Context dependent non canonical WNT signaling mediates activation of fibroblasts by transforming growth factor-beta

Actions of transforming growth factor-beta are largely context dependent. For instance, TGF-beta is growth inhibitory to epithelial cells and many tumor cell-lines while it stimulates the growth of mesenchymal cells. TGF-beta also activates fibroblast cells to a myofibroblastic phenotype. In order to understand how the responsiveness of fibroblasts to TGF-beta would change in the context of transformation, we have compared the differential gene regulation by TGF-beta in immortal fibroblasts (hFhTERT), transformed fibroblasts (hFhTERT-LTgRAS) and a human fibrosarcoma cell-line (HT1080). The analysis revealed regulation of 6735, 4163, and 3478 probe-sets by TGF-beta in hFhTERT, hFhTERT-LTgRAS and HT1080 cells respectively. Intriguingly, 5291 probe-sets were found to be either regulated in hFhTERT or hFhTERT-LTgRAS cells while 2274 probe-sets were regulated either in hFhTERT or HT1080 cells suggesting that the response of immortal hFhTERT cells to TGF-beta is vastly different compared to the response of both the transformed cells hFhTERT-LTgRAS and HT1080 to TGF-beta. Strikingly, WNT pathway showed enrichment in the hFhTERT cells in Gene Set Enrichment Analysis. Functional studies showed induction of WNT4 by TGF-beta in hFhTERT cells and TGF-beta conferred action of these cells was mediated by WNT4. While TGF-beta activated both canonical and non-canonical WNT pathways in hFhTERT cells, Erk1/2 and p38 Mitogen Activated Protein Kinase pathways were activated in hFhTERT-LTgRAS and HT1080 cells. This suggests that transformation of immortal hFhTERT cells by SV40 large T antigen and activated RAS caused a switch in their response to TGF-beta which matched with the response of HT1080 cells to TGF-beta. These data suggest context dependent activation of non-canonical signaling by TGF-beta. (C) 2015 Published by Elsevier Inc.

Bioengineering of AAV2 Capsid at Specific Serine, Threonine, or Lysine Residues Improves Its Transduction Efficiency in Vitro and in Vivo

We hypothesized that the AAV2 vector is targeted for destruction in the cytoplasm by the host cellular kinase/ubiquitination/proteasomal machinery and that modification of their targets on AAV2 capsid may improve its transduction efficiency. In vitro analysis with pharmacological inhibitors of cellular serine/threonine kinases (protein kinase A, protein kinase C, casein kinase II) showed an increase (20-90%) on AAV2-mediated gene expression. The three-dimensional structure of AAV2 capsid was then analyzed to predict the sites of ubiquitination and phosphorylation. Three phosphodegrons, which are the phosphorylation sites recognized as degradation signals by ubiquitin ligases, were identified. Mutation targets comprising eight serine (S) or seven threonine (T) or nine lysine (K) residues were selected in and around phosphodegrons on the basis of their solvent accessibility, overlap with the receptor binding regions, overlap with interaction interfaces of capsid proteins, and their evolutionary conservation across AAV serotypes. AAV2-EGFP vectors with the wild-type (WT) capsid or mutant capsids (15 S/T -> alanine A] or 9 K -> arginine R] single mutant or 2 double K -> R mutants) were then evaluated in vitro. The transduction efficiencies of 11 S/T -> A and 7 K -> R vectors were significantly higher (similar to 63-90%) than the AAV2-WT vectors (similar to 30-40%). Further, hepatic gene transfer of these mutant vectors in vivo resulted in higher vector copy numbers (up to 4.9-fold) and transgene expression (up to 14-fold) than observed from the AAV2-WT vector. One of the mutant vectors, S489A, generated similar to 8-fold fewer antibodies that could be cross-neutralized by AAV2-WT. This study thus demonstrates the feasibility of the use of these novel AAV2 capsid mutant vectors in hepatic gene therapy.

Simvastatin Induced Neurite Outgrowth Unveils Role of Cell Surface Cholesterol and Acetyl CoA Carboxylase in SH-SY5Y Cells

Statins are known to modulate cell surface cholesterol (CSC) and AMP-activated protein kinase (AMPK) in nonneural cells; however no study demonstrates whether CSC and AMPK may regulate simvastatin induced neuritogenesis (SIN). We found that simvastatin (SIM) maintains CSC as shown by Fillipin III staining, Flotillin-2 protein expression / localization and phosphorylation of various receptor tyrosine kinases (RTKs) in the plasma membrane. Modulation of CSC revealed that SIN is critically dependent on this CSC. Simultaneously, phospho array for mitogen activated protein kinases (MAPKs) revealed PI3K / Akt as intracellular pathway which modulates lipid pathway by inhibiting AMPK activation. Though, SIM led to a transient increase in AMPK phosphorylation followed by a sudden decline; the effect was independent of PI3K. Strikingly, AMPK phosphorylation was regulated by protein phosphatase 2A (PP2A) activity which was enhanced upon SIM treatment as evidenced by increase in threonine phosphorylation. Moreover, it was observed that addition of AMP analogue and PP2A inhibitor inhibited SIN. Biocomposition of neurites shows that lipids form a major part of neurites and AMPK is known to regulate lipid metabolism majorly through acetyl CoA carboxylase (ACC). AMPK activity is negative regulator of ACC activity and we found that phosphorylation of ACC started to decrease after 6 hrs which becomes more pronounced at 12 hrs. Addition of ACC inhibitor showed that SIN is dependent on ACC activity. Simultaneously, addition of Fatty acid synthase (FAS) inhibitor confirmed that endogenous lipid pathway is important for SIN. We further investigated SREBP-1 pathway activation which controls ACC and FAS at transcriptional level. However, SIM did not affect SREBP-1 processing and transcription of its target genes likes ACC1 and FAS. In conclusion, this study highlights a distinct role of CSC and ACC in SIN which might have implication in process of neuronal differentiation induced by other agents.

ATP Antagonizes Thrombin-Induced Signal Transduction through 12(S)-HETE and cAMP

15 p.

Resveratrol Metabolites Modify Adipokine Expression and Secretion in 3T3-L1 Pre-Adipocytes and Mature Adipocytes

Objective: Due to the low bioavailability of resveratrol, determining whether its metabolites exert any beneficial effect is an interesting issue. Methods: 3T3-L1 maturing pre-adipocytes were treated during differentiation with 25 mu M of resveratrol or with its metabolites and 3T3-L1 mature adipocytes were treated for 24 hours with 10 mM resveratrol or its metabolites. The gene expression of adiponectin, leptin, visfatin and apelin was assessed by Real Time RT-PCR and their concentration in the incubation medium was quantified by ELISA. Results: Resveratrol reduced mRNA levels of leptin and increased those of adiponectin. It induced the same changes in leptin secretion. Trans-resveratrol-3-O-glucuronide and trans-resveratrol-4'-O-glucuronide increased apelin and visfatin mRNA levels. Trans-resveratrol-3-O-sulfate reduced leptin mRNA levels and increased those of apelin and visfatin. Conclusions: The present study shows for the first time that resveratrol metabolites have a regulatory effect on adipokine expression and secretion. Since resveratrol has been reported to reduce body-fat accumulation and to improve insulin sensitivity, and considering that these effects are mediated in part by changes in the analyzed adipokines, it may be proposed that resveratrol metabolites play a part in these beneficial effects of resveratrol.

1-42 beta-Amyloid peptide requires PDK1/nPKC/Rac 1 pathway to induce neuronal death

1-42 beta-Amyloid (A beta(1-42)) peptide is a key molecule involved in the development of Alzheimer's disease. Some of its effects are manifested at the neuronal morphological level. These morphological changes involve loss of neurites due to cytoskeleton alterations. However, the mechanism of A beta(1-42) peptide activation of the neurodegenerative program is still poorly understood. Here, A beta(1-42) peptide-induced transduction of cellular death signals through the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/phosphoinositol- dependent kinase (PDK)/novel protein kinase C (nPKC)/Rac 1 axis is described. Furthermore, pharmacological inhibition of PDK1 and nPKC activities blocks Rac 1 activation and neuronal cell death. Our results provide insights into an unsuspected connection between PDK1, nPKCs and Rac 1 in the same signal-transduction pathway and points out nPKCs and Rac 1 as potential therapeutic targets to block the toxic effects of A beta(1-42) peptide in neurons.

Mechanisms Responsible for the Trophic Effect of Beta-Adrenoceptors on the I-to Current Density in Type 1 Diabetic Rat Cardiomyocytes

Background/Aims: In diabetic ventricular myocytes, transient outward potassium current (I-to) amplitude is severely reduced because of the impaired catecholamine release that characterizes diabetic autonomic neuropathy. Sympathetic nervous system exhibits a trophic effect on I-to since incubation of myocytes with noradrenaline restores current amplitude via beta-adrenoceptor (beta AR) stimulation. Here, we investigate the intracellular signalling pathway though which incubation of diabetic cardiomyocytes with the beta AR agonist isoproterenol recovers I-to amplitude to normal values. Methods: Experiments were performed in ventricular myocytes isolated from streptozotocin-diabetic rats. I-to current was recorded by using the patch-clamp technique. Kv4 channel expression was determined by immunofluorescence. Protein-protein interaction was determined by coimmunoprecipitation. Results: Stimulation of beta AR activates first a G alpha s protein, adenylyl cyclase and Protein Kinase A. PKA-phosphorylated receptor then switches to the G alpha i protein. This leads to the activation of the beta AR-Kinase-1 and further receptor phosphorylation and arrestin dependent internalization. The internalized receptor-arrestin complex recruits and activates cSrc and the MAPK cascade, where Ras, c-Raf1 and finally ERK1/2 mediate the increase in Kv4.2 and Kv4.3 protein abundance in the plasma membrane. Conclusion: beta(2)AR stimulation activates a G alpha s and G alpha i protein dependent pathway where the ERK1/2 modulates the Ito current amplitude and the density of the Kv4.2 and Kv4.2 channels in the plasma membrane upon sympathetic stimulation in diabetic heart.

Novel mechanisms for regulation of cell survival and migration by ceramide 1-phosphate

201 p. : gráf.

RCeveierwamide and ceramide 1-phosphate in health and disease

Sphingolipids are essential components of cell membranes, and many of them regulate vital cell functions. In particular, ceramide plays crucial roles in cell signaling processes. Two major actions of ceramides are the promotion of cell cycle arrest and the induction of apoptosis. Phosphorylation of ceramide produces ceramide 1-phosphate (C1P), which has opposite effects to ceramide. C1P is mitogenic and has prosurvival properties. In addition, C1P is an important mediator of inflammatory responses, an action that takes place through stimulation of cytosolic phospholipase A2, and the subsequent release of arachidonic acid and prostaglandin formation. All of the former actions are thought to be mediated by intracellularly generated C1P. However, the recent observation that C1P stimulates macrophage chemotaxis implicates specific plasma membrane receptors that are coupled to Gi proteins. Hence, it can be concluded that C1P has dual actions in cells, as it can act as an intracellular second messenger to promote cell survival, or as an extracellular receptor agonist to stimulate cell migration.

Estudo da bioenergética mitocondrial de cardiomiócitos de camundongos obesos

A obesidade é uma doença crônica, resultante do excesso de gordura no organismo. O aumento da obesidade no mundo, tem se revelado como um dos fenômenos clínicos e epidemiológicos da atualidade. Estudos populacionais e em modelos animais demonstram que a origem da epidemia da obesidade está relacionada a fatores genéticos, modificações de hábitos nutricionais, redução da atividade física, e alterações nutricionais durante a lactação, desempenhando um papel relevante no desenvolvimento da obesidade, DM2 e cardiomiopatias. As mitocôndrias são os coordenadores centrais do metabolismo energético, assim, alterações funcionais e estruturais dessa organela têm sido associadas à desordens metabólicas. Elas exercem um papel na sobrevivência e função dos cardiomiócitos devido à alta demanda energética do miocárdio. Desta forma, disfunções mitocondriais estão relacionadas com disfunções no miocárdio e conseqüente progressão de cardiomiopatias. Neste estudo, avaliamos a bioenergética e a ultraestrutura de cardiomiócitos de camundongos obesos e controle hiperalimentados durante a lactação. O consumo de oxigênio das fibras cardíacas foi avaliado por respirometria de alta-resolução, utilizando um oxígrafo-2K-Oroboros. A ultraestrutura dos cardiomiócitos foi analisada por microscopia eletrônica de transmissão e o conteúdo das proteínas Carnitina palmitoil transferase 1 (CPT1), Proteína desacopladora 2 (UCP2) , Transportador de glicose 1 e 4 (GLUT1) e (GLUT4), Proteína Kinase ativada por AMP (AMPK) e Proteína kinase ativada por AMP fosforilada p(AMPK) por Western blotting (WB). Além disso, o peso dos animais, a gordura retroperitoneal, epididimal e a glicemia em jejum foram determinadas. Nossos resultados confirmaram que os animais do grupo hiperalimentados (GH), aos 90 dias de vida, apresentaram aumento da massa corporal, de gordura epididimária e retroperitoneal comparado ao grupo controle (GC). As taxas respiratórias foram semelhantes nos dois grupos quando foram utilizados os substratos dos complexos I e II. Entretanto, quando o ácido graxo palmitoil-L-carnitina foi utilizado, a taxa respiratória máxima do GH foi significativamente menor. A análise ultraestrutural dos cardiomiócitos do GH demonstrou intenso dano na matriz mitocondrial e maior presença de gotículas de lipídios, caracterizando deposição ectópica. Os resultados do WB mostraram aumento significativo do conteúdo de CPT1 e UCP2 no GH comparado ao GC. Não foram encontradas diferenças significativas no conteúdo de GLUT1 entre os grupos, entretanto, observamos maior conteúdo do GLUT4 no GH. Além disso, encontramos maior conteúdo de AMPK no GH, ao passo que o conteúdo de pAMPK foi semelhante entre os grupos. Entretanto, a razão pAMPK/AMPK é significativamente menor no GH. Esses resultados sugerem que a hiperalimentação durante a lactação leva a obesidade na vida adulta com alterações na bioenergética e ultraestrutura dos cardiomiócitos.

Sinalização da grelina no coração de camundongos obesos após hipernutrição durante a lactação

A grelina é um ligante endógeno do receptor secretagogo do hormônio do crescimento (GHSR), potente estimulador da liberação do hormônio de crescimento (GH), ingestão alimentar, e adiposidade. Além disso, sua ação hormonal inclui regulação do metabolismo energético cardíaco. Entretanto, a hipernutrição no início da vida leva ao desenvolvimento da obesidade, induz hipertrofia cardíaca, compromete a função cardíaca, e gera insuficiência cardíaca na vida adulta. Avaliar proteínas chaves no processo de sinalização da grelina no remodelamento cardíaco no coração de camundongos obesos após a hipernutrição na lactação. A obesidade foi induzida por redução de ninhada e camundongos adultos (180 dias) foram divididos em: grupo hiperalimentado, GH com obesidade decorrente de hipernutrição na lactação e controle, GC. Cardiomiócitos (cmi) do ventrículo esquerdo foram analisados por microscopia de luz e estereologia, o conteúdo e fosforilação de proteínas cardíacas: receptor de grelina (hormônio do crescimento secretagogo receptor 1a, GHSR-1a), proteína quinase-B (AKT e pAKT), phosphatidil inositol 3-quinase (PI3K), proteína quinase ativada por AMP (AMPK e pAMPK), m-TOR, pmTOR, Bax, Bcl2 e actina foram analizados por western blotting. A expressão gênica do GHSR-1a foi analisada por PCR em tempo real. A respirometria de alta resolução dos cardiomiócitos foi analisada por oxígrafo OROBOROS. Significância estatística (P< 0,05) determinada por teste t-Student não-pareado. Nossos dados demonstram que a hipernutrição na lactação induz aumento no peso corporal, iniciado aos 10 dias de idade, persistindo até os 180 dias de idade. A glicemia, peso do fígado, e da gordura visceral foram maiores no grupo GH. Além disso, o grupo GH também apresentou aumento no peso do coração e razão peso do coração/CT (comprimento da tíbia), indicando hipertrofia e remodelamento cardíaco, aumento na expressão e conteúdo de GHSR-1a no coração, associado ao maior conteúdo de PI3K e maior conteúdo e fosforilação de AKT, diminuição no conteúdo de Bcl2. Em contraste, o conteúdo e fosforilação da AMPK e mTOR no coração não foram diferentes entre os grupos. Os níveis de grelina plasmático no GH foram menores. A respiração do GH com grelina foi menor que no GC com grelina. A incubação das fibras cardíacas com grelina resultou em aumento do fluxo respiratório após adição de citocromo c nos grupos com grelina, indicando dano à membrana mitocondrial e extravazamento de citocromo c. Os grupos GC com grelina e GH sem grelina apresentaram RCR menor comparado ao GC sem grelina, indicando desacoplamento mitocondrial. Nossos resultados mostram que a hipernutrição na lactação induz diminuição do nível de grelina plasmática e aumento da expressão do GHS-R1a no cardiomiócito do animal quando adulto. Tal processo determina aumento da sensibilidade a grelina no coração, processo que ocorre independentemente de variações do AMPK e mTOR. Sugerimos uma redução no efeito protetor da ação da grelina na AMPK. Também, demonstramos que o remodelamento do miocárdio nestes animais adultos associa-se a GHSR-1a, PI3K, e fosforilação da AKT, mas não com AMPK e mTOR na vida adulta.

Proteómica dirigida en la cirugía del cáncer gástrico

240 p. + anexos

Muscle wasting in myotonic dystrophies: a model of premature aging

Myotonic dystrophy type 1 (DM1 or Steinert's disease) and type 2 (DM2) are multisystem disorders of genetic origin. Progressive muscular weakness, atrophy and myotonia are the most prominent neuromuscular features of these diseases, while other clinical manifestations such as cardiomyopathy, insulin resistance and cataracts are also common. From a clinical perspective, most DM symptoms are interpreted as a result of an accelerated aging (cataracts, muscular weakness and atrophy, cognitive decline, metabolic dysfunction, etc.), including an increased risk of developing tumors. From this point of view, DM1 could be described as a progeroid syndrome since a notable age dependent dysfunction of all systems occurs. The underlying molecular disorder in DM1 consists of the existence of a pathological (CTG) triplet expansion in the 3' untranslated region (UTR) of the Dystrophia ll/Iyotonica Protein Kinase (DMPK) gene, whereas (CCTG)n repeats in the first intron of the Cellular Nucleic acid Binding Protein/Zinc Finger Protein 9 (CNBP/ZNF9) gene cause DM2. The expansions are transcribed into (CUG)n and (CCUG)n-containing RNA, respectively, which form secondary structures and sequester RNA binding proteins, such as the splicing factor muscleblind-like protein (MBNL), forming nuclear aggregates known as foci. Other splicing factors, such as CUGBP, are also disrupted, leading to a spliceopathy of a large number of downstream genes linked to the clinical features of these diseases. Skeletal muscle regeneration relies on muscle progenitor cells, known as satellite cells, which are activated after muscle damage, and which proliferate and differentiate to muscle cells, thus regenerating the damaged tissue. Satellite cell dysfunction seems to be a common feature of both age-dependent muscle degeneration (sarcopenia) and muscle wasting in DM and other muscle degenerative diseases. This review aims to describe the cellular, molecular and macrostructural processes involved in the muscular degeneration seen in DM patients, highlighting the similarities found with muscle aging.

Influência da ck2 no processo de interação Leishmania donovani-macrófagos

O gênero Leishmania apresenta espécies capazes de desenvolver doenças de grande importância para a saúde pública, as leishmanioses, que apresentam prevalência mundial de 12 milhões de pessoas. Quando os parasitos entram em contato com o hospedeiro humano passam por um processo de metaciclogênese adquirindo capacidade de interagir com os macrófagos. Inúmeras atividades biológicas são desencadeadas pela ativação de sistemas de transdução de sinais, onde as proteínas cinases e fosfatases desempenham papel fundamental. A proteína cinase CK2 parece estar presente em todas as células eucarióticas (núcleo, citoplasma e superfície). É caracterizada como enzima serina/treonina cinase, embora também seja capaz de fosforilar resíduos de tirosina em suas proteínas-alvo. No presente trabalho, demonstramos que o principal inibidor da CK2, TBB, foi capaz de inibir o crescimento de formas promastigotas de L. donovani e mostrou um mecanismo de ação irreversível, entretanto não foi capaz de induzir apoptose nas formas promastigotas de L. donovani. O pré-tratamento dos parasitos e macrófagos, assim como a adição do TBB durante o processo de infecção induziram uma redução significativa no número de amastigotas por macrófagos possivelmente pelo mecanismo de morte celular programada demosntrada pela técnica do TUNEL. O tratamento de macrófagos com TBB não induziram o aumento de óxido nítrico. Ensaios de imunofluorescência demonstraram a presença de CK2α em promastigotas. Macrófagos não infectados demonstraram pouca marcação para CK2α. Após a interação, a enzima mostrou-se distribuída preferencialmente na periferia dos macrófagos. Os dados do trabalho sugerem que a CK2 é uma importante enzima para a atividade biológica da Leishmania donovani, tendo seu estudo importante relevância para a descoberta de novos alvos terapêuticos.

Hemodinâmica cardíaca e o metabolismo energético mitocondrial de camundongos adultos hiperalimentados na lactação

O desequilíbrio nutricional no início da vida leva ao desenvolvimento da obesidade, diabetes e doenças cardiovasculares na idade adulta. Este estudo teve como objetivo analisar os efeitos a longo prazo da hiperalimentação na lactação por meio do modelo de redução da ninhada na hemodinâmica e bioenergética cardíaca. Vinte e quatro camundongos machos Swiss adultos foram divididos em dois grupos (controle e hiperalimentado) submetidos a duas condições (linha de base e isquemia/reperfusão) formando quatro grupos no total: grupo controle linha de base (GCLB), grupo controle isquemia/reperfusão (GCIR), grupo hiperalimentado linha de base (GHLB) e o grupo hiperalimentado isquemia/reperfusão (GHIR), todos com seis camundongos/grupo. As alterações cardíacas foram analisadas por meio da hemodinâmica cardíaca, da respiração mitocondrial e da biologia molecular. Os parâmetros hemodinâmicos analisados foram a velocidade de contração (Max dP/dt), a velocidade de relaxamento (Min dP/dt), o tempo de relaxamento cardíaco isovolumétrico (Tau) e os batimentos por minuto (BPM). A respiração mitocondrial foi avaliada por meio da razão do controle respiratório (RCR) na oxidação de carboidratos e ácidos gordos, e finalmente, a biologia molecular, através de proteínas-chave como a proteína quinase B (AKT), a proteína quinase ativada por adenosina monofosfato (AMPK), a carnitina palmitoil transferase 1 (CPT-1), a proteína desacopladora 2 (UCP2), o 4-hidroxinonenal (4-HNE) e a gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH). Os camundongos do GH desenvolveram maior peso corporal (30,95%, P<0,001), gordura epididimal (68,64%, P<0,001), gordura retroperitoneal (109,38%, P<0,01) e glicemia de jejum (19,52%, P<0,05) comparados aos do GC. Os parâmetros Max dP/dt e BPM apresentaram diminuição no GHIR quando comparado ao GHLB (P<0,001 e P<0,05). O parâmetro Min dP/dt apresentou-se reduzido no GCIR e GHIR quando comparado aos grupos GCLB e GCLB (P<0,05; P<0,0001 respectivamente). Camundongos do GHIR apresentaram redução do Tau quando comparado aos grupos GCIR e GHLB (P<0,0001). Estes desequilíbrios na hemodinâmica cardíaca foram associados a função mitocondrial, uma vez que, o GHLB apresenta a RCR reduzida para oxidação de ácidos graxos e carboidratos (P<0,05 e P<0,01, respectivamente) e o GHIR apenas na oxidação dos ácidos graxos (P<0,01). Além disso, o GHIR apresentou diversas alterações nas proteínas-chave do metabolismo energético cardíaco, como diminuição do conteúdo de AKT (P<0,05) e aumento do conteúdo de CPT-1 (P<0,05), 4-HNE (P<0,05) e GAPDH (P<0,05) quando comparado ao CGIR. Finalmente, a expressão do mRNA para CPT1, GAPDH e UCP2 foi aumentada no GHIR quando comparado aos GCIR (P<0,05) e GHLB (P<0,05). A expressão de mRNA para UCP2 e CPT-1 foi reduzida no GCIR quando comparado ao GCLB (P<0,01 e P<0,05, respectivamente). O estudo apresenta resultados consistentes, demonstrando efeitos deletérios sobre o metabolismo cardíaco adulto resultante de alterações nutricionais durante a lactação.