l’association E2-Brd4(L) serve à la régulation de la transcription des gènes viraux. Dans un second temps, nos recherches se sont concentrées sur l’existence d’une interface de dimérisation au sein du domaine de transactivation de E2 et de son implication dans les activités transcriptionnelles et réplicatives de la protéine. Nos études ont aussi mis en évidence que l’intégrité de la structure de ce domaine contribue au bon fonctionnement de la réplication du génome viral. Cette découverte suggère que la dimérisation de E2 peut réguler l’initiation de la réplication et propose l’existence d’un niveau de régulation additionnel impliquant l’état de la structure quaternaire de la protéine E2 et une modulation de l’interaction entre E1 et E2 à cette étape du cycle viral. Finalement, l’étude de l’instabilité de la protéine E2 nous a permis de définir une région importante dans le domaine flexible de la protéine, nécessaire à sa dégradation par le protéasome. De plus, la présence de résidus conservés localisés dans ce domaine, sont associés à la dégradation et portent la signature d’un signal de localisation nucléaire de type PY-NLS, suggérant que la stabilité de la protéine E2 est régulée par sa localisation au sein de la cellule. Ces études démontrent l’existence de nouvelles stratégies de régulation des activités transcriptionnelle et réplicative de la protéine E2 des papillomavirus. La compréhension de ces mécanismes nous permet de mieux cerner les étapes favorisant l’établissement et la progression du cycle viral et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques contre les infections aux papillomavirus.

Caractérisation du système d’acquisition de fer codé par le locus iro chez Salmonella enterica sérovar Typhi

Le fer est un élément essentiel pour les bactéries. Puisqu’elles ne peuvent le synthétiser elles-mêmes, elles utilisent un ou plusieurs systèmes d’acquisition de fer afin de se le procurer dans l’environnement, ou chez l’hôte pour leurs propres métabolismes. Différentes stratégies coexistent chez les bactéries pathogènes dues à la faible concentration de cet élément, autant chez l’hôte que dans l’environnement. Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est une entérobactérie Gram négative causant une maladie systémique, soit la fièvre typhoïde, qui est spécifique à l’homme. Les mécanismes de pathogènese de ce sérovar sont peu connus jusqu’à ce jour, puisque son tropisme pour l’humain empêche l’utilisation d’un modèle animal adéquat. L’objectif de cette recherche est de caractériser le système d’acquisition de fer chez S. Typhi encodé par le locus iro. Les gènes du locus, iroBCDEN ont fait l’objet de plusieurs recherches chez différents pathogènes, notamment E. coli et Salmonella Typhimurium. Bien qu’un rôle dans la virulence ait été établi pour ce locus chez ces bactéries, très peu d’informations sont disponibles quant au rôle chez S. Typhi, qui emprunte plutôt la voie systémique d’infection. Nous avons évalué le rôle de la synthèse, de l’exportation et de l’importation du sidérophore salmochéline, codé par les gènes iroBCDEN. En inactivant le locus puis par la suite les gènes de façon indépendante par échange allélique, il a été possible d’observer leurs implications in vitro lors d’infections de cellules humaines. Le rôle dans l’adhésion et l’invasion des cellules épithéliales ainsi que le rôle dans la phagocytose et la survie dans les macrophages ont donc été déterminés. De plus, le mécanisme de sécrétion par lequel la salmochéline peut traverser la membrane externe est inconnu à ce jour. La pompe à efflux TolC est responsable de la sécrétion de plusieurs molécules, y compris l’entérobactine, un sidérophore analogue à la salmochéline. Par mutagénèse, nous avons effectué un mutant de délétion tolC afin de vérifier son implication dans l’interaction avec les cellules épithéliales et les macrophages. Afin de caractériser in vitro les mutants, nous avons effectué des courbes de croissance dans différents milieux. La sensibilité au peroxyde d’hydrogène a été vérifiée par la suite, puis dû aux résultats d’infections, la mobilité de la souche ΔtolC a été évaluée. Ces différents tests nous ont permis de mieux comprendre l’implication du locus iro, de ses composantes et de la pompe à efflux TolC lors de l’interaction avec les cellules cibles d’une infection systémique causée par Salmonella Typhi.

Étude sur les fonctions in vivo des GEFs DOCK chez les mammifères

Dock1 (aussi nommé Dock180) est le membre prototypique de la famille Dock d’activateurs des petites GTPases de la famille Rho. Dock1 agit au sein d’une voie de signalisation conservée au cours de l’évolution et des études génétiques ont démontré que les orthologues de Dock1, myoblast city (mbc) chez la drosophile et Ced-5 chez le nématode, activent Rac dans divers processus biologiques. Notamment, mbc est un important régulateur de la fusion des myoblastes lors de la formation des fibres musculaires de drosophile. Mbc est aussi essentiel à la migration collective d’un groupe de cellules, appelées cellules de bordures, lors de leur migration dans la chambre de l’oeuf suite à l’activation de récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK). La migration collective des cellules de bordures récapitule certains des événements observés lorsque des cellules tumorales envahissent le tissu environnant lors de la formation de métastases. Chez les mammifères, des études réalisées en lignées cellulaires suggèrent que Dock1 est aussi un régulateur du cytosquelette lors de la migration cellulaire. De plus, certaines études ont démontré que la voie Dock1/Rac agit en aval de RTKs lors de l’invasion de cellules de glioblastome. Néanmoins, les fonctions in vivo de Dock1 chez les mammifères demeurent méconnues et le but de cette thèse est d’identifier et de caractériser certaines de ses fonctions. Guidés par la fonction de mbc, nous démontrons dans l’objectif no 1 un rôle essentiel pour ce gène au cours du développement embryonnaire grâce à la caractérisation d’une souris Dock1 knock-out. Des défauts sévères de fusion des myoblastes sont observés en absence de l’expression de Dock1 et ils contribuent à la réduction de la masse musculaire des souris mutantes. De plus, nous avons constaté une contribution du gène Dock5, un membre de la famille Dock proche de Dock1, au développement des fibres musculaires. Dans l’objectif no 2, nous avons observé que des hauts niveaux d’expression de DOCK1 corrèlent avec un mauvais pronostic chez les patientes atteintes de cancer du sein possédant une forte expression du gène codant pour le RTK HER2. Une surexpression ou une amplification du locus codant pour le récepteur HER2 est associée à près de 20% des cas de cancer du sein. Les cancers de ces patientes développent fréquemment des métastases et sont associés à un mauvais pronostic. Des études biochimiques ont révélé que DOCK1 interagit avec le récepteur HER2 dans des cellules de cancer du sein. De plus, DOCK1 est essentiel à l’activation de RAC et à la migration cellulaire induite par HER2 dans ces cellules. L’utilisation d’un modèle de cancer du sein médié par HER2 chez la souris combiné avec l’inactivation du gène Dock1 dans les glandes mammaires, nous a permis d’identifier Dock1 et Rac comme de nouveaux effecteurs de la croissance tumorale et de la formation de métastases régulées par l’oncogène HER2. Nous concluons que l’utilisation de différents modèles de souris knock-out pour le gène Dock1 nous a permis d’identifier des fonctions clés de ce gène. Tout comme son orthologue mbc, Dock1 joue un rôle important lors du développement embryonnaire en régulant notamment la fusion des myoblastes. Nos études ont également contribué à démontrer un important degré de conservation des mécanismes moléculaires de fusion entre les espèces. De plus, DOCK1 agit en aval du RTK HER2 et son expression dans les cellules épithéliales de glandes mammaires contribue au développement tumoral et à la formation de métastases induits par cet oncogène.