Influência das proteínas motoras e CK2 no processo de interação Leishmania braziliensis-macrófago.

O gênero Leishmania é responsável por um grupo de parasitoses que podem variar desde lesões auto-limitadas até severa injúria de tecido. Estes protozoários são parasitos obrigatoriamente intracelulares, tendo o macrófago como célula hospedeira. Durante o processo de fagocitose os macrófagos utilizam a maquinaria presente em seu citoesqueleto, a qual compreende a participação de miosinas e actinas, para a formação do fagossoma. Estas proteínas estão envolvidas em processos como citocinese, tráfego intracelular de organelas e vesículas, podendo interferir com a penetração do parasito. Alguns trabalhos vêm sendo realizados visando analisar a expressão, localização e o papel de miosina e de actina em Leishamania. Estudos associados à participação destas proteínas motoras em processo vitais para a biologia do parasito podem auxiliar na compreensão de seu ciclo e permitir a geração de conhecimentos que apontem novos alvos para intervenções terapêuticas. Uma vez que a miosina é necessária no transporte intracelular, alguns estudos tentam analisar a expressão e a localização intracelular de miosinas na Leishmania. Estudos mostram a presença de atividades cinásicas do tipo CK2 em diversos tripanossomatídeos, ligadas ao crescimento celular, morfologia e infectividade de promastigotas para macrófagos. Desta maneira, como objetivo desta tese temos o estudo da participação das miosinas, actina e CK2 na infectividade da Leishmania braziliensis. Além disso, investigamos a influência destas proteínas na produção de citocinas pelos macrófagos e em sua atividade microbicida. Lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de, pelo menos, 50% no crescimento de L. braziliensis. A CK2 secretada pelo parasito foi purificada de seu sobrenadante através de coluna de HPLC e a fração 44 mostrou ser a fração correspondente a esta enzima. A lipoxina e o TBB promoveram a inibição da atividade desta enzima ao contrário da latrunculina que forneceu aumento dessa atividade. O pré-tratamento dos parasitos ou dos macrófagos com lipoxina, latrunculina, nocodazol e TBB promoveram uma inibição de cerca de 50% no índice de associação entre Leishmania e macrófagos não-ativados ou ativados por LPS e IFN-γ. Latrunculina e TBB aumentaram a produção de NO em macrófagos não ativados e não infectados enquanto que em macrófagos ativados à exceção do TBB, todas as drogas diminuíram a produção de NO. A liberação de IL-10 foi diminuída após tratamento com todas as drogas em macrófagos não ativados em ausência de promastigotas e ativados em presença do parasito. Para a produção de TNF-α há uma redução significativa em macrófagos ativados não infectados tratados com latrunculina, nocodazol e TBB. Quando ativados e infectados, os macrófagos tratados com lipoxina tiveram a produção dessa citocina aumentada, ao contrário do TBB em que houve redução. Quando avaliamos a integridade da actina verificamos que todos os compostos foram capazes de influenciar a distribuição dessa proteína, levando a uma redução no índice de associação. Ao transfectarmos a cauda da miosina Va fusionada a GFP nos macrófagos observamos que houve uma diminuição de 94% no índice de associação. Nossos dados confirmam a importância da CK2, actina e miosina Va no processo de interação parasito- macrófago.

Avaliação da interação de Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) pertencente ao sorotipo O157: H7 isoladas de bovinos assintomáticos e de doença humana com células enterocíticas humanas (linhagem Caco-2)

Reconhecida como agente de doença humana em 1982, E.coli enterohemorrágica (EHEC) pode causar diarréia sanguinolenta, colite hemorrágica e síndrome hemolítica urêmica (SHU). EHEC constitui um subgrupo especialmente virulento das E.coli produtoras de toxina de Shiga (Stx). O fator crítico da sua virulência é a toxina Shiga, capaz de interromper a síntese proteica da célula eucariótica. São conhecidos dois subgrupos de Stx, Stx1 e Stx2. Stx1 possui duas variantes Stx1c e Stx1d. Stx2 possui muitas variantes. Estudos epidemiológicos sugerem que cepas com os perfis toxigênicos Stx2 ou Stx2/Stx2c seriam mais frequentemente associadas a pacientes com SHU. Além da expressão de Stx, EHEC do sorotipo O157:H7 colonizam a mucosa intestinal induzindo a formação de lesões denominadas attaching/effacing (A/E). Para a produção da lesão A/E, é necessária a presença de uma ilha de patogenicidade cromossômica denominada LEE, composta por cinco operons, LEE 1 a LEE5. Em LEE 5 são codificadas a adesina intimina e o seu receptor Tir, o qual é translocado por um sistema de secreção tipo III (SSTT) e em LEE 4 são codificadas as proteínas secretadas EspA,B e D. Em EHEC O157:H7 são descritos muitos fatores de virulência, codificados em ilhas de patogenicidade, no cromossomo e no megaplasmídio pO157. Bovinos são o principal reservatório deste patógeno e alimentos de origem bovina e produtos contaminados com fezes de bovinos são causadores de surtos epidêmicos. Em nosso país EHEC O157:H7 é isolada do reservatório animal mas é muito rara a sua ocorrência em doença humana. Notamos que nas cepas bovinas predomina Stx2c, enquanto nas cepas humanas predomina o perfil toxigenico Stx2/Stx2c. Quanto a interação com enterocitos humanos cultivados in vitro (linhagem Caco-2), verificamos que tanto cepas bovinas quanto humanas mostram idêntica capacidade de invadir e persistir no compartimento intracelular das células Caco-2. No entanto, em comparação com as cepas humanas, as cepas bovinas mostram uma reduzida capacidade de produzir lesões A/E. Empregamos qPCR para aferir a transcrição de três diferentes locus (eae, espA e tir) situados nos operons LEE4 e LEE5 de cepas bovinas e humanas, durante a infecção de células Caco-2. Verificamos diferenças na expressão dos genes, especialmente espA, entre cepas bovinas e humanas com maior expressão para estas ultimas, em linha com os achados dos testes FAS. Através de clonagem e expressão de proteínas recombinantes, purificamos as proteínas Eae, EspA e Tir e obtivemos anticorpos específicos, empregados para acompanhar a sua expressão ao longo da infecção de células Caco-2, por imunofluorescencia. Verificamos que as três proteínas são detectadas tanto em cepas bovinas quanto humanas, mas nestas ultimas, a marcação é precoce e torna-se mais intensa com o avanço da infecção. Nossos resultados indicam que cepas EHEC O157:H7 isoladas do reservatório bovino em nosso país apresentam diferenças importantes em relação ao perfil toxigenico e a capacidade de indução de lesões A/E, características apontadas na literatura como relevantes para a virulência do micro-organismo. Por outro lado, nossos achados quanto a capacidade de invadir e multiplicar-se no interior de enterócitos pode explicar a persistência do patógeno no reservatório animal e a sua capacidade de transmissão horizontal.

Perfil de secreção de citocinas e de ativação de células endoteliais após interação com cepas selvagens e mutantes de Aspergillus fumigatus

Apesar do desenvolvimento de novas drogas antifúngicas e da sua utilização como terapia profilática visando à prevenção de infecções fúngicas invasivas, estas ainda constituem-se num problema emergente, com elevadas taxas de mortalidade. Neste contexto, destaca-se a aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete pacientes com neutropenia profunda e prolongada, principalmente os pacientes com leucemia aguda ou submetidos a transplante de medula óssea. Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso, é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, sendo um patógeno angioinvasivo. As hifas deste fungo são capazes de causar injúria e ativação endotelial, induzindo o endotélio a um fenótipo pró-trombótico, que por sua vez, é mediado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, em especial, o TNF-α. O presente trabalho teve como objetivo estudar a capacidade de cepas mutantes de A. fumigatus em ativar células endoteliais, avaliando o perfil de secreção de citocinas em meio condicionado e a expressão de fator tecidual. Resumidamente, monocamadas confluentes de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana foram incubadas com conídios e tubos germinativos de cepas selvagens (Af293 e Ku80) e mutantes (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) de A. fumigatus. A taxa de adesão e endocitose destas cepas às monocamadas de HUVEC foi avaliada a partir de um ensaio quantitativo de imunofluorescência diferencial. O perfil cinético de secreção de citocinas foi determinado em meio condicionado das HUVECs, por ensaio de multiplex para IL-6, IL-8 e TNF-α. A ativação endotelial, por sua vez, foi determinada pela expressão de fator tecidual por RT-PCR em tempo real. Os resultados obtidos demonstraram que a mutante para o gene ugm1, responsável por codificar a enzima UDP-galactopiranose mutase, que converte resíduos de galactopiranose a galactofuranose, apresentou um fenótipo hiperaderente às células endoteliais e um estímulo 10 vezes maior à secreção de TNF-α e 2,5 vezes maior a secreção de IL-6, quando comparada a ativação observada para as cepas selvagens. A galactofuranose é um componente importante de glicoconjugados da parede celular de A. fumigatus. Dessa forma, a ausência desse monossacarídeo na célula fúngica leva a um mecanismo compensatório caracterizado por um aumento na expressão de moléculas de galactosaminogalactana na parede celular. De maneira contrária, mutantes para os genes calA e crzA, apresentaram um fenótipo hipoaderente às HUVECs e uma perda na capacidade de induzir a secreção de citocinas e ativar o endotélio. Essas mutantes apresentam deleções que interferem na via de cálcio/calcineurina, responsável por regular a morfogênese e virulência de A. fumigatus, além de apresentarem alterações no conteúdo de beta-1-3 glucana. Já a cepa ΔprtT, mutante para o fator de transcrição prtT que regula a secreção de múltiplas proteases, apresentou um fenótipo de adesão, estímulo e ativação endotelial semelhante ao observado para as cepas selvagens. A comparação entre a capacidade de conídios e tubos germinativos em ativar células endoteliais, corroborou achados anteriores da literatura que reportam que só hifas são capazes de ativar células endoteliais, independentemente da sua viabilidade. Os dados deste estudo permitiram concluir que dentre os componentes de superfície celular de A. fumigatus, os polímeros de galactose, em especial a galactosaminogalactana, parecem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelos mecanismos de interação e ativação endotelial.

A robust Bayesian two-sample test for detecting intervals of differential gene expression in microarray time series.

Understanding the regulatory mechanisms that are responsible for an organism's response to environmental change is an important issue in molecular biology. A first and important step towards this goal is to detect genes whose expression levels are affected by altered external conditions. A range of methods to test for differential gene expression, both in static as well as in time-course experiments, have been proposed. While these tests answer the question whether a gene is differentially expressed, they do not explicitly address the question when a gene is differentially expressed, although this information may provide insights into the course and causal structure of regulatory programs. In this article, we propose a two-sample test for identifying intervals of differential gene expression in microarray time series. Our approach is based on Gaussian process regression, can deal with arbitrary numbers of replicates, and is robust with respect to outliers. We apply our algorithm to study the response of Arabidopsis thaliana genes to an infection by a fungal pathogen using a microarray time series dataset covering 30,336 gene probes at 24 observed time points. In classification experiments, our test compares favorably with existing methods and provides additional insights into time-dependent differential expression.