Initiation de l'adhésion leucocytaire : rôle des fucosyltransférases et des ligands des sélectines

RESUME La dissémination extramédullaire des cellules blastiques est une complication majeure des leucémies myéloïdes (LMA) ou lymphoïdes aiguës (LLA). La migration des cellules blastiques dépend de mécanismes semblables à ceux qui régulent la migration des leucocytes dans un site d'inflammation. Parmi ceux-ci, les oligosaccharides fucosylés décorant les ligands des sélectines jouent un rôle clé en interagissant avec les sélectines. PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand-1) est une protéine de 240 kD, exprimée à la surface des leucocytes, permettant de soutenir le roulement leucocytaire sur les sélectines, le long de la paroi vasculaire. L'interaction de PSGL-1 avec les sélectines nécessite des modifications post-traductionnelles de type sialylation, sulfatation , N et 0-glycosylation. Parmi les enzymes impliqués, les α1,3-fucosyltransférases jouent un rôle important dans la biosynthèse d'oligosaccharides fucosylés, ligands des sélectines (sLex, Lex, VIM-2, CLA). Comme l'expression des α1,3-fucosyltransférases par les cellules blastiques leucémiques n'a pas été étudiée précédemment, nous l'avons recherchée dans 120 cas de leucémies aiguës. Les ARNm des FucT-IV et -VII ont été détectés, par RT-PCR, dans tous les cas testés. L'ARNm de la FucT-IX n'a été observé que dans 40% des leucémies aiguës (48/120). L'ARNm de la FucT-IX est détecté dans 65% des LMA (47/72) et, moins fréquemment, dans 26% des LLA (11/42). A noter que les cas de LLA exprimant la FucT-IX correspondent essentiellement à des LLA secondaires à la transformation d'une leucémie myéloïde chronique ou des LLA de la lignée B de type leucémie/lymphome de Burkitt. L'expression de PSGL-1 et des oligosaccharides fucosylés par les blastes varie significativement parmi les LMA et les LLA : Lex, VIM-2 et sLex étant exprimés plus fréquemment par les myéloblastes que par les lymphoblastes. Le rôle des FucT-IV, -VII et -IX dans la synthèse des Lex, VIM-2, CLA et sLex a été examiné en exprimant l'ADNc de chaque FucT dans des cellules CHO. L'immunophénotypisation des transfectants indique que la FucT-VII synthétise sLex et CLA, mais pas Lex et VIM-2. Lex et VIM-2 sont générés par la FucT-IV. La FucT-IX ne participe qu'à la synthèse de Lex, sa capacité de synthèse de VIM-2 dans les cellules CHO est très faible. Le rôle de la FucT-IX dans la régulation du roulement cellulaire dépendant des sélectines a été testé dans des conditions de flux. Les vitesses de roulement des cellules CHO co-exprimant la FucT-LX, la core-2 01,6-N-acetylglucosaminyltransferase et PSGL-1 sont très élevées sur la P-sélectine (médiane : 497.95 µm/s, n=96) alors qu'elles sont beaucoup plus lentes sur la E-sélectine (médiane 7 µm/s, n=64). Les recrutements sur la E-sélectine des cellules CHO-C2F9PSGL¬1 et des CHO-C2F7PSGL-1 sont similaires (moyenne ± SEM : 127.44 ± 4.38 vs. 151.16 ± 3.16 cellules/min/mm2, n=5). Celui des cellules CHO-C2F4PSGL-1 est par contre plus faible (54.20 ± 2.13 cellules/min/mm2, n=5). Ces résultats indiquent que la FucT-IX est impliquée dans la biosynthèse de Lex, VIM-2 et CLA et qu'elle régule l'interaction des cellules CHO avec la E-sélectine. Contrairement aux FucT-IV et -VII, la FucT-IX ne joue qu'un rôle mineur dans la régulation du roulement cellulaire sur la L- et la P-sélectine. L'expression fréquente de la FucT-IX par les myéloblastes suggère qu'elle pourrait participer avec les FucT-IV et -VII à la régulation de la migration cellulaire dépendant de la E-sélectine. Finalement, ce travail de thèse a été étendu à l'identification des protéines cytoplasmiques qui interagissent avec le domaine cytoplasmique de PSGL-1 et qui pourraient être impliquées dans la transmission de signaux intracellulaires. Les ligands intracellulaires de PSGL-1 seront identifiés par la technique du double hybride qui nous a déjà permis de confirmer que syk et la N-moésine se lient au domaine cytoplasmique de PSGL-1. Des ligands supplémentaires seront identifiés employant une librairie provenant des cellules souches hématopoïétiques comme proie. ABSTRACT Blast cell dissemination is a major complication of acute myeloblastic (AML) and lymphoblastic leukemia (ALL). Blast cell migration is dependent on mechanisms that are similar to those which regulate leukocyte migration into inflammatory lesions. Among them, fticosylated oligosaccharides that decorate selectin ligands play a key role by interacting with selectins. PSGL-1 (P-Selectin Glycoprotein Ligand-1) is a 240 kD glycoprotein constitutively expressed on leucocytes and which supports leukocyte rolling on selectins. PSGL-1 interaction with selectins is dependent on post-translational modifications such as sialylation, sulfation, N- and 0-glycosylation. Among the involved enzymes, the α1,3-fucosyltransferases (FucT) play a major role in generating cell surface glycoconjugates carrying fucosylated oligosaccharides which interact with selectins (sLex, Lex, VIM-2, CLA). Since no information is available on the expression of α1,3-fucosyltransferases by leukemic blast cells, we examined it in 120 cases of acute leukemia. FucT-IV and -VII mRNAs were detected, by RT-PCR, in all tested cases. In contrast, the presence of FucT-IX mRNA was shown in only 40% of patients with acute leukemia (48/120). FucT-IX mRNA was detected in 65% of AML (47/72) and, less frequently, in 26% of ALL (11/42). Importantly, all ALL cases expressing FucT-IX were either secondary leukemia resulting from the transformation of chronic myelocytic leukemia in acute lymphoblastic leukemia or mature B-ALL (FAB L3 subtype or Burkitt lymphoma/leukemia according to WHO classification). FucT-IX was not detected in precursor B or T-ALL. The expression of PSGL-1 and fucosylated epitopes was significantly different among AML and ALL, Lex, VIM-2 and sLex being more frequently expressed by myeloblasts than by lymphoblasts. The role of FucT-IV, -VII and -IX in the biosynthesis of Lex, VIM-2, CLA and sLex was examined by expressing the cDNA of each α1,3-FucT in CHO cells. Immunophenotypic analysis of CHO transfectants indicated that FucT-VII synthesizes sLex and CLA but not Lex or VIM-2. Lex and CLA were generated by both FucT-IV and -IX. FucT-IV and FucT-IX differed in their ability to synthesize VIM-2, FucT-IX being less efficient than FucT-IV. The role of FucT-IX in regulating selectin-dependent rolling was assessed under hydrodynamic flow conditions. P-selectin-dependent interactions were transient and occurred at high velocities (median: 497.95 1,µm/s, n=96). In contrast, much slower rolling velocities were observed on E-selectin (median: 7 µm/s, n=64). The recruitment of CHO-C2F9PSGL-1 and CHO-C2F7PSGL-1 cells was similar on E-selectin (mean ± SEM: 127.44 ± 4.38, n=5 vs 151.16 ± 3.16 cells/min/mm2, n=5). In the other hand, CHO-C2F4PSGL-1 cells were less efficiently recruited on E-selectin (54.20 ± 2.13 cells/min/mm2, n=5). This results indicate that FucT-IX is involved in the biosynthesis of Lex, VIM-2 and CLA and that it confers E-selectin binding activity to CHO cells. By contrast to FucT-IV and -VII, FucT-IX had a minor role in regulating P- and L-selectin-dependent rolling on CHO transfectants. The frequent expression of FucT-IX in myeloblasts suggests that it may participate with FucT-IV and -VII in regulating E-selectin-dependent cell migration into tissues. Finally, this thesis work was extended to the identification of the cytoplasmic proteins interacting with cytoplasmic domain of PSGL-1 that may be involved in transducing intracellular signals. We planned to identify these intracellular ligands of PSGL-1 by using the double hybrid technique and already confirmed that syk and N-moesin bind to the cytoplasmic domain of PSGL-1. Additional PSGL-1 ligands will be sought by the same technique using a CD34+ stem cell library as pray. RESUME DESTINE A UN LARGE PUBLIC : L'adhésion et la migration leucocytaire sont nécessaires à de nombreux processus cellulaires comme la régulation de l'hématopoïèse, mais aussi dans la pathogenèse de l'artériosclérose, des maladies inflammatoires et de la métastatisation des cellules cancéreuses. Les molécules impliquées constituent depuis peu des cibles pour la thérapie du cancer. La migration leucocytaire vers un site d'inflammation dépend de mécanismes complexes, se déroulant en plusieurs étapes, nécessitant l'interaction séquentielle de molécules d'adhésion leucocytaires et endothéliales. Ainsi, chronologiquement, suite à un stimulus inflammatoire, les leucocytes « roulent » sur les cellules endothéliales, sont activées, s'arrêtent et traversent la paroi endothéliale (diapédèse) pour migrer dans les tissus environnants inflammés selon un gradient chimiotactique. La première étape de roulement met en jeu deux molécules principales : PSGL-1 (P-Sélectine Glycoprotéine Ligand-1) du coté des leucocytes et les sélectines du coté de l'endothélium de la paroi vasculaire. L'interaction entre ces deux molécules nécessite des décorations de ces protéines par des sucres, des résidus sulfates et des acides sialiques. Le sucre essentiel à la liaison demeure le fucose qui est attaché aux protéines grâce à des enzymes de la famille des fucosyltransferases. Actuellement, neuf fucosyltransférases humaines ont été identifiées et désignées sous FucT-I à IX. La FucT-IX, dernière fucosyltransférase clonée, a un faible degré d'homologie avec les autres fucosyltransférases mais sa séquence est extrêmement conservée entre les espèces. Ceci traduit son importance par une forte résistance à la pression évolutive. L'examen de son expression au sein de 120 cas de leucémies aiguës a mis en évidence son comportement atypique. En effet, alors que les autres FucTs sont toujours présentes, la FucT¬IX ne s'exprime que dans un cas sur deux en moyenne avec une préférence plus importante pour les leucémies myéloïdes. Ainsi, une étude plus approfondie de cet enzyme à mis en évidence sa capacité à induire une interaction cellulaire plus spécifique de la E-sélectine. Elle décore non seulement des protéines de surface, mais aussi certainement les glycolipides constituant la membrane cellulaire.

Regulation of P-selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1) interactions with selectins : role of the decameric repeats and of the cytoplasmic domain

SUMMARY BACKGROUND: P-selectin glycoprotein ligand 1 (PSGL-1) is a major selectin ligand, mediating leukocyte rolling along inflamed vascular wall. It is a mucin-like homodimer composed of a N-terminal domain which binds selectins, followed by 14-16 decameric repeats (DR), a transmembrane domain and a cytoplasmic tail, which may be involved in regulating leukocyte rolling and in generating intracellular signals, through its binding to moesin and Syk. P- and L-selectin binding is dependent on core-2 O-glycosylation and tyrosine sulfation of PSGL-1 N-terminus. However, a minor part of E-selectin-mediated rolling is dependent on N-terminal O-glycans; additional binding sites may thus be involved. In this project, we studied whether (1) PSGL-1 DR and (2) PSGL-1 cytoplasmic residues which bind moesin, were also involved in the regulation of selectin-dependent rolling. METHODS: Several mutated cDNAs were obtained: (1) PSGL-1 DR were either deleted, or substituted by platelet GPlba macroglycopeptide, (2) Ser-336, -348, Lys-337 and Arg-338 were mutated to alanine; moreover, truncation mutants retaining only 6 or 2 cytoplasmic residues were also generated. Transfected CHO expressing mutant PSGL-1 were tested for their ability to bind soluble selectin chimeras and to support selectin-dependent rolling under flow conditions. RESULTS: (1) Deletion of the DR had a dramatic effect on P- and L-selectin-dependent cell recruitment and rolling stability, which could only partially be compensated for, by GPlba substitution. In addition, we observed that DR create a binding site for E-selectin and thus support PSGL-1-dependent rolling. (2) Flow assays revealed that the moesin-binding site, in particular Ser-336, plays a crucial role in regulating the recruitment, velocity and rolling stability of PSGL-1-expressing cells on P- and L-selectin. CONCLUSIONS: Data presented here highlight the structure -function relationship of PSGL-1 DR. Moreover, they reveal a crucial role for the moesin-binding residues in regulating P-and L-selectin-dependent rolling. RÉSUMÉ CONTEXTE: PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand 1) est un ligand majeur des sélectines permettant le roulement des leucocytes le long de la paroi vasculaire enflammée. C'est un homodimère de type mucine, composé d'un domaine N-terminal liant les sélectines, suivi de 14-16 répétitions décamèriques (RD), d'un domaine transmembranaire et d'une queue cytoplasmique qui pourrait être impliquée dans la régulation du roulement leucocytaire et la génération de signaux intracellulaires, via sa liaison à la moésine et à Syk. La liaison à la Pet à la L-sélectine dépend de la présentation par le N-terminus de PSGL-1 de O-glycans sur des structures core-2 et de tyrosines sulfatées. Cependant, une fraction mineure du roulement médié par la E-sélectine dépend des O-glycans N-terminaux; des sites de liaisons supplémentaires pourraient donc être impliqués. Dans ce projet, nous avons étudié si (1) les RD de PSGL-1 ainsi que (2) les résidus cytoplasmiques liant la moésine, étaient impliqués dans la régulation du roulement dépendant des sélectines. MÉTHODES: Plusieurs ADN codant des formes mutées de PSGL-1 ont été obtenus: (1) Les RD de PSGL-1 ont été soit ôtées, soit remplacées par le macroglycopeptide de la GPlba plaquettaire, (2) les Ser-336, -348, la Lys-337 et l'Arg-338 ont été mutées en alanine; par ailleurs, des mutants tronqués ne retenant plus que 6 ou 2 résidus cytoplasmiques ont également été générés. Des CHO transfectées exprimant PSGL-1 muté ont été testées pour leur capacité à lier des sélectines chimériques solubles et à soutenir un roulement dépendant des sélectines dans des conditions de flux. RÉSULTATS: (1) La perte des RD a eu un effet dramatique sur le recrutement cellulaire et la stabilité de roulement dépendant des P- et L-sélectine, qui n'a pu être que partiellement compensé par la substitution par la GPlba. De plus, nous avons observé que les RD forment un site de liaison pour la E-sélectine et soutiennent ainsi le roulement dépendant de PSGL-1. (2) Les tests de flux ont révélé que le site de liaison à la moésine, notamment la Ser-336, joue un rôle crucial dans la régulation du recrutement, de la vitesse et de la stabilité du roulement des cellules exprimant PSGL-1 sur les P- et L-sélectine. CONCLUSIONS; Les données présentées ici ont permis d'éclaircir la relation structure -fonction des RD de PSGL-1. Par ailleurs, elles révèlent un rôle crucial pour les résidus liant la moésine dans le roulement dépendant des P- et L-sélectine. RÉSUMÉ DESTINÉ À UN LARGE PUBLIC Pour accomplir ses fonctions, le sang circule sur un réseau de 96'000 kilomètres; ainsi, il approvisionne les cellules de l'organisme en énergie, il transporte diverses substances, il assure la défense contre les pathogènes et il participe à la régulation de la température corporelle. Le sang contient plusieurs types de cellules: la grande majorité sont les globules rouges, auxquels il faut ajouter les plaquettes (dont le rôle est de colmater les lésions vasculaires) et les globules blancs (leucocytes) qui, bien que présents en très faible quantité (moins de 0.01 %), jouent un rôle crucial en cas d'infection ou d'inflammation. Une attaque par un pathogène provoque plusieurs changements (rougeur, chaleur, gonflement, douleur), qui sont des manifestations de l'inflammation. Pour atteindre l'agent infectieux, des globules blancs spécialisés (les granulocytes) doivent quitter la circulation sanguine. Afin de faciliter leur capture, les vaisseaux sanguins vont exprimer des protéines telles que les sélectines, qui sont reconnues par une protéine leucocytaire appelée PSGL-1 (P-selectin glycoprotein ligand 7). L'interaction des sélectines avec PSGL-1 soutient le roulement du globule blanc le long de la paroi vasculaire, à une vitesse très inférieure à celle du flux sanguin. Ce roulement conduit à l'activation du globule blanc par des molécules de l'inflammation, permettant son adhésion ferme, puis son arrêt. Finalement, le granulocyte va migrer à travers la paroi du vaisseau pour atteindre et éliminer les causes de l'inflammation. L'adhésion est un processus intéressant à caractériser, car outre l'inflammation, il est également impliqué dans l'artériosclérose, l'infarctus, la métastatisation et la thrombose. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à définir les rôles des différents domaines de PSGL-1 dans la régulation de son interaction avec les sélectines. En effet, en plus de son extrémité extracellulaire de haute affinité pour les sélectines, PSGL-1 est composé de plusieurs séquences répétées hautement glycosylées et d'une courte région intracellulaire, dont les fonctions n'avaient pas été étudiées auparavant. En créant des formes mutées de PSGL-1, nous avons pu montrer qu'un roulement efficace des leucocytes nécessite la présence des régions répétitives et du domaine intracellulaire au complet.

Restoration of lymphoid organ integrity through the interaction of lymphoid tissue-inducer cells with stroma of the T cell zone.

The generation of lymphoid microenvironments in early life depends on the interaction of lymphoid tissue-inducer cells with stromal lymphoid tissue-organizer cells. Whether this cellular interface stays operational in adult secondary lymphoid organs has remained elusive. We show here that during acute infection with lymphocytic choriomeningitis virus, antiviral cytotoxic T cells destroyed infected T cell zone stromal cells, which led to profound disruption of secondary lymphoid organ integrity. Furthermore, the ability of the host to respond to secondary antigens was lost. Restoration of the lymphoid microanatomy was dependent on the proliferative accumulation of lymphoid tissue-inducer cells in secondary lymphoid organs during the acute phase of infection and lymphotoxin alpha(1)beta(2) signaling. Thus, crosstalk between lymphoid tissue-inducer cells and stromal cells is reactivated in adults to maintain secondary lymphoid organ integrity and thereby contributes to the preservation of immunocompetence.

Low levels of human leukocyte antigen donor-specific antibodies detected by solid phase assay before transplantation are frequently clinically irrelevant.

Since new technologies based on solid phase assays (SPA) have been routinely incorporated in the transplant immunology laboratory, the presence of pretransplantation donor-specific antibodies (DSA) against human leukocyte antigen (HLA) molecules has generally been considered as a risk factor for acute rejection (AR) and, in particular, for acute humoral rejection (AHR). We retrospectively studied 113 kidney transplant recipients who had negative prospective T-cell and B-cell complement-dependent cytotoxicity (CDC) crossmatches at the time of transplant. Pretransplantation sera were screened for the presence of circulating anti-HLA antibody and DSA by using highly sensitive and HLA-specific Luminex assay, and the results were correlated with AR and AHR posttransplantation. We found that approximately half of our patient population (55/113, 48.7%) had circulating anti-HLA antibody pretransplantation. Of 113 patients, 11 (9.7%) had HLA-DSA. Of 11 rejection episodes post-transplant, only two patients had pretransplantation DSA, of whom one had a severe AHR (C4d positive). One-year allograft survival was similar between the pretransplantation DSA-positive and -negative groups. Number, class, and intensity of pretransplantation DSA, as well as presensitizing events, could not predict AR. We conclude that, based on the presence of pretransplantation DSA, post-transplantation acute rejections episodes could not have been predicted. The only AHR episode occurred in a recipient with pretransplantation DSA. More work should be performed to better delineate the precise clinical significance of detecting low titers of DSA before transplantation.

7Ni-O chemical interaction and the transition temperature of Ni-doped Bi2Sr2Ca1Cu2O8

We find that even very low Ni doping levels of high-quality Bi2Sr2Ca1Cu2O8 single crystals strongly affect the transition temperature T(c). We also observed that T(c) is not related to the total Ni concentration, but only to that of Ni engaged in NiO-type bonds. By controlling the temperature during crystal growth, one can modify the relative weight of Ni in NiO-type bonds with respect to other configurations-and therefore T(c).

Expressed isolated integrin beta1 subunit cytodomain induces endothelial cell death secondary to detachment.

Expression of isolated beta integrin cytoplasmic domains in cultured endothelial cells was reported to induce cell detachment and death. To test whether cell death was the cause or the consequence of cell detachment, we expressed isolated integrin beta1 cytoplasmic and transmembrane domains (CH1) in cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), and monitored detachment, viability, caspase activation and signaling. CH1 expression induced dose-dependent cell detachment. At 24 h over 90% of CH1-expressing HUVEC were detached but largely viable (>85%). No evidence of pro-caspase-8,-3, and PARP cleavage or suppression of phosphorylation of ERK, PKB and Ikappa-B was observed. The caspase inhibitor z-VAD did not prevent cell detachment. At 48 h, however, CH1-expressing cells were over 50% dead. As a comparison trypsin-mediated detachment resulted in a time-dependent cell death, paralleled by caspase-3 activation and suppression of ERK, PKB and Ikappa-B phosphoyrylation at 24 h or later after detachment. HUVEC stimulation with agents that strengthen integrin-mediated adhesion (i.e. PMA, the Src inhibitor PP2 and COMP-Ang1) did not prevent CH1-induced detachment. Expression of CH1 in rat carotid artery endothelial cells in vivo caused endothelial cell detachment and increased nuclear DNA fragmentation among detached cells. A construct lacking the integrin cytoplasmic domain (CH2) had no effect on adhesion and cell viability in vitro and in vivo. These results demonstrate that isolated beta1 cytoplasmic domain expression induces caspase-independent detachment of viable endothelial cells and that death is secondary to detachment (i.e. anoikis). They also reveal an essential role for integrins in the adhesion and survival of quiescent endothelial cells in vivo.

Structural investigations into the interaction of hemoglobin and part structures with bacterial endotoxins.

An understanding of details of the interaction mechanisms of bacterial endotoxins (lipopolysaccharide, LPS) with the oxygen transport protein hemoglobin is still lacking, despite its high biological relevance. Here, a biophysical investigation into the endotoxin:hemoglobin interaction is presented which comprises the use of various rough mutant LPS as well as free lipid A; in addition to the complete hemoglobin molecule from fetal sheep extract, also the partial structure alpha-chain and the heme-free sample are studied. The investigations comprise the determination of the gel-to-liquid crystalline phase behaviour of the acyl chains of LPS, the ultrastructure (type of aggregate structure and morphology) of the endotoxins, and the incorporation of the hemoglobins into artificial immune cell membranes and into LPS. Our data suggest a model for the interaction between Hb and LPS in which hemoglobins do not react strongly with the hydrophilic or with the hydrophobic moiety of LPS, but with the complete endotoxin aggregate. Hb is able to incorporate into LPS with the longitudinal direction parallel to the lipid A double-layer. Although this does not lead to a strong disturbance of the LPS acyl chain packing, the change of the curvature leads to a slightly conical molecular shape with a change of the three-dimensional arrangement from unilamellar into cubic LPS aggregates. Our previous results show that cubic LPS structures exhibit strong endotoxic activity. The property of Hb on the physical state of LPS described here may explain the observation of an increase in LPS-mediating endotoxicity due to the action of Hb.

Fluid-rock interaction during late stages of the Alpine exhumation

Résumé de la thèseLa fracturation des roches au cours de phases compressives ou extensives est un souvent évoquée pour expliquer la circulation de fluide au sein des roches cristallines. Dans le cadre de cette thèse, la circulation des fluides lors de l'exhumation tardive des Alpes a été étudiée en utilisant deux approches différentes: analyses structurales de la déformation fragile d'une part et analyses géochimiques des roches et des minéraux (isotopes stables, datations U/Pb, thermochronologie (U-Th)/He) d'autre part. Cette approche combinée a permis de mieux comprendre l'interaction existante entre les fluides métamorphiques et les fluides météoriques, ainsi que leur interaction avec les roches encaissantes. Le travail a été effectué dans la zone Pennique du Valais suisse.La première partie était focalisée sur la déformation fragile, le but étant de définir les différents types de déformations existantes et de déterminer l'âge relatif des différentes familles de failles. Dans la région d'étude, quatre domaines ont été distingués. Chacun d'eux comportent deux types de structures fragiles, certaines sont minéralisées alors que d'autre non. Au sein de chaque domaine, la direction principale des structures minéralisées correspond à l'orientation des accidents tectoniques majeurs de la région (Aosta- Ranzola Line au Sud, Rhône Line au Nord et Simplon Fault Zone à l'Est), alors que les structures non- minéralisées montrent des orientations plus variables. Ainsi, le premier type de structure est interprété comme résultant d'une dislocation tectonique alors que le deuxième type de structure résulterait d'une dislocation gravitaire locale. Il n'est néanmoins pas possible de classer chronologiquement la formation de ces deux types de structure ni d'attribuer un âge relatif aux changements d'orientation des contraintes majeures.La deuxième étude a été effectuée dans la région de la zone de faille du Simplon. Dans cette zone, la composition isotopique des minéraux ayant cristallisé à l'intérieur des fractures tardives permet de distinguer différents types de circulation de fluide. Les valeurs δ180 du quartz de la roche encaissante ainsi que ceux des veines tardives du bloque inférieur de la faille sont comparables. Ces valeurs indiquent un rééquilibrage et un tamponnage isotopique des fluides tardifs au contact de la roche encaissante lors de la fracturation de cette dernière et de la cristallisation des veines tardives. La même situation est observée dans la partie nord du bloque supérieur ainsi que dans sa partie sud. Ceci n'est néanmoins pas le cas pour la partie centrale du bloque supérieur où les valeurs isotopiques des minéraux dans les veines tardives sont approximativement 3 %o plus basses (avec des valeurs extrêmes négatifs), indiquant une contribution d'eau météorique aux fluides circulant dans les veines. Ces données suggèrent qu'une infiltration d'eau météorique a pu avoir lieu dans le bloque supérieur, où la fracturation des roches est plus intensive car le déplacement relatif le long de la faille y fut plus important, et la température maximale du métamorphisme plus basse. La troisième contribution traite de la géo-thermochronologie de la zone de contact entre la klippe de la Dent Blanche et la nappe de Tsaté. De petits zircons euhédraux ont été trouvés dans un plan de faille minéralisé (parallèle à la Faille du Rhône, voir première partie de l'étude), riche en hématite et quartz, de la zone d'étude. Les analyses U/Pb donnent des âges radiométriques autour de 270 - 280 Ma aux zircons extraits de la minéralisation ainsi que ceux extraits de la roche encaissante, ce qui correspond à l'âge de la nappe de la Dent Blanche et non celui de la nappe du Tsaté qui est elle-même classiquement interprétée comme une ophiolite Jurassique de l'Océan Liguro-Piémontais. Ces données suggèrent que les zircons contenus dans la veine ont été hérités de la roche encaissante. Les résultats (U-Th)/He indiquent un âge de refroidissement différent pour la roche encaissante (25.5 ± 2.0 Ma) que celui de la minéralisation (17.7 ±1.4 Ma). Le thermomètre isotopique quartz-hématite indique une température d'équilibre, et donc de mise en place de la minéralisation, d'environ 170 °C, température très proche de la température de -180 °C de fermeture du zircon pour le système (U-Th)/He. Ceci suggère que l'âge de refroidissement des zircons de la minéralisation correspond aussi à l'âge de formation de la faille.Thesis abstractFluid circulation in fractured rocks is a common process in geology, and it is generally the consequence of faulting and fracturing during both tectonic compression and extension. This thesis is focused on fluid circulation during late stages of the Alpine exhumation. After a structural analysis of the late brittle deformation of the studied samples, several analytical methods (stable isotope investigations, U/Pb radiometric dating, (U-Th)/He thermochronology) have been applied to understand the interaction of metamorphic and meteoric fluids with one another as well as with the host rock. This thesis is articulated around three study directions. All studies were conducted in the Penninic Zone of the Valais, Switzerland. The first study deals with late, brittle deformation and focuses on the different deformation styles and on the relative age of the different families of fractures. In order to do this, late brittle structures observed in four different domains have been subdivided as a function of the existence (or not) and type of mineralization. Comparisons between mineralized and non-mineralized strike directions for all four domains show that mineralized structures follow the strike orientation of major tectonic movements indicated in the Penninic Zone of the Valais (Aosta-Ranzola Line to the S, Rhône Line to the Ν and Simplon Fault Zone to the E), whereas non-mineralized fractures have a more variable strike orientation. This difference could be interpreted as indicative of tectonic-related faulting (mineralized structures) vs. local, collapse-related faulting (non-mineralized fractures), but it is not strong enough to indicate a relative age of the late brittle structures, and/or a change in the orientation of the strain field in post-Miocene times. The second studied area is focused on the Simplon Fault Zone (SFZ). Stable isotope analyses of minerals filling these late fractures indicate that there are two different fluid circulation systems in the footwall and hanging wall of the SFZ. In the footwall, δ180 values of quartz from both the host rock and the late veins range from +10 %o to +12 %o. This is consistent with buffering of circulating fluids by the host rock during fracturing and vein precipitation. In the hanging wall, δΙ80 values for quartz crystals from the host rock and the late veins are similar in both the northern and southern parts of the detachment that are both affected by the same degree of metamorphism (greenschist to the Ν and amphibolite to the S). This is not the case in the central part of the SFZ, where there is a jump from amphibolite facies in the footwall to greenschist facies in the hanging wall. δ,80 values for quartz from the hanging wall late veins are approximately 3.0 %o lower (down to negative values in some cases) than the values observed in the footwall These data suggest that infiltration of meteoric water may have occurred in the most fractured parts of the hanging wall, where relative displacement on the SFZ was the greatest and the peak temperature lower. In the less fractured footwall the δ180 values reflect a host rock-buffered system.The third study is focused on geo-thermochronology at the contact between the Dent Blanche nappe and the Tsaté nappe where small, euhedral zircons were found in a hematite- and quartz-rich mineralization on a late normal fault plane parallel to the Rhône Line (see first part of the study). U/Pb analysis indicates that the zircons - both in the late mineralization and in the host rock - have absolute radiometric ages clustering around 270 - 280 Ma, which is the accepted age for intrusive rocks from the Austroalpine Dent Blanche units but not for the Tsaté nappe. The latter is classically interpreted as an ophiolitic remnant of the Jurassic Liguro-Piemontais Ocean. U/Pb analyses suggest that zircons in late mineralization are all inherited from the host rock; however, results of (U-Th)/He analyses indicate that cooling ages for the host rocks are different to the cooling ages for the zircons in late mineralization. Indeed, the calculated cooling age for the Arolla gneiss is 25.5 ± 2.0 Ma, whilst the cooling age for the associated mineralized fault plane is 17.7 ±1.4 Ma. Oxygen stable isotope fractionation between quartz and hematite in the same late mineralization corresponds to temperatures of about 170 °C. The proximity of the calculated emplacement temperature for the mineralization and the lower accepted closure temperature for zircon in the (U-Th)/He system (-180 °C) imply that the age of 17.7 ± 1.4 Ma can also be interpreted as the formation age of this late brittle fault.Résumé grand publicLa circulation des fluides dans les roches fracturées est typique de nombreux processus géologiques, et très souvent est la conséquence de la fracturation des roches. Cette thèse aborde la question de la circulation des fluides pendant les dernières phases du soulèvement des Alpes. Après une analyse structurale de la fracturation directement sur le terrain, plusieurs méthodes géochimiques ont été appliquées pour comprendre l'interaction entre les différents fluides circulants, et avec leur propre roche mère. L'étude, concentrée sur trois directions principales, a été conduite dans la zone Pennique du Valais suisse. La première partie traite de la déformation cassante dans le secteur cité. L'analyse détaillée des fractures a permis de les subdiviser en structures minéralisées et non-minéralisées, sur quatre domaines différents. La comparaison entre les directions des structures minéralisées et non-minéralisées a permis de montrer que les premières suivent l'orientation des accidents tectoniques majeurs de la région, alors que les structures non- minéralisées ont une orientation plus variable. Cette différence pourrait être interprétée comme indication d'une dislocation tectonique (structures minéralisées) contre une dislocation gravitaire locale (structures non-minéralisées), mais elle n'est pas assez forte pour indiquer un âge relatif des structures tardives et/ou un changement de l'orientation des contraintes après -20 Ma vers le présent.A partir de ces observations, la deuxième étude est concentrée dans la région de la faille du Simplon. Les analyses géochimiques sur les minéraux remplissant les structures tardives indiquent qu'il y a deux différents systèmes de circulation des fluides dans les deux parties (toit et mur) de la faille. Dans le mur, les valeurs isotopiques des minéraux cristallisés à partir d'un fluide tardif sont les mêmes de ceux de la roche mère, donc il y a eu rééquilibration chimique entre fluide et roche pendant la fracturation de cette dernière et la précipitation des minéraux. Dans le toit, les valeurs isotopiques dans la roche mère et dans les minéraux des veines tardives sont comparables dans les parties Ν et S de la faille, où les roches du toit et du mur ont atteint une température maximale - pendant phase prograde de la formation des Alpes - comparable. Au contraire, dans la partie centrale, où le mur a atteint des températures maximales plus élevées par rapport au toit, les valeurs géochimiques des minéralisations tardives du toit sont parfois plus basses que les valeurs observées dans le mur. Ces données suggèrent que l'infiltration de l'eau de surface aurait pu se produire dans la partie plus fracturée du toit, où le déplacement relatif le long de la faille était majeur et les températures maximales mineures. Au contraire, les données géochimiques du mur de la partie centrale indiquent un système isotopique équilibré par la roche mère.La troisième partie de ce travail se base sur l'étude géochimique intégrée des isotopes stables d'Oxygène et radioactifs du Plomb, Uranium, Thorium et Hélium, auprès d'une faille normale minéralisée et des roches de la région à cheval entre deux nappes, la nappe de la Dent Blanche et la nappe de Tsaté. Ici, des petits zircons ont été trouvés dans la minéralisation citée, riche en hématite et quartz. L'analyse radiométrique Uranium/Plomb a montré que les zircons dans la minéralisation et dans les roches autour ont des âges comparables (autour 280 Ma). Cela signifie que les zircons dans la minéralisation tardive ont été hérités de la roche mère pendant la fracturation et la circulation des fluides tardives. De l'autre coté, les résultats des analyses Uranium-Thorium/Hélium indiquent que les âges de refroidissement pour les roches mères sont différents comparés aux âges de refroidissement pour les zircons dans la minéralisation tardive: ces derniers sont plus jeunes d'environ 8 Ma (autour 25 Ma et autour 17 Ma respectivement). Les analyses des isotopes de l'oxygène sur quartz et hématite dans la même minéralisation donnent une température de mise en place de cette dernière d'environ 170° C. La température de fermeture du système chimique des zircons dans le système (Uranium-Thorium)/Hélium est d'environ 180 °C: la proximité de ces deux températures implique que l'âge de refroidissement de la minéralisation tardive peut également être interprété comme âge de formation de la faille.

Probing the interaction between feline immunodeficiency virus and CD134 by using the novel monoclonal antibody 7D6 and the CD134 (Ox40) ligand.

The feline immunodeficiency virus (FIV) targets activated CD4-positive helper T cells preferentially, inducing an AIDS-like immunodeficiency in its natural host species, the domestic cat. The primary receptor for FIV is CD134, a member of the tumor necrosis factor receptor superfamily, and all primary viral strains tested to date use CD134 for infection. We examined the expression of CD134 in the cat using a novel anti-feline CD134 monoclonal antibody (MAb), 7D6, and showed that as in rats and humans, CD134 expression is restricted tightly to CD4+, and not CD8+, T cells, consistent with the selective targeting of these cells by FIV. However, FIV is also macrophage tropic, and in chronic infection the viral tropism broadens to include B cells and CD8+ T cells. Using 7D6, we revealed CD134 expression on a B220-positive (B-cell) population and on cultured macrophages but not peripheral blood monocytes. Moreover, macrophage CD134 expression and FIV infection were enhanced by activation in response to bacterial lipopolysaccharide. Consistent with CD134 expression on human and murine T cells, feline CD134 was abundant on mitogen-stimulated CD4+ T cells, with weaker expression on CD8+ T cells, concordant with the expansion of FIV into CD8+ T cells with progression of the infection. The interaction between FIV and CD134 was probed using MAb 7D6 and soluble CD134 ligand (CD134L), revealing strain-specific differences in sensitivity to both 7D6 and CD134L. Infection with isolates such as PPR and B2542 was inhibited well by both 7D6 and CD134L, suggesting a lower affinity of interaction. In contrast, GL8, CPG, and NCSU were relatively refractory to inhibition by both 7D6 and CD134L and, accordingly, may have a higher-affinity interaction with CD134, permitting infection of cells where CD134 levels are limiting.

Effect of atazanavir versus other protease inhibitor-containing antiretroviral therapy on endothelial function in HIV-infected persons: randomised controlled trial.

OBJECTIVE: Impaired endothelial function was demonstrated in HIV-infected persons on protease inhibitor (PI)-containing antiretroviral therapy, probably due to altered lipid metabolism. Atazanavir is a PI causing less atherogenic lipoprotein changes. This study determined whether endothelial function improves after switching from other PI to atazanavir. DESIGN: Randomised, observer-blind, treatment-controlled trial. SETTING: Three university-based outpatient clinics. PATIENTS: 39 HIV-infected persons with suppressed viral replication on PI-containing regimens and fasting low-density lipoprotein (LDL)-cholesterol greater than 3 mmol/l. INTERVENTION: Patients were randomly assigned to continue the current PI or change to unboosted atazanavir. MAIN OUTCOME MEASURES: Endpoints at week 24 were endothelial function assessed by flow-mediated dilation (FMD) of the brachial artery, lipid profiles and serum inflammation and oxidative stress parameters. RESULTS: Baseline characteristics and mean FMD values of the two treatment groups were comparable (3.9% (SD 1.8) on atazanavir versus 4.0% (SD 1.5) in controls). After 24 weeks' treatment, FMD decreased to 3.3% (SD 1.4) and 3.4% (SD 1.7), respectively (all p = ns). Total cholesterol improved in both groups (p<0.0001 and p = 0.01, respectively) but changes were more pronounced on atazanavir (p = 0.05, changes between groups). High-density lipoprotein and triglyceride levels improved on atazanavir (p = 0.03 and p = 0.003, respectively) but not in controls. Serum inflammatory and oxidative stress parameters did not change; oxidised LDL improved significantly in the atazanavir group. CONCLUSIONS: The switch from another PI to atazanavir in treatment-experienced patients did not result in improvement of endothelial function despite significantly improved serum lipids. Atherogenic lipid profiles and direct effects of antiretroviral drugs on the endothelium may affect vascular function. Trial registration number: NCT00447070.

The integrin antagonist cilengitide activates alphaVbeta3, disrupts VE-cadherin localization at cell junctions and enhances permeability in endothelial cells.

Cilengitide is a high-affinity cyclic pentapeptdic alphaV integrin antagonist previously reported to suppress angiogenesis by inducing anoikis of endothelial cells adhering through alphaVbeta3/alphaVbeta5 integrins. Angiogenic endothelial cells express multiple integrins, in particular those of the beta1 family, and little is known on the effect of cilengitide on endothelial cells expressing alphaVbeta3 but adhering through beta1 integrins. Through morphological, biochemical, pharmacological and functional approaches we investigated the effect of cilengitide on alphaVbeta3-expressing human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) cultured on the beta1 ligands fibronectin and collagen I. We show that cilengitide activated cell surface alphaVbeta3, stimulated phosphorylation of FAK (Y(397) and Y(576/577)), Src (S(418)) and VE-cadherin (Y(658) and Y(731)), redistributed alphaVbeta3 at the cell periphery, caused disappearance of VE-cadherin from cellular junctions, increased the permeability of HUVEC monolayers and detached HUVEC adhering on low-density beta1 integrin ligands. Pharmacological inhibition of Src kinase activity fully prevented cilengitide-induced phosphorylation of Src, FAK and VE-cadherin, and redistribution of alphaVbeta3 and VE-cadherin and partially prevented increased permeability, but did not prevent HUVEC detachment from low-density matrices. Taken together, these observations reveal a previously unreported effect of cilengitide on endothelial cells namely its ability to elicit signaling events disrupting VE-cadherin localization at cellular contacts and to increase endothelial monolayer permeability. These effects are potentially relevant to the clinical use of cilengitide as anticancer agent.

Membrane interaction of polymyxin B and synthetic analogues studied in biomimetic systems: implications for antibacterial action

Membrane-active antimicrobial peptides, such as polymyxin B (PxB), are currently in the spotlight as potential candidates toovercome bacterial resistance. We have designed synthetic analogs ofPxB in order to determine the structural requirements for membraneaction. Since the mechanism of action of PxB involves interaction withboth the outer membrane and the cytoplasmic membrane of Gramnegative bacteria, we have used an approach based on mimicking theouter layers of these membranes using monolayers, Langmuir-Blodgettfilms and unilamelar vesicles, and applying a battery of biophysicalmethods in order to dissect the different events of membraneinteraction. Collectively, results indicate that the PxB analogues act inthe bacterial membrane by the same mechanism than PxB, and that cationic amphipathicity determines peptide activity.

Gene by environment interaction: effects of a single-gene and social-environment on reproductive phenotypes of fire ant queens

1. The gene Pgm-3 (or a closely linked gene) influences the phenotype and reproductive success of queens in multiple-queen (polygynous) colonies but not single-queen (monogynous) colonies of the Fire Ant Solenopsis invicta. 2. We investigated the mechanisms of differential phenotypic expression of Pgm-3 in these alternate social forms. Mature winged queens with the homozygous genotype Pgm-3(a/a) averaged 26% heavier than queens with the genotypes Pgm-3(a/b) and Pgm 3(b/b) in the polygynous form. Heterozygotes were slightly heavier (2%) than Pgm-3(b/b) queens in this form, demonstrating that the allele Pgm-3(a) is not completely recessive in its effects on weight. 3. There was no significant difference in weight among queens of the three Pgm-3 genotypes in the monogynous form, with the mean weight of monogynous queens slightly greater than that of polygynous Pgm-3(a/a) queens. Differences in weight between queens of the two social forms and among queens of the three genotypes in the polygynous form are not evident at the pupal stage and thus appear to develop during sexual maturation of the adults. This suggests that some component of the social environment of polygynous colonies inhibits weight gains during queen maturation and that Pgm-(3a/a) queens are relatively less sensitive to this factor. 4. To test whether the high cumulative queen pheromone level characteristic of polygynous colonies is the factor responsible for the differential queen maturation, we compared phenotypes of winged queens reared in split colonies in which pheromone levels were manipulated by adjusting queen number. Queens produced in colony fragments made monogynous were heavier than those produced in polygynous fragments, a finding consistent with the hypothesis that pheromone level affects the reproductive development of queens. However, genotype-specific differences in weights of queens were similar between the two treatments, suggesting that pheromone level was not the key factor of the social environment responsible for the gene-environment interaction. 5. To test whether limited food availability to winged queens associated with the high brood/worker ratios in polygynous colonies is the factor responsible for this interaction, similar split-colony experiments were performed. Elevated brood/worker ratios decreased the weight of winged queens but there was no evidence that this treatment intensified differential weight gains among queens with different Pgm-3 genotypes. Manipulation of the amount of food provided to colonies had no effect on queen weight. 6. The combined data indicate that cumulative pheromone level and brood/worker ratio are two of the factors responsible for the differences in reproductive phenotypes between monogynous and polygynous winged queens but that these factors are not directly responsible for inducing the phenotypic effects of Pgm-3 in polygynous colonies.

Characterization of MAP1B heavy chain interaction with actin.

Microtubule-associated protein 1B is an essential protein during brain development and neurite outgrowth and was studied by several assays to further characterize actin as a major interacting partner. Tubulin and actin co-immunoprecipitated with MAP1B at similar ratios throughout development. Their identity was identified by mass spectrometry and was confirmed by Western blots. In contrast to previous reports, the MAP1B-actin interaction was not dependent on the MAP1B phosphorylation state, since actin was precipitated from brain tissue throughout development at similar ratios and equal amounts were precipitated before and after dephosphorylation with alkaline phosphatase. MAP1B heavy chain was able to bind actin directly and therefore the N-terminal part of MAP1B heavy chain must also contain an actin-binding site. The binding force of this interaction was measured by atomic force microscopy and values were in the same range as those of MAP1B binding to tubulin or that measured in MAP1B self-aggregation. Aggregation was confirmed by negative staining and electron microscopy. Experiments including COS-7 cells, PC12 cells, cytochalasin D and immunocytochemistry with subsequent confocal laser microscopy, suggested that MAP1B may bind to actin but has no obvious microfilament stabilizing effect. We conclude, that the MAP1B heavy chain has a microtubule-stabilization effect, and contains an actin-binding site that may play a role in the crosslinking of actin and microtubules, a function that may be important in neurite elongation.