Contribuição para o estudo da prevalência de Dirofilariose Felina na Sub-Região do Baixo Vouga

A Dirofilariose é uma doença parasitária, provocada por um nemátode, Dirofilaria immitis que, não obstante ser considerada rotineiramente como diagnóstico diferencial em canídeos, é bastante subdiagnosticada em felinos. Nestes, a infecção caracteriza-se por uma baixa carga parasitária e microfilarémia rara ou transitória, tornando o diagnóstico num desafio clínico, não só pela sintomatologia inespecífica, como pelas limitações dos meios de diagnóstico. Por exemplo, em Portugal ainda não é comercializado o teste de detecção de anticorpos contra D. immitis. O objectivo deste estudo foi estimar a prevalência de D. immitis em felinos por pesquisa de antigénios, na sub-região do Baixo Vouga, recorrendo ao teste SNAP® Feline Triple® Test (Idexx). Para o efeito foi colhida uma amostra de setenta e dois gatos, sintomáticos e assintomáticos. Esta zona possui uma prevalência de Dirofilariose em cães assintomáticos de 9,3%. Nenhum dos animais testados apresentou microfilarémia no teste de gota fresca. A detecção sérica de antigénios de D. immitis foi de 1,4%, resultado que poderá alertar a comunidade veterinária para o risco de gatos manifestarem esta doença, bem como o dever de implementar uma correcta profilaxia, sobretudo por se tratar de uma doença severa e mortal para os felídeos e pelos riscos que representa para a Saúde Pública, uma vez que se trata de uma zoonose.

Desenvolvimento e validação de um método analítico para a determinação de clorpromazina em sangue por extracção em fase sólida e cromatografia gasosa/espectometria de massa

O objectivo deste trabalho foi o desenvolvimento e validação de uma metodologia analítica para a determinação de clorpromazina em sangue total, tendo a protriptilina sido usada como padrão interno. A extracção e purificação dos analitos foi efectuada por extracção em fase sólida com colunas Oasis® HLB, e análise posterior por cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massa de impacto electrónico (GC/EI-MS). Para a preparação das curvas de calibração foram fortificadas diariamente amostras de sangue branco com concentrações crescentes de clorpromazina entre 0,01 e 5 µg/mL. Foi utilizado um modelo de regressão linear, sendo os coeficientes de correlação superiores a 0,998. Os coeficientes de variação e os erros relativos foram respectivamente inferiores a 12 e 13%, cumprindo assim critérios internacionalmente aceites para a validação de métodos bioanalíticos. Foram também estudados os limites de detecção e quantificação, sendo de 3 e 10 ng/mL respectivamente. A interferência de outras substâncias foi excluída por análise de dez amostras brancas de sangue. O rendimento médio do método foi de 81%. Em virtude da sua simplicidade e rapidez, este método pode ser aplicado na determinação deste antipsicótico em amostras de sangue total, sendo adequado para análises de rotina no âmbito da toxicologia clínica e forense.

O potencial da PCR em tempo real no diagnóstico da infecção por helicobacter pylori

H. pylori é um microrganismo responsável por gastrites e implicado, em associação com outros factores, na úlcera gastroduodenal e no cancro gástrico. O diagnóstico da infecção por microrganismo pode realizar-se recorrendo a métodos invasivos através da obtenção de uma biópsia gástrica obtida por endoscopia digestiva alta e a métodos não invasivos. Nenhum dos métodos, desenvolvido até hoje, constitui o método ideal. Todos eles possuem as suas vantagens e desvantagens consoante a situação em que são aplicados. A reacção de polimerização em cadeia (PCR) conduziu a uma modificação fundamental no campo da biologia molecular, abrindo novos horizontes nas ciências médicas e biológicas. Apesar da cultura de H. pylori a partir de biópsia gástrica continuar a ser o método de referência para o diagnóstico da infecção por esta bactéria, ela apresenta inconvenientes que podem ser ultrapassados pela utilização da PCR, como sejam o longo período para a obtenção de resultados e o respeito de condições estritas de transporte da biópsia gástrica. Recentemente foi desenvolvido um protocolo baseado no principio da PCR em tempo real, utilizando o aparelho LightCycler Roche Diagnostics. Este protocolo permite a obtenção de um resultado de detecção da presença de H. pylori na biópsia gástrica assim como do seu perfil de susceptibilidade aos macrólidos. A PCR em tempo real é dotada de uma grande sensibilidade e especificidade, rapidez de obtenção de resultados o que aliado à sua capacidade de detecção de mutações responsáveis pela resistência dos microrganismos aos antibióticos faz com que esta técnica seja a metodologia do futuro no diagnóstico das doenças infecciosas.

Actividade de acetilcolinesterase em esponjas marinhas da costa portuguesa

As esponjas marinhas são organismos ubíquos possuindo muitas características que lhes conferem um elevado potencial como organismos bioindicadores. Dado que se reveste de enorme importância e premência o estabelecimento de um grande número de organismos que possam actuar como bioindicadores de exposição a poluentes, neste trabalho investigamos a presença do biomarcador acetilcolenesterase nas esponjas marinhas Spongia officianalis e Spongia agaricina. Os exemplos foram recolhidos em locais pré-seleccionados ao longo da costa oeste portuguesa em locais considerados não sujeitos a poluição. Escolheram-se também alguns pontos de amostragem onde pode ocorrer alguma actividade antropogénica. Para o estudo foi usado um método padrão de detecção da actividade de acetilcolinesterase - a produção do ião 5-tio-2-nitrobenzoato. Estabeleceu-se a presença de acetilcolinesterase nestas espécies e validou-se o método em termos de repetibilidade e reprodutibilidade para estes organismos. Foi também possível determinar o intervalo normal de valores de actividade específica de AChE para as espécies em estudo [0,000; 1,270] mU of AChE/mg of proteina para S. officinallis e [0,000; 1,439] mU of AChE/mg de proteina para S. agaricina.

Tecnologia de iplex massarray aplicado ao diagnóstico de miocardiopatia hipertrófica

A miocardiopatia hipertrófica (MH) é a doença cardíaca genética mais comum, afectando 1:500 indivíduos, apresentando um padrão de transmissão autossómico dominante, com mutações associadas a genes sarcoméricos e não sarcoméricos. A MH apresenta uma variedade de manifestações clínicas, desde indivíduosassintomáticos a indivíduos que manifestam uma progressão da severidade dos sintomas, podendo nalguns casos ocorrer morte súbita. O diagnóstico clínico é realizado por Electrocardiograma e Ecocardiograma. O diagnóstico genético baseia-se na Sequenciação Automática (SA) dos 5 principais genes sarcoméricos MYBPC3, MYH7, TNNT2, TNNI3 e MYL2, sendo considerada uma metodologia bastante dispendiosa e demorada e que não permite a identificação de mutações em cerca de 1/3 dos individuos. A Genotipagem por iPLEX MassARRAY revela-se uma boa alternativa à SA no diagnóstico genético de MH, uma vez que permite a análise de várias amostras em simultâneo, para um elevado número de mutações, num único ensaio, com uma maior rentabilidade de tempo e recursos. Este trabalho teve como objectivo a optimização e a validação desta metodologia, na detecção de 541 mutações em 33 genes, tendo-se verificado que 29 % das reacções multiplex necessitam de ser revistas, quer pelo desenho de novos conjuntos de primers, quer pela sua relocalização no chip.

Estudo da metrite puerperal numa exploração leiteira da região de Idanha-a-Nova

Com o presente trabalho, pretendeu realizar-se um resumo bibliográfico, seguido de um estudo de campo, contribuindo para uma melhor identificação da metrite puerperal, dos factores responsáveis pelo seu desenvolvimento, bem como das consequências que diariamente provoca nas explorações de bovinos leiteiros em Portugal. O estudo foi realizado numa exploração leiteira de grande dimensão, e contou com uma amostragem de 202 animais que completaram a gestação entre final de Outubro e fim de Fevereiro e que foram sujeitos a um exame de monitorização das vacas recém-paridas. Durante o exame, foi possível observar a metrite puerperal em 37,8% das vacas. Constatou-se também que a palpação vaginal é um método extremamente eficaz, prático e útil na detecção da metrite puerperal em explorações de grandes dimensões. Na análise dos factores de risco, constatou-se que a incidência da metrite não se encontrou significativamente correlacionada com o número de lactações, com o período do ano em que se diagnosticou a metrite, com os partos distócicos ou com a retenção placentária. Ao dia 30-37 pp., os animais com metrite puerperal tiveram maior probabilidade de desenvolver endometrite clínica. As vacas com metrite puerperal também apresentaram menor quantidade de leite produzido, e afectaram a performance reprodutiva com um aumento do intervalo parto-concepção, do número serviços até concepção e com diminuição da taxa de animais gestantes ao 1º serviço.

Deteção e seleção de talentos em andebol : diferentes perspetivas

In seeking to maximize athletic performance, optimizing the improvement of players, we find a line of study that focuses on the detection, selection and talent development. The talent is one of the fundamental constraints to access to excellence in competitive sport. Its identification is the first step to select individuals with the characteristics required to achieve the improvement sports through a complex process of expertise. The aim of this work is essentially to realize how it is made detection and selection of talent in Handball and understand how countries reference to the sport develop their work. In this sense, we choose in addition to Portugal, France, Spain and Denmark. We want to see how these four countries invest and develop detection and talent selection, taking into account the different characteristics of countries in many different contexts. So we can see that each country invests in talent selection and detection taking into account the financial capacity, the development and popularity of the sport. In all three countries, with the exception of Portugal, the Handball is a sport with great impact not only through their championships as well as the level of selections. All invest in detection and selection of talents initially by direct observation and collection of anthropometric data, and organize their structure depending on the size of your country. With the exception of France all other countries after detecting the taletos, fits us in selection schemes open. France chooses to create training centers where these young people will develop their skills. These centers are autonomous although the supervision and guidance of the technical staff of the federation. All countries except Portugal, opt to develop regional selections, thereby widening the recruitment base within a competitive framework extra club.

Prevenção da toxoplasmose congénita em Portugal

A toxoplasmose congénita é uma doença infecciosa, causada pelo parasita Toxoplasma gondii e, adquirida por transmissão materno-fetal, a qual pode acarretar sequelas neurológicas e oculares muito graves, no recém-nascido. O presente estudo incide sobre as linhas de prevenção da doença, em Portugal. A base da prevenção define-se como primária, através da determinação do estatuto imunológico da mulher, do aconselhamento e adopção de medidas higiénico-dietéticas das mulheres seronegativas, de forma a evitar a infecção materna. A vigilância serológica, na detecção de uma possível infecção materna, e a instituição da terapêutica de profilaxia, constituem a prevenção secundária, de modo a evitar a infecção fetal. A prevenção terciária recai, sobre o estabelecimento de um novo esquema terapêutico, dotado de alguma teratogenicidade, com o intuito de minimizar as sequelas da infecção. Em Portugal, existem muitas mulheres seronegativas, mal informadas acerca da doença, e que não tomam medidas preventivas correctas, para evitar a infecção. Esta problemática é decrescente, de norte para sul do país. A prevenção da doença pode ser bem-sucedida, através da implementação de directrizes específicas, dirigidas aos diferentes grupos de risco e da orientação correcta, pelos profissionais de saúde. A realização de estudos, em várias áreas de intervenção da doença, optimiza a sua prevenção e a sua relação de custo-benefício.

Nanotecnologia e a sua aplicação à terapêutica oncológica

A nanotecnologia, e a sua aplicação na área da biomedicina, em particular na terapêutica e diagnóstico oncológico, tem sido alvo de um desenvolvimento exponencial, com impacto profundo no que respeita a cuidados de saúde. O cancro é uma das doenças que afecta mais pessoas a nível mundial, com elevados índices de mortalidade, níveis de sofrimento físico e emocional e, encargos para o doente, família e sociedade. É uma doença complexa, e a prática clínica convencional constitui um paradigma, na medida em que se revela insuficiente e extremamente agressiva, expondo o doente a medicamentos citotóxicos, não específicos, com elevada toxicidade sistémica e efeitos adversos. A Nanomedicina, e a exploração das propriedades únicas das nanopartículas, apresenta a potencialidade de melhorar a capacidade de detecção e diagnóstico do cancro e, aumentar a especificidade e efectividade no tratamento das células tumorais. No entanto, o recurso a nanotecnologias continua a ser alvo de alguma controvérsia e cepticismo por parte de alguns elementos das comunidades científicas e académica. Com nanoprodutos já aprovados e utilizados em prática clínica e muitos outros em desenvolvimento e investigação em ensaios clínicos, a realização deste trabalho tem como objectivo compreender os conceitos de nanotecnologia e Nanomedicina, perceber o estado da arte, ponderando as vantagens e desvantagens da abordagem “nano” e a sua real aplicação à terapêutica oncológica.

Estudo da susceptibilidade aos antimicrobianos de estirpes de brucella suis

A brucelose é uma zoonose de distribuição mundial e representa um importante problema de saúde pública em muitos países em desenvolvimento. Preocupante é, também, a emergência da resistência bacteriana aos antimicrobianos, a nível mundial. Do nosso conhecimento, em Portugal, não existem estudos publicados sobre a susceptibilidade in vitro de Brucella spp a antimicrobianos. O presente estudo teve como objectivo a avaliação da susceptibilidade aos antimicrobianos de Brucella suis e sua comparação com estirpes de Brucella melitensis e Brucella abortus. Para tal, foi determinada em 89 estirpes bacterianas (75 de B. suis, 11 de B. melitensis e 3 de B. abortus) a Concentração Mínima Inibitória para a tetraciclina, doxiciclina, estreptomicina, gentamicina, trimetoprim, sulfametoxazol, rifampicina e polimixina-B. A maioria das estirpes em estudo mostrou ser suscetível à tetraciclina, doxiciclina, gentamicina, estreptomicina e rifampicina. Detectaram-se diferenças significativas na susceptibilidade entre as várias espécies e biovares à polimixina-B. Uma estirpe de campo de B. suis biovar 2 revelou um comportamento atípico em relação à estreptomicina, gentamicina e rifampicina. Sugere-se, como trabalho futuro, o estudo mais aprofundado desta estirpe, a nível molecular, para detecção de genes responsáveis pelo seu comportamento face aos antimicrobianos em questão. Os resultados obtidos poderão servir como base de dados e de comparação por parte de outros autores, em estudos futuros.

Análise das regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave que afeta a população de vários países, onde o Brasil apresenta a maior prevalência da infecção nas Américas. Com o estudo do gene codificante da proteína B de superfície (HASPB ou K26) de Leishmania infantum é possível identificar as variações polimórficas intraespecíficas e, assim, será possível consolidar a descrição de um perfil polimórfico presente no Estado de Pernambuco. O objetivo do trabalho foi analisar as regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV. O sistema K26 PCR foi otimizado utilizando concentrações variadas de DNA genômico de L. infantum. Foi realizado o screening de amostras clínicas de DNA através de dois sistemas de PCR simples, kDNA e ITS1/RFLP, para ensaios posteriores com a K26 PCR nas amostras positivas. A curva de dissociação de alta definição (qPCR-HRM) foi empregada na localização de temperaturas de melting específicas para L. infantum. Os amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados as sequencias selecionadas em base de dados. A K26 PCR apresentou limiar de detecção de 1 pg para amplicon de 700 pb. A especificidade dos primers foi avaliada experimentalmente e in silico, apresentando anelamento inespecífico com DNA humano. Em paralelo, foram selecionadas 78 amostras de DNA através dos dois sistemas screening, sendo 17 caracterizadas como L. infantum. Os ensaios com DNA das amostras clínicas para o sistema K26 PCR revelaram bandas espúrias. A análise através qPCR-HRM em DNA genômico do parasita resultou em amplificação com Tm de 88,2 °C, já o ensaio com amostra clínica revelou duas amplificações com distintas temperaturas de melting, 84,6 e 88,2 °C. Três amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados a cinco sequencias da base de dados, indicando 38,2 % de similaridade. Pode-se concluir que o sistema K26 PCR é recomendável para análise dos polimorfismos genéticos, contanto que o DNA seja extraído diretamente de espécies isoladas em meio de cultura.

Diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana utilizando a saliva coletada com swab

As leishmanioses caracterizam-se por um espectro de doenças distribuídas endemicamente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. A obtenção de material biológico para análise diagnóstica apresenta cuidados cruciais ao paciente, por se tratar de um processo invasivo, passível de inflamação, e podendo haver reativação da doença, em alguns casos. Diante do avanço das técnicas moleculares e da utilização de alguns fluidos biológicos para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), cogitou-se a possibilidade da identificação de DNA de Leishmania spp. em saliva através do método de coleta de swab, sendo contribuinte para o avanço no diagnóstico laboratorial. Assim, o propósito do estudo foi a identificação de DNA de Leishmania spp. a partir do diagnóstico molecular. Foram incluídos no estudo os pacientes que apresentaram lesões ativas, diagnósticos clínicos para LTA, antecedentes epidemiológicos compatíveis e não possuíam lesões cutâneo mucosas. O diagnóstico laboratorial envolveu a abordagem parasitológica através da pesquisa direta do parasito em amostras escarificadas de lesões, enquanto que o molecular compreendeu a extração do DNA das amostras de biópsia e swab salivar, seguidas da reação de PCR convencional (cPCR) e PCR em tempo real (qPCR). Foram investigados 40 pacientes com LTA havendo ocorrência de DNA do parasito em 10 amostras de saliva com cPCR, e 36 amostras utilizando qPCR. Em 28 amostras de biópsias também foi possível a detecção do DNA de Leishmania spp. e em 35 amostras de escarificado de lesão foram encontradas formas amastigotas do parasito, através de pesquisa direta. Na comparação entre os métodos propostos, a biópsia apresentou uma média de 50 por cento de compatibilidade em relação a cPCR e 67,5 por cento para a qPCR. A análise comparativa observou entre o diagnóstico parasitológico e os diagnósticos moleculares uma concordância de 32,5 por cento (14/40) em relação a cPCR, enquanto que a qPCR obteve 75,5 por cento (31/40) de concordância. Considerando a sensibilidade das técnicas de PCR utilizadas e o procedimento de coleta, através de swab advindo de fluidos salivares, os resultados demonstram a viabilidade do método de coleta de Leishmania spp. como uma nova abordagem diagnóstica auxiliar para a LTA, com benefícios à saúde do paciente

PCR em tempo real para caracterização de fontes alimentares de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae)

Os flebotomíneos são insetos hematófagos de grande importância médica e veterinária atuando como vetores de parasitas como Leishmania. O estudo do padrão alimentar desses vetores pode ajudar a compreender a sua interação com potenciais reservatórios de Leishmania. Neste estudo, desenvolvemos ensaios de PCR em tempo real para identificação de sangue em flebotomíneos. Seis pares de primers foram desenhados com base no gene citocromo b de sequencias disponíveis no GenBank dos seguintes hospedeiros potenciais: cão, gato, cavalo, galinha, rato e humano. Primeiramente, os ensaios de PCR em tempo real utilizando SYBR Green foram conduzidos usando uma curva padrão com oito concentrações diferentes (i.e., 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg e 1 fg por 2 µl) de amostras do DNA extraído do sangue com EDTA a partir de cada espécie de animal. Em seguida, o DNA foi extraído de 100 fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas de campo pertencentes a três espécies (i.e., Lutzomyia longipalpis, L. migonei e L. lenti) foram testadas pelos protocolos aqui padronizados. Fêmeas de flebotomíneos foram experimentalmente alimentadas em um rato (Rattus rattus) e utilizadas para avaliar a detecção do ensaio. Os protocolos funcionaram de forma eficiente com limites de detecção de 10 pg a 100 fg. Fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas coletadas no campo estavam alimentadas de humanos (73 por cento), galinhas (23 por cento), cães (22 por cento), cavalos (15 por cento), ratos (11 por cento) e gatos (2 por cento). Curiosamente, 76,1 por cento das fêmeas de L. longipalpis foram positivas para o sangue humano. No total, 48 por cento das fêmeas testadas estavam alimentadas em uma única fonte, 31 por cento em duas e 12 por cento em três. A análise do curso de tempo mostrou que a técnica de PCR em tempo real visando o DNA de roedor foi capaz de detectar pequenas quantidades de DNA do hospedeiro até 5 dias após o repasto sanguíneo. Esses protocolos representam ferramentas promissoras para a identificação da fonte alimentar de flebotomíneos de campo

Estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na leishmaniose visceral

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a síntese de sondas TaqMan® compatíveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatística descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatísticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatísticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia

Suscetibilidade in vitro e resistência a antifúngicosestudo comparativo entre os tipos moleculares VNI de Cryptococcus neoformans e VGI, VGII de Cryptococcus gattii pela citometria de fluxo

A criptococose é uma micose sistêmica adquirida pela inalação de basidiosporos ou leveduras desidratadas de Cryptococus neoformans e Cryptococus gattii, estas duas espécies podem causar criptococose oportunista e primária respectivamente. C. neoformans está constituído de tipos moleculares VNI-VNIV e C. gattii de VGI-VGIV que apresentam distribuição geográfica diferenciada, como por exemplo, o tipo VNI é cosmopolita e está associado a AIDS e VGI predominando na Austrália e EUA, o tipo VGII predominando no Brasil e America Latina. Este trabalho tem por objetivo realizar estudo comparado dos tipos moleculares VNI de C. neoformans, VGI e VGII de C. gattii analisando diferentes aspectos tais como: 1- Determinar o perfil da suscetibilidade in vitro da concentração inibitória mínima (CIM) de fluconazol (FLZ), itraconazol (ITZ), 5-fluorocitosina (5FC) e anfotericina B (AMB), isoladamente e de forma combinada de AMB com 5FC e AMB com Voriconazol (VRZ); 2- Determinar CIM pela citometria de fluxo (CMF) frente a FLZ, ITZ e AMB; 3- Definir a concentração mínima letal (CML) de AMB e 5FC, isoladamente e em combinação; 4- Avaliar a ação da melanina frente a 5FC e AMB na forma combinada e isolada de 5FC; 5- Induzir a resistência in vitro para FLZ e padronizar os fluorocromos: acetoximetil - calceína (calceina-AM), acetoximetil - 2\2019, 7\2019 -bis-(2-carboxietil)-5-(e -6)- carboxifluoresceína (BCECF-AM), rodamina 123 (Rh123) e iodeto de 3, 3\2019 \2013dipentiloxacarbocianina (DiOC5) na CMF para verificar a expressão de bombas de efluxo; 6- Comparar a expressão de bombas de efluxo Os resultados permitiram identificar diferentes fenótipos de suscetibilidade que foram analisados e comparados entre as duas espécies e os tipos moleculares, permitindo a produção de quatro artigos; sendo assim, concluímos que: 1- Na análise das CIMs o tipo molecular VGII apresentou-se menos suscetível em relação a VGI e VNI; já na combinação in vitro de AMB e VRZ foi observado 100% de indiferença, e na combinação de AMB e 5FC observou-se necessidade de padronização da concentração da glicose para obter testes que possam ser futuramente relacionados a casos clínicos; 2- O método de CMF demonstrou ser alternativa de leitura automatizada, reprodutível, para os testes de suscetibilidade antifúngica com uso de Laranja de Acridina e FUN-1; 3- Foi verificada a importância da realização do teste da CML para verificar a ação protetora da melanina frente a combinação de AMB e 5FC. 4- A expressão da melanina, na combinação de AMB e 5FC reduz a detecção do sinergismo e o efeito aditivo in vitro. 5. Os isolados induzidos à resistência ao FLZ permitiram obter resultados estatisticamente significativos na verificação de Bombas de efluxo in vitro na CMF com uso de fluorocromo Dioc5 e bloqueador de protonóforos CCCP; 6- Foi verificado que 65% de isolados não induzidos a resistência e 90% de isolados induzidos a resistência do tipo molecular VGII expulsam o FLZ com certa vantagem em relação aos tipos moleculares VGI e VNI. Os resultados deste trabalho contribuem para compreensão do comportamento in vitro de C. neoformans e C. gattii frente a drogas antifúngicas cujos resultados poderão ser aplicados em estudos clínicos de correlação in vitro e in vivo para melhor compreensão da terapêutica antifúngica da criptococose e validação dos testes de suscetibilidade para estas duas espécies