Molecular pathogenesis of spondylocheirodysplastic Ehlers-Danlos syndrome caused by mutant ZIP13 proteins.

The zinc transporter protein ZIP13 plays critical roles in bone, tooth, and connective tissue development, and its dysfunction is responsible for the spondylocheirodysplastic form of Ehlers-Danlos syndrome (SCD-EDS, OMIM 612350). Here, we report the molecular pathogenic mechanism of SCD-EDS caused by two different mutant ZIP13 proteins found in human patients: ZIP13(G64D), in which Gly at amino acid position 64 is replaced by Asp, and ZIP13(ΔFLA), which contains a deletion of Phe-Leu-Ala. We demonstrated that both the ZIP13(G64D) and ZIP13(ΔFLA) protein levels are decreased by degradation via the valosin-containing protein (VCP)-linked ubiquitin proteasome pathway. The inhibition of degradation pathways rescued the protein expression levels, resulting in improved intracellular Zn homeostasis. Our findings uncover the pathogenic mechanisms elicited by mutant ZIP13 proteins. Further elucidation of these degradation processes may lead to novel therapeutic targets for SCD-EDS.

Frequencies of candidate genes and associations with carcass and meat traits in Nellore and crossbred cattle

Abstract: The objective of this work was to estimate allelic frequencies of the polymorphisms IGF2/MboII (G > T) of the insulin-like growth factor 2 (IGF2) gene, DQ499531.1:g.134A > T of the pro-melanin-concentrating hormone (PMCH) gene, and DQ667048.1:g.3290G > T of the RARrelated orphan receptor C (RORC) gene in beef cattle of different genetic groups, and to evaluate the associations between these polymorphisms and traits related to carcass composition and meat quality. Data on carcass and meat quality of 499 animals was used: of 313 Nellore (Bos indicus) and of 186 Nellore crossed with different taurine (Bos taurus) breeds. For the IGF2/MboII polymorphism, the frequencies found for the G allele were 0.231 and 0.631 for Nellore and crossed breeds, respectively. For the DQ499531.1:g.134A > T polymorphism, the allelic frequencies of A were 0.850 for Nellore and 0.905 for crossed breeds. For the DQ667048.1:g.3290G > T polymorphism, the allelic frequencies of G were 0.797 and 0.460 for Nellore and crossed breeds, respectively. The evaluated single nucleotide polymorphisms (SNPs) are not significantly associated with carcass and meat traits (rib eye area, back fat thickness, shear force, total lipids, and myofibrillar fragmentation index), suggesting little utility of the analyzed polymorphisms of the IGF2, PMHC, and RORC genes as selection markers in the studied cattle populations.

Glutamate reduces glucose utilization while concomitantly enhancing AQP9 and MCT2 expression in cultured rat hippocampal neurons.

The excitatory neurotransmitter glutamate has been reported to have a major impact on brain energy metabolism. Using primary cultures of rat hippocampal neurons, we observed that glutamate reduces glucose utilization in this cell type, suggesting alteration in mitochondrial oxidative metabolism. The aquaglyceroporin AQP9 and the monocarboxylate transporter MCT2, two transporters for oxidative energy substrates, appear to be present in mitochondria of these neurons. Moreover, they not only co-localize but they interact with each other as they were found to co-immunoprecipitate from hippocampal neuron homogenates. Exposure of cultured hippocampal neurons to glutamate 100 μM for 1 h led to enhanced expression of both AQP9 and MCT2 at the protein level without any significant change at the mRNA level. In parallel, a similar increase in the protein expression of LDHA was evidenced without an effect on the mRNA level. These data suggest that glutamate exerts an influence on neuronal energy metabolism likely through a regulation of the expression of some key mitochondrial proteins.

Hepatic glucose sensing is required to preserve β cell glucose competence.

Liver glucose metabolism plays a central role in glucose homeostasis and may also regulate feeding and energy expenditure. Here we assessed the impact of glucose transporter 2 (Glut2) gene inactivation in adult mouse liver (LG2KO mice). Loss of Glut2 suppressed hepatic glucose uptake but not glucose output. In the fasted state, expression of carbohydrate-responsive element-binding protein (ChREBP) and its glycolytic and lipogenic target genes was abnormally elevated. Feeding, energy expenditure, and insulin sensitivity were identical in LG2KO and control mice. Glucose tolerance was initially normal after Glut2 inactivation, but LG2KO mice exhibited progressive impairment of glucose-stimulated insulin secretion even though β cell mass and insulin content remained normal. Liver transcript profiling revealed a coordinated downregulation of cholesterol biosynthesis genes in LG2KO mice that was associated with reduced hepatic cholesterol in fasted mice and reduced bile acids (BAs) in feces, with a similar trend in plasma. We showed that chronic BAs or farnesoid X receptor (FXR) agonist treatment of primary islets increases glucose-stimulated insulin secretion, an effect not seen in islets from Fxr-/- mice. Collectively, our data show that glucose sensing by the liver controls β cell glucose competence and suggest BAs as a potential mechanistic link.

Pseudoachondroplasia and multiple epiphyseal dysplasia: a 7-year comprehensive analysis of the known disease genes identify novel and recurrent mutations and provides an accurate assessment of their relative contribution.

Pseudoachondroplasia (PSACH) and multiple epiphyseal dysplasia (MED) are relatively common skeletal dysplasias resulting in short-limbed dwarfism, joint pain, and stiffness. PSACH and the largest proportion of autosomal dominant MED (AD-MED) results from mutations in cartilage oligomeric matrix protein (COMP); however, AD-MED is genetically heterogenous and can also result from mutations in matrilin-3 (MATN3) and type IX collagen (COL9A1, COL9A2, and COL9A3). In contrast, autosomal recessive MED (rMED) appears to result exclusively from mutations in sulphate transporter solute carrier family 26 (SLC26A2). The diagnosis of PSACH and MED can be difficult for the nonexpert due to various complications and similarities with other related diseases and often mutation analysis is requested to either confirm or exclude the diagnosis. Since 2003, the European Skeletal Dysplasia Network (ESDN) has used an on-line review system to efficiently diagnose cases referred to the network prior to mutation analysis. In this study, we present the molecular findings in 130 patients referred to ESDN, which includes the identification of novel and recurrent mutations in over 100 patients. Furthermore, this study provides the first indication of the relative contribution of each gene and confirms that they account for the majority of PSACH and MED.

Imatinib plasma concentrations variability in hemato-oncologic patients

Abstract Imatinib (Glivec~ has transformed the treatment and prognosis of chronic myeloid leukaemia (CML) and of gastrointestinal stromal tumor (GIST). However, the treatment must be taken indefinitely and is not devoid of inconvenience and toxicity. Moreover, resistance or escape from disease control occurs. Considering the large interindividual differences in the function of the enzymatic and transport systems involved in imatinib disposition, exposure to this drug can be expected to vary widely among patients. Among those known systems is a cytochrome P450 (CYI'3A4) that metabolizes imatinib, the multidrug transporter P-glycoprotein (P-gp; product of the MDR1 gene) that expels imatinib out of cells, and al-acid glycoprotein (AGP), a circulating protein binding imatinib in the plasma. The aim of this observational study was to explore the influence of these covariates on imatinib pharmacokinetics (PK), to assess the interindividual variability of the PK parameters of the drug, and to evaluate whether imatinib use would benefit from a therapeutic drug monitoring (TDM) program. A total of 321 plasma concentrations were measured in 59 patients receiving imatinib, using a validated chromatographic method developed for this study (HPLC-LTV). The results were analyzed by non-linear mixed effect modeling (NONMEM). A one-compartment pharmacokinetic model with first-order absorption appropriately described the data, and a large interindividual variability was observed. The MDK> polymorphism 3435C>T and the CYP3A4 activity appeared to modulate the disposition of imatinib, albeit not significantly. A hyperbolic relationship between plasma AGP levels and oral clearance, as well as volume of distribution, was observed. A mechanistic approach was built up, postulating that only the unbound imatinib concentration was able to undergo first-order elimination. This approach allowed determining an average free clearance (CL,~ of 13101/h and a volume of distribution (Vd) of 301 1. By comparison, the total clearance determined was 141/h (i.e. 233 ml/min). Free clearance was affected by body weight and pathology diagnosis. The estimated variability of imatinib disposition (17% for CLu and 66% for Vd) decreased globally about one half with the model incorporating the AGP impact. Moreover, some associations were observed between PK parameters of the free imatinib concentration and its efficacy and toxicity. Finally, the functional influence of P-gp activity has been demonstrated in vitro in cell cultures. These elements are arguments to further investigate the possible usefulness of a TDM program for imatinib. It may help in individualizing the dosing regimen before overt disease progression or development of treatment toxicity, thus improving both the long-term therapeutic effectiveness and tolerability of this drug. Résumé L'imatinib (Glivec ®) a révolutionné le traitement et le pronostic de la leucémie myéloïde chronique (LMC) et des tumeurs stromales d'origine digestive (GIST). Il s'agit toutefois d'un traitement non dénué d'inconvénients et de toxicité, et qui doit être pris indéfiniment. Par ailleurs, une résistance, ou des échappements au traitement, sont également rencontrés. Le devenir de ce médicament dans l'organisme dépend de systèmes enzymatiques et de transport connus pour présenter de grandes différences interindividuelles, et l'on peut s'attendre à ce que l'exposition à ce médicament varie largement d'un patient à l'autre. Parmi ces systèmes, on note un cytochrome P450 (le CYP3A4) métabolisant l'imatinib, la P-glycoprotéine (P-gp ;codée par le gène MDR1), un transporteur d'efflux expulsant le médicament hors des cellules, et l'atglycoprotéine acide (AAG), une protéine circulante sur laquelle se fixe l'imatinib dans le plasma. L'objectif de la présente étude clinique a été de déterminer l'influence de ces covariats sur la pharmacocinétique (PK) de l'imatinib, d'établir la variabilité interindividuelle des paramètres PK du médicament, et d'évaluer dans quelle mesure l'imatinib pouvait bénéficier d'un programme de suivi thérapeutique (TDM). En utilisant une méthode chromatographique développée et validée à cet effet (HPLC-UV), un total de 321 concentrations plasmatiques a été dosé chez 59 patients recevant de l'imatinib. Les résultats ont été analysés par modélisation non linéaire à effets mixtes (NONMEM). Un modèle pharmacocinétique à un compartiment avec absorption de premier ordre a permis de décrire les données, et une grande variabilité interindividuelle a été observée. Le polymorphisme du gène MDK1 3435C>T et l'activité du CYP3A4 ont montré une influence, toutefois non significative, sur le devenir de l'imatinib. Une relation hyperbolique entre les taux plasmatiques d'AAG et la clairance, comme le volume de distribution, a été observée. Une approche mécanistique a donc été élaborée, postulant que seule la concentration libre subissait une élimination du premier ordre. Cette approche a permis de déterminer une clairance libre moyenne (CLlibre) de 13101/h et un volume de distribution (Vd) de 301 l. Par comparaison, la clairance totale était de 141/h (c.à.d. 233 ml/min). La CLlibre est affectée par le poids corporel et le type de pathologie. La variabilité interindividuelle estimée pour le devenir de l'imatinib (17% sur CLlibre et 66% sur Vd) diminuait globalement de moitié avec le modèle incorporant l'impact de l'AAG. De plus, une certaine association entre les paramètres PK de la concentration d'imatinib libre et l'efficacité et la toxicité a été observée. Finalement, l'influence fonctionnelle de l'activité de la P-gp a été démontrée in nitro dans des cultures cellulaires. Ces divers éléments constituent des arguments pour étudier davantage l'utilité potentielle d'un programme de TDM appliqué à l'imatinib. Un tel suivi pourrait aider à l'individualisation des régimes posologiques avant la progression manifeste de la maladie ou l'apparition de toxicité, améliorant tant l'efficacité que la tolérabilité de ce médicament. Résumé large public L'imatinib (un médicament commercialisé sous le nom de Glivec ®) a révolutionné le traitement et le pronostic de deux types de cancers, l'un d'origine sanguine (leucémie) et l'autre d'origine digestive. Il s'agit toutefois d'un traitement non dénué d'inconvénients et de toxicité, et qui doit être pris indéfiniment. De plus, des résistances ou des échappements au traitement sont également rencontrés. Le devenir de ce médicament dans le corps humain (dont l'étude relève de la discipline appelée pharmacocinétique) dépend de systèmes connus pour présenter de grandes différences entre les individus, et l'on peut s'attendre à ce que l'exposition à ce médicament varie largement d'un patient à l'autre. Parmi ces systèmes, l'un est responsable de la dégradation du médicament dans le foie (métabolisme), l'autre de l'expulsion du médicament hors des cellules cibles, alors que le dernier consiste en une protéine (dénommée AAG) qui transporte l'imatinib dans le sang. L'objectif de notre étude a été de déterminer l'influence de ces différents systèmes sur le comportement pharmacocinétique de l'imatinib chez les patients, et d'étudier dans quelle mesure le devenir de ce médicament dans l'organisme variait d'un patient à l'autre. Enfin, cette étude avait pour but d'évaluer à quel point la surveillance des concentrations d'imatinib présentes dans le sang pourrait améliorer le traitement des patients cancéreux. Une telle surveillance permet en fait de connaître l'exposition effective de l'organisme au médicament (concept abrégé par le terme anglais TDM, pour Therapeutic Drag Monitoring. Ce projet de recherche a d'abord nécessité la mise au point d'une méthode d'analyse pour la mesure des quantités (ou concentrations) d'imatinib présentes dans le sang. Cela nous a permis d'effectuer régulièrement des mesures chez 59 patients. Il nous a ainsi été possible de décrire le devenir du médicament dans le corps à l'aide de modèles mathématiques. Nous avons notamment pu déterminer chez ces patients la vitesse à laquelle l'imatinib est éliminé du sang et l'étendue de sa distribution dans l'organisme. Nous avons également observé chez les patients que les concentrations sanguines d'imatinib étaient très variables d'un individu à l'autre pour une même dose de médicament ingérée. Nous avons pu aussi mettre en évidence que les concentrations de la protéine AAG, sur laquelle l'imatinib se lie dans le sang, avait une grande influence sur la vitesse à laquelle le médicament est éliminé de l'organisme. Ensuite, en tenant compte des concentrations sanguines d'imatinib et de cette protéine, nous avons également pu calculer les quantités de médicament non liées à cette protéine (= libres), qui sont seules susceptibles d'avoir une activité anticancéreuse. Enfin, il a été possible d'établir qu'il existait une certaine relation entre ces concentrations, l'effet thérapeutique et la toxicité du traitement. Tous ces éléments constituent des arguments pour approfondir encore l'étude de l'utilité d'un programme de TDM appliqué à l'imatinib. Comme chaque patient est différent, un tel suivi pourrait aider à l'ajustement des doses du médicament avant la progression manifeste de la maladie ou l'apparition de toxicité, améliorant ainsi tant son efficacité que son innocuité.

Métabolisme d'antidépresseurs dans différentes espèces : aspects méthodologiques et pharmacogénétiques, perspectives cliniques

Résumé pour large public Unité de Biochimie et Psychopharmacologie Clinique, Centre de neurosciences Psychiatrique, Département de Psychiatrie Adulte, Faculté de Biologie et de Médecine, Université de Lausanne Lors de la prise d'un médicament, celui-ci va passer par différentes étapes que sont l'absorption, la distribution, le métabolisme et enfin l'élimination. Ces quatre étapes sont regroupées sous le nom de pharmacocinétique. A noter que ces quatre paramètres sont dynamiques et en constante évolution. Durant cette thèse, nous avons investigué différents aspects de la pharmacocinétique, tout d'abord par une revue de la littérature sur la glycoprotéine-P (Pgp). Récemment découverte, cette protéine de membrane est située aux endroits stratégiques de l'organisme comme la barrière hématoencéphalée, le placenta ou les intestins où elle influencera l'entrée de différentes substances, en particulier les médicaments. La Pgp serait impliquée dans les phénomènes de résistances aux agents thérapeutiques en oncologie. La Pgp influence donc l'absorption des médicaments, et son impact en clinique, en termes d'efficacité de traitement et de toxicité prend chaque jour plus d'importance. Ensuite nous avons mis au point une méthode d'analyse quantitative d'un antidépresseur d'une nouvelle génération : la mirtazapine (Remeron®). La nouveauté réside dans la façon dont la mirtazapine interagit avec les neurotransmetteurs impliqués dans la dépression que sont la sérotonine et la noradrénaline. Cette méthode utilise la chromatographie liquide pour séparer la mirtazapine de ses principaux métabolites dans le sang. La spectrométrie de masse est utilisée pour les détecter et les quantifier. Les métabolites sont des substances issues de réactions chimiques entre la substance mère, la mirtazapine, et généralement des enzymes hépatiques, dans le but de rendre cette substance plus soluble en vue de son élimination. Cette méthode permet de quantifier la mirtazapine et ses métabolites dans le sang de patients traités et de déterminer la variation des taux plasmatiques chez ces patients. Puis nous avons étudié le métabolisme d'un autre antidépresseur, le citalopram, qui a un métabolisme complexe. Le citalopram est un racémate, c'est-à-dire qu'il existe sous forme de deux entités chimiques (R-(-) et S-(+) citalopram) qui ont le même nombre d'éléments mais arrangés différemment dans l'espace. La voie métabolique cérébrale du citalopram est sous le contrôle d'une enzyme, la monoamine oxydase (MAO), conduisant à une forme acide du citalopram (l'acide propionique du citalopram). La MAO existe sous deux formes : MAO-A et MAO-B. Nous avons utilisé des souris déficientes d'un gène, celui de la MAO-A, pour mieux en comprendre le métabolisme en les comparants à des souris sauvages (sans déficience de ce gène). Nous avons utilisé le citalopram et deux de ses métabolites (le déméthylcitaloprarn et le didéméthyícitalopram) comme substrats pour tester la formation in vitro de l'acide propionique du citalopram. Nos résultats montrent que la MAO-A favorise la formation de l'entité R-(-) et présente une plus grande affinité pour le citalopram, tandis que la MAO-B métabolise préférentiellement l'entité S-(+) et a une plus grande affinité pour les deux métabolites déméthylés. De plus, la déficience en MAO-A est partiellement compensée parla MAO-B chez les souris déficientes du gène de la MAO-A. Enfin, nous avons étudié une deuxième voie métabolique du citalopram qui s'est avérée toxique chez le chien Beagle. Celle-ci est catalysée par une autre famille d'enzymes, les cytochromes P-450, et mène aux métabolites déméthylés et didéméthylés du citalopram. Nous avons utilisé des tissus hépatiques de chiens Beagle. Plusieurs cytochromes P-450 sont impliqués dans le métabolisme du citalopram menant à sa forme déméthylée, ceci tant chez l'homme que chez le chien. Par contre, dans le métabolisme de la forme déméthylée menant à 1a forme didéméthylée, un seul cytochrome P-450 serait impliqué chez l'Homme, tandis qu'ils seraient plusieurs chez le chien. L'activité enzymatique produisant la forme didéméthylée est beaucoup plus importante chez le chien comparé à l'homme. Cette observation soutien l'hypothèse que des taux élevés de la forme didéméthylée participent à la toxicité spécifique du citalopram chez le chien. Nous pouvons conclure que plusieurs famille d'enzymes sont impliquées tant au niveau cérébral qu'hépatique dans la métabolisation de médicaments psychotropes. Sachant que les enzymes peuvent être stimulées ou inhibées, il importe de pouvoir suivre au plus prés les taux plasmatiques des différents psychotropes et de leurs métabolites. Résumé Unité de Biochimie et Psychopharmacologie Clinique, Centre de neurosciences Psychiatrique, Département de Psychiatrie Adulte, Faculté de Biologie et de Médecine, Université de Lausanne La plupart des médicaments subissent une transformation enzymatique dans l'organisme. Les substances issues de cette métabolisation ne sont pas toujours dotées d'une activité pharmacologique. Il s'est avéré par conséquent indispensable de suivre les taux plasmatiques d'une substance et de ses métabolites et d'établir ou non l'existence d'une relation avec l'effet clinique observé. Ce concept nommé « therapeutic drag monitoring » (TDM) est particulièrement utile en psychiatrie ou un manque de compliance des patients est fréquemment observé. Les médicaments psychotropes ont un métabolisme principalement hépatique (cytochromes P-450) et parfois cérébral (monoamines oxydases), comme pour le citalopram par exemple. Une méthode stéréosélective de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse a été développée pour analyser les énantiomères R-(-) et S-(+) d'un antidépresseur agissant sur les récepteurs noradrénergiques et sérotoninergiques, la mirtazapine et de ses métabolites déméthylmirtazapine et 8-hydroxymirtazapine. Les données préliminaires obtenues dans les plasmas dosés suggèrent que les concentrations de R-(-)-mirtazapine sont plus élevées que celles de S-(+)-mirtazapine, à l'exception des patients qui auraient comme co-médication des inhibiteurs du CYP2D6, telle que la fluoxétine ou la thioridazine. Il y a une enantiosélectivité du métabolisme de la mirtazapine. En particulier pour la 8-hydroxymirtazapine qui est glucuroconjuguée et pour laquelle le ratio S/R varie considérablement. Cette méthode analytique présente l'avantage d'être utilisable pour le dosage stéréosélectif de la mirtazapine et de ses métabolites dans le plasma de patients ayant d'autres substances en co-médication. La glycoprotéine P fonctionne comme une pompe transmembranaire transportant les xénobiotiques depuis le milieu intracellulaire vers le milieu extracellulaire. Son induction et son inhibition, bien que moins étudiées que pour les cytochromes P-450, ont des implications cliniques importantes en termes d'efficacité de traitement et de toxicité. Cette glycoprotéine P a fait l'objet d'une recherche bibliographique. Nous avons étudié le métabolisme du citalopram, un antidépresseur de la classe des inhibiteurs spécifiques de la recapture de la sérotonine chez la souris et chez le chien. Cette substance subit un métabolisme complexe. La voie de métabolisation conduisant à la formation de l'acide propionique du citalopram, catalysée par les monoamines oxydases, a été étudiée in vitro dans les mitochondries cérébrales chez la souris déficiente du gène de la MAO-A (Tg8). La monoamine oxydase A catalyse la formation de l'énantiomère R-(-) et présente une plus grande affinité pour les amines tertiaires, tandis que la monoamine oxydase B favorise la formation de la forme S-(+) et a une affinité plus marquée pour les amines secondaires et primaires. L'étude du citalopram chez la souris Tg8 adulte a montré que la monoamine oxydase B compense la déficience de la monoamine oxydase A chez ces souris génétiquement modifiées. Une autre voie de métabolisation du citalopram conduisant à la formation de didéméthylcitalopram, catalysée par les cytochromes P-450, a été étudiée in vitro dans des microsomes hépatiques de chiens Beagle. Nos études ont montré que les cinétiques de N-déméthylation du citalopram sont biphasiques chez le chien. Les orthologues canins impliqués dans la première N-déméthylation semblent être identiques aux cytochromes P-450 humains. Par contre, dans la deuxième Ndéméthylation, un seul cytochrome P-450 semble être impliqué chez l'homme (CYP2D6), tandis qu'on retrouve jusqu'à cinq orthologues chez le chien. Le CYP2D15, orthologue canin du CYP2D6, est majoritairement impliqué. De plus, l'activité enzymatique, reflétée par les clairances intrinsèques, dans la première N-déméthylation est jusqu'à 45 fois plus élevée chez le chien comparé à l'homme. Ces différentes observations soutiennent l'hypothèse que des taux élevés de didéméthylcitalopram sont responsables de la toxicité du citalopram chez le chien. Nous pouvons conclure que plusieurs famille d'enzymes sont impliquées tant au niveau cérébral qu'hépatique dans la métabolisation de médicaments psychotropes. Sachant -que les enzymes peuvent être induits ou inhibés, il importe de pouvoir suivre au plus près les taux plasmatiques des différents psychotropes et de leurs métabolites. Summary Most of the drugs are metabolized in the organism. Substances issued from this metabolic activity do not always show a pharmacological activity. Therefore, it is necessary to monitor plasmatic levels of drugs and their metabolites, and establish the relationship with the clinical effect. This concept named therapeutic drug monitoring is very useful in psychiatry where lack of compliance is commonly observed. Antidepressants are mainly metabolized in the liver (cytochrome P-450) and sometimes in the brain (monoamine oxidase) like the citalopram, for exemple. A LC-MS method was developed, which allows the simultaneous analysis of R-(-) and S-(+) enantiomers of mirtazapine, an antidepressant acting specifically on noradrenergic and serotonergic receptors, and its metabolites demethylmirtazapine and 8-hydroxymirtazapine in plasma of mirtazapine treated patients. Preliminary data obtained suggested that R-(-) mirtazapine concentrations were higher than those of S-(+) mirtazapine, except in patients comedicated with CYP2D6 inhibitors such as fluoxetine or thioridazine. There is an enantioselectivity in the metabolism of mirtazapine. In particular for the 8-hydroxymirtazapine, which is glucuroconjugated and S/R ratio varies considerably. Therefore this method seems to be suitable for the stereoselective assay of mirtazapine and its metabolites in plasma of patients comedicated with mirtazapine and other drugs for routine and research purposes. P-glycoprotein is working as an efflux transporter of xenobiotics from intracellular to extracellular environment. Its induction or inhibition, although less studied than cytochrome P-450, has huge clinical implications in terms of treatment efficacy and toxicity. An extensive literature search on P-glycoprotein was performed as part of this thesis. The study of citalopram metabolism, an antidepressant belonging to the class of selective serotonin reuptake inhibitors. This substance undergoes a complex metabolism. First metabolization route leading to citalopram propionic acid, catalyzed by monoamine oxidase was studied in vitro in mice brain mitochondria. Monoamine oxidase A catalyzed the formation of R-(-) enantiomer and showed greater affinity for tertiary amines, whereas monoamine oxidase B triggered the formation of S-(+) enantiomer and demonstrated higher affinity for primary and secondary amines. citalopram evaluation in adult Tg8 mice showed that monoamine oxidase B compensated monoamine oxidase A deficiency in those genetically transformed mice. The second metabolization route of citalopram leading to didemethylcitalopram and catalyzed by cytochrome P-450 was studied in vitro in Beagle dog's livers. Our results showed that citalopram N-demethylation kinetics are biphasic in dogs. Canine orthologs involved in the first N-demethylation seemed to be identical to human cytochromes P-450. However, in the second N-demethylation only one cytochrome P-450 seemed to be involved in human (CYP2D6), whereas up to five canine orthologs were found in dogs. CYP2D15 canine ortholog of CYP2D6 was mainly involved. In addition, enzymatic activity reflected by intrinsic clearance in the first N-demethylation was up to 45 fold higher in dogs compared to humans. Those observations support the assumption that elevated rates of didemethylcitalopram are responsible for citalopram toxicity in dogs. We can conclude that several enzymes groups are involved in the brain, as well as in the liver, in antidepressant metabolization. Knowing that enzymes may be induced or inhibited, it makes sense to closely monitor plasmatic levels of antidepressants and their metabolites.

From pathogen defence to food allergy; The multiple facets of the mucosal immune system

Résumé destiné à un large public Le système immunitaire associé aux muqueuses gastro-intestinales doit être capable de protéger notre organisme contre l'invasion de pathogènes. Parallèlement, il doit identifier en Cant que tels, des composés inoffensifs comme la nourriture ou les milliards de bactéries qui résident dans notre intestin. Le travail présenté ici aborde ces deux aspects essentiels au bon fonctionnement de notre muqueuse intestinale. Dans une première partie, la protéine nommée pièce sécrétoire a été étudiée pour ses propriétés protectrices contre le pathogène viral rotavirus. Le rôle de la pièce sécrétoire est de transporter les anticorps que nous produisons vers la surface des muqueuses. En dehors de cette fonction bien connue, il se peut que cette protéine soit également capable de protéger notre organisme contre certains virus. L'hypothèse de travail était donc que la pièce sécrétoire se lie directement au virus, l'empêchant ainsi d'infecter des cellules épithéliales de l'intestin. En utilisant différentes techniques biochimiques, cette hypothèse s'est révélée fausse car aucune interaction entre la pièce sécrétoire et le virus n'a pu être observée, et logiquement, aucune protection n'a pu prendre place. En revanche, la pièce sécrétoire se lie à d'autres structures pathogéniques et permet ainsi de neutraliser leurs effets néfastes. La pièce sécrétoire participe donc activement à la protection de nos muqueuses, en plus de son rôle de transporteur. La deuxième partie de ce travail avait pour sujet les réactions inappropriées que le système immunitaire induit parfois contre un aliment, ou, autrement dit, les allergies alimentaires. Un modèle d'allergie alimentaire à donc été développé chez la souris et a permis de mesurer plusieurs symptômes et facteurs liés à l'allergie. Puis, ce modèle a été utilisé afin de tester les effets bénéfiques d'une bactérie lactique, dite probiotique, sur le développement de l'allergie. Il a été observé que, sous certaines circonstances, l'administration de la bactérie lactique protégeait entièrement les souris contre les réactions allergiques. L'effet bénéfique dépend donc du probiotique mais également d'autres facteurs encore inconnus â ce jour. Cette étude ouvre la voie sur la compréhension des mécanismes liés aux allergies alimentaires et sur l'impact que peuvent avoir les bactéries probiotiques sur cette maladie. Résumé Le système immunitaire associé aux muqueuses intestinales doit être capable de différencier les antigènes inoffensifs tels que 1a nourriture ou les bactéries commensales des microorganismes potentiellement dangereux. Cet aspect est essentiel pour le maintien de l'homéostase intestinale et fait l'objet du travail présenté ici. Dans un premier projet, les propriétés protectrices de la protéine appelée pièce sécrétoire (SC) ont été étudiées. SC est une protéine connue pour le transport des immunoglobulines à la surface des muqueuses. Cette protéine est fortement glycosylée paz des sucres complexes, ce qui nous a mené à postuler que SC puisse interagir avec le pathogène rotavirus. Cette hypothèse était soutenue par le fait que ce virus adhère aux cellules épithéliales par des résidus glycosylés. Des analyses biochimiques et biologiques ont démontré qu'aucune interaction entre SC et le virus ne prenait place, et que par conséquent SC n'offrait aucune protection contre ce pathogène. En revanche, SC interagit avec d'autres structures pathogéniques, comme la toxine A de Clostridium difficile, et la molécule d'adhésion intimine de la bactérie entéropathogène Escherichia coli. La liaison se fait par l'intermédiaire des sucres et confère ainsi une protection contre ces pathogènes. Ainsi, SC a été identifié comme agent neutralisant au niveau de l'intestin. La deuxième partie de ce travail abordait le sujet des allergies alimentaires, et avait pour but de tester les effets bénéfiques potentiels d'une bactérie probiotique, Lactobacillus paracasei NCC2461, contre les réactions allergiques. Un modèle marin d'allergie alimentaire a été mis au point, permettant de mesurer des immunoglobulines E, des symptômes allergiques, et la dégranulation de mastocytes. Lorsque le probiotique a été administré aux souris, celles-ci ont été complètement protégées des réactions allergiques dans une première expérience. Cependant, cette protection n'a pas été reproduite et suggère que des facteurs environnementaux encore inconnus sont critiques pour que le probiotique agisse positivement. Ce travail a permis de mettre en évidence la complexité de l'approche des traitements liés aux probiotiques et ouvre la voie sur la compréhension des mécanismes liés à l'allergie. Abstract The mucosal immune system associated to the gastrointestinal mucosa must efficiently distinguish between innocuous antigens, such as food proteins and commensal bacteria and potentially infectious agents. The work presented here deals with these two essential aspects guaranteeing intestinal homeostasis. In the first part of this work, the protective properties of secretory component (SC) toward the pathogen rotavirus were investigated. SC, which allows the transport of polymeric immunoglobulins (Ig) to mucosal surfaces, is highly glycosylated with complex glycan structures. The abundance and the nature of these carbohydrates led us to speculate that SC might interact with rotavirus, which is known to bind target cells with glycan receptors. Using various biological and biochemical techniques, we demonstrated that SC did not interact with rotaviruses, nor protected epithelial cells from infection. However, SC was shown to bind to Clostridium difficile toxin A and to the enteropathogenic Echerischia coli adhesion molecule intimin in a glycan-dependent fashion. These interactions allow in vitro protection of epithelial cells using physiological concentrations of SC. These data identify SC as a microbial scavenger at mucosal surfaces, and in the context of secretory IgA, further enhance the neutralising properties of the complex. The second project was inscribed in the domain of food allergy and aimed to test the modulatory functions of a probiotic strain of Lactobacillus paracasei toward allergic reactions. A model of food-mediated allergy was developed in the mouse using mucosal sensitisation. Several parameters associated to allergy were quantified after allergen challenge, and included allergen-specific IgE, allergic signs like diarrhea and temperature drop, and degranulation of mast cells. Administration of the probiotic strain was shown to completely protect mice from allergic reactions. However, these data were not reproduced, suggesting that unknown environmental factors are required so that protection mediated by the probiotic strain occurs. This study paves the way to the understanding of the mechanisms associated to allergy, and highlights the tremendous complexity that probiotic treatments will have to face.

Le trouble somatoforme douloureux et le syndrome de fatigue chronique, des nouvelles expressions de la médicalisation de la souffrance

Résumé Le trouble somatoforme douloureux persistant et le syndrome de fatigue chronique constituent des entités cliniques qui incarnent la position particulière du corps dans notre société actuelle. Tous les deux se situent dans un carrefour entre le psychique et le somatique, en interaction étroite avec l'entourage socioculturel, soulignant ainsi la nécessité de considérer l'être humain dans son intégralité. La société actuelle, pauvre en repères collectifs, où l'exaltation de l'individualité est un critère primordial et où le corps social réparateur n'existe pas, provoque une grand mal être. Le sentiment de ne pas être reconnu dans son intériorité est incorporé et après s'exprime ensuite sous la forme d'une plainte douloureuse. Le contexte de l'émigration et celui des systèmes de prévoyance sociale dans les pays occidentaux, sont des exemples de conditions qui favorisent le changement dans la dynamique de la maladie. En s'appuyant sur la représentation du corps dans un moment historique précis, l'homme cherche à exprimer une souffrance profonde dans le vécu de soi-même, qui n'a pas accès à d'autres voies d'expression. Le contexte social, culturel, médical, professionnel, lui facilite les moyens d'obtenir la reconnaissance de son affliction sans être exclu du groupe d'appartenance sociale. Les deux symptômes, douleur et fatigue, rassemblent les conditions nécessaires, dans la conception actuelle du corps, sociale et médicale, pour transporter le désir et la demande d'une partie de la société qui ne peut pas exprimer sa souffrance.

The Pseudomonas aeruginosa antimetabolite L -2-amino-4-methoxy-trans-3-butenoic acid (AMB) is made from glutamate and two alanine residues via a thiotemplate-linked tripeptide precursor.

The Pseudomonas aeruginosa toxin L-2-amino-4-methoxy-trans-3-butenoic acid (AMB) is a non-proteinogenic amino acid which is toxic for prokaryotes and eukaryotes. Production of AMB requires a five-gene cluster encoding a putative LysE-type transporter (AmbA), two non-ribosomal peptide synthetases (AmbB and AmbE), and two iron(II)/α-ketoglutarate-dependent oxygenases (AmbC and AmbD). Bioinformatics analysis predicts one thiolation (T) domain for AmbB and two T domains (T1 and T2) for AmbE, suggesting that AMB is generated by a processing step from a precursor tripeptide assembled on a thiotemplate. Using a combination of ATP-PPi exchange assays, aminoacylation assays, and mass spectrometry-based analysis of enzyme-bound substrates and pathway intermediates, the AmbB substrate was identified to be L-alanine (L-Ala), while the T1 and T2 domains of AmbE were loaded with L-glutamate (L-Glu) and L-Ala, respectively. Loading of L-Ala at T2 of AmbE occurred only in the presence of AmbB, indicative of a trans loading mechanism. In vitro assays performed with AmbB and AmbE revealed the dipeptide L-Glu-L-Ala at T1 and the tripeptide L-Ala-L-Glu-L-Ala attached at T2. When AmbC and AmbD were included in the assay, these peptides were no longer detected. Instead, an L-Ala-AMB-L-Ala tripeptide was found at T2. These data are in agreement with a biosynthetic model in which L-Glu is converted into AMB by the action of AmbC, AmbD, and tailoring domains of AmbE. The importance of the flanking L-Ala residues in the precursor tripeptide is discussed.

No development of hypertension in the hyperuricemic liver-Glut9 knockout mouse.

Urate is the metabolic end point of purines in humans. Although supra-physiological plasma urate levels are associated with obesity, insulin resistance, dyslipidemia, and hypertension, a causative role is debated. We previously established a mouse model of hyperuricemia by liver-specific deletion of Glut9, a urate transporter that provides urate to the hepatocyte enzyme uricase. These LG9 knockout mice show mild hyperuricemia (120 μmol/l), which can be further increased by the urate precursor inosine. Here, we explored the role of progressive hyperuricemia on the cardiovascular function. Arterial blood pressure and heart rate were periodically measured by telemetry over 6 months in LG9 knockout mice supplemented with incremental amounts of inosine in a normal chow diet. This long-term inosine treatment elicited a progressive increase in uricemia up to 300 μmol/l; however, it did not modify heart rate or mean arterial blood pressure in LG9 knockout compared with control mice. Inosine treatment did not alter cardiac morphology or function measured by ultrasound echocardiography. However, it did induce mild renal dysfunction as revealed by higher plasma creatinine levels, lower glomerular filtration rate, and histological signs of chronic inflammation and fibrosis. Thus, in LG9 knockout mice, inosine-induced hyperuricemia was not associated with hypertension despite partial renal deficiency. This does not support a direct role of urate in the control of blood pressure.

Early adversity and 5-HTT-BDNF genes: new evidences of gene-environment interactions on depressive symptoms in a general population

Adverse childhood experiences have been described as one of the major environmental risk factors for depressive disorder. Likewise, the deleterious impact of early traumatic experiences on depression seems to be moderated by individual genetic variability. Serotonin transporter (5-HTT) and the Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) seem to modulate the effect of childhood adversity on adult depression, although inconsistencies across studies have been found. Moreover, the GxE interaction concerning the different types of childhood adversity remains poorly understood. The aim of this study is to analyse the putative interaction between the 5-HTT gene (5-HTTLPR polymorphism), BDNF gene (Val66Met polymorphism) and childhood adversity in accounting for adult depressive symptoms.

Dose and time-dependent selective neurotoxicity induced by mephedrone in mice.

Mephedrone is a drug of abuse marketed as 'bath salts'. There are discrepancies concerning its long-term effects. We have investigated the neurotoxicity of mephedrone in mice following different exposition schedules. Schedule 1: four doses of 50 mg/kg. Schedule 2: four doses of 25 mg/kg. Schedule 3: three daily doses of 25 mg/kg, for two consecutive days. All schedules induced, in some animals, an aggressive behavior and hyperthermia as well as a decrease in weight gain. Mephedrone (schedule 1) induced dopaminergic and serotoninergic neurotoxicity that persisted 7 days after exposition. At a lower dose (schedule 2) only a transient dopaminergic injury was found. In the weekend consumption pattern (schedule 3), mephedrone induced dopamine and serotonin transporter loss that was accompanied by a decrease in tyrosine hydroxylase and tryptophan hydroxylase 2 expression one week after exposition. Also, mephedrone induced a depressive-like behavior, as well as a reduction in striatal D2 density, suggesting higher susceptibility to addictive drugs. In cultured cortical neurons, mephedrone induced a concentration-dependent cytotoxic effect. Using repeated doses for 2 days in an elevated ambient temperature we evidenced a loss of frontal cortex dopaminergic and hippocampal serotoninergic neuronal markers that suggest injuries at nerve endings.

Eficiência de transformação genética de citrange 'carrizo' com duas construções gênicas

Transformação genética é considerada uma importante ferramenta auxiliar no melhoramento genético de plantas cítricas. Entretanto, a eficiência de transformação pode variar em função de diversos fatores, incluindo a própria construção gênica utilizada. Este trabalho buscou avaliar a eficiência de transformação genética de plantas de citrange 'Carrizo' [Poncirus trifoliata (L.) Raf. x Citrus sinensis (L.) Osbeck] com duas construções gênicas diferentes contendo o gene uidA (GUS) sob o controle dos promotores Arabidopsis thaliana phloem protein 2 (AtPhP2) e Arabidopsis thaliana sucrose transporter 2 (AtSuT2). Segmentos de epicótilo de plântulas germinadas in vitro foram utilizados como explantes. O gene nptII, que confere resistência ao antibiótico canamicina, foi utilizado nas construções gênicas como agente de seleção para regeneração de plantas transgênicas. O ensaio histoquímico com X-GLUC foi realizado em todas as brotações regeneradas para verificar a expressão do gene uidA. Dos 4.790 segmentos de epicótilo utilizados, registrou-se a regeneração de 366 brotações com reação positiva no ensaio histoquímico, as quais foram enxertadas em porta-enxertos cultivados in vitro. Cinco dessas brotações, de cada construção gênica, foram selecionadas para análise da PCR, com primers específicos para amplificação da sequência do gene uidA. A inserção do transgene foi confirmada por PCR em todas as brotações selecionadas. A eficiência de transformação e o número de brotos escapes, avaliada pelo teste histoquímico, variaram em função das construções gênicas utilizadas.

The embryonic blood-CSF barrier has molecular elements for specific glucose transport and for the general transport of molecules via transcellular routes.

In vertebrates, early brain development takes place at the expanded anterior end of the neural tube, which is filled with embryonic cerebrospinal fluid (E-CSF). We have recently identified a transient blood-CSF barrier that forms between embryonic days E3 and E4 in chick embryos and that is responsible for the transport of proteins and control of E-CSF homeostasis, including osmolarity. Here we examined the presence of glucose transporter GLUT-1 as well the presence of caveolae-structural protein Caveolin1 (CAV-1) in the embryonic blood-CSF barrier which may be involved in the transport of glucose and of proteins, water and ions respectively across the neuroectoderm. In this paper we demonstrate the presence of GLUT-1 and CAV-1 in endothelial cells of blood vessels as well as in adjacent neuroectodermal cells, located in the embryonic blood-CSF barrier. In blood vessels, these proteins were detected as early as E4 in chick embryos and E12.7 in rat embryos, i.e. the point at which the embryonic blood-CSF barrier acquires this function. In the neuroectoderm of the embryonic blood-CSF barrier, GLUT-1 was also detected at E4 and E12.7 respectively, and CAV-1 was detected shortly thereafter in both experimental models. These experiments contribute to delineating the extent to which the blood-CSF embryonic barrier controls E-CSF composition and homeostasis during early stages of brain development in avians and mammals. Our results suggest the regulation of glucose transport to the E-CSF by means of GLUT-1 and also suggest a mechanism by which proteins are transported via transcellular routes across the neuroectoderm, thus reinforcing the crucial role of E-CSF in brain development.