The proprotein convertase PC5/6 is protective against intestinal tumorigenesis: in vivo mouse model

BACKGROUND: The secretory basic amino acid-specific proprotein convertases (PCs) have often been associated with cancer/metastasis. By controlling the cleavage of cancer-associated proteins, PCs play key roles in multiple steps of cancer development. Most analyses of the implication of PCs in cancer/metastasis relied on the use of in vitro overexpression systems or inhibitors that can affect more than one PC. Aside from the role of furin in salivary gland tumorigenesis, no other in vivo genetic model of PC-knockout was reported in relation to cancer development. RESULTS: Since PC5/6 is highly expressed in the small intestine, the present study examined its in vivo role in intestinal tumorigenesis. Analysis of human intestinal tumors at various stages showed a systematic down-regulation of PC5/6 expression. Since gene inactivation of PC5/6 leads to lethality at birth, we generated mice lacking PC5/6 in enterocytes and analyzed the impact of the presence or absence of this PC in the mouse ApcMin/+ model that develops numerous adenocarcinomas along the intestinal tract. This resulted in viable mice with almost no expression of PC5/6 in small intestine, but with no overt phenotype. The data showed that by themselves ApcMin/+ tumors express lower levels of PC5/6 mRNA, and that the lack of PC5/6 in enterocytes results in a significantly higher tumor number in the duodenum, with a similar trend in other intestinal segments. Finally, the absence of PC5/6 is also associated with a premature mortality of ApcMin/+ mice. CONCLUSION: Overall, these data suggest that intestinal PC5/6 is protective towards tumorigenesis, especially in mouse duodenum, and possibly in human colon.

Rôle de CD47 dans l’induction de la tolérance in vivo

La tolérance orale permet la modulation de la réponse immunitaire à l’égard des antigènes exogènes présents dans la lumière intestinale. Essentiels à l’établissement d’une relation symbiotique entre le système immunitaire et la flore intestinale, l’induction et le maintien de la tolérance orale reposent sur différents mécanismes immunologiques. Parmi eux, l’induction de cellules T régulatrices par les cellules dendritiques et de mécanismes apoptotiques. Or, la glycoprotéine membranaire CD47 est impliquée, en périphérie, dans ces mécanismes. Cependant, le rôle de CD47 dans la tolérance orale n’est pas connu. À l’aide d’un modèle murin déficient en CD47, nous avons démontré principalement, que l’absence de CD47 est associée à une diminution de 50 % de la proportion de cellules dendrites myéloïdes CD11b+CD103- retrouvées dans les ganglions mésentériques. Suite au transfert adoptif de cellules T antigènes spécifiques dans nos différents modèles expérimentaux, on a, aussi, observé une diminution de 45 % de leur niveau d’activation dans les ganglions mésentériques. Malgré les effets observés, le CD47 n’est pas impliqué dans l’induction d’une réaction de tolérance orale secondaire à l’administration intragastrique de fortes doses d’ovalbumine. Cependant, nous avons démontré que CD47 est impliquée au niveau de la migration des cellules dendritiques de la peau et de certaines sous-populations retrouvées dans les ganglions mésentériques.

The in vivo characterization of the DNA repair gene apn-1 in the model organism Caenorhabditis elegans

Les sites apuriniques/apyrimidinique (AP) représentent une forme de dommage à l’ADN hautement mutagène et ce type de dommage peut survenir spontanément ou être induit par une variété d’agents. Afin de préserver la stabilité génomique, deux familles d’endonucléases de type AP, endo-IV et exo-III, sont nécessaires pour contrecarrer les effets mutagènes des sites AP. Malgré l’identification de membres des deux familles dans plusieurs organismes unicellulaire tels que E.coli et S. cerevisiae, aucun membre de la famille endo-IV n’a été identifié chez les organismes multicellulaires à l’exception de C. elegans et de C. briggsae. Nous avons donc décidé d’investiguer l’importance biologique de APN-1 chez C. elegans par l’utilisation d’une approche de knockdown du gène. Dans notre étude, nous avons montré que le knockdown du gène apn-1 chez C. elegans, en utilisant des ARN d’interférence (ARNi), cause une accumulation de mutations spontanées et induites par des drogues résultant en un délai de l’éclosion des œufs ainsi que par une diminution de la survie et de la longévité des vers adultes. De plus, nous avons montré que cette accumulation de mutations mène à un délai dans la progression du cycle cellulaire durant l’embryogénèse, représentant possiblement une explication du délai dans l’éclosion des œufs. Nous avons montré qu’il y avait une augmentation du niveau de mutations dans la gorge des vers, sans toutefois pouvoir confirmer la distribution de APN-1 qui possède une étiquette GFP. Les animaux transgéniques APN-1-GFP n’exprimaient pas suffisamment de la protéine de fusion pour permettre une visualisation à l’aide d’un microscope à fluorescence, mais la protéine a été détectée par immunobuvardage de type western. Les animaux transgéniques APN-1-GFP étaient instables et avaient des phénotypes concordants avec les défauts génétiques. En conclusion, il semble que C. elegans aie évolué afin de retenir un niveau de base de APN-1 jouant ainsi un rôle versatile afin de maintenir l’intégrité génétique d’autant plus que cet organisme semble manquer plusieurs enzymes de la voie de réparation par excision de base.

La PCSK9 humaine, une molécule aux multiples facettes métaboliques et une cible thérapeutique prometteuse : études de régulation in vitro et in vivo

La proprotéine convertase subtilisine/kexine-9 (PCSK9) a été identifiée comme le troisième locus impliqué dans l’hypercholestérolémie autosome dominante (ADH). Les deux autres gènes impliqués dans l’ADH encodent le récepteur des lipoprotéines de faible densité (LDLR) et l’apolipoprotéine B. La PCSK9 est une convertase qui favorise la dégradation du LDLR dans les hépatocytes et augmente le niveau plasmatique de cholestérol des LDL (LDL-C). Les mutations « gain de fonction » de la PCSK9 sont associées à un phénotype d’hypercholestérolémie familiale, tandis que les variantes « perte de fonction » sont associées à un LDL-C réduit et à un risque coronarien plus faible. Pour élucider le rôle physiologique de la PCSK9, nous avons étudié sa régulation génique. En utilisant le RT-PCR quantitatif dans des hépatocytes humains, nous avons analysé la régulation de PCSK9 sous différentes conditions modulant l’expression des gènes impliqués dans le métabolisme du cholestérol. Nous avons démontré que l’expression de la PCSK9 était induite par les statines de manière dose-dépendante et que cette induction était abolie par le mévalonate. De plus, le promoteur de PCSK9 contenait deux motifs conservés pour la régulation par le cholestérol : le sterol regulatory element (SRE) et un site Sp1. La PCSK9 circule dans le plasma sous des formes mature et clivée par la furine. Grâce à notre anticorps polyclonal, nous avons mis au point un test ELISA mesurant la PCSK9 plasmatique totale. Une étude transversale a évalué les concentrations plasmatiques de PCSK9 chez des sujets sains et hypercholestérolémiques, traités ou non par des statines ou une combinaison statine/ezetimibe. Chez 254 sujets sains, la valeur moyenne de PCSK9 (écart-type) était de 89,5 (31,9) µg/L. La concentration plasmatique de la PCSK9 corrélait avec celle de cholestérol total, du LDL-C, des triglycérides (TG), de la glycémie à jeun, l’âge et l’indice de masse corporelle. Le séquençage de PCSK9 chez des sujets aux extrêmes de la distribution des concentrations de PCSK9 de notre cohorte a révélé la présence d’une nouvelle variation « perte de fonction » : R434W. Chez 200 patients hypercholestérolémiques, la concentration de PCSK9 était plus élevée que chez les sujets sains (P<0,04). Elle a augmenté avec une dose croissante de statine (P<0,001), et a augmenté encore plus suite à l’ajout d’ezetimibe (P<0,001). Chez les patients traités, ceux présentant une hypercholestérolémie familiale (HF; due à une mutation du LDLR) avaient des concentrations plus élevées de PCSK9 que les non-HF (P<0,005), et la réduction de LDL-C corrélait positivement avec la concentration de PCSK9 atteinte de la même manière dans les deux sous-catégories (P<0,02 et P<0,005, respectivement). Par ailleurs, une incubation des cellules HepG2 (hépatocytes) et Caco-2 (entérocytes) avec de l’ezetimibe a provoqué une augmentation de l’ARNm de PCSK9 et de NPC1L1 de 1,5 à 2 fois (P<0,05), mais aucune variation significative de PCSK9 sécrétée n’a été observée, suggérant que ces lignées cellulaires ne sont pas un modèle idéal. Nous avons également mesuré le niveau de PCSK9 chez 1 739 Canadiens-français âgés de 9, 13 et 16 ans. La valeur moyenne (écart-type) de PCSK9 dans cette cohorte était de 84,7 (24,7) µg/L, légèrement plus basse que dans la cohorte d’adultes (89,5 (31,9) µg/L). Chez les garçons, la PCSK9 circulante diminuait avec l’âge, tandis que c’était l’inverse chez les filles. Il y avait des associations positives et significatives entre la PCSK9 et la glycémie à jeun, l’insulinémie, le HOMA-IR, et les paramètres lipidiques (TC, LDL-C, TG, HDL-C, apoAI et apoB). Dans l’analyse multivariée, une hausse de 10% de l’insulinémie à jeun était associée à une augmentation de 1 à 2% de PCSK9. La régulation de PCSK9 est typique de celle d’un gène impliqué dans le métabolisme des lipoprotéines et est probablement la cible du facteur de transcription «sterol regulatory element-binding protein » (SREBP-2). La concentration plasmatique de la PCSK9 est associée avec l’âge, le sexe, et de multiples marqueurs métaboliques chez les enfants et les adultes. La détection de la PCSK9 circulante chez les sujets HF et non-HF signifie que ce test ELISA spécifique à PCSK9 pourrait servir à suivre la réponse à la thérapie chez un grand éventail de sujets. PCSK9 semble être une cible thérapeutique prometteuse dans le traitement de l’hypercholestérolémie et de la maladie cardiovasculaire.

The proprotein convertase PC5/6 is protective against intestinal tumorigenesis: In vivo mouse model

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Validation des effets antidiabétiques de Rhododendron groenlandicum, une plante médicinale des Cri de la Baie James, dans le modèle in vitro et in vivo : élucidation des mécanismes d’action et identification des composés actifs

Le diabète est un syndrome métabolique caractérisé par une hyperglycémie chronique due à un défaut de sécrétion de l’insuline, de l’action de l’insuline (sensibilité), ou une combinaison des deux. Plus d'un million de canadiens vivent actuellement avec le diabète. La prévalence de cette maladie est au moins trois fois plus élevée chez les autochtones que dans la population canadienne en général. Notre équipe vise à étudier les effets potentiellement antidiabétiques de certaines plantes médicinales utilisées par les Cris d'Eeyou Istchee (Baie James, Québec) où l’adhérence aux traitements médicamenteux est faible, en partie à cause de la déconnection culturelle de ces derniers. Grâce à une approche ethnobotanique, notre équipe a identifié 17 plantes médicinales utilisées par cette population pour traiter des symptômes du diabète. Parmi ces plantes, l’extrait éthanolique de Rhododendron groenlandicum (Thé du Labrador) a montré un fort potentiel antidiabétique chez plusieurs lignées cellulaires, notamment les adipocytes (3T3-L1). Cette plante induit la différenciation adipocytaire probablement par l’activation du peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR γ). Cette stimulation améliore la résistance à l’insuline et constitue un mécanisme privilégié pour une classe de médicaments antidiabétiques, les thiazolidinediones. Le but de la présente étude est de valider l’efficacité et l’innocuité de R. groenlandicum in vivo, dans un modèle animal de résistance à l’insuline, d’élucider les mécanismes par lesquels cet extrait exerce ses effets antidiabétiques et d’identifier les principes actifs responsables de son activité. L'isolation et l'identification des constituants actifs ont été réalisées à l’aide d'une approche de fractionnement guidé par bioessai; en l'occurrence, l'adipogénèse. Cette approche, réalisée dans la lignée adipocytaire 3T3-L1, a pour but de mesurer leur teneur en triglycérides. Des études in vivo ont été réalisées sur le modèle de souris DIO (diet induced obesity). L'extrait éthanolique du R. groenlandicum a été incorporé à la nourriture grasse (35% d’apport calorique lipidique) à trois doses différentes (125, 250 et 500 mg / kg) sur une période de 8 semaines. Des tissus cibles de l’insuline (foie, muscle squelettique et tissus adipeux) ont été récoltés afin de faire des analyses d’immunobuvardage de type western. La quercétine, la catéchine et l’épicatéchine ont été identifiées comme étant les composés actifs responsables de l'effet antidiabétique du R. groenlandicum. Seules la catéchine et l’épicatéchine activent l’adipogénèse uniquement à forte concentration (125-150 M), tandis que la quercétine l’inhibe. L’étude in vivo a montré que le traitement avec R. groenlandicum chez les souris DIO réduit le gain de poids de 6%, diminue l'hyperglycémie de 13% et l’insulinémie plasmatique de 65% et prévient l’apparition des stéatoses hépatiques (diminution de 42% de triglycéride dans le foie) sans être toxique. Les analyses d’immunobuvardage ont montré que R. groenlandicum stimule la voie de l’insuline via la phosphorylation de l’Akt et a augmenté le contenu protéique en Glut 4 dans les muscles des souris traitées. Par contre, dans le foie, le R. groenlandicum passerait par deux voies différentes, soit la voie insulino-dépendante par l’activation de l’AKT, soit la voie insulino-indépendante par la stimulation de l’AMPK. L’amélioration observée des stéatoses hépatiques chez les souris DIO traitées, a été confirmée par une baisse du facteur de transcription, SREBP-1, impliqué dans la lipogénèse de novo, ainsi qu’une diminution de l’inflammation hépatique (diminution de l’activité d’IKK α/β). En conclusion, l’ensemble de ces résultats soutiennent le potentiel thérapeutique de Rhododendron groenlandicum et de ses composants actifs dans le traitement et la prévention du diabète de type 2. Nous avons validé l'innocuité et l'efficacité de cette plante issue de la médecine traditionnelle Cri, qui pourrait être un traitement alternatif du diabète de type 2 dans une population ayant une faible adhérence au traitement pharmacologique existant.

Inhibition de la réception des signaux de danger via les TLR TRIF-dépendants dans les cellules dendritiques myéloïdes infectées avec le virus de l'hépatice C in vivo : mécanisme d'évasion de l'immunité innée dans l'infection chronique

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Études in vitro et in vivo évaluant le rôle du métabolisme des médicaments par les CYP450s comme facteurs de variabilité interindividuelle dans la réponse aux médicaments

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Évaluation de l'efficacité d'inhibiteurs de la cyclooxygénase dans le traitement de tumeurs mammaires canines in vivo

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

In vitro and in vivo virulence evaluation of the new genotype of porcine circovirus type 2 and identification of a new cell line permissive to virus replication

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Validation in-vivo des techniques d’élastographie ultrasonore, invasive et non-invasive, à l’aide d’un modèle porcin

Il est maintenant admis que la composition de la plaque athérosclérotique est un déterminant majeur de sa vulnérabilité à se rompre. Vu que la composition de la plaque affecte ses propriétés mécaniques, l'évaluation locale des propriétés mécaniques de la plaque d'athérome peut nous informer sur sa vulnérabilité. L'objectif est de comparer les techniques d’élastographie ultrasonores endovasculaire (EVE) et non-invasive (NIVE) en fonction de leur potentiel à identifier les composantes calcifiées et lipidiques de la plaque. Les acquisitions intravasculaire et extravasculaire ont été effectuées sur les artères carotidiennes de neuf porcs hypercholestérolémiques à l’aide d’un cathéter de 20 MHz et d'une sonde linéaire de 7.5 MHz, respectivement. Les valeurs de déformation radiale et axiale, rapportés par EVE et NIVE, ont été corrélées avec le pourcentage des zones histologiques calcifiées et lipidiques pour cinq plaques. Nos résultats démontrent une bonne corrélation positive entre les déformations et les composantes calcifiées (r2 = 0.82, P = 0.034 valeur par EVE et r2 = 0.80, P = 0.041 valeur par NIVE). Une forte corrélation entre les déformations axiales et les contenus lipidiques par NIVE (r2 = 0.92, P-value = 0.010) a été obtenue. En conclusion, NIVE et EVE sont des techniques potentielles pour identifier les composants de la plaque et aider les médecins à diagnostiquer précocement les plaques vulnérables.

In vivo phosphorus spectroscopy in human subjects on a clinical 3T MRI system

Alors que l’Imagerie par résonance magnétique (IRM) permet d’obtenir un large éventail de données anatomiques et fonctionnelles, les scanneurs cliniques sont généralement restreints à l’utilisation du proton pour leurs images et leurs applications spectroscopiques. Le phosphore jouant un rôle prépondérant dans le métabolisme énergétique, l’utilisation de cet atome en spectroscopie RM présente un énorme avantage dans l’observation du corps humain. Cela représente un certain nombre de déEis techniques à relever dus à la faible concentration de phosphore et sa fréquence de résonance différente. L’objectif de ce projet a été de développer la capacité à réaliser des expériences de spectroscopie phosphore sur un scanneur IRM clinique de 3 Tesla. Nous présentons ici les différentes étapes nécessaires à la conception et la validation d’une antenne IRM syntonisée à la fréquence du phosphore. Nous présentons aussi l’information relative à réalisation de fantômes utilisés dans les tests de validation et la calibration. Finalement, nous présentons les résultats préliminaires d’acquisitions spectroscopiques sur un muscle humain permettant d’identiEier les différents métabolites phosphorylés à haute énergie. Ces résultats s’inscrivent dans un projet de plus grande envergure où les impacts des changements du métabolisme énergétique sont étudiés en relation avec l’âge et les pathologies.

Étude de la dynamique des interactions des constituants du complexe de biosynthèse et d’insertion de la sélénocystéine dans la traduction des sélénoprotéines in vivo

Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche.

Étude sur les fonctions in vivo des GEFs DOCK chez les mammifères

Dock1 (aussi nommé Dock180) est le membre prototypique de la famille Dock d’activateurs des petites GTPases de la famille Rho. Dock1 agit au sein d’une voie de signalisation conservée au cours de l’évolution et des études génétiques ont démontré que les orthologues de Dock1, myoblast city (mbc) chez la drosophile et Ced-5 chez le nématode, activent Rac dans divers processus biologiques. Notamment, mbc est un important régulateur de la fusion des myoblastes lors de la formation des fibres musculaires de drosophile. Mbc est aussi essentiel à la migration collective d’un groupe de cellules, appelées cellules de bordures, lors de leur migration dans la chambre de l’oeuf suite à l’activation de récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK). La migration collective des cellules de bordures récapitule certains des événements observés lorsque des cellules tumorales envahissent le tissu environnant lors de la formation de métastases. Chez les mammifères, des études réalisées en lignées cellulaires suggèrent que Dock1 est aussi un régulateur du cytosquelette lors de la migration cellulaire. De plus, certaines études ont démontré que la voie Dock1/Rac agit en aval de RTKs lors de l’invasion de cellules de glioblastome. Néanmoins, les fonctions in vivo de Dock1 chez les mammifères demeurent méconnues et le but de cette thèse est d’identifier et de caractériser certaines de ses fonctions. Guidés par la fonction de mbc, nous démontrons dans l’objectif no 1 un rôle essentiel pour ce gène au cours du développement embryonnaire grâce à la caractérisation d’une souris Dock1 knock-out. Des défauts sévères de fusion des myoblastes sont observés en absence de l’expression de Dock1 et ils contribuent à la réduction de la masse musculaire des souris mutantes. De plus, nous avons constaté une contribution du gène Dock5, un membre de la famille Dock proche de Dock1, au développement des fibres musculaires. Dans l’objectif no 2, nous avons observé que des hauts niveaux d’expression de DOCK1 corrèlent avec un mauvais pronostic chez les patientes atteintes de cancer du sein possédant une forte expression du gène codant pour le RTK HER2. Une surexpression ou une amplification du locus codant pour le récepteur HER2 est associée à près de 20% des cas de cancer du sein. Les cancers de ces patientes développent fréquemment des métastases et sont associés à un mauvais pronostic. Des études biochimiques ont révélé que DOCK1 interagit avec le récepteur HER2 dans des cellules de cancer du sein. De plus, DOCK1 est essentiel à l’activation de RAC et à la migration cellulaire induite par HER2 dans ces cellules. L’utilisation d’un modèle de cancer du sein médié par HER2 chez la souris combiné avec l’inactivation du gène Dock1 dans les glandes mammaires, nous a permis d’identifier Dock1 et Rac comme de nouveaux effecteurs de la croissance tumorale et de la formation de métastases régulées par l’oncogène HER2. Nous concluons que l’utilisation de différents modèles de souris knock-out pour le gène Dock1 nous a permis d’identifier des fonctions clés de ce gène. Tout comme son orthologue mbc, Dock1 joue un rôle important lors du développement embryonnaire en régulant notamment la fusion des myoblastes. Nos études ont également contribué à démontrer un important degré de conservation des mécanismes moléculaires de fusion entre les espèces. De plus, DOCK1 agit en aval du RTK HER2 et son expression dans les cellules épithéliales de glandes mammaires contribue au développement tumoral et à la formation de métastases induits par cet oncogène.

High-amylose carboxymethyl starch matrices for oral sustained drug-release : in vitro and in vivo evaluation

Les amidons non modifiées et modifiés représentent un groupe d’excipients biodégradables et abondants particulièrement intéressant. Ils ont été largement utilisés en tant qu’excipients à des fins diverses dans des formulations de comprimés, tels que liants et/ou agents de délitement. Le carboxyméthylamidon sodique à haute teneur en amylose atomisé (SD HASCA) a été récemment proposé comme un excipient hydrophile à libération prolongée innovant dans les formes posologiques orales solides. Le carboxyméthylamidon sodique à haute teneur en amylose amorphe (HASCA) a d'abord été produit par l'éthérification de l'amidon de maïs à haute teneur en amylose avec le chloroacétate. HASCA a été par la suite séché par atomisation pour obtenir le SD HASCA. Ce nouvel excipient a montré des propriétés présentant certains avantages dans la production de formes galéniques à libération prolongée. Les comprimés matriciels produits à partir de SD HASCA sont peu coûteux, simples à formuler et faciles à produire par compression directe. Le principal objectif de cette recherche était de poursuivre le développement et l'optimisation des comprimés matriciels utilisant SD HASCA comme excipient pour des formulations orales à libération prolongée. A cet effet, des tests de dissolution simulant les conditions physiologiques du tractus gastro-intestinal les plus pertinentes, en tenant compte de la nature du polymère à l’étude, ont été utilisés pour évaluer les caractéristiques à libération prolongée et démontrer la performance des formulations SD HASCA. Une étude clinique exploratoire a également été réalisée pour évaluer les propriétés de libération prolongée de cette nouvelle forme galénique dans le tractus gastro-intestinal. Le premier article présenté dans cette thèse a évalué les propriétés de libération prolongée et l'intégrité physique de formulations contenant un mélange comprimé de principe actif, de chlorure de sodium et de SD HASCA, dans des milieux de dissolution biologiquement pertinentes. L'influence de différentes valeurs de pH acide et de temps de séjour dans le milieu acide a été étudiée. Le profil de libération prolongée du principe actif à partir d'une formulation de SD HASCA optimisée n'a pas été significativement affecté ni par la valeur de pH acide ni par le temps de séjour dans le milieu acide. Ces résultats suggèrent une influence limitée de la variabilité intra et interindividuelle du pH gastrique sur la cinétique de libération à partir de matrices de SD HASCA. De plus, la formulation optimisée a gardé son intégrité pendant toute la durée des tests de dissolution. L’étude in vivo exploratoire a démontré une absorption prolongée du principe actif après administration orale des comprimés matriciels de SD HASCA et a montré que les comprimés ne se sont pas désintégrés en passant par l'estomac et qu’ils ont résisté à l’hydrolyse par les α-amylases dans l'intestin. Le deuxième article présente le développement de comprimés SD HASCA pour une administration orale une fois par jour et deux fois par jour contenant du chlorhydrate de tramadol (100 mg et 200 mg). Ces formulations à libération prolongée ont présenté des valeurs de dureté élevées sans nécessiter l'ajout de liants, ce qui facilite la production et la manipulation des comprimés au niveau industriel. La force de compression appliquée pour produire les comprimés n'a pas d'incidence significative sur les profils de libération du principe actif. Le temps de libération totale à partir de comprimés SD HASCA a augmenté de manière significative avec le poids du comprimé et peut, de ce fait, être utilisé pour moduler le temps de libération à partir de ces formulations. Lorsque les comprimés ont été exposés à un gradient de pH et à un milieu à 40% d'éthanol, un gel très rigide s’est formé progressivement sur leur surface amenant à la libération prolongée du principe actif. Ces propriétés ont indiqué que SD HASCA est un excipient robuste pour la production de formes galéniques orales à libération prolongée, pouvant réduire la probabilité d’une libération massive de principe actif et, en conséquence, des effets secondaires, même dans le cas de co-administration avec une forte dose d'alcool. Le troisième article a étudié l'effet de α-amylase sur la libération de principe actif à partir de comprimés SD HASCA contenant de l’acétaminophène et du chlorhydrate de tramadol qui ont été développés dans les premières étapes de cette recherche (Acetaminophen SR et Tramadol SR). La modélisation mathématique a montré qu'une augmentation de la concentration d’α-amylase a entraîné une augmentation de l'érosion de polymère par rapport à la diffusion de principe actif comme étant le principal mécanisme contrôlant la libération de principe actif, pour les deux formulations et les deux temps de résidence en milieu acide. Cependant, même si le mécanisme de libération peut être affecté, des concentrations d’α-amylase allant de 0 UI/L à 20000 UI/L n'ont pas eu d'incidence significative sur les profils de libération prolongée à partir de comprimés SD HASCA, indépendamment de la durée de séjour en milieu acide, le principe actif utilisé, la teneur en polymère et la différente composition de chaque formulation. Le travail présenté dans cette thèse démontre clairement l'utilité de SD HASCA en tant qu'un excipient à libération prolongée efficace.