Subcellular localization of the coat protein in tobacco cells infected by cucumber mosaic virus isolated from Catharanthus roseus

Electron microscopy and immunolabelling with antiserum specific to cucumber mosaic virus coat protein were used to examine tobacco leaf cells infected by cucumber mosaic virus isolated from Catharanthus roseus (CMV-Cr). Crystalline and amorphous inclusions in the vacuoles were the most obvious cytological modifications seen. Immunogold labelling indicated that the crystalline inclusion was made up of virus particles and amorphous inclusions contained coat protein. Rows of CMV-Cr particles were found between membranes of dictyosomes, but membranous bodies and tonoplast-associated vesicles were not evident. Virus particles and/or free coat protein were easily detected in the cytoplasm by immunolabelling. No gold labelling was found within nuclei, chloroplasts and mitochondria.

Evidence supporting the recognition of Cole latent virus as a distinct carlavirus

Some molecular properties are described of Cole latent virus (CoLV), hitherto designated a tentative species of the Carlavirus genus. CoLV genomic RNA (Ribonucleic acid) of 8.3 Kb is polyadenylated. Two unencapsidated polyadenylated subgenomic RNAs (2.6 and 1.3 Kb) and three double-stranded RNAs (dsRNAs) (8.3, 2.6 and 1.3 Kbp), which are twice the size of the genomic and subgenomics ssRNAs, are produced in CoLV-infected plants, two additional dsRNAs (7.2 and 6.3 Kbp) were also detected plant extracts. By using a Carlavirus specific primer and a CoLV cDNA, a-3'-terminus fragment of 116 bp was amplified; it had homology with the carlaviruses Potato virus M (62%)., Hop latent virus (37%) and Blueberry scorch virus (36%) but no significant homology with 11 other carlaviruses. These results support the classification of CoLV as a distinct species of the Carlavirus genus.

Limited movement of Cucumber mosaic virus (CMV) in yellow passion flower in Brazil

Symptoms of Cucumber mosaic virus (CMV) on yellow passion flower (Passiflora edulis f. flavicarpa) are characterized by bright yellow mottling on leaves, starting at random points on the vine and diminishing in intensity towards the tip, which becomes symptomless as it grows. To determine whether symptomless portions of vines are CMV-free or represent latent infection, leaves with and without symptoms were collected from infected vines in the field. Biological, serological (plate-trapped antigen enzyme-linked immunosorbent assay, PTA-ELISA), Western blot and dot-blot hybridization assays showed that portions of the vines without symptoms were CMV-free. Vegetatively propagated vines with symptoms showed remission of symptoms on newly developed leaves. One year later, no CMV was detected in the upper leaves of these plants. Mechanically inoculated passion flower seedlings behaved similarly; symptoms were shown by few leaves after inoculation. Afterwards, plants became symptomless and CMV was not detected in the upper leaves or root system, 40 or 85 days after inoculation. The mechanism responsible for remission of symptoms accompanied by CMV disappearance is not known.

Caracterização da região 3'-terminal do genoma de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus

O presente trabalho caracteriza a região 3'-terminal do genoma de um isolado do Southern bean mosaic virus encontrado no Estado de São Paulo (SBMV-SP). O RNA foi extraído de partículas virais purificadas e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar 972 nt da região 3'-terminal do RNA viral. Foi obtido fragmento de tamanho esperado que inclui o gene da proteína capsidial e a região 3'-terminal não codificadora. O gene da proteína capsidial (ORF4) contém 801 nucleotídeos, incluindo-se o códon de terminação UGA, com seqüência deduzida de 266 aminoácidos e massa molecular estimada de 28.800 Da. Sessenta e um aminoácidos terminais da ORF2 estão sobrepostos na ORF4. O sinal de localização nuclear, encontrado dentro do Domínio R na região 5'-terminal da ORF4 de alguns sobemovírus, não foi identificado no SBMV-SP. Esse dado pode explicar a ausência de partículas virais do SBMV-SP no núcleo celular. A seqüência do SBMV-SP apresentou identidade de nucleotídeos e aminoácidos de, respectivamente, 91% e 93% com o isolado Arkansas (SBMV-ARK) descrito nos EUA. Os resultados obtidos indicam que o SBMV-SP e o SBMV-ARK são isolados muito proximamente relacionados.

A degenerate primer allows amplification of part of the 3 '-terminus of three distinct carlavirus species

Sequences of the coat protein amino acids of definitive and tentative species of carlaviruses deposited in GenBank were aligned and a region of seven amino acids (GLGVPTE) was found to be conserved. The corresponding nucleotides were aligned, allowing the design of a degenerate primer that together with an oligo dT anti-sense primer, was effective for the detection of three distinct carlavirus species, two transmitted by aphids and one by whitefly. These primers have the advantage that about 940 nt from the 3'-terminus, comprising part of the CP gene (about 60%), the 11 K gene, and the terminal untranslated region can be amplified for sequencing. The fact that this amino acid sequence is conserved in almost all of the sequenced carlaviruses, allows the prediction that this primer pair will be useful as a diagnostic tool for carlavirus species. (C) 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Identification and characterization of a potyvirus isolated from siratro plants

The present work describes the identification and characterization of a potyvirus isolated from siratro (Macroptilium atropurpureum Urb.) in the north-west region of the State of Sdo Paulo, Brazil. The virus was transmitted by mechanical inoculation. Its host range was restricted mainly to members of the Fabaceae. A cDNA fragment of about 930 bp was amplified by RT/PCR, cloned and sequenced. The fragment, which included the coat protein gene, had amino acid identity percentages between 88 and 98% with isolates of Bean common mosaic virus (BCMV). Phylogenetic analysis grouped the. siratro potyvirus and BCMV isolates in 99% of the replicates, including Azuki mosaic virus, Dendrobium mosaic virus, Blackeye cowpea mosaic virus and Peanut stripe virus, which have been classified as BCMV strains. This is the first citation on the presence of BCMV in siratro plants in Brazil.

Completion of the Nucleotide Sequence of a Brazilian Isolate of Southern bean mosaic virus

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Detection and partial characterization of a carlavirus causing stem necrosis of soybean in Brazil

No ano agrícola de 2000/2001, ocorreu um surto de nanismo e necrose da haste em soja (Glycine max) plantada em duas áreas do Brasil Central e na safra seguinte, esta anomalia foi constatada em outras regiões produtoras, mesmo distantes mais de 2.000 km de onde fora inicialmente constatada. Estudos envolvendo ensaios de transmissão (enxertia, mecânica e insetos vetores), microscopia eletrônica, purificação, sorologia e ensaios moleculares indicaram que a enfermidade foi causada por um carlavirus transmitido por mosca branca, possivelmente relacionado ao Cowpea mild mottle virus (CpMMV).

Detecção do Southern bean mosaic virus no Paraná, e separação do Bean rugose mosaic virus em feijoeiro

Em lavouras de feijoeiro (Phaseolus vulgaris) da cultivar Carioca Comum, no município de Londrina, Estado do Paraná, foram encontradas plantas com sintomas de necrose da haste, mosaico clorótico leve e porte reduzido, semelhantes aos sintomas causados por infecção viral. Exames de microscopia eletrônica revelaram a presença de partículas isométricas. em testes de imunodifusão dupla em gel de ágar os extratos foliares de plantas infetadas reagiram positivamente com anti-soro específico para o Southern bean mosaic virus (SBMV). O vírus foi purificado e a massa molecular de sua proteína capsidial foi estimada em 30 kDa, valor esperado para proteínas do capsídeo de vírus do gênero Sobemovirus. A gama de hospedeiras do SBMV isolado no Paraná foi restrita ao feijoeiro e a algumas cultivares de soja (Glycine max). A separação de dois vírus isométricos comuns em infecções mistas no feijoeiro foi possível através da reação de imunidade ao SBMV apresentada por Crotalaria sp, Chenopodium quinoa e Mucuna deeringiana, e da reação de susceptibilidade dessas mesmas hospedeiras ao Bean rugose mosaic virus (BRMV).

Propriedades moleculares de um isolado brasileiro do Southern bean mosaic virus

Um isolado do Southern bean mosaic virus (SBMV), gênero Sobemovirus, encontrado em feijoeiro (Phaseolus vulgaris) no Estado de São Paulo, foi purificado e algumas de suas propriedades moleculares determinadas. As partículas virais apresentam diâmetro de 28-30 nm e proteína capsidial com massa molecular estimada em 30 kDa. Das partículas virais foi extraído RNA de vários tamanhos (4,2 Kb, 3,1 Kb, 2,65 Kb, 2,15 Kb, 1,64 Kb, 1,36 Kb e 1,0 Kb) sendo aquele de 4,2 Kb o RNA genômico e o de 1,0 Kb supostamente um subgenômico que codifica para a proteína capsidial. Ácidos ribonucleicos de mesmo tamanho foram também detectados in vivo, indicando estar associados à replicação viral. Na análise do RNA de fita dupla (dsRNA), somente duas espécies foram detectadas (4,2 Kpb e 1,0 Kpb) correspondendo às formas replicativas do RNA genômico e do subgenômico para proteína capsidial. Os resultados indicam que somente estes dois RNA são replicados por meio de formas replicativas (RFs), enquanto os demais devem ser formados talvez por iniciação interna da fita negativa do RNA genômico. O SBMV-B SP apresentou propriedades moleculares análogas àquelas do SBMV descrito na América do Norte.

Coat protein and RNAs of Cole latent virus are not present within chloroplasts of Chenopodium quinoa-infected cells

O vírus latente da couve (Cole latent virus, CoLV), gênero Carlavirus, foi estudado, por microscopia eletrônica de transmissão e técnicas bioquímicas, em relação à ultra-estrutura das células infetadas de Chenopodium quinoa, e de sua associação com os cloroplastos. O CoLV foi observado como partículas dispersas pelo citoplasma entremeadas com vesículas membranosas e ribossomos e/ou como densas massas de partículas. Estes partículas reagiram por imunomarcação com anti-soro policlonal para o CoLV. Morfologicamente, cloroplastos, mitocôndrias e núcleos mostraram-se inalterados e partículas virais não foram encontradas dentro dessas organelas. Entretanto, agregados de partículas virais foram freqüentemente vistos em associação com a membrana externa dos cloroplastos e ocasionalmente com peroxissomos. Cloroplastos foram purificados em gradiente de Percoll e as proteínas e os RNA foram extraídos e analisados, respectivamente, por Western blot e Northern blot. Proteína capsidial e RNA associados ao CoLV não foram detectados nessa organela. Os resultados aqui obtidos indicam que a associação CoLV/cloroplastos, observada nos estudos de microscopia eletrônica, é possivelmente um evento casual dentro da célula hospedeira e que o vírus não se multiplica dentro dessa organela.

Identificação e caracterização de um potyvírus isolado de Zinnia elegans

O presente trabalho teve como objetivo a identificação e caracterização de um potyvírus isolado de Zinnia elegans, na Região Noroeste do Estado de São Paulo. O potyvírus foi transmitido por inoculação mecânica e apresentou uma gama restrita de hospedeiras sendo que as espécies mais afetadas pertencem à família Asteraceae. em SDS-PAGE, a massa molecular da proteína capsidial (CP) foi estimada em 33 kDa e, em Western-blot, reagiu com anti-soro para o Bidens mosaic virus (BiMV). Um fragmento de aproximadamente 820 pb foi amplificado por RT/PCR, clonado e seqüenciado. O fragmento, que inclui o gene da proteína capsidial, mostrou similaridade de aminoácidos do core da CP variando de 55% (Tobacco vein mottling virus, TVMV) a 95% (Sunflower chlorotic mottle virus, SuCMoV) e da CP completa de 55% (TVMV) a 91% (SuCMoV). Na região N-terminal, o potyvírus de Zinnia tem uma deleção de quatro aminoácidos (posições 9 a 12 após o sítio de clivagem entre a proteína NIb e a CP) quando comparada com a seqüência do SuCMoV. A análise filogenética agrupou o potyvírus de Zinnia e o SuCMoV em um mesmo ramo em 100% das réplicas, mostrando uma relação de parentesco muito próxima entre esses dois vírus. Os resultados obtidos no presente trabalho demonstraram que o potyvírus de Zinnia e o SuCMoV são estirpes do mesmo vírus. Sugere-se o nome Sunflower chlorotic mottle virus, isolado Zinnia (SuCMoV-Zi), ao potyvírus encontrado em Z. elegans no Brasil.

Caracterização do gene da proteína capsidial do Grapevine virus A em videiras afetadas pela acanaladura do lenho de Kober no Estado de São Paulo

O presente trabalho caracteriza o gene codificador da proteína capsidial do isolado do Grapevine virus A (GVA) encontrado no Estado de São Paulo (GVA-SP). RNA total foi extraído de folhas e pecíolos de plantas de videira (Vitis spp.) da variedade 'Kober 5BB' e submetido a RT-PCR usando oligonucleotídeos desenhados para amplificar um fragmento entre as posições 6409 e 7175 do RNA do GVA (GenBank, acesso X75433). Foi obtido um fragmento de tamanho esperado (767 nt) que inclui o gene da proteína capsidial, codificando 198 aminoácidos. A seqüência do GVA-SP apresentou similaridade de nucleotídeos e aminoácidos de, respectivamente, 86-92,3% e 94,5-98% com isolados do GVA da Europa, África e Japão (Acessos X75433, AF441234, AF007415, AB039841) e da região Sul do Brasil (Acesso AF494187), sendo, entretanto, mais similar aos isolados africano e italiano.

Detecção do Grapevine virus A e Grapevine virus B por hibridização dot-blot com sondas moleculares não radioativas

O vírus A da videira (Grapevine virus A, GVA) e o vírus B da videira (Grapevirus virus B, GVB) estão associados à acanaladura do lenho de Kober (Kober stem grooving) e ao fendilhamento cortical da videira (grapevine corky bark), respectivamente. Este trabalho descreve o uso de sondas moleculares de cDNA na detecção de isolados do GVA (GVA-SP) e do GVB (GVB-C-SP e GVB-I-SP) em videiras (Vitis spp.) e fumo (Nicotiana occidentalis). As sondas marcadas com digoxigenina foram produzidas por RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos para os genes da proteína capsidial. Os RNA totais foram extraídos de 45 plantas de diversas variedades de videira e de 13 plantas de fumo inoculadas mecanicamente com o GVB. Os RNA extraídos das plantas infetadas, indexadas biologicamente, hibridizaram com as sondas, não se verificando reação com plantas sadias. Para confirmar os resultados de hibridização, foram também feitos testes de RT-PCR. A utilização de hibridização dot-blot com sondas de cDNA mostrou-se eficaz na detecção dos vírus com especificidade e sensibilidade, ressaltando-se que, preferencialmente, folhas maduras e ramos dormentes devem ser utilizados nos testes diagnósticos para o GVB e GVA, respectivamente.