Humoral response towards high density lipoprotein : a new mechanism for atherogenesis

RESUMO:Aterosclerose é uma das principais causas de morbilidade e mortalidade no mundo ocidental. É responsável, direta ou indiretamente, pela maior percentagem de gastos com a saúde na maioria dos países europeus. A “teoria lipídica” da aterosclerose, que se baseia na dislipidemia como causa primária para a doença vascular tem algumas implicações práticas importantes: permite a definição de linhas de orientação e protocolos simples e ainda estabelece alvos terapêuticos que podem ser atingidos na maior parte dos casos com a atual intervenção farmacológica. A associação da aterosclerose com o sistema imunológico (a “teoria imunológica”), forneceu por sua vez novas formas de explorar os mecanismos envolvidos e abriu novas perspetivas para um conhecimento mais completo da doença. No entanto, levanta dificuldades evidentes no que diz respeito às possibilidades terapêuticas. De todos os intervenientes no processo aterosclerótico (bioquímicos, imunológicos e anatómicos), as lipoproteínas de elevada densidade (HDL) são atualmente reconhecidas como um dos fatores mais importantes na aterogénese. Isto é baseado no reconhecimento das múltiplas propriedades anti-aterogénicas das HDL como por exemplo: a anti-oxidante, a anti-inflamatória e a antitrombótica, bem como o seu importante papel na melhoraria da função endotelial. Atualmente, é consensual que as funções anti-aterogénicas das HDL vão além do seu papel no transporte reverso do colesterol (RCT) e a importância das HDL no processo aterosclerótico baseia-se não apenas no seu papel protetor impedindo a formação da placa de ateroma, mas também na estabilização destas, prevenindo a sua ruptura e, consequentemente o evento trombótico. Como fundamentais no processo aterosclerótico estão reconhecidos dois principais conjuntos de eventos: um caracterizado por alterações no metabolismo das lipoproteínas que resultam em lipoproteínas pró-inflamatórias e pró-oxidantes que interagem com os componentes celulares da parede arterial e que conduzem à formação da placa de ateroma; o outro evento é a resposta imunológica desencadeada contra um novo conjunto de antigénios que por sua vez leva à produção de citoquinas pró-inflamatórias. Dada a complexidade da HDL e das suas múltiplas funções estas lipoproteínas tornaram-se um potencial alvo para a resposta auto-imune, e cujas consequências podem explicar algumas das associações identificados em estudos clínicos e epidemiológicos. Contudo esta interação entre o sistema imunológico e HDL nunca foi exaustivamente estudada. Portanto, pomos a hipótese de que em condições oxidativas e pró-inflamatórias, um aumento do antigénio (HDL) conduz a um consequente acréscimo na produção de anticorpos anti-HDL (aHDL) responsáveis pela alteração quantitativa e / ou qualitativa das HDL. O conceito de que estes anticorpos podem contribuir tanto para a evolução a longo prazo do processo aterosclerótico, como para o desencadeamento de eventos clínicos pode também explicar a heterogeneidade encontrada em cada doente e nos grandes estudos clínicos, no que diz respeito aos fatores de risco e outcomes clínicos. Para além disso, a confirmação desta hipótese pode permitir explicar porque é que as intervenções terapêuticas atualmente em desenvolvimento para aumentar os níveis de HDL, não conseguem mostrar a tão esperada redução do risco vascular. O objetivo geral desta tese foi identificar e caracterizar a resposta humoral contra os componentes da HDL, e avaliar possíveis mecanismos que possam contribuir para a modificação das propriedades anti-aterogénicas das HDL. Para alcançar este objetivo investigou-se: 1) A presença de anticorpos aHDL em doentes com lúpus eritematoso sistémico (SLE) e em doentes com manifestações clínicas de aterosclerose, como os doentes com doença arterial coronária (CAD), acidente vascular cerebral isquémico (IS) e diabetes tipo 2; 2) Os principais alvos antigénicos dentro do complexo das HDL e a associação entre os títulos de anticorpos aHDL e diferentes características clínicas destas doenças; 3) As modificações das funções normais associadas às HDL, em particular da função anti-oxidante e anti-inflamatória; 4) A atividade biológica dos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes através de um conjunto de experiências in vitro de inibição da atividade da paraoxonase 1 (PON1) e da expressão de moléculas de adesão em culturas de células endoteliais. Para tal foi necessário estabelecer um método de isolamento dos anticorpos. Os anticorpos aHDL isolados do soro de doentes foram utilizados de forma a identificar as potenciais alterações dos sistemas celulares utilizados; 5) O efeito de fármacos usados no tratamento das dislipidemias, em particular o ácido nicotínico e as estatinas, na variação dos títulos de anticorpos aHDL através de ensaios clínicos randomizados, controlados com placebo e em dupla ocultação. Os métodos utilizados neste trabalho incluíram: técnicas imunológicas (como por exemplo, enzyme-linked immunoabsorbent assay - ELISA, ensaio imunoturbidimetrico e cromatografia de imuno-afinidade) técnicas bioquímicas (tais como a quantificação de atividade enzimática por espectrofotometria e por luminescência), experiências com cultura de células e citometria de fluxo. Os nossos resultados mostram que: 1) A presença de anticorpos aHDL, e mais especificamente anticorpos contra alguns do seus principais componentes como a apolipoproteína A-I (ApoA-I, principal apolipoproteína presente nas HDL) e a PON1 (o enzima que mais contribui para a propriedade anti-oxidante das HDL), quer em doentes com doenças auto-imunes, como o SLE, quer em doentes com manifestações clínicas de aterosclerose, como CAD, IS e diabetes tipo 2. Os doentes apresentaram títulos de anticorpos IgG aHDL, aApoA-I e aPON1 significativamente mais elevados do que controlos saudáveis com a mesma idade e sexo. 2) A correlação positiva estatisticamente significativa entre os títulos de aHDL e aApoA-I e aPON1 sugere que estes sejam dois dos principais alvos antigénicos dentro do complexo das HDL. Os anticorpos encontrados nestes doentes estão associados com a diminuição da atividade da PON1 e a uma redução da capacidade anti-oxidante total (TAC) do soro, um aumento dos biomarcadores de disfunção endotelial (como por exemplo dos metabolitos do óxido nítrico - NO2- e NO3-, as moléculas de adesão vascular e intracelular - VCAM-1 e ICAM-1 e os níveis de 3-nitrotirosina). Nos doentes com SLE os títulos destes estão associados a um aumento do dano cardiovascular e à atividade global da doença avaliados pelas escalas SLICC/ACR DI e BILAG score, respetivamente. Enquanto que nos doentes com diabetes tipo 2 estes anticorpos estão associados com um aumento dos níveis de glicemia em jejum (FGP) e hemoglobina glicada (HbA1c). 3) Após se ter estabelecido um método de isolamento dos anticorpos que permite isolar quantidades significativas de anticorpos do soro de doentes sem perder a sua especificidade, foi identificada a capacidade dos anticorpos isolados do soro de doentes inibirem de uma forma dependente da concentração a atividade da PON1 até um máximo de 70% no caso dos doentes com SLE e ente 7-52% no caso dos anticorpos isolados de doentes com CAD e IS. 4) O efeito anti-inflamatório das HDL na inibição da produção de VCAM-1 induzida por citoquinas (como o TNF-) foi revertido em mais de 80% pelos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes. 5) A angiogenesis induzida por HDL através do aumento do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) foi anulada em 65% pelos anticorpos aHDL isolados do soro de doentes. 6) Os atuais agentes farmacológicos disponíveis para aumentar as concentrações de HDL-C estão associados a um aumento dos títulos de anticorpos.-------- ABSTRACTAtherosclerosis is the major cause of morbidity and mortality in the western world. It is also responsible, directly or indirectly, for the highest percentage of health costs in most European countries. Despite the use of new technologies for the diagnosis of vascular disease and regardless of the major advances in treatment, the atherosclerosis-related clinical burden is still raising. The “lipid theory” of atherogenesis, which identifies dyslipidemia as the primary cause of this vascular disease has some important practical implications: it allows the definition of simple guidelines and establishes therapeutic targets which can be generally met with current pharmacologic intervention. The association between atherosclerosis an the immune system (the immune concept) has in turn provided new ways of exploring the mechanisms involved in this condition and has opened new perspectives in the understanding of the disease. However, it raises obvious difficulties when it comes to treatment options. Of all the players (biochemical, immunological and anatomical) involved in this matter, high-density lipoproteins (HDL) are currently recognised as one of the most important factors in atherogenesis. This is based on the recognition of HDL's multiple anti-atherogenic properties: anti-oxidant, anti-inflammatory and antithrombotic, as well as its capacity to improve endothelial function. Nowadays, it is widely recognized that the anti-atherogenic functions of HDL go beyond reverse cholesterol transport (RCT), and the importance of HDL is based not just on its ability to reduce atheroma formation but also on its ability to stabilise plaques, therefore preventing their rupture and ultimately thrombosis. Two main set of events have been recognised as fundamental in atherogenesis: one, characterized by lipoprotein metabolism alterations, resulting in pro-inflammatory and pro-oxidative lipoproteins, which interact with the normal cellular elements of the arterial wall leading to atheroma formation; the other, the immune cellular response towards new sets of antigens which lead to the production of pro-inflammatory cytokines. Given to HDL complexity and multiple functions this lipoprotein has became a potential target for an auto-immune response, the consequences of which may explain some of the association identified in epidemiological and clinical studies, though the interaction between the immune system and HDL has never been thoroughly addressed. Therefore, we hypothesized that under oxidative and pro-inflammatory conditions, the increase in the antigen (HDL) would lead to a consequent increase in the production of anti-HDL (aHDL) antibodies be responsible for quantitative and/or qualitative changes of HDL. The concept that these antibodies may contribute either to the long-term evolution of atherosclerosis or to the triggering of clinical events may also explain the heterogeneity found in individual patients and in large cohorts regarding risk factors and clinical outcomes. Moreover this may be a major breakthrough in understanding why therapeutic interventions that increase HDL levels, failed to show the anticipated reduction in vascular risk. The overall aims of this thesis were to identified and characterize the humoral response towards HDL components and to evaluate the possible mechanisms that may contribute to the modifications of the anti-atherogenic properties of HDL. To achieve this objective we investigated: 1) the presence of aHDL antibodies in patients with systemic lupus erythematosus (SLE) and in patients with atherosclerosis-related clinical events, such as coronary artery disease (CAD), ischemic stroke (IS) and type 2 diabetes; 2) the association between the titres of aHDL antibodies and different clinical features of these diseases; 3) the modifications of the anti-atherogenic properties of HDL; 4) the biologic effect of aHDL antibodies isolated from serum of patients on the anti-oxidant and anti-inflammatory properties of HDL; 5) the effect of different pharmacologic treatments for dyslipidemia on the prevalence and activity of aHDL antibodies. The methodologies used in this work included immunologic-related techniques (e.g. enzyme-linked immunoabsorbent assay – ELISA, immunoturbidimetric immunoassay and immunoaffinity chromatography), biochemical techniques (enzymatic assays with quantification by spectrophotometry and luminescence methods), cell culture experiments and flow cytometry. Our results indicate that: 1) The titres of IgG aHDL, anti-apolipoprotein A-I (aApoA-I) and anti-paraoxonase 1 (aPON1) antibodies were higher in patients with SLE, CAD, IS and type 2 diabetes when compared with age and sex matched healthy controls. 2) The antibodies found in these patients were associated with decreased PON1 activity, (the enzyme responsible for most of the anti-oxidant effect of HDL), reduced total anti-oxidant capacity (TAC) of serum and increased biomarkers of endothelial dysfunction (nitric oxide metabolites, adhesion molecules, nitrotyrosine). In patients with SLE the antibody titres were associated with an increase in disease-related cardiovascular damage and activity whereas in patients with type 2 diabetes they were directly related with the fasting glucose plasma (FGP) levels and the glycosylated haemoglobin (HbA1c). 3) The antibodies isolated from serum of our patients, directly inhibited HDL-associated PON1 activity in a dose dependent way ranging from 7 to 52%. 4) The anti-inflammatory effect of HDL, measured by the percentage of inhibition of the cytokine-induced production of vascular adhesion molecules (VCAM-1), was reduced in more than 80% by aHDL antibodies isolated from our patients. 5) The HDL-induced angiogenesis by increasing vascular endothelial growth factor (VEGF) levels was abrogated in 65% by the antibodies isolated from serum of patients. 6) The current available pharmacologic agents for increasing HDL-C concentrations were associated with an increase in the titres of IgG aApoA-I antibodies. This increase was higher in the extended release niacin when compared to statins probably due to their dampening effect on oxidative stress. In conclusion, aHDL antibodies are present in different pathologic conditions. aHDL antibodies represent a family of self-reacting immunoglobulins, of which ApoA-I and PON1 might be the most relevant targets. These antibodies are biologically active, interfering with the HDL anti-oxidant and anti-inflammatory properties and, consequently, with the atherosclerotic process. The pathogenic potential of these antibodies may lead to the identification of a new biomarker for vascular disease, whilst presenting itself as a novel target for a different treatment approach which may redefine the treatment strategies and clinical trials design for HDL interventions in the future.

Leucoencefalopatia multifocal progressiva como manifestação inicial da síndrome da imunodeficiência adquirida

Relata-se caso de homem portador da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida que apresentou quadro agudo e grave de Leucoencefalopatia Multifocal Progressiva (LMP) como primeira manifestação da Síndrome. A LMP foi caracterizada macro e microscopicamente e através de estudo imuno-histoquímico utilizando o anticorpo antivírus JC.

Glomerulonefrite associada à infecção pelo vírus da hepatiteC

Descrevem-se pacientes com glomerulonefrites (GNs) associadas à infecção pelo vírus da hepatite C (HCV). Entre agosto de 93 e julho de 96 foram observados 4 pacientes, com idade mediana de 41 anos, sendo 2 do sexo masculino. Pesquisaram-se o anti-HCV por ensaio imuno-enzimático e o HCV-RNA por PCR. Também foram pesquisadas crioglobulinas séricas, hemácias dismórficas no sedimento urinário e proteinúria de 24h. Viremia, crioglobulinas, hematúria e proteinúria foram observadas nos 4 pacientes. As biópsias hepáticas revelaram atividade inflamatória nos 3 pacientes em que foram realizadas e as do rim revelaram glomerulonefrite membranoproliferativa em 3 e glomerulonefrite proliferativa mesangial em 1 paciente. Dois pacientes vêm recebendo antivirais (IFN associado à ribavirina) e evoluindo com melhora. A presença de viremia e de hepatite concomitante com as alterações urinárias constituem indícios do envolvimento viral na glomerulopatia. Tais achados são reforçados pela melhora das alterações urinárias durante o tratamento específico. Conclui-se que a pesquisa de marcadores virais em pacientes com GNs assume relevância na medida em que pode modificar a conduta terapêutica.

Isolamento de Rickettsia em cultura de células vero

Embora o diagnóstico da febre maculosa baseie-se em sinais e sintomas característicos, o mesmo requer confirmação laboratorial, pois existem alguns diagnósticos diferenciais possíveis como meningococcemia, leptospirose, infecção por enterovírus e febre tifóide. A confirmação laboratorial pode ser feita através da pesquisa de anticorpos específicos, possível somente alguns dias após o aparecimento da doença, através do isolamento do agente em amostras de sangue e/ou biópsia de pele, e ainda, de amostras de carrapatos coletados do paciente ou de animais reservatório. O isolamento a partir de sangue ou biópsia de pele resulta em diagnóstico precoce da doença, pois na fase de rickettsemia ainda não há anticorpos detectáveis no sangue. Assim, com o objetivo de facilitar o diagnóstico precoce da febre maculosa, estabelecemos um método de isolamento de rickettsia em cultura de células vero. Para a padronização foi inoculada amostra padrão de Rickettsia rickettsii, cepa Sheyla Smith, cedida pelo CDC. A identificação foi feita através da reação de imunofluorescência indireta. A presença de microrganismos verdes fluorescentes visualizados no interior do citoplasma das células caracterizou o crescimento do agente. Posteriormente, a metodologia foi confirmada pelo isolamento do agente da febre maculosa em amostras de biópsia de pele de paciente proveniente de área endêmica no Estado de São Paulo, bem como, de amostras de carrapato do gênero Amblyomma, considerado o reservatório e transmissor da doença no Brasil.

Hepatite D

O vírus da hepatite D (VHD), também chamado de vírus delta, é um pequeno vírus contendo RNA circular. O VHD causa infecção, quando há coinfecção com o vírus da hepatite B (VHB) em indivíduos normais ou superinfecção em portadores crônicos do VHB. Três genótipos já foram clonados e seqüenciados. A infecção apresenta distribuição mundial, sendo a região ocidental da Amazônia brasileira considerada área de alta endemicidade. Estima-se que 18 milhões de pessoas encontram-se infectadas pelo vírus entre os 350 milhões de portadores crônicos do VHB no mundo. As vias de transmissão do VHD e os fatores de risco mostram-se similares aos da infecção pelo VHB. O diagnóstico se faz pela identificação imuno-histológica do HDAg no fígado e pelo encontro das frações IgM e IgG anti-HD no soro por radioimunoensaio ou ELISA. O curso clínico da infecção pelo VHD mostra-se variável. Os pacientes podem apresentar formas fulminantes de hepatite. As formas crônicas associam-se a achados histopatológicos graves no fígado, com curso rápido e progressivo, evoluindo para cirrose, insuficiência hepática e morte. O interferon alfa constitui a única opção terapêutica com algum efeito benéfico no tratamento da hepatite. O transplante hepático encontra indicação nos casos terminais de cirrose. A profilaxia indireta da infecção pelo VHD tornou-se possível com o advento da vacina contra o vírus da hepatite B.

Anticorpos antipromastigotas vivas de Leishmania (Viannia) braziliensis, detectados pela citometria de fluxo, para identificação da infecção ativa na leishmaniose tegumentar americana

Neste estudo, descrevemos etapas iniciais de padronização de uma nova metodologia para detecção de anticorpos antipromastigotas vivas de Leishmania (Viannia) braziliensis, pela citometria de fluxo e a análise de sua aplicabilidade para estudos clínicos. Foram avaliados 39 indivíduos com sorologia convencional (RIFI) positiva para leishmaniose, classificados quanto à ausência/presença de lesão (L- e L+). Os resultados foram expressos sob a forma de percentual de parasitas fluorescentes positivos (PPFP). A análise dos dados, na diluição 1:1.024, permitiu distinguir 95% dos pacientes L+ como um grupo de alta reatividade (PPFP>50%) e 72% dos indivíduos L- como um grupo de baixa reatividade (PPFP<50%). A análise dos títulos da reação de imunofluorescência indireta não demonstrou nenhuma relação com a ausência/presença de lesão. Em conjunto, nossos dados sugerem a aplicabilidade da citometria de fluxo na identificação dos casos de infecção ativa, o que não tem sido possível através das reações sorológicas convencionais.

Identificação de agentes infecciosos pulmonares em autópsias de pacientes com a síndrome da imunodeficiência adquirida

As afecções pulmonares são freqüentes em indivíduos infectados pelo vírus da imunodeficiência humana. Neste trabalho, procurou-se identificar através de histoquímica e imunohistoquímica, agentes infecciosos nos pulmões de indivíduos portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), autopsiados entre março de 1990 e julho de 2000 na FMTM. Fragmentos de pulmão de 40 indivíduos com SIDA autopsiados foram analisados histologicamente. Foram identificados agentes infecciosos em 34 (85%) casos dos 40 analisados, sendo que bactérias foram encontradas em 22 (55%) casos. Entre os agentes fúngicos o Pneumocystis carinii foi encontrado em oito (19,1%) casos; Cryptococcus sp em quatro (9,5%), Histoplasma sp em dois (4,8%) e Candida sp em um (2,4%) caso. Detectou-se também associação entre Pneumocystis carinii, Citomegalovirus e Cryptococcus sp; CMV e Toxoplasma gondii. Em cinco casos, Candida sp, CMV e Pneumocystis carinii estiveram associados a bactérias. Entre as infecções não bacterianas, os fungos foram os agentes infecciosos mais isolados dos pulmões em autópsias de indivíduos com SIDA, sendo o Pneumocystis carinii o mais freqüente.

Levantamento de leishmaniose visceral em cães de Santa Maria e municípios próximos, Estado do Rio Grande do Sul

A partir de relato de diagnóstico de leishmaniose visceral em cinco cães dos municípios de Santa Maria, Itaara e Júlio de Castilhos, no centro do Estado do Rio Grande do Sul, foi realizado levantamento sorológico através de teste de imunofluorescência indireta em sangue obtido em papel de filtro de 40 cães de Santa Maria, 20 de Itaara e 11 de Júlio de Castilhos, em geral relacionados aos cinco cães considerados como positivos. Além destes, foi também examinado o sangue de 44 cães vadios de Júlio de Castilhos, 68 de Cachoeira do Sul e 20 de Caçapava do Sul. Soros fracamente reagentes com títulos < 1:40 foram avaliados em ensaios de Ensaio Imuno-enzimático. Amostras de fígado, baço, pulmão e linfonodos de um sexto cão de Santa Maria, considerado como positivo à necropsia, foram examinadas através de histopatologia e PCR. Todos os resultados dos 204 cães foram negativos, indicando que, apesar de não ser impossível a ocorrência de leishmaniose visceral na região, por vários fatores aqui discutidos, ela deve ser pelo menos extremamente rara, sendo necessários estudos mais detalhados do material dos cinco cães tidos como positivos.

Perfil hematológico, bioquímico sérico e sorológico de Felis domesticus com lagochilascariose experimental

No presente trabalho, avaliou-se o hemograma, diversas proteínas e enzimas séricas ou plasmáticas e a produção de anticorpos específicos em Felis domesticus, experimentalmente infectados por Lagochilascaris minor. Verificou-se nos animais infectados aumento de leucócitos totais, principalmente eosinófilos; queda do número de plaquetas; aumento de aspartato-aminotransferase e alanina-aminotransferase; e principalmente a presença de anticorpos IgG específicos para antígenos do parasita. A reação com extrato bruto de parasitas adultos mostrou-se mais específica, permitindo a discriminação de soros de animais: não infectados, com infecção por outros parasitas, e com lagochilascariose. Esta é a primeira descrição da padronização de uma reação sorológica para diagnóstico da lagochilascariose em Felis domesticus.

Avaliação da concordância entre exames clínicos e laboratoriais no diagnóstico da hanseníase

Este estudo avaliou a concordância entre o diagnóstico clínico e o diagnóstico laboratorial da hanseníase, utilizando os resultados de biópsias dos laboratórios A e B e o teste ML-Flow. A concordância diagnóstica clínico-histopatológica foi de 67,6%. Os laboratórios apresentaram um índice de concordância de 73,7% em relação ao índice baciloscópico, e o laboratório B detectou 25,4% a mais de casos positivos. A maior concordância foi obtida para a forma V, e a menor para a forma I. A maior discrepância diagnóstica ocorreu para a forma DD. A concordância clínico-laboratorial foi de 41,3% para o laboratório A e 54% para o B. O teste ML-Flow reclassificou 10,7% dos pacientes. A classificação espectral é importante para o melhor entendimento da doença e para seu tratamento adequado, mas não é utilizada em centros de saúde, que adotam os critérios simplificados da OMS, que poderiam ser complementados pelo teste ML-Flow. Tal simplificação é inaceitável para os Centros de Referência em assistência, ensino e pesquisa em hanseníase, de modo que é recomendada a padronização pela classificação de Ridley-Jopling.

Associação entre reação hansênica após alta e a carga bacilar avaliada utilizando sorologia anti PGL-I e baciloscopia

As reações hansênicas são fenômenos imuno inflamatórios que ocorrem durante a evolução da hanseníase. Atualmente com os critérios de finalização de tratamento esta intercorrência pode ser observada após a alta da poliquimioterapia. Trata-se de um estudo caso-controle onde foram comparados, laboratorialmente, os casos de reação hansênica após alta da poliquimioterapia multibacilar (PQT/MB) com o grupo controle para analisar a possível associação entre a reação hansênica após alta e a carga bacilar, utilizando o ML Flow, teste sorológico para detecção de anticorpos contra o Mycobacterium leprae, e os resultados das baciloscopias cutâneas. O estudo foi realizado em dois serviços de referência na cidade de Recife - Pernambuco - Brasil, onde participaram 208 pacientes. Os resultados encontrados indicam que a reação após alta está estatisticamente associada à carga bacilar através da positividade do teste sorológico após alta. Conclui-se que existem fatores de riscos comuns entre a recidiva e a reação após alta.

Thomsen-Friedenreich antigens in bladder cancer: evaluation of their prognostic value

RESUMO: Introdução. O cancro de bexiga é uma patologia comum que representa o 6° e o 5° cancro mais incidente em Portugal e na Itália, respetivamente. Em mais de metade dos casos ocorre reincidência durante o primeiro ano, requerendo acompanhamento clínico ao longo da vida. A instilação intravesical de Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (uma estirpe atenuada do Mycobacterium bovis) representa uma imunoterapia eficaz no combate ao cancro de bexiga, no entanto, muitos aspetos da interação de BCG com as células tumorais bem como com as células do sistema imunitário permanecem por desvendar. As células tumorais de bexiga expressam frequentemente as formas sialiladas dos antigénios de Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). Contudo ainda se desconhece o significado da sua expressão na malignidade tumoral e se afeta a eficácia da terapêutica BCG. Objetivo do estudo. Investigar o papel dos antigénios sT e sTn no fenótipo maligno de células de cancro de bexiga bem como na resposta mediada pelo sistema imunitário à terapia com BCG. Metodologia. Para tal, foram utilizadas as linhas celulares de cancro da bexiga HT1376 e MCR, geneticamente modificadas por transdução com vetores codificantes para as sialiltransferases ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, de forma a expressar homogeneamente os antigénios sT ou sTn respetivamente. Estes modelos celulares foram estudados após confronto com BCG. O nível de BCG internalizado foi avaliado por citometria de fluxo. O perfil global de expressão genética dos modelos celulares antes e após incubação com BCG foi analisado pela tecnologia de microarray. O perfil de citocinas secretadas pelos modelos celulares após incubação com BCG, bem como de macrófagos estimulados pelo secretoma de células de cancro de bexiga que por sua vez foram estimuladas previamente por BCG, foi estudado pelo sistema multiplex de “imuno-esferas”. Resultados. A análise do transcritoma dos modelos celulares revelou que grupos de genes envolvidos em funções específicas foram modulados em paralelo nos dois modelos celulares, após transdução, independentemente da sialiltransferase expressa. Ou seja, em células que expressavam a sialiltransferase ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, os genes envolvidos na regulação da segregação cromossómica e na reparação do DNA foram consistentemente regulados negativamente. Genes descritos na literatura como marcadores para o cancro de bexiga foram também modulados. A incubação com BCG resultou numa tendência ao aumento da expressão de genes relevantes na preservação e estabilidade genómica e menor malignidade, no entanto, apenas em células que expressavam sT ou sTn. Entre as dez citocinas testadas, apenas a IL-6 e IL-8 foram expressas pelas linhas celulares de cancro da bexiga, com indução destas após estimulação com BCG, e principalmente em células que expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1. Em macrófagos, citocinas inflamatórias, tais como IL-1β, IL-6 e TNFα, e a citocina anti-inflamatória IL-10, foram induzidas apenas pelo secretoma de células de cancro da bexiga confrontadas com BCG, com maior relevância quando estas expressavam ST3GAL1 ou ST6GALNAC1, prevendo a estimulação de macrófagos semelhantes aos de tipo M1 e uma melhor resposta à terapia com BCG. Conclusões. O efeito geral da expressão destas sialiltransferases e dos produtos enzimáticos sT ou sTn nas células de cancro de bexiga conduz a um fenótipo de maior malignidade. Contudo, a maior avidez de estas na produção de citocinas inflamatórias após confronto com BCG, bem como a maior capacidade de estimulação de macrófagos, predirá uma resposta à terapia com BCG mais eficaz em tumores que expressem os antigénios de TF sialilados. Tais conclusões são totalmente concordantes com os nossos mais recentes dados clínicos obtidos em colaboração, que mostram que em doentes com cancro de bexiga que expressam sTn respondem melhor a terapia BCG. ----------ABSTRACT: Background. Bladder cancer is a common malignancy representing the 6th and the 5th most incident cancer in Portugal and in Italy, respectively. More than half of the cases relapse within one year, requiring though a lifelong follow-up. Intravesical instillation of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) (an attenuated strain of Mycobacterium bovis) represents an effective immunotherapy of bladder cancer, although many aspects of the interaction of BCG with cancer cells and host immune cells remain obscure. Bladder cancer cells often express the sialylated forms of the Thomsen-Friedenreich (TF), i.e., sialil-T (sT) e sialil-Tn (sTn). However, it’s still unknown the sense of such expression in tumour malignancy and in the BCG therapy efficacy. Aim of the study. To investigate the role of the sT and sTn antigens on the malignant phenotype of bladder cancer cells and the immune mediated response to BCG therapy. Experimental. We have utilized populations of the bladder cancer cell lines HT1376 and MCR, genetically modified by transduction with the sialyltransferases ST3GAL1 or ST6GALNAC1 to express homogeneously sT or sTn antigens. The level of BCG internalized was assessed by flow cytometry. The whole gene expression profile of BCG-challenged or unchallenged bladder cancer cell lines was studied by microarray technology. The profile of cytokines secreted by BCG-challenged bladder cancer cells and that of macrophages challenged by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells was studied by multiplex immune-beads assay. Results. Transcriptome analysis of the sialyltransferase-transduced cells revealed that groups of genes involved in specific functions were regulated in parallel in the two cell lines, regardless the sialyltransferase expressed. Namely, in sialyltransferase-expressing cells, genes involved in the proper chromosomal segregation and in the DNA repair were consistently down-regulated, while genes reported in literature as markers for bladder cancer were modulated. BCG-challenging induced a tendency to up-regulation of the genes preserving genomic stability and reducing malignancy, but only in cells expressing either sT or sTn. Among the ten cytokines tested, only IL-6 and IL-8 were expressed by bladder cancer cell lines and up-regulated by BCG-challenging, mainly in sialyltransferases-expressing cells. In macrophages, inflammatory cytokines, such as IL-1β, IL-6 and TNFα, and the antinflammatory IL-10 were induced only by the secretome of BCG-challenged bladder cancer cells, particularly when expressing either sialyltransferase, predicting the stimulation of M1-like macrophages and a better response to BCG therapy. Conclusions. The general effect of the expression of the two sialyltransferases and their products in the bladder cancer cells is toward a more malignant phenotype. However, the stronger ability of sialyltransferase expressing cells to produce inflammatory cytokines upon BCG-challenging and to stimulate macrophages predicts a more effective response to BCG in tumours expressing the sialylated TF antigens. This is fully consistent with our recent clinical data obtained in collaboration, showing that patients with bladder cancer expressing sTn respond better to BCG therapy.

Extração de DNA a partir de sangue humano coagulado para aplicação nas técnicas de genotipagem de antígenos leucocitários humanos e de receptores semelhantes à imunoglobulina

O objetivo deste estudo foi padronizar uma metodologia de extração de DNA de alta qualidade a partir de amostras de sangue coagulado. Quarenta e oito amostras de sangue humano coagulado foram utilizadas para a extração de DNA pelo kit comercial EZ-DNA® (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), pelo kit de coluna Neoscience® (One Lambda Inc., San Diego, CA) e pelo método modificado de salting out. Apenas o método de salting out foi capaz de extrair altas concentrações de DNA (média, 180ng/µL), as quais foram medidas pelo detector de fluorescência Qubit® (Invitrogen, USA). Este método permitiu a amplificação dos genes HLA (human leukocyte antigens) pela tecnologia PCR-SSO (polymerase chain reaction - specific sequence of oligonucleotides) Luminex, a qual exige DNA de boa qualidade, e de genes KIR (killer cell immunoglobulin-like receptors) pela técnica made in house PCR-SSP (polymerase chain reaction-sequence specific of primers), a qual demanda uma concentração específica de DNA (10ng/µL). Concluímos que a técnica de salting out modificada foi muito eficiente, simples e rápida para a extração de DNA de amostras de sangue humano coagulado, com o objetivo de realizar a genotipagem de genes HLA e KIR.

Culturas adeptas do futebol. O espaço plural da condição adepta: práticas e identidades

No domínio da figura paradigmática do mundo do futebol do adepto – convenção que ela mesma importará problematizar –, muitas questões, problemas e articulações podem ser equacionadas. Desde logo salientar-se-á que nas suas urdiduras mais ferrenhas e investidas a condição de adepto também se constituirá em torno de sonhos, fantasias pessoais (mas com recorte intersubjectivo) cuja concretização não escapa a contingências circunstanciais (uma bola no poste, lesão inesperada de um jogador influente, erros de arbitragem, etc.). Uma convulsão de expectativas entra em jogo quanto a feitos do clube dilecto, resultados, vitórias, intimidade com ‘estrelas’ do jogo, etc. Sonhos que, por seu turno, assumirão formas próximas de sonhos acordados, tanto antecipatórios (por exemplo, imaginando o que poderão ser os lances capitais do próximo jogo ou a carreira numa certa competição, o rendimento e mais-valia de uma falada aquisição) como retrospectivos (por hipótese, ficcionando, talvez até remoendo, o que, num dado jogo passado, teria acontecido se o jogador x não tivesse falhado aquela oportunidade clara de golo, ou o guarda-redes não tivesse sofrido aquele frango). Como em relação aos protagonistas do jogo, os jogadores, que recorrentemente são descritos como a melhor coisa do futebol, também a análise dos típicos sonhos de adepto não dispensa situá-los perante a estrutura do campo do futebol português. Pelo menos em parte, os objecto e conteúdo e a padronização de tais sonhos será função do tecido de interdependências que aí se concentra. Quanto a este ponto, há que prestar especial atenção à crescente penetração do capital económico (ou da lógica de rendibilidade financeira de larga escala) quer directamente na esfera do futebol quer, paralelamente, na esfera da comunicação social desportiva, tornando ambas no essencial áreas de negócio como outras quaisquer. Entre outros impactes colaterais, esta industrialização ou mercadorização do futebol produzirá efeitos diversos, e inclusive na aparência contraditórios, sobre os próprios adeptos e as suas identidades (Giullianoti, 2002). Basta ver que, ao mesmo que tempo que induz a legitimação do adepto – tornado ele próprio protagonista do espectáculo – reduz-lhe o poder de intervir na vida do clube, dado que este poder tende a transitar (não sem resistências) da esfera associativa para a empresarial, logo dos associados para os accionistas. No caso português, acresce que a mercadorização do futebol, além de modificar e fragmentar a relação dos adeptos com o futebol (Kumar, 2004), logo as expectativas, ficções e devaneios, que nela convergem, acentuará a hipertrofia da simpatia clubista em Portugal (manifestamente concentrada em três clubes apenas), comprimindo desse jeito o espectro de clubes objectivamente capazes de insuflar nos indivíduos aquilo que, aqui, provisoriamente designaremos de crença clubista.

As dificuldades dos pequenos restaurantes do norte do Brasil: um estudo de caso no Sabor & Arte na cidade de São Miguel do Guamá

Este trabalho é um estudo de caso que ilustra o cenário da maioria das empresas de serviços alimentícios no norte do Brasil em que, geralmente, os estabelecimentos das pequenas e médias empresas não cumprem os padrões legalmente exigidos para funcionamento. Descreve a consultoria realizada no restaurante Sabor & Arte, localizado na cidade de São Miguel do Guamá, Pará, Brasil, na sequência de um pedido endereçado ao SEBRAE pelos responsáveis da empresa. Através de check-lists baseados na legislação relativa a este tipo de estabelecimento, verificaram-se as deficiências e não conformidades mais aparentes da empresa. Além disso, foram realizadas pesquisas descritivo-conclusivas para que se chegasse a conclusões concretas sobre a realidade da organização. Os resultados dessas pesquisas apontaram as necessidades e falhas do empreendimento. Esses dados foram a base para a criação de um plano de ação que corrigisse os problemas identificados a fim de incrementar a lucratividade do negócio. Para o estudo adotou-se o modelo de Gestão Integrada por Resultados com Foco em Competências (GIRFC), desenvolvido pela empresa de consultoria Gestão e Inovação Empresarial (Belém, Pará, Brasil) que objetiva ultrapassar deficiências no âmbito do negócio, bem como instruir a padronização dos estabelecimentos de acordo com as exigências da lei, intervindo assim em diferentes áreas de funcionamento: Finanças, Marketing, Processos, Gestão de Pessoas e Conformidades da Lei. O processo envolveu mudanças em todos os segmentos da empresa e como resultado espera-se o incremento da qualidade em geral, a implementação de diferenciais inovadores e a orientação do foco empresarial, direcionando estrategicamente os esforços do negócio para a obtenção de uma vantagem competitiva no mercado e retorno dos investimentos financeiros.