Molecular genetic causes of columnar growth in apple (Malus x domestica)

The columnar growth habit of apple is interesting from an economic point of view as the pillar-like trees require little space and labor. Genetic engineering could be used to speed up breeding for columnar trees with high fruit quality and disease resistance. For this purpose, this study dealt with the molecular causes of this interesting phenotype. The original bud sport mutation that led to the columnar growth habit was found to be a novel nested insertion of a Gypsy-44 LTR retrotransposon on chromosome 10 at 18.79 Mb. This subsequently causes tissue-specific differential expression of nearby downstream genes, particularly of a gene encoding a 2OG-Fe(II) oxygenase of unknown function (dmr6-like) that is strongly upregulated in developing aerial tissues of columnar trees. The tissue-specificity of the differential expression suggests involvement of cis-regulatory regions and/or tissue-specific epigenetic markers whose influence on gene expression is altered due to the retrotransposon insertion. This eventually leads to changes in genes associated with stress and defense reactions, cell wall and cell membrane metabolism as well as phytohormone biosynthesis and signaling, which act together to cause the typical phenotype characteristics of columnar trees such as short internodes and the absence of long lateral branches. In future, transformation experiments introducing Gypsy-44 into non-columnar varieties or excising Gypsy-44 from columnar varieties would provide proof for our hypotheses. However, since site-specific transformation of a nested retrotransposon is a (too) ambitious objective, silencing of the Gypsy-44 transcripts or the nearby genes would also provide helpful clues.

Enzyme tRNA interaction and (t)RNA conformation probed via environmentally sensitive cyanine dyes

Nukleosidmodifikationen beeinflussen Dynamik und Konformation von RNArnund sind epigenetisch wirksam. Wenig verstanden sind konformationelle Dynamik und enzymatische Erkennung von tRNA, sowie der Einfluss des mutmaßlichen kovalenten Inhibitors 5-Fluorouridine (5FU) auf Y Synthasen, die Pseudouridin (Y) erzeugen. Frühere Arbeiten nutzten mit den Fluorophoren Cy3 und Cy5rnmarkierte tRNA, um diese Fragen zu adressieren.rnDie vorliegende Arbeit weitet Cy3-Cy5-Markierung auf Hefe tRNArnPhernaus undrnnutzt Thermophorese und fortschrittliche Fluoreszenzspektroskopie. In der Thermophorese zeigte sich eine hohe Toleranz gegenüber Fluoreszenzmarkierung beirngleichzeitiger Erhöhung der Cy5 Fluoreszenz durch Enzymbindung. Zudem konnte die Konformation verschiedener Mutanten human mitochondrialer tRNArnLysrnund die Bindung von SAM durch SAM-I Riboswitch RNA untersucht werden.rnUm etwaige Unterschiede in der Interaktion von Y55 Synthase TruB mit Cy5-gelabelter U55- bzw. 5FU55-tRNA aufzudecken, wurde eine Kombination ausrnThermophorese, zeit- und polarisationsaufgelöster Fluoreszenzspektroskopie undrn’gel shift’ Experimenten genutzt. Alle Ergebnisse zeigten übereinstimmend einernreversible Bindung ähnlicher Affinität für beide tRNAs und widersprechen somit einer kovalenten Inhibition durch 5FU. Folgerichtig wurde der SDS-stabilernKomplex von TruB mit 5FU-tRNA neu evaluiert, da er bisher als kovalent interpretiert wurde. Es erfolgte eine schnelle Komplexbildung in hoher Ausbeute auchrnfür schlechte Substrate, außerdem ließ sich die Komplexausbeute nicht durch andere Reaktionsbedingungen beeinflussen. Somit kann der SDS stabile Komplexrnnur den ersten, nicht-kovalenten Kontakt von Enzym und 5FU55-tRNA darstellen und repräsentiert kein kovalentes Addukt späterer Katalyse.

Die Rolle der Topoisomerase 2 beta in der normalen Herzfunktion sowie in der Entstehung der Herzinsuffizienz

Die Herzinsuffizienz (HI) ist eine der häufigsten und teuersten medizinischen Indikationen in der heutigen Zeit. rnIn der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal die Topoisomerase 2b (Top2b) in Zusammenhang mit der Entstehung einer dilatativen Kardiomyopathie gebracht werden. rnIn einem speziellen Mausmodell war es möglich, die Top2b gewebsspezifisch und zeitspezifisch nur in Kardiomyozyten zu deletieren. Dies geschah mittels eines Tamoxifen-induzierten Cre-Rekombinase-Gendeletionsmodells. Phänotypisch zeigten die Top2b-deletierten Mäuse 8 Wochen nach der Tamoxifen-Gabe signifikant reduzierte kardiale Ejektionsfraktionen sowie erhöhte linksventrikuläre enddiastolische und endsystolische Volumina. Weder Schlagvolumen noch Körpergewicht waren verändert. Die natriuretischen Peptide ANP und BNP waren in den Top2b-deletierten Tieren ebenfalls signifikant erhöht. Zusätzlich zeigten sowohl elektronenmikroskopische Untersuchungen als auch klassische histologische Verfahren fibrotische Veränderungen und erhöhte Kollagenablagerungen in Top2b-deletierten Tieren. Begleitend dazu stiegen die mRNA-Expressionslevel von Col1a1, Col3a1, Tgfβ1 und Tgfβ2 in den deletierten Tieren 8 Wochen nach der Implementierung der Deletion signifikant an. rnIn einer genomweiten Hochdurchsatz-Sequenzierung waren bereits 2 Wochen nach Tamoxifen-Gabe 128 Gene mindestens 2-fach gegenüber der Kontrollgruppe differentiell exprimiert. Eine genauere Analyse der veränderten Genexpression ließ bereits 14 Tage nach Implementierung der Deletion kardiale Verschlechterungen vermuten. So waren neben dem atrialen natriuretischen Peptid ANP die beiden häufigsten Kollagenarten im Herzen, Col3a1 und Col1a1, hochreguliert. rnInteressanterweise beinhalteten die 37 herunterregulierten Gene 11 Transkriptionsfaktoren. Da der Top2b in den letzten Jahren eine immer stärker werdende Bedeutung in der Transkription zugesprochen wird, sollte mittels Chromatin-Immunpräzipitation ein direkter Zusammenhang zwischen der Top2b-Deletion und der Herunterregulierung der 11 Transkriptionsfaktoren sowie die Bindung der Top2b an Promotoren ausgewählter, differentiell-exprimierter Gene untersucht werden. Generell konnte keine vermehrte Bindung von Top2b an Promotorbereiche gezeigt werden, was aber nicht dem generellen Fehlen einer Bindung gleichkommen muss. Vielmehr gab es methodische Schwierigkeiten, weshalb die Bedeutung der Top2b in der Transkription im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht ausreichend geklärt werden konnte.rnEine Kardiomyozyten-spezifische Top2b-Deletion mündete 8 Wochen nach Tamoxifen-Gabe in eine dilatative Kardiomyopathie. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind keine klaren Aussagen zum zugrundeliegenden Mechanismus der entstehenden Herzschädigung in Folge einer Top2b-Deletion zu treffen. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass der Tumorsuppressormarker p53 eine wichtige Rolle in der Entstehung der dilatativen Kardiomyopathie spielen könnte. So konnte 8 Wochen nach der Top2b-Deletion mittels Chromatin-Immunpräzipitation eine erhöhte Bindung von p53 an Promotorregionen von Col1a1, Tgfβ2 und Mmp2 detektiert werden. Die Bedeutung dieser Bindung, und ob aufgrund dessen die Entstehung der Fibrose erklärt werden könnte, ist zum jetzigen Zeitpunkt unklar.rn

Evaluation of polymeric nanocarriers for RNA delivery

Therapeutic RNAs, especially siRNAs, are a promising approach for treating diseases like cancer, neurodegenerative disorders and viral infections. Their application, however, is limited due to a lack of safe and efficient delivery systems. Nanosized carriers with the ability to either complex or entrap RNA species are a promising option. rn rn rnSuch a carrier has to meet a lot of requirements, some of which are even partly contradictive. Understanding and controlling the interplay between the different demands would advance a strategic design at an early stage of therapeutic development. rn rn This work is centered around a systematic evaluation of polyplexes, such carriers that are able to complex siRNA due to electrostatic interactions. Six structurally and chemically diverse candidates, poly-L-lysine brushes, block copolymers, cationic peptides, cationic lipids, nanohydrogels, and manganese oxide particles, were tested in a simultaneous fashion. The assays, mostly based on fluorescently labeled siRNA, ranged from the evaluation of polyplex formation and stability to in vitro parameters like cellular uptake and knockdown capability. The analysis from several perspectives offered insight into the interplay between the specifications of one polyplex. Assessing the different carriers under exactly the same experimental conditions also allowed conclusions about favourable traits and starting points for further optimization. This comparative approach also revealed weaknesses of some of the conventional protocols, which were therefore contrasted with alternative methods. In addition, in vitro knockdown assays were optimized and the impact of fluorescently labeled siRNA on knockdown efficiency was assessed. rn rn rn A second class of carriers, which share the ability to entrap siRNA inside their matrix, are briefly addressed. Nanocapsules, dextran particles and liposomes were assessed for basic features like siRNA encapsulation and knockdown capability. rn rn rn rn In an approach towards targeted delivery of RNA, liposomes were endowed with mitochondriotropic tags. Despite successful functionalization, no colocalization between the liposomal cargo and mitochondria was so far observed, which makes further optimization necessary.

Dynamics of small interfering RNA - FRET based integrity measurements of siRNA in the cuvette & inside cells

RNAi ist ein bedeutendes Werkzeug zur Funktionsanalyse von Genen und hat großes Potential für den Einsatz in der Therapie. Obwohl effiziente Knockdowns in der Zellkultur erzielt werden, erweist sich eine in vivo Anwendung als schwierig. Die großen Hürden sind dabei der Transport der siRNA ins Zielgewebe und deren voranschreitende Degradierung.rnMarkierte siRNA kann sowohl zur eigenen Integritätsmessung als auch zur Lokalisierung verwendet werden. Zwei Farbstoffe an den jeweiligen 3’- bzw. -5’-Enden des Sense- bzw. Antisense-Stranges erzeugen ein robustes FRET-System (Hirsch et al. 2012). Das Verhältnis von FRET- zu Donor-Signal, das R/G-Ratio, dient zur sensitiven Klassifizierung des Integritätslevels einer siRNA Probe (Järve et al. 2007; Hirsch et al. 2011; Kim et al. 2010). Mit diesem System kann eine Degradierung von weniger als 5 % in der Küvette und in Zellen nachgewiesen werden.rnDie vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Evaluierung von potentiellen FRET Farbstoffpaaren hinsichtlich deren Eignung für in vitro und in vivo Anwendung. Verschiedenste FRET-Paare, die das gesamte sichtbare Spektrum abdecken, wurden evaluiert und ermöglichen nun die Auswahl eines geeigneten Paares für die jeweilige Anwendung oder Kombination mit anderen Farbstoffen.rnMit Hilfe von Alexa555/Atto647N siRNA wurde ein erfolgreicher Einschluss von siRNA in Liposomen beobachtet. Eine anschließende Evaluierung der RNase-Protektion ergab für Liposomen, Nanohydrogele und kationische Peptide hervorragende protektive Eigenschaften. Basierend auf den Ergebnisse können diese und andere Transportsysteme nun für eine zelluläre Aufnahme optimiert werden.rnAtto488/Atto590 zeigte die besten Eigenschaften für Echtzeit-Integritätsmessungen in der Lebendzellmikroskopie. Verringerte Bleicheigenschaften und minimaler spektraler “Cross-Talk” ermöglichten es, transfizierte Zellen über einen Zeitraum von bis zu 8 Stunden zu beobachten. Mittels Atto488/Atto590 siRNA wurde die Einschleusung und Freisetzung in Zellen in Echtzeit untersucht. Dabei konnten Freisetzung und Verteilung in einzelnen Zellen beobachtet und analysiert werden. rnAuf eine anfängliche Phase mit hoher Freisetzungsrate folgte eine Phase mit geringerer Rate für den restlichen Beobachtungszeitraum. Die durchschnittliche Verweildauer im Zytosol betrug 24 und 58 Minuten, wobei zwischen lang- und kurzanhaltenden Ereignissen unterschieden werden konnte. Obwohl ein Import von siRNA in den Zellkern beobachtet wurde, konnte kein Schema bzw. genauer Zeitpunkt, in Bezug auf den Transfektionszeitraum für diese Ereignisse bestimmt werden. Die beobachteten Freisetzungsprozesse fanden sporadisch statt und Änderungen in der zellulären Verteilung geschahen innerhalb von wenigen Minuten. Einmal freigesetzte siRNA verschwand mit der Zeit wieder aus dem Zytosol und es blieben nur kleine Aggregate von siRNA mit immer noch geringer Integrität zurück.rn

Optimization of RNA-based transgene expression by targeting Protein Kinase R

The aim of this thesis was to establish a method for repeated transfection of in vitro transcribed RNA (IVT-RNA) leading to a sustained protein expression lasting for days or even weeks. Once transfected cells recognize IVT-RNA as "non-self" and initiate defense pathways leading to an upregulated interferon (IFN) response and stalled translation. In this work Protein Kinase R (PKR) was identified as the main effector molecule mediating this cellular response. We assessed four strategies to inhibit PKR and the IFN response: A small molecule PKR inhibitor enhanced protein expression and hampered the induction of IFN-transcripts, but had to be excluded due to cytotoxicity. A siRNA mediated PKR knockdown and the overexpression of a kinase inactive PKR mutant elevated the protein expression, but the down-regulation of the IFN response was insufficient. The co-transfer of the viral inhibitors of PKR and the IFN response was most successful. The use of E3, K3 and B18R co-transfection enabled repeated IVT-RNA-based transfection of human fibroblasts. Thus, the developed protocol allows a continuous IVT-RNA encoded protein expression of proteins, which could be the basis for the generation of induced pluripotent stem cells (iPS) for several therapeutic applications in regenerative medicine or drug research.

Improving adoptive T cell therapies of cancer by ectopic expression of miR181a to repress inhibitory phosphatases

Adoptive T cell therapy using antigen-specific T lymphocytes is a powerful immunotherapeutic approach against cancer. Nevertheless, many T cells against tumor-antigens exhibit only weak anti-tumoral response. To overcome this barrier it is necessary to improve the potency and anti-tumoral efficacy of these T cells. Activation and activity of T cells are tightly controlled to inhibit unwanted T cell responses and to reduce the risk of autoimmunity. Both are regulated by extrinsic signals and intrinsic mechanisms which suppress T cell activation. The intrinsic mechanisms include the expression of phosphatases that counteract the activation-inducing kinases. Modifying the expression of these phosphatases allows the targeted modulation of T cell reactivity. MicroRNAs (miRNAs) are regulatory small noncoding RNA molecules that control gene expression by targeting messenger RNAs in a sequence specific manner. Gene-specific silencing plays a key role in diverse biological processes, such as development, differentiation, and functionality. miR181a has been shown to be highly expressed in immature T cells that recognize low-affinity antigens.rnThe present study successfully shows that ectopic expression of miR181a is able to enhance the sensitivity of both murine and human T cells. In CD4+ T helper cells as well as in CD8+ cytotoxic T cells the overexpression of miR181a leads to downregulation of multiple phosphatases involved in the T cell receptor signaling pathway. Overexpression of miR181a in human T cells achieves a co-stimulatory independent activation and has an anti-apoptotic effect on CD4+ T helper cells. Additionally, increasing the amount of miR181a enhances the cytolytic activity of murine CD8+ TCRtg T cells in an antigen-specific manner.rnTo test miR181a overexpressing T cells in vivo, a mouse tumor model using a B cell lymphoma cell line (A20-HA) expressing the Influenza hemagglutinin (Infl.-HA) antigen was established. The expression of model antigens in tumor cell lines enables targeted elimination of tumors using TCRtg T cells. The transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells alone has no positive effect neither on tumor control nor on survival of A20-HA tumor-bearing mice. In contrast, the co-transfer of miR181a overexpressing Infl.-HA TCRtg CD8+ and CD4+ T cells leads to improved tumor control and prolongs survival of A20-HA tumor-bearing mice. This effect is characterized by higher amounts of effector T cells and the expansion of Infl.-HA TCRtg CD8+ T cells.rnAll effects were achieved by changes in expression of several genes including molecules involved in T cell differentiation, activation, and regulation, cytotoxic effector molecules, and receptors important for the homing process of T cells in miR181a overexpressing T cells. The present study demonstrates that miR181a is able to enhance the anti-tumoral response of antigen-specific T cells and is a promising candidate for improving adoptive cell therapy.

Etablierung transgener BY-2-Zelllinien zur In-vivo-Lokalisierung pflanzlicher Cytoskelettproteine

Bei den Pflanzen sind viele Fragen bezüglich der Organisation und Regulation des bei der Zellteilung und differenzierung wichtigen Auf-, Ab- und Umbaus des Mikrotubuli-Netzwerkes noch immer offen, insbesondere was die Rolle des γ-Tubulins betrifft. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung von BY-2 Modell-Zelllinien (Nicotiana), die verschiedene mit fluoreszierenden Proteinen (FP) markierte Elemente des Cytoskeletts exprimieren, um eine fluoreszenzmikroskopische Detektion in vivo zu ermöglichen.rnAls Grundlage für alle weiteren Versuche wurde eine zuverlässige Methode zur A. tumefaciens vermittelten stabilen Transfektion von BY-2 Zellen erarbeitet. Für die Expression von FP-markierten Cytoskelettproteinen, wurden entsprechende Fusionskonstrukte kloniert und via A. tumefaciens in BY-2 Zellen transferiert. So gelang zunächst die Herstellung transgener Zelllinien, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimierten. Diese sollten später als Basis für die Untersuchung des dynamischen Mikrotubuli-Netzwerkes bzw. dessen Regulation dienen. In beiden Zelllinien standen die Konstrukte zunächst unter Kontrolle eines doppelten 35S-Promotors, was zu einer starken, konstitutiven Expression der Transgene führte. Fluoreszenzmikroskopisch konnten Strukturen, an deren Aufbau Mikrotubuli beteiligt sind, detektiert werden. Aufgrund einer starken Hintergrundfluoreszenz, vermutlich bedingt durch die konstitutive Überexpression, war die Darstellung feinerer Bereiche, wie sie im Cytoskelett häufig auftreten, jedoch äußerst schwierig. Deshalb wurde eine schwächere bzw. adäquate Expressionsrate angestrebt. rnPhysiologische Expressionsraten sollten vor allem durch den endogenen γ-Tubulin-Promotor ermöglicht werden. Da die entsprechende Sequenz noch unbekannt war, wurde sie zunächst bestimmt und in ein passendes Konstrukt integriert. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der resultierenden Zelllinie ließen auf eine stark reduzierte Expressionsrate schließen. Tatsächlich war die Detektion von Cytoskelettstrukturen, wenn überhaupt, erst bei deutlich längeren Belichtungszeiten möglich. Bedingt durch die langen Belichtungszeiten wurde die Dokumentation durch eine latente pflanzentypische Autofluoreszenz der Zellen erschwert. Auch wenn hier keine detailreicheren Aufnahmen der Cytoskelettstrukturen möglich waren, ist die Zellkultur für weiterführende Untersuchungen, z.B. in Studien bezüglich des zeitlichen Expressionsmusters des γ-Tubulins, potentiell geeignet. Der Einsatz eines sensibleren Mikroskopsystems ist allerdings erforderlich. rnUm klären zu können, inwieweit γ-Tubulin mit den Mikrotubuli co-lokalisiert, wurden Zelllinien benötigt, bei denen die entsprechenden Elemente unterschiedlich markiert waren. Zu diesem Zweck wurde der Einsatz von RFP-markiertem Tubulin getestet. Eine deutliche Überexpression von RFP alleine war möglich. Trotz mehrfacher Wiederholung der Versuche war aber keine Expression von RFP-markiertem α-Tubulin in BY-2 Zellen zur Visualisierung der Mikrotubuli detektierbar. Die DNA-Sequenzen waren im Genom nachweisbar, eine Transkription jedoch nicht. Möglicherweise spielten hier gene silencing Effekte eine Rolle. Das verwendete RFP (TagRFP) und GFP stammten aus unterschiedlichen Organismen, aus einer Seeanemone bzw. einer Qualle. Eine Lösung könnte der Austausch des TagRFP durch ein Quallen-Derivat, das in einer von grün unterscheidbaren Farbe fluoresziert, bringen. Da bereits BY-2 Zelllinien vorliegen, die GFP-markiertes α- bzw. γ-Tubulin exprimieren, sollte es, nach Klonieren eines entsprechenden Konstruktes, zeitnah möglich sein, eine doppelt transfizierte Zelllinie herzustellen.

Posttranskriptionale Regulation von Myelin-mRNAs

Die Myelinisierung neuronaler Axone ermöglicht eine schnelle und energieeffiziente Weiterleitung von Informationen im Nervensystem. Durch lokale Synthese von Myelinproteinen kann die Myelinschicht, zeitlich und räumlich reguliert, gebildet werden. Dieser Prozess ist abhängig von verschiedensten axonalen Eigenschaften und muss damit lokal reguliert werden. Die Myelinisierung im zentralen sowie im peripheren Nervensystem hängt unter anderem stark von kleinen regulatorischen RNA Molekülen ab. In Oligodendrozyten wird das Myelin Basische Protein (MBP) von der sncRNA715 translational reguliert, indem diese direkt innerhalb der 3’UTR der Mbp mRNA bindet und damit die Proteinsynthese verhindert. Mbp mRNA wird in hnRNP A2‐enthaltenen RNA Granula in die Zellperipherie transportiert, wo in Antwort auf axonale Signale die membranständige Tyrosin‐ Kinase Fyn aktiviert wird, welche Granula‐Komponenten wie hnRNP A2 und F phosphoryliert wodurch die lokale Translation initiiert wird. Während des Transports wird die mRNA durch die Bindung der sncRNA715 translational reprimiert. SncRNAs bilden zusammen mit Argonaut‐Proteinen den microRNA induced silencing complex (miRISC), welcher die translationale Inhibition oder den Abbau von mRNAs vermittelt. In der vorliegenden Arbeit sollte zum einen die Regulation der sncRNA715‐abhängigen translationalen Repression der Mbp mRNA in oligodendroglialen Zellen genauer untersucht werden und im zweiten Teil wurde die Rolle der sncRNA715 in den myelinbildenden Zellen des peripheren Nervensystems, den Schwann Zellen, analysiert. Es konnte in oligodendroglialen Zellen die mRNA‐Expression der vier, in Säugern bekannten Argonaut‐Proteinen nachgewiesen werden. Außerdem konnten die beiden Proteine Ago1 und Ago2 in vitro sowie in vivo detektiert werden. Ago2 interagiert mit hnRNP A2, Mbp mRNA und sncRNA715, womit es als neue Komponente des Mbp mRNA Transportgranulas identifiziert werden konnte. Des Weiteren colokalisiert Ago2 mit der Fyn‐Kinase und alle vier Argonaut‐Proteine werden Fyn‐abhängig Tyrosin‐phosphoryliert. Die Fyn‐abhängige Phosphorylierung der Granula‐Komponenten in Antwort auf axo‐glialen Kontakt führt zum Zerfall des RNA‐Granulas und zur gesteigerten MBP Proteinsynthese. Dies wird möglicherweise durch Abstoßungskräfte der negativ geladenen phosphorylierten Proteine vermittelt, wodurch diese sich voneinander und von der mRNA entfernen. Durch die Ablösung des miRISCs von der Mbp mRNA wird die Translation möglicherweise reaktiviert und die Myelinisierung kann starten. Mit der Identifizierung von Ago2 als neuer Mbp mRNA Transportgranula‐Komponente konnte ein weiterer Einblick in die Regulation der lokalen Translation von MBP gewährt werden. Das Verständnis dieses Prozesses ist entscheidend für die Entwicklung neuer Therapien von demyelinisierenden Erkrankungen, da neue Faktoren als eventuelle Ziele für pharmakologische Manipulationen identifiziert und möglichweise neue Therapiemöglichkeiten entstehen könnten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die translationale Regulation von Mbp mRNA in Schwann Zellen untersucht. Auch Schwann Zell‐Mbp wird als mRNA translational inaktiviert zur axo‐glialen Kontaktstelle transportiert, wo vermutlich auch lokale Translation in Antwort auf spezifische Signale stattfindet. Allerdings bleiben die genauen Mechanismen der mRNA‐Lokalisation und damit verbundenen translationalen Repression bislang ungeklärt. Es konnte hier gezeigt werden, dass auch in Schwann Zellen die sncRNA715 exprimiert wird und die Translation von Mbp reguliert. Überexpression der synthetischen sncRNA715 führt zu einer signifikanten Reduktion der MBP Proteinmengen in differenzierten primären Schwann Zellen. Damit kann vermutet werden, dass die Regulation der lokalen MBP Proteinsynthese in Schwann Zellen der in Oligodendrozyten ähnelt

Investigations on DNA methylation by Dnmt2 and impact of tRNA modifications on TLR7 stimulation

The incorporation of modified nucleotides into ribonucleic acids (RNAs) is important for their structure and proper function. These modifications are inserted by distinct catalytic macromolecules one of them being Dnmt2. It methylates the Cytidine (C) at position 38 in tRNA to 5-methylcytidine (m5C). Dnmt2 has been a paradigm in this respect, because all of its nearest neighbors in evolution are DNA-cytosine C5-methyltransferases and methylate DNA, while its (own) DNA methyltransferase activity is the subject of controversial reports with rates varying between zero and very weak. This work determines whether the biochemical potential for DNA methylation is present in the enzyme. It was discovered that DNA fragments, when presented as covalent RNA:DNA hybrids in the structural context of a tRNA, can be more efficiently methylated than the corresponding natural tRNA substrate. Additional minor deviations from a native tRNA structure that were seen to be tolerated by Dnmt2 were used for a stepwise development of a composite system of guide RNAs that enable the enzyme to perform cytidine methylation on single stranded DNA in vitro. Furthermore, a proof-of-principle is presented for utilizing the S-adenosyl methionine-analog cofactor SeAdoYn with Dnmt2 to search for new possible substrates in a SELEX-like approach.rnIn innate immunity, nucleic acids can function as pathogen associated molecular patterns (PAMPs) recognized by pattern recognition receptors (PRRs). The modification pattern of RNA is the discriminating factor for toll-like receptor 7 (TLR7) to distinguish between self and non-self RNA of invading pathogens. It was found that a 2'-O-methylated guanosine (Gm) at position18, naturally occurring at this position in some tRNAs, antagonizes recognition by TLR7. In the second part of this work it is pointed out, that recognition extends to the next downstream nucleotide and the effectively recognized molecular detail is actually a methylated dinucleotide. The immune silencing effect of the ribose methylation is most pronounced if the dinucleotide motif is composed of purin nucleobases whereas pyrimidines diminish the effect. Similar results were obtained when the Gm modification was transposed into other tRNA domains. Point mutations abolishing base pairings important for a proper tertiary structure had no effect on the immune stimulatory potential of a Gm modified tRNA. Taken together these results suggest a processive type of RNA inspection by TLR7.rn

Molecular risk assessment of BIG 1-98 participants by expression profiling using RNA from archival tissue

The purpose of the work reported here is to test reliable molecular profiles using routinely processed formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues from participants of the clinical trial BIG 1-98 with a median follow-up of 60 months.

CXC receptor-4 mRNA silencing abrogates CXCL12-induced migration of colorectal cancer cells

Background Interactions between CXCR4 and its ligand CXCL12 have been shown to be involved in cancer progression in colorectal cancer (CRC). We performed a comparative CXCL12/CXCR4 expression analysis and assessed the effect of external CXCL12 stimulation on migration of CRC cells without and with CXCR4 inhibition. Methods Expression of CXCL12/CXCR4 was assessed by quantitative real-time PCR, ELISA and immunohistochemistry in resection specimens of 50 CRC patients as well as in the corresponding normal tissues and in three human CRC cell lines with different metastatic potential (Caco-2, SW480 and HT-29). Migration assays were performed after stimulation with CXCL12 and CXCR4 was inhibited by siRNA and neutralizing antibodies. Results In CRC tissues CXCL12 was significantly down-regulated and CXCR4 was significantly up-regulated compared to the corresponding normal tissues. In cell lines CXCR4 was predominantly expressed in SW480 and less pronounced in HT-29 cells. CXCL12 was only detectable in Caco-2 cells. CXCL12 stimulation had no impact on Caco-2 cells but significantly increased migration of CXCR4 bearing SW480 and HT-29 cells. This effect was significantly abrogated by neutralizing anti-CXCR4 antibody as well as by CXCR4 siRNAs (P < 0.05). Conclusions CXCR4 expression was up-regulated in CRC and CXCL12 stimulation increased migration in CXCR4 bearing cell lines. Migration was inhibited by both neutralizing CXCR4 antibodies and CXCR4 siRNAs. Thus, the expression and functionality of CXCR4 might be associated with the metastatic potential of CRC cells and CXCL12/CXCR4 interactions might therefore constitute a promising target for specific treatment interventions.

Inactivation of the hypermethylated in cancer 1 tumour suppressor--not just a question of promoter hypermethylation?

The chromosomal region 17p13.3 is frequently deleted or epigenetically silenced in a variety of human cancers. It includes the hypermethylated in cancer 1 (HIC1) gene placed telomerically to the p53 tumour suppressor gene. HIC1 encodes a transcriptional repressor, and its targets identified to date are genes involved in proliferation, tumour growth and angiogenesis. In addition, HIC1 functionally cooperates with p53 to suppress cancer development. Frequent allelic loss at position 17p13.1 in human cancers often points to mutations of the tumour suppressor p53. However, in a variety of cancer types, allelic loss of the short arm of chromosome 17 may hit regions distal to p53 and, interestingly, without leading to p53 mutations. Furthermore, the neighbouring region 17p13.3 often shows loss of heterozygosity or DNA hypermethylation in various types of solid tumours and leukaemias. In line with this concept, Wales et al. described a new potential tumour suppressor in this region and named it hypermethylated in cancer 1 (HIC1). Further, it was shown that in the majority of cases hypermethylation of this chromosomal region leads to epigenetic inactivation of HIC1. A role for HIC1 in tumour development is further supported by a mouse model, since various spontaneous, age- and gender-specific malignant tumours occur in heterozygous Hic1+/- knockout mice. Furthermore, exogenously delivered HIC1 leads to a significant decrease in clonogenic survival in cancer cell lines. This review highlights the role of HIC1 inactivation in solid tumours and particularly in leukaemia development.

Cellular immune responses to HCV core increase and HCV RNA levels decrease during successful antiretroviral therapy

Background Hepatitis C virus (HCV) infection is a major cause of morbidity in HIV infected individuals. Coinfection with HIV is associated with diminished HCV-specific immune responses and higher HCV RNA levels. Aims To investigate whether long-term combination antiretroviral therapy (cART) restores HCV-specific T cell responses and improves the control of HCV replication. Methods T cell responses were evaluated longitudinally in 80 HIV/HCV coinfected individuals by ex vivo interferon-γ-ELISpot responses to HCV core peptides, that predominantly stimulate CD4+ T cells. HCV RNA levels were assessed by real-time PCR in 114 individuals. Results The proportion of individuals with detectable T cell responses to HCV core peptides was 19% before starting cART, 24% in the first year on cART and increased significantly to 45% and 49% after 33 and 70 months on cART (p=0.001). HCV-specific immune responses increased in individuals with chronic (+31%) and spontaneously cleared HCV infection (+30%). Median HCV RNA levels before starting cART were 6.5 log10 IU/ml. During long-term cART, median HCV-RNA levels slightly decreased compared to pre-cART levels (−0.3 log10 IU/ml, p=0.02). Conclusions Successful cART is associated with increasing cellular immune responses to HCV core peptides and with a slight long-term decrease in HCV RNA levels. These findings are in line with the favourable clinical effects of cART on the natural history of hepatitis C and with the current recommendation to start cART earlier in HCV/HIV coinfected individuals.