Caracterização do gene da proteína capsidial de dois isolados, patologicamente distintos e sorologicamente semelhantes, do Grapevine virus B em videiras no Estado de São Paulo

No presente trabalho, descreve-se a caracterização do gene codificador da proteína capsidial de dois isolados sintomatologicamente distintos do Grapevine virus B (GVB). Para isto, RNA totais foram extraídos de folhas e pecíolos de videiras (Vitis spp.) infetadas, cultivares Rubi (GVB-C SP) e Itália (GVB-I SP) e utilizados para amplificar, por RT/PCR, um fragmento entre as posições 6425 e 7118 (694 nucleotídeos, nt) do RNA do GVB ("GenBank", acesso X75448). O fragmento obtido inclui o gene da proteína capsidial (594 nt) codificando 197 aminoácidos com massa molecular estimada em aproximadamente 21.600 Da. A seqüência do GVB-C SP apresentou maior similaridade de nucleotídeos e aminoácidos deduzidos com o isolado italiano (acesso X75448), enquanto que o GVB-I SP foi mais similar a um outro isolado brasileiro do GVB descrito no Rio Grande do Sul (GVB BR1, acesso AF438410). Os dois isolados paulistas do GVB podem ser diferenciados por digestão com a enzima de restrição EcoRI, uma vez que há um sítio interno no GVB-C SP que está ausente no isolado GVB-I SP.

Surto epidemiológico do vírus do mosaico amarelo do pimentão em tomateiro na região serrana do Espírito Santo

Este trabalho relata a ocorrência de um surto epidemiológico causado pelo vírus do mosaico amarelo do pimentão (Pepper yellow mosaic virus - PepYMV) em tomateiro (Lycopersicon esculentum) 'Alambra' na região serrana do Estado do Espírito Santo. Os sintomas consistiam de mosaico, definhamento e redução de produção. Visando a caracterização do agente causal foram realizados estudos sorológicos por ELISA, observações ao microscópio eletrônico e determinação da gama parcial de hospedeiros. Ao microscópio eletrônico de transmissão foram observadas, em amostras de tomateiro, partículas alongadas e flexuosas e inclusões cilíndricas típicas de vírus do gênero Potivirus. O PepYMV foi confirmado como agente causal por ELISA indireto. Levantamentos realizados em campos de cultivo demonstraram que a disseminação do vírus é muito rápida. Este é o primeiro relato da ocorrência do PepYMV na cultura do tomate no Brasil, causando sérios danos.

Germinação e penetração de Stenocarpella macrospora em folhas de milho

O sucesso do estabelecimento de uma relação parasitária entre fungos e plantas, em muitos casos, depende de eventos que antecedem à infecção. Neste trabalho, as fases compreendidas entre a germinação e a penetração do fungo Stenocarpella macrospora foram analisadas por meio de microscópio eletrônico de varredura. Para tanto, plantas de milho (Zea mays) híbrido Das-8492, suscetível à mancha foliar de diplodia, foram cultivadas em casa de vegetação e inoculadas com 300 µl de uma suspensão de 10(5) conídios/ml ao atingirem cinco-seis folhas expandidas. As amostras foram obtidas a partir de discos foliares coletados em vários momentos após a inoculação e preparadas para análise ao microscópio eletrônico de varredura. Oitenta e seis por cento dos conídios germinaram entre 12 e 15 h após a inoculação, ao passo que a formação dos apressórios ocorreu 18 h após a inoculação. A presença de uma matriz extracelular também foi observada desde a germinação até a penetração do patógeno, sugerindo a participação da mesma nos processos relacionados à patogênese.

Reestudo de Anthomyces brasiliensis em Caesalpinia echinata no Brasil

O fungo Anthomyces brasiliensis foi descrito em 1899 no Rio de Janeiro causando ferrugem em Caesalpinia sp. ou Piptadenia sp. sendo redescoberto no ano de 2001 em Porto Seguro, Bahia, causando a ferrugem do pau-brasil (Caesalpinia echinata). Na descrição original de A. brasiliensis estão descritos apenas télios e urédios, não tendo sido observada a existência de espermogônios e écios. Folhas com pequenas lesões necróticas nos folíolos foram coletadas de mudas e plantas adultas de pau-brasil na Estação Experimental Pau-Brasil (CEPLAC) no município de Porto Seguro, Bahia. Folíolos frescos e herborizados foram examinados ao microscópio estereoscópico, sendo efetuadas raspagens e cortes histológicos, os quais foram analisados em microscópios e composto, e eletrônico de varredura para caracterização, mensuração e fotomicrografias das estruturas observadas. Nos estudos conduzidos no material coletado na Bahia foram encontrados espermogônios do grupo VI, tipo 7, característicos da família Raveneliaceae à qual pertence o gênero Anthomyces. Os espermogônios de A. brasiliensis são subcuticulares, de contorno circular, aplanados e medem 70-100 x 30-56 µm, com espermacióforos hialinos, basais, cilíndricos, agrupados em forma de paliçada, medindo 12-14 x 2-3 µm. Os espermácios são hialinos, unicelulares, lisos, medindo 3-4 x 2-3 µm. Pústulas acompanhadas por espermogônios foram interpretadas como écios uredinóides, característicos da família Raveneliaceae. Estas estruturas têm aspecto de pústulas alargadas, sem perídio definido, mostrando-se maiores que os télios e os urédios, medindo 200-700 µm diâmetro e 100-110 µm de altura, com eciósporos idênticos aos urediniósporos, medindo de 22-24 x 18-22 µm. Desta forma, A. brasiliensis passa a ser definida como uma ferrugem macrocíclica, autóica, contendo os estádios de 0 a IV.

Desenvolvimento de marcadores moleculares para análogos a genes de resistência em Arachis spp. silvestres

O maior grupo de genes de resistência de plantas já clonados codifica para proteínas com um sítio de ligação a nucleotídios (NBS) na região N-terminal, e um domínio rico em repetições de leucina (LRR) na região C-terminal. Genes desta classe conferem resistência a diversos patógenos incluindo vírus, bactérias, fungos e nematóides. Para diferentes espécies do gênero Arachis, primers de "polymerase chain reaction" (PCR) degenerados foram construídos para a região NBS, e o produto de tradução putativo indicou similaridade com proteínas de resistência conhecidas sendo denominados análogos a genes de resistência (RGAs). Doze destes RGAs foram utilizados para o desenvolvimento de marcadores moleculares baseados em seus padrões de hibridização com DNA de Arachis spp. digerido com enzimas de restrição. Inicialmente, avaliou-se o polimorfismo de cada RGA como sonda nos parentais de uma população de mapeamento, contrastantes quanto à resistência as manchas foliares e nematóides das galhas, e no híbrido F1. Os RGAs, mesmo isolados de espécies diferentes do gênero Arachis apresentaram homologia com o DNA das espécies testadas, além de apresentarem múltiplas cópias e alto polimorfismo na progênie F2. Todas estas características tornam estes RGAs marcadores moleculares altamente informativos, sendo que alguns apresentaram segregação em "clusters" na F2, indicando que seus locos estão ligados. Estes marcadores serão incluídos em um mapa genético de Arachis spp., o que será de grande utilidade para os programas de melhoramento do amendoim (Arachis hypogaea) cultivado.

Hipersensibilidade e necrose sistêmica em Nicotiana benthamiana transformada com o gene de resistência Sw-5 de tomateiro

O gene Sw-5 do tomateiro confere resistência a várias espécies de tospovírus e codifica uma proteína contendo domínios de ligação a nucleotídeos e repetições ricas em leucina. Tomateiros com Sw-5 exibem reações necróticas nas folhas inoculadas com tospovírus. Estas reações e a estrutura da proteína Sw-5 indicam que a resistência ocorre por meio do reconhecimento do patógeno e desencadeamento da resposta de hipersensibilidade. A capacidade de Sw-5 de conferir resistência a tospovírus em tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana Domin.) foi avaliada em plantas transgênicas. Uma construção com a seqüência aberta de leitura de Sw-5 e sua região 3’ não-traduzida sob controle do promotor 35S do CaMV foi utilizada para transformação de N. benthamiana via Agrobacterium tumefaciens. Plantas de progênies R1 foram inoculadas com um isolado de tospovírus e avaliadas quanto à ocorrência de reação de hipersensibilidade e resistência à infecção sistêmica. Em uma progênie com segregação 3:1 (resistente:suscetível), foi selecionada uma planta homozigota e sua progênie avaliada quanto ao espectro da resistência a tospovírus. Plantas com o transgene exibiram resposta de hipersensibilidade 48 h após a inoculação, sendo resistentes à infecção sistêmica. O fenótipo da resistência foi dependente do isolado viral e um isolado de Tomato chlorotic spot virus (TCSV) causou necrose sistêmica em todas as plantas inoculadas, enquanto que isolados de Groundnut ringspot virus (GRSV) e um isolado relacionado a Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV) ficaram restritos ao sítio de infecção. Comparações do espectro da resistência obtido neste trabalho com aquele observado em outros membros da família Solanaceae indicam que as vias de transdução de sinais e as respostas de defesa ativadas por Sw-5 são conservadas dentro desta família e polimorfismos genéticos nas vias de transdução de sinais ou em componentes das respostas de defesa podem resultar em diferentes níveis de resistência.

Síntese, caracterização e estudos de transferencia de energia do complexo dimérico constituído por Zn e Mn porfirina

Muitos compostos modelo contendo porfirinas têm sido preparados num esforço para entender o sistema de fotossíntese e os processos de aproveitamento de energia solar. Sistemas doadores-receptores contendo porfirinas têm sido freqüentemente estudados para testar várias descrições teóricas sobre transferência de elétrons. O estudo de parâmetros fotoquímicos e fotofísicos como a distância para transferência de energia, geometria molecular e a diferença de potencial eletrônico, tem se mostrado importante para a definição da transferência eletrônica em porfirinas. Neste trabalho apresentamos a síntese, purificação e caracterização por espectroscopia UV/Vis, ¹H e 19F RMN, luminescência e tempos de vida de novos modelos moleculares de porfirinas, que permitam investigar esses parâmetros. Utilizou-se o dímero Zn,Mn(TPPF4)2pip e seus monômeros ZnTPPF4pipH e MnF5TPP. A caracterização do ZnMn(TPPF4)2pip, foi dificultada devido a presença de Mn+3, devido ao forte acoplamento dos orbitais dpi do manganês e o sistema pi da porfirina, que aumenta a interação manganês-porfirina mudando o espectro eletrônico UV/Vis e distorcendo os sinais de ¹H e 19F RMN do dímero. A presença de Mn+3 desloca E1/2 do anel porfirínico para valores mais negativos, o que resulta em reduções mais difíceis, impedindo a transferência de energia da Znporfirina para a Mnporfirina.

Comportamento fotofísico do antraceno em sistemas micro-heterogêneos argila-surfactantes-íons metálicos

Argilas constituem uma classe de complexos micro-heterogêneos e podem ser utilizados como substrato para adsorção. O seu comportamento de sorção em fase sólida intensificada pela presença de surfactantes, argilas organofílicas, é um importante fenômeno explorado pela tecnologia ambiental para a remoção de compostos orgânicos policíclicos (hidrocarbonetos aromáticos policíclicos, HPA) da água, introduzidos no ambiente por fontes antropogênicas. Este trabalho tem por objetivo estudar o comportamento fotofísico do antraceno, como modelo de HPA, em sistemas micro-heterogêneos argila-surfactantes-íons metálicos (M(II)= Cd(II), Cu(II), Hg(II), Ni(II) e Pb(II); surfactantes: CTACl; SDS; TR-X100). Os estudos foram conduzidos pelo monitoramento na mudança das propriedades de fluorescência estática e na supressão da emissão do antraceno utilizado como sonda fluorescente. Como supressores foram utilizados os cátions metálicos: Cd(II), Cu(II), Hg(II), Ni(II) e Pb(II). O perfil do espectro de fluorescência e os resultados dos ensaios de supressão da fluorescência da sonda permitiram inferir na localização do sítio de solubilização do antraceno nos sistemas micro-heterogêneos estudados e na conseqüente organização dos mesmos.

Influência da temperatura no desenvolvimento de teliósporosde Phakopsora pachyrhizi em folíolos de soja

A ferrugem da soja pode ser causada pelas espécies Phakopsora meibomiae e P. pachyrhizi. A distinção dessas espécies pode ser feita de forma segura por meio das características morfológicas dos teliósporos. Este estudo teve como objetivo determinar o efeito da temperatura na formação de teliósporos em folíolos de plantas de soja e realizar um estudo morfométrico dos soros teliais e teliósporos. Para o desenvolvimento do experimento sementes dos cultivares Uirapuru e Pintado foram semeadas em vasos para 3 kg de substrato. Trinta dias após, no estádio V3, estas plantas foram inoculadas com urediniósporos de P. pachyrhizi. Os sintomas iniciais da doença foram observados 7 dias após a inoculação, quando as plantas foram transferidas para câmaras de crescimento vegetal do DFP/UFLA sob temperaturas de 10ºC, 15ºC e 20ºC. O monitoramento da presença de soros teliais teve início 15 dias após a transferência das plantas. Lesões típicas com soros teliais foram observadas com estereomicroscópio em folíolos do cultivar Uirapuru crescendo a 15ºC no 25º dia, após a transferência das plantas, e no cultivar Pintado no 30º dia. A presença de soros teliais foi confirmada com cortes finos do material fresco e observação em microscópio de luz e microscópio eletrônico de varredura (MEV). Foram observados dois tipos de soros teliais: os arredondados a elípticos com altura média de 35,25 µm e largura de 77 µm, predominante no cultivar Uirapuru e o alongado com altura média de 41,33 µm e largura de 127,33 µm predominante no cultivar Pintado. A forma e dimensões dos teliósporos também variaram entre os cultivares. No cultivar Pintado as células oblongas predominaram, enquanto que, no cultivar Uirapuru as sub-globosas. Quanto às dimensões o cultivar Pintado apresentou células com medidas de 6,87 µm de largura por 14,91 µm de comprimento e 1,9 µm de espessura da parede distal da célula apical, enquanto que, o cultivar Uirapuru apresentou células com 7,02 µm de largura por 10,02 µm de comprimento e 1,43 µm de espessura da parede distal da célula apical.

Metodologias de preparação de amostras de ferrugem para estudos morfológicos de urediniósporos por meio de microscopia eletrônica de varredura

Amostras de urediniósporos de ferrugens das espécies Melampsora epitea Thum., Melampsora medusae Thuem., Hemileia vastatrix Berk., Uromyces appendiculatum Pers., Puccinia sorghi Schwein., Tranzschelia discolor Fuckel e Phakopsora euvitis Ono, coletadas dos hospedeiros, chorão (Salix sp.), álamo (Populus deltoides Bartr. Ex. Marsh), cafeeiro (Coffea arabica L.), feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.), milho (Zea mays L.), pessegueiro (Prunus persicae L.) e videira (Vitis vinifera L.) respectivamente, foram processadas de 3 formas: a) método convencional (fixação em glutaraldeído e tetróxido de ósmio, desidratação em acetona e secagem ao ponto crítico); b) método do vapor de ósmio e metalização com ouro; c) metalização direta de amostras (utilizado para esporos soltos). A técnica de fratura de amostra congelada em nitrogênio líquido também foi testada para o estudo do interior de pústulas da ferrugem da videira (P. euvitis). As amostras foram visualizadas em microscópio eletrônico de varredura no NAP/MEPA da ESALQ/USP. Procedeu-se à mensuração dos esporos e as imagens obtidas foram capturadas pelo software LeoUserInterface e processadas utilizando-se o programa de computador "Corel Draw". Em todos os métodos analisados obteve-se uma boa preservação da estrutura possibilitando imagens de alta qualidade. No entanto, para esporos livres (mantidos em cápsula de gelatina) o método da metalização direta foi mais prático e rápido. Para observação das pústulas em tecido vegetal os dois métodos de processamento de amostras avaliados proporcionaram resultados satisfatórios. A técnica de fratura em nitrogênio líquido também permitiu perfeita visualização do interior das pústulas da ferrugem da videira.

Progresso da sigatoka-negra (Mycosphaerella fijiensis) em bananeiras após a emissão do cacho no Município de Cáceres, Mato Grosso-Brasil

A sigatoka-negra, causada pelo fungo Mycosphaerella fijiensis, pode causar 100% de perdas na produção das cultivares suscetíveis. O objetivo deste trabalho foi avaliar o progresso da sigatoka-negra em bananeiras após a emissão do cacho no Município de Cáceres, Mato Grosso. O experimento foi conduzido no período de fevereiro a dezembro de 2004 em plantios das cultivares Grande Naine, Maçã e Farta Velhaco, sendo esta última uma cultivar de plátano, do grupo Terra. As avaliações foram efetuadas a intervalos de 15 dias, quantificando-se, através de uma escala diagramática, a severidade da sigatoka-negra em todas as folhas de 5 plantas de cada cultivar, marcadas logo após a emissão das inflorescências. A partir dos dados coletados no campo, computaram-se: a severidade da doença na folha n.º 10 e o número de folhas viáveis. Considerou-se como folha viável as folhas sadias e aquelas com até 15% de área foliar lesionada. Os dados de temperatura e da umidade relativa foram registrados por um aparelho eletrônico instalado na área. A precipitação pluvial foi registrada na Estação meteorológica de Cáceres, distante 12 km do experimento. As condições climáticas foram favoráveis à sigatoka negra durante o ano todo e as plantas das cultivares Grande Naine, Maçã e Farta Velhaco após a emissão do cacho, perderam totalmente as folhas antes dos frutos atingirem o pleno desenvolvimento, cujos prejuízos no primeiro semestre atingiram 100% de perdas na produção comercializável.

Candidatus Phytoplasma brasiliense associado ao superbrotamento do hibisco (Hibiscus rosa-sinensis L.) no Estado de São Paulo

Plantas de hibisco com superbrotamento e definhamento seguido de morte têm sido observadas nos municípios de São Paulo, Campinas e Piracicaba. Como os sintomas são sugestivos daqueles induzidos por fitoplasmas, o presente trabalho buscou identificar o possível fitoplasma associado com a doença. Assim, 14 plantas sintomáticas de hibisco foram coletadas em Piracicaba (SP) e submetidas ao PCR duplo com os primers P1/Tint-R16F2n/R2 e ao exame em microscópio eletrônico de transmissão. A identificação foi realizada por análise de RFLP com as enzimas de restrição BfaI, DraI, HaeIII, HhaI, HpaII, MboI, MseI, RsaI e TaqI. Testes de transmissão foram conduzidos com enxertia de ramos e uso de Cuscuta subinclusa. Os resultados de nested-PCR revelaram a presença consistente de fitoplasmas em todas as plantas sintomáticas e foram confirmados pela observação de corpúsculos pleomórficos no floema, através da microscopia eletrônica. A análise de RFLP mostrou que o fitoplasma encontrado em hibisco pertence ao grupo 16SrXV, o mesmo grupo do Candidatus Phytoplasma brasiliense. O fitoplasma foi transmitido de planta doente para sadia, tanto pela enxertia como pela C. subinclusa, demonstrando ser o agente do superbrotamento do hibisco.

Eventos do processo de infecção de Colletotrichum gloeosporioides inoculados em folhas de Coffea arabica L

O presente trabalho teve por objetivo obter informações sobre os eventos de pré-penetração, penetração e colonização de isolados de C. gloeosporioides, obtidos de mangueira e cafeeiro, quando inoculados em folhas de cafeeiros (Coffea arabica L.) da cultivar Catucaí Vermelho. As folhas foram selecionadas, padronizadas e lavadas, demarcando-se áreas circulares de 0,5 cm de diâmetro na face abaxial, inoculando-se uma alíquota de 20 µL da suspensão de conídios. Utilizou-se um isolado obtido de mangueira e dois isolados obtidos de cafeeiro com mancha manteigosa. Realizaram-se avaliações com 3, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 144 e 240 horas após a inoculação (hai). Todos os materiais foram processados e observados em microscópico eletrônico de varredura. Os conídios de todos os isolados aderiram freqüentemente nas depressões das células da epiderme e células-guarda dos estômatos, formando septo antes da germinação. A penetração, na maior parte, se deu por via direta e algumas vezes por estômatos. Isolados de cafeeiro germinaram em folhas de 6 a 8 hai, produzindo apressórios 12 hai e acérvulos de 96 a 144 hai. O isolado de mangueira germinou de 6 a 8 hai com formação de apressório de 8 a 12 hai e produziu novos conídios diretamente em hifas conidiogênicas. Não foi observada a formação acérvulos para este isolado.

Padrão de integração de pAN7-1 em mutantes de Magnaporthe grisea com patogenicidade alterada em arroz

Ensaios foram conduzidos para verificar a presença, o número de cópias e de sítios de integração de pAN7-1 no genoma de mutantes de M. grisea I-22 com patogenicidade alterada em arroz. Foram analisados T41, T93, T251 (gerados por mutagênese REMI) e T108 (oriundo de mutagênese convencional), os quais exibiram diferentes fenótipos mutantes. O DNA total desses mutantes foi submetido à reação em cadeia de polimerase (PCR) e às análises de hibridização com o vetor (Southern blot). A presença de pAN7-1 no genoma de todos os mutantes foi confirmada por PCR. Segundo as análises de Southern blot, T41 exibiu duas integrações do vetor, ambas na forma de cópia única. No genoma de T93 também foram detectados dois sítios de inserção de pAN7-1, um dos quais envolvendo múltiplas cópias do vetor. Os resultados indicaram a presença de apenas uma cópia do vetor em um único sítio nos genomas de T108 e T251. O padrão de integração em T251 foi o único a sugerir a ocorrência de evento REMI. As diferenças quanto ao tamanho dos fragmentos com homologia a pAN7-1 refletiram a possível aleatoriedade dos eventos de integração no genoma de M. grisea. Os resultados evidenciaram o potencial de REMI para a mutagênese insercional de M. grisea, quando conduzida com pAN7-1 e HindIII

Anatomia de lesões foliares causadas pelo vírus da Mancha Clorótica do Clerodendrum, transmitido pelo ácaro Brevipalpus phoenicis em diferentes espécies

O gênero botânico Clerodendrum pertence à família Lamiaceae e compreende várias espécies ornamentais, Manchas cloróticas e necróticas em folhas de coração-sangrento foram observadas pela primeira vez em um jardim de Piracicaba, SP, associadas à infestação com Brevipalpus phoenicis (Acari: Tenuipalpidae). Exames de secções de tecidos das lesões foliares ao microscópio eletrônico revelaram ocorrência de efeitos citopáticos do tipo nuclear e concluiu-se que os sintomas eram causados por um vírus transmitido por Brevipalpus (VTB), o qual foi designado de mancha clorótica de Clerodendrum (Clerodendrum Chlorotic Spot Virus- ClCSV). O ClCSV é transmitido mecanicamente de coração-sangrento para coração-sangrento. Em ensaios preliminares foi transmitido por B. phoenicis e mecanicamente para várias outras plantas, além da ocorrência de sua disseminação natural por este ácaro para outras espécies. Visando complementar a caracterização do ClCSV foram feitos estudos sobre alterações anatômicas em folhas de plantas infectadas pelo ClCSV. Foram examinadas secções histológicas de folhas sadias e infectadas pelo ClCSV de C. x speciosum e de outras hospedeiras como Hibiscus schizopetalus, Salvia leucantha, Malvaviscus arboreus e Annona muricata. Constatou-se que o ClCSV causa alterações celulares semelhantes nas diferentes hospedeiras e os sintomas causados por este vírus são similares aos causados por outros vírus transmitidos por Brevipalpus como o vírus da leprose dos citros citoplasmático (Citrus Lepros Virus Cytoplasmic- CiLV-C) e nuclear (Citrus Leprosis Virus Nuclear- CiLV-N), mancha anular do cafeeiro (Coffee Ringspot Virus- CoRSV), mancha anular de Solanum violaefolium (Solanum violaefolium Ringspot Virus- SvRSV) e "Orchid Fleck Vírus" (OFV), representadas por hipertrofia e hiperplasia frequentemente acompanhadas de necrose nos tecidos do parênquima paliçádico e lacunoso.