Mechanisms contributing to the deep chlorophyll maximum in Lake Superior

The seasonal appearance of a deep chlorophyll maximum (DCM) in Lake Superior is a striking phenomenon that is widely observed; however its mechanisms of formation and maintenance are not well understood. As this phenomenon may be the reflection of an ecological driver, or a driver itself, a lack of understanding its driving forces limits the ability to accurately predict and manage changes in this ecosystem. Key mechanisms generally associated with DCM dynamics (i.e. ecological, physiological and physical phenomena) are examined individually and in concert to establish their role. First the prevailing paradigm, “the DCM is a great place to live”, is analyzed through an integration of the results of laboratory experiments and field measurements. The analysis indicates that growth at this depth is severely restricted and thus not able to explain the full magnitude of this phenomenon. Additional contributing mechanisms like photoadaptation, settling and grazing are reviewed with a one-dimensional mathematical model of chlorophyll and particulate organic carbon. Settling has the strongest impact on the formation and maintenance of the DCM, transporting biomass to the metalimnion and resulting in the accumulation of algae, i.e. a peak in the particulate organic carbon profile. Subsequently, shade adaptation becomes manifest as a chlorophyll maximum deeper in the water column where light conditions particularly favor the process. Shade adaptation mediates the magnitude, shape and vertical position of the chlorophyll peak. Growth at DCM depth shows only a marginal contribution, while grazing has an adverse effect on the extent of the DCM. The observed separation of the carbon biomass and chlorophyll maximum should caution scientists to equate the DCM with a large nutrient pool that is available to higher trophic levels. The ecological significance of the DCM should not be separated from the underlying carbon dynamics. When evaluated in its entirety, the DCM becomes the projected image of a structure that remains elusive to measure but represents the foundation of all higher trophic levels. These results also offer guidance in examine ecosystem perturbations such as climate change. For example, warming would be expected to prolong the period of thermal stratification, extending the late summer period of suboptimal (phosphorus-limited) growth and attendant transport of phytoplankton to the metalimnion. This reduction in epilimnetic algal production would decrease the supply of algae to the metalimnion, possibly reducing the supply of prey to the grazer community. This work demonstrates the value of modeling to challenge and advance our understanding of ecosystem dynamics, steps vital to reliable testing of management alternatives.

Gender modulates the expression of calcium-regulating proteins in pediatric atrial myocardium

A differential expression of sarcoplasmic reticulum calcium-ATPase (SERCA2a) and phospholamban (PLB) characterizes the remodeling process in heart failure and atrial arrhythmias in adult patients. Gender is known to modulate the course and prognosis of different forms of heart disease. We hypothesized that gender plays a role in molecular changes of myocardial calcium regulating components already in childhood. Moreover, we studied the influence of volume overloaded (VO) on SERCA2a and PLB in pediatric patients. Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction was used to measure mRNA expression of SERCA2a and PLB in atrial myocardium from 30 pediatric patients (12 girls, 18 boys). Eighteen patients had VO right atria, and 12 patients had not-overloaded atria (NO). Protein expression was studied by Western blot. In the entire population, SERCA2a and PLB expression was not different between girls and boys. If hemodynamic overload was taken into account, SERCA2a mRNA expression was significantly reduced in the VO group compared with the NO group (P = 0.021). The VO versus NO difference was restricted to boys, which corresponds to a highly significant interaction of gender versus VO status (P = 0.002). The PLB to SERCA2a protein ratio was significantly lower in girls (P = 0.028). The decrease in SERCA2a mRNA expression in VO atrial myocardium and the PLB to SERCA2a ratio of protein expression was modulated by gender in this pediatric population. To our knowledge, this study is the first to show the impact of gender on the differential expression of calcium-regulating components in pediatric cardiac patients.

Age-dependent suppression of SERCA2a mRNA in pediatric atrial myocardium

Differential expression of sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase (SERCA2a) and phospholamban (PLB) has been shown in heart failure and atrial arrhythmias. We investigated the influence of volume overload and age on their expression in pediatric atrial myocardium. Right atrial specimens from 18 children with volume overloaded right atrium (VO) and 12 patients without overload were studied. Each group was further divided into patients less than and older than 12 months of age. Only in the younger patients SERCA2a was significantly reduced in the VO group. In younger patients PLB mRNA level tended to be lower in VO. The PLB:SERCA protein ratio was significantly reduced in the VO group. Age itself did not influence the SERCA2a and PLB expression, if the hemodynamic overload was not taken into account. This study is the first to show a combined influence of volume overload and age on atrial SERCA2a expression.

Tribologische Untersuchungen am Förderzahnriemen

Zahnriemenfördersysteme haben auf Grund ihrer wirtschaftlichen und technischen Vorteile beim Transport von Stückgütern ein breites Anwendungsfeld in den unterschiedlichen Bereichen der Industrie gefunden und gewinnen weiterhin an Bedeutung. Die Auslegung der Systeme beschränkt sich gegenwärtig im Wesentlichen auf die Zugstrang- und die Zahnfußfestigkeit des Zahnriemens. Grundlagen der Berechnungen sind oft recht vage Aussagen zur Höhe des Reibwertes zwischen dem Zahnriemen und dessen Stützschiene. Die Erhöhung der Kontakttemperatur durch die eingebrachte Reibleistung wird meist völlig vernachlässigt. In der Praxis wird oftmals auf Erfahrungswerte zurückgegriffen, wobei die Gefahr der Über- bzw. Unterdimensionierung mit erheblichen Auswirkungen auf die Lebensdauer, das Verschleißverhalten und die Betriebssicherheit besteht. 1. Anwendung von Zahnriemenförderern Das Einsatzgebiet der Zahnriemen ist neben der Antriebstechnik in zunehmendem Maße die Fördertechnik, wo diese als Zug- und Tragmittel für den Stückguttransport zur Anwendung kommen. Der Grund dieser Entwicklung lässt sich mit den günstigen Eigenschaften dieser Maschinenelemente erklären. Besonders zu erwähnen sind dabei der geräuscharme Lauf, die geringe Masse und die niedrigen Kosten in Anschaffung und Wartung. Der synchrone Lauf, der mit Zahnriemen wie auch mit Förderketten realisierbar ist, ist ein weiterer wesentlicher Vorteil. Dabei übernehmen die robusten Förderketten den Bereich der Fördertechnik, in dem große Kräfte übertragen werden müssen und stark schmutzintensive Umgebungsbedingungen vorherrschen. Haupteinsatzgebiete der Zahnriemenförderer ist der Bereich der empfindlicheren Güter mit relativ geringen Massen, wobei sich immer mehr abzeichnet, dass auch Einsatzgebiete mit schweren Werkzeugträgern erschlossen werden. Die Transportzahnriemen müssen bei dem Einsatz zahnseitig abgestützt werden, um die Gutmasse aufnehmen zu können. Stückgüter können von Zahnriemen durch Kraft- oder Formschluss transportiert werden. Der Einsatz ist von den technologischen Erfordernissen und der Art des Transportgutes abhängig. Formschluss wird meist über aufgeschweißte Formelemente / Mitnehmer realisiert. Diese Art des Transportes wird verwendet, wenn Teile: • vereinzelt, • genau positioniert, ������ zeitlich exakt getaktet, • über starke Steigungen bis hin zum vertikalen transportiert werden müssen, • bzw. sich gegenseitig nicht berühren dürfen. Abbildung 1: Formschlüssiger Transport mit aufgeschweißten Formelementen Die Art und die Form des auf dem Zahnriemenrücken aufgebrachten Formelementes werden vom Gut selbst und dem Einsatzzweck bestimmt. Eine Vielzahl von verschiedenen Elementen wird von der Industrie standardmäßig angeboten. Bei der kraftschlüssigen Variante können zwei grundlegende Arten unterschieden werden: Zum einen Zahnriemenbeschichtungen mit sehr hohem Reibwert, zum anderen mit sehr niedrigen Reibwerten. Beschichtungen mit sehr hohem Reibwert (z. B. Silikon, PUR-Schaum, Naturkautschuk) eignen sich besonders für Schrägförderer und Abzugsbänder sowie für einfache Positionieraufgaben. Dabei wird eine relative Verschiebung des Gutes zum Zahnriemen durch den hohen Reibwert in der Kontaktzone behindert. Abbildung 2: Abzugsband für biegeschlaffe Flachformkörper z. B. Folie, Textilien Zahnriemenrückenbeschichtungen mit geringen Reibwerten bestehen meist aus Polyamidgewebe und eignen sich besonders gut für den Staubetrieb. Hierbei dient der Zahnriemen selbst als Zwischenspeicher. Bei Bedarf können die Güter freigegeben werden. Dabei muss aber sichergestellt werden, dass auch die Auflagefläche des Fördergutes für einen solchen Einsatzzweck geeignet ist, da es zu einer Relativbewegung zwischen Gut und undZahnriemen kommt. Abbildung 3: Stauförderer Parallelförderer können sowohl als reibschlüssige als auch als formschlüssige Variante ausgeführt werden. Ihr Vorteil liegt darin, dass größere Güter, z. B. Flachglas, Bleche usw. auf zwei oder mehreren Riemen aufliegen und durch die gleiche Geschwindigkeit der synchron angetriebenen Riemen keine Verschiebung des Gutes erfolgt. Würde der Antrieb nicht über Zahnriemen erfolgen, sondern über Flachriemen bzw. Gurte, wäre außerdem ein Zugmittel in der Breite des Fördergutes notwendig. Daraus ergibt sich zusätzlich eine wesentliche Massereduzierung der Zugmittel für den Stückguttransport in der Fördertechnik. Abbildung 4: Parallelförderer für kraftschlüssigen Transport Allen diesen Varianten ist jedoch gemein, dass der Zahnriemen auf einer Stützschiene gleitet und die Normalkraft des Transportgutes in Verbindung mit Riemengeschwindigkeit und Reibwert eine Reibleistung und damit Wärme erzeugt. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt fehlen exakte Angaben zu den Reibwerten für die einzelnen Gleitpaarungen. Auch ist eine Veränderung dieser Reibwerte bei Geschwindigkeits-, Temperatur-, und Belastungsänderung ungeklärt. Des Weiteren ist es auch notwendig, die Belastungsgrenzen für die Auslegung von Zahnriemenförderern zu definieren und das Verschleißverhalten zu kennen. Die derzeit üblichen Auslegungskriterien für diese fördertechnischen Anlagen sind Zugstrangfestigkeit und Zahnfußfestigkeit. Dabei bleibt jedoch die Erwärmung des Zugmittels und der Stützschiene durch die eingebrachte Reibleistung und den sich ändernden Reibwert unbeachtet. Insbesondere bei kurzen Förderstrecken mit großen Lasten bzw. hohen Transportgeschwindigkeiten ist die Gefahr von thermischen Überlastungen gegeben, welche zu erhöhtem Verschleiß bzw. zum Totalausfall der Anlage führen kann. Soll dieses zusätzliche Auslegungskriterium angewandt werden, sind Erkenntnisse aus den Gebieten der Tribologie und der Wärmelehre/Thermodynamik anzuwenden. Zum einen ist eine Bestimmung der entstehenden Reibleistung notwendig und zum anderen der abgeführte Wärmestrom zu ermitteln. Die sehr komplexen Zusammenhänge werden durch konstruktive und technologische Größen beschrieben, welche sich wiederum gegenseitig beeinflussen. 2. Reibwerte in der Gleitpaarung In DIN ISO 7148-2 sind die Besonderheiten bei der tribologischen Prüfung von polymeren Werkstoffen beschrieben. Dabei wird explizit darauf hingewiesen, dass die Prüfanordnung möglichst der praktischen Anwendung entsprechen sollte, um die Übertragbarkeit der Prüfergebnisse zu gewährleisten. Deshalb wurde ein Versuchsstand konzipiert, der die Kontaktverhältnisse von Zahnriemen und Stützschienen möglichst real abbildet (Abb.5). Abbildung 5: Schematischer Aufbau des Versuchsstandes Für die Untersuchung der Zahnriemenpaarung wird der Zahnriemen mit der Zahnseite nach oben aufgespannt. Auf die nach oben zeigende Zahnseite wird eine planparallele Platte des jeweiligen Gleitschienenmaterials aufgelegt. Die Flächenpressung der Paarung lässt sich über aufgebrachte Massestücke variieren und die Reibkraft über den Kraftsensor direkt über eine Schnittstelle zur Aufzeichnung an einen Rechner weiterleiten. Zur Ermittlung der Kontakttemperaturen wurden Bohrungen in das Gleitschienenmaterial eingebracht, die unmittelbar bis an die Oberfläche der Kontaktfläche reichen und mit Thermoelementen bestückt sind. Die Abstützung des Zahnriemens erfolgt auf einem Flachriemen, der wiederum auf einer Rollenbahn abrollt. Dadurch wird ein zusätzlicher Wärmeeintrag durch eine gleitende Abstützung vermieden. Die Gleitgeschwindigkeit und Flächenpressung auf die Paarung werden in Stufen variiert. Als Versuchszahnriemen dienten PU-Riemen mit und ohne zahnseitiger Polyamidbeschichtung der Abmessung 1250 x 25 T10. Abbildung 6: Reibwertmessungen an PU-Zahnriemen ohne Beschichtung (Kurzzeitversuche) Die ermittelten Messwerte der Gleitreibungszahl µ für verschiedene PU-Zahnriemen – Stützschienenkombinationen sind in Abbildung 6 dargestellt. Die schraffierten Balken geben die Reibungszahlempfehlungen von Herstellern sowie aus Literaturquellen für diese Paarungen wieder. Oft wird jedoch darauf hingewiesen, dass für einen konkreten Anwendungsfall eigene Untersuchungen durchzuführen sind. Die grauen Balken geben die bei einer Versuchsdauer von bis zu 8 Stunden ermittelten Reibungszahlen wieder. Dabei wurden sowohl die Flächenpressungen als auch die Gleitgeschwindigkeiten variiert. Bei einigen Paarungen (Holz (Abb.7)) konnte ein sehr starker abrasiver Verschleiß am Zahnriemen festgestellt werden. Diese Werkstoffkombinationen sind nur für geringe Belastungen geeignet. Abbildung 7: Oberfläche PU-Zahnriemen, verschlissen an Schichtholz Die Paarungen in Verbindung mit Stahl- bzw. Aluminiumstützschienen neigen zu stick-slip- Erscheinungen verbunden mit starker Geräuschentwicklung. Aufgrund der relativ hohen Reibungszahlen wurden keine Dauerversuche an unbeschichteten PU-Zahnriemen durchgeführt. Für die weiteren Untersuchungen wurden ausschließlich polyamidbeschichtete Zahnriemen verwendet. In Abbildung 8 werden die Ergebnisse der Reibwertuntersuchungen an PAZ-Zahnriemen (Polyamidgewebebeschichtung auf der Zahnseite) dargestellt. Die schraffierten Balken stellen wiederum die bisherigen Empfehlungen dar, die grauen Balken die ermittelten Messwerte im Kurzzeitversuch (bis 8 Stunden) und die schwarzen Balken die Messwerte im Langzeitversuch (zwischen 7 und teilweise bis zu 100 Tagen). Hier ist die Übereinstimmung der Reibungszahlen zwischen Empfehlungen und Kurzzeitmesswerten sehr gut. Der deutliche Anstieg der Werte im weiteren Verlauf der Untersuchungen deutet daraufhin, dass der tribologische Einlauf innerhalb von 8 Stunden meist noch nicht abgeschlossen ist und dass nach fortlaufender Belastung weitere tribologische Phänomene die Kontaktverhältnisse ändern. Abbildung 8: Reibungszahlen an polyamidbeschichteten PU-Zahnriemen (PAZ) in Verbindung mit verschiedenen Gleitschienen Bei den Paarungen mit einer Stützschiene aus Stahl, Aluminium oder Schichtholz konnte eine polymere Filmbildung auf der Gleitfläche beobachtet werden. In Abbildung 9 und 10 ist die Entwicklung am Beispiel von Stahlproben zu sehen. Gemeinsam bei diesen Paarungen ist die fortschreitende Schichtbildung, verbunden mit einer Reibwerterhöhung. Der Verschleiß der Gewebeschicht am Zahnriemen setzt bei größeren Reibungszahlen ein, was zu deren weiterer Erhöhung führt Ein weiterer Einsatz führt zur vollständigen Abtragung der Gewebeschicht und damit zu einer neuen tribologischen Paarung PU-Zahnriemen ��� Polymerschicht. Abbildung 9: beginnende polymere Ablagerung auf Stahlprobe Rz28 Abbildung 10: nahezu geschlossener polymerer Film auf Stahlprobe Rz28 Am Beispiel der Paarung PAZ Zahnriemen – Stahlstützschiene wird die Entwicklung der Reibungszahl über die Zeit des Gleitkontaktes in Abbildung 12 dargestellt. Dabei wurde die Oberflächenrauigkeit (Rz 6,3; Rz 28) durch entsprechende Bearbeitungen variiert. Der relativ starke Anstieg an der Paarung Rz 6,3 kann zum einen auf die hohe Gleitgeschwindigkeit und den damit entsprechend langen Gleitweg zurückgeführt werden, zum anderen auf den höheren adhäsiven Anteil durch die relativ glatte Oberfläche und der damit erhöhten Kontaktfläche. Abbildung 11 zeigt einen verschlissenen Zahnkopf. Abbildung 9: Verschlissene Zahnkopfflanke, PAZ - Stahl Abbildung 10: Änderung der Reibungszahl im zeitlichen Verlauf an der Paarung ZR PA – Stahl Die Erhöhung der Reibungszahlen an der Paarung PE UHMW - polyamidbeschichteter Zahnriemen kann nicht unmittelbar auf direkte Verschleißerscheinungen zurückgeführt werden. Sowohl die Gleitfläche als auch der Zahnriemen weisen auch nach längerem Kontakt keine sichtbaren Schäden auf: Es bildet sich kein polymerer Film auf der PE- UHMW- Gleitfläche heraus. In Abbildung 11 wird die Änderung der Reibungszahl dargestellt. Es wurden Paarungen mit steigendem p•v-Wert gewählt. Mit höheren Werten für die eingebrachte Leistung pro Flächeneinheit ist ein schnellerer Anstieg der Reibungszahlen zu verzeichnen. Abbildung 11: Änderung der Reibungszahl im zeitlichen Verlauf an der Paarung ZR PAZ – PE UHMW Die Erhöhung der Reibwerte zieht nicht nur eine Steigerung der Antriebsleistung nach sich, sondern auch eine Zunahme der Reibleistung und damit einen Anstieg der Kontakttemperatur. Hat diese einen bestimmten Wert erreicht, kommt es zum Aufschmelzen der Gleitflächen und damit zum Totalausfall der Paarung (Abbildungen 14, 15, 16). Ebenfalls tritt durch die Reibwerterhöhung eine höhere Belastung des Zugstranges und der Zahnfüße im Einlauf des Zahnriemens auf. Für eine konstruktive Auslegung entsprechender Zahnriemenförderer ist dies durch entsprechende Sicherheitsfaktoren zu berücksichtigen. Abbildung 12: Aufgeschmolzene PE-Laufschiene, 2-fach vergrößert Abbildung 13: geschmolzene Faserbündel 20- fach Abbildung 14: zerstörtes Gewebe in Folge thermischer Überlastung 3. Thermische Zusammenhänge Die Temperaturerhöhung in der Wirkstelle zwischen Zahnriemen und Stützschiene kann im stationären Zustand in der vereinfachten Form: p Flächenpressung v Gleitgeschwindigkeit µ Reibungszahl A Kontaktfläche / jeweilige Oberfläche a Wärmeübergangskoeffizient l Wärmeleitwert Abbildung 15: Kontaktmodell dargestellt werden. Dabei werden verschiedene Vereinfachungen angenommen: • Reibleistung wird auf die gesamte Fläche gleichmäßig verteilt, • Wärmestrom erfolgt nur in Normalenrichtung zur Gleitfläche, • konstante Reibleistung über die gesamte Zeit, • keine Ableitung des Wärmestromes über Stirn- und Seitenflächen, • eingeschwungener Gleichgewichtszustand der Temperaturverteilung, • gleiche Temperatur über der jeweiligen Oberfläche, • gleiche Strömungsverhältnisse und -bedingungen an der jeweiligen Oberfläche, • konstante - und - Werte über der gesamten Fläche. Der Temperaturverlauf für verschiedene Materialpaarungen ist in Abbildung 16 dargestellt. Der unterschiedliche Verlauf der Kurven kann mit den verschiedenen eingebrachten Reibleistungen durch sich unterschiedlich einstellende Reibungszahlen und durch die unterschiedlichen Wärmeleitwerte und Wärmekapazitäten der Gleitschienen erklärt werden. Ist eine stationäre Temperatur erreicht, so gilt vereinfacht die Vorstellung von Abbildung 15. Abbildung 16: thermischer Einlauf verschiedener Stützschienenmaterialien Die sich einstellende Gleitflächentemperatur ist im Wesentlichen von den in Abbildung 17 dargestellten Einflüssen abhängig. Da die Kontakttemperatur die Grenztemperatur (ca. 65°C) nicht überschreiten darf, um eine thermische Schädigung zu vermeiden, sind die entsprechenden Einflussgrößen zweckmäßig zu wählen. Die Parameter Gleitgeschwindigkeit und Flächenpressung sind meist durch die technologischen Erfordernisse vorgegeben, die Reibungszahl stellt sich entsprechend der tribologischen Paarung ein und die Wärmeleitfähigkeit ist ein kaum zu verändernder Stoffwert. Die Einflussmaßnahmen erstrecken sich also meist auf die Schichtstärke s der Abstützung und den Wärmeübergang zur Umgebung. Abbildung 17: Technologische und konstruktive Einflüsse auf die Gleitflächentemperatur in der Wirkstelle 4. Zusammenfassung Die Kenntnis der sich nach einer entsprechenden Einlaufphase einstellenden Reibungszahlen für verschiedene Zahnriemen – Stützschienenkombinationen ist für die Anwender und Entwickler wichtig, da damit eine optimale Auslegung von Zahnriemenförderern erfolgen kann. Diese optimale Auslegung realisiert dann in der Anwendung eine ökonomische Lebensdauer bei verbesserter konstruktiver Auslegung. Die bisher weitgehend unbeachtete Temperaturerhöhung in der Gleitschienen – Zahnriemenkombination durch die eingebrachte Reibleistung sollte zukünftig ein weiteres Auslegungskriterium darstellen. Eine erste Annäherung an dieses Problem kann durch die Form: p Flächenpressung v Gleitgeschwindigkeit µ Reibungszahl A Kontaktfläche / jeweilige Oberfläche K Wärmeabgabekoeffizient DT max. zul. Temperaturerhöhung K= f (µ, p, v, Gleitschienenmaterial, Zahnriemenausführung, Maschinenkonstante…) gezeigt werden. Für die Ermittlung des Wärmeabgabekoeffizienten sind entsprechende Untersuchungen durchzuführen und Zusammenhänge zu ermitteln. Bestimmte Praxiseinflüsse (Umgebungstemperaturschwankungen, Verschmutzung, Stöße, Montagefehler) sind in die bisherigen Untersuchungen noch nicht eingeflossen, sollten aber nicht unbeachtet bleiben. Durch eine vorteilhafte Auslegung der Förderanlagen kann eine höhere Zuverlässigkeit bei geringeren Wechselintervallen und niedrigeren Kosten für den Betrieb erreicht werden.

Alpha1-syntrophin mutations identified in sudden infant death syndrome cause an increase in late cardiac sodium current.

BACKGROUND Sudden infant death syndrome (SIDS) is a leading cause of death during the first 6 months after birth. About 5% to 10% of SIDS may stem from cardiac channelopathies such as long-QT syndrome. We recently implicated mutations in alpha1-syntrophin (SNTA1) as a novel cause of long-QT syndrome, whereby mutant SNTA1 released inhibition of associated neuronal nitric oxide synthase by the plasma membrane Ca-ATPase PMCA4b, causing increased peak and late sodium current (I(Na)) via S-nitrosylation of the cardiac sodium channel. This study determined the prevalence and functional properties of SIDS-associated SNTA1 mutations. METHODS AND RESULTS Using polymerase chain reaction, denaturing high-performance liquid chromatography, and DNA sequencing of SNTA1's open reading frame, 6 rare (absent in 800 reference alleles) missense mutations (G54R, P56S, T262P, S287R, T372M, and G460S) were identified in 8 (approximately 3%) of 292 SIDS cases. These mutations were engineered using polymerase chain reaction-based overlap extension and were coexpressed heterologously with SCN5A, neuronal nitric oxide synthase, and PMCA4b in HEK293 cells. I(Na) was recorded using the whole-cell method. A significant 1.4- to 1.5-fold increase in peak I(Na) and 2.3- to 2.7-fold increase in late I(Na) compared with controls was evident for S287R-, T372M-, and G460S-SNTA1 and was reversed by a neuronal nitric oxide synthase inhibitor. These 3 mutations also caused a significant depolarizing shift in channel inactivation, thereby increasing the overlap of the activation and inactivation curves to increase window current. CONCLUSIONS Abnormal biophysical phenotypes implicate mutations in SNTA1 as a novel pathogenic mechanism for the subset of channelopathic SIDS. Functional studies are essential to distinguish pathogenic perturbations in channel interacting proteins such as alpha1-syntrophin from similarly rare but innocuous ones.

Syntrophin mutation associated with long QT syndrome through activation of the nNOS-SCN5A macromolecular complex.

Mutations in 11 genes that encode ion channels or their associated proteins cause inherited long QT syndrome (LQTS) and account for approximately 75-80% of cases (LQT1-11). Direct sequencing of SNTA1, the gene encoding alpha1-syntrophin, was performed in a cohort of LQTS patients that were negative for mutations in the 11 known LQTS-susceptibility genes. A missense mutation (A390V-SNTA1) was found in a patient with recurrent syncope and markedly prolonged QT interval (QTc, 530 ms). SNTA1 links neuronal nitric oxide synthase (nNOS) to the nNOS inhibitor plasma membrane Ca-ATPase subtype 4b (PMCA4b); SNTA1 also is known to associate with the cardiac sodium channel SCN5A. By using a GST-fusion protein of the C terminus of SCN5A, we showed that WT-SNTA1 interacted with SCN5A, nNOS, and PMCA4b. In contrast, A390V-SNTA1 selectively disrupted association of PMCA4b with this complex and increased direct nitrosylation of SCN5A. A390V-SNTA1 expressed with SCN5A, nNOS, and PMCA4b in heterologous cells increased peak and late sodium current compared with WT-SNTA1, and the increase was partially inhibited by NOS blockers. Expression of A390V-SNTA1 in cardiac myocytes also increased late sodium current. We conclude that the A390V mutation disrupted binding with PMCA4b, released inhibition of nNOS, caused S-nitrosylation of SCN5A, and was associated with increased late sodium current, which is the characteristic biophysical dysfunction for sodium-channel-mediated LQTS (LQT3). These results establish an SNTA1-based nNOS complex attached to SCN5A as a key regulator of sodium current and suggest that SNTA1 be considered a rare LQTS-susceptibility gene.

Design, synthesis and pharmacological characterization of analogs of 2-aminoethyl diphenylborinate (2-APB), a known store-operated calcium channel blocker, for inhibition of TRPV6-mediated calcium transport

2-Aminoethyl diphenylborinate (2-APB) is a known modulator of the IP3 receptor, the calcium ATPase SERCA, the calcium release-activated calcium channel Orai and TRP channels. More recently, it was shown that 2-APB is an efficient inhibitor of the epithelial calcium channel TRPV6 which is overexpressed in prostate cancer. We have conducted a structure-activity relationship study of 2-APB congeners to understand their inhibitory mode of action on TRPV6. Whereas modifying the aminoethyl moiety did not significantly change TRPV6 inhibition, substitution of the phenyl rings of 2-APB did. Our data show that the diaryl borinate moiety is required for biological activity and that the substitution pattern of the aryl rings can influence TRPV6 versus SOCE inhibition. We have also discovered that 2-APB is hydrolyzed and transesterified within minutes in solution.

Transient Neonatal Zinc Deficiency Caused by a Heterozygous G87R Mutation in the Zinc Transporter ZnT-2 (SLC30A2) Gene in the Mother Highlighting the Importance of Zn (2+) for Normal Growth and Development

Suboptimal dietary zinc (Zn(2+)) intake is increasingly appreciated as an important public health issue. Zn(2+) is an essential mineral, and infants are particularly vulnerable to Zn(2+) deficiency, as they require large amounts of Zn(2+) for their normal growth and development. Although term infants are born with an important hepatic Zn(2+) storage, adequate Zn(2+) nutrition of infants mostly depends on breast milk or formula feeding, which contains an adequate amount of Zn(2+) to meet the infants' requirements. An exclusively breast-fed 6 months old infant suffering from Zn(2+) deficiency caused by an autosomal dominant negative G87R mutation in the Slc30a2 gene (encoding for the zinc transporter 2 (ZnT-2)) in the mother is reported. More than 20 zinc transporters characterized up to date, classified into two families (Slc30a/ZnT and Slc39a/Zip), reflect the complexity and importance of maintaining cellular Zn(2+) homeostasis and dynamics. The role of ZnTs is to reduce intracellular Zn(2+) by transporting it from the cytoplasm into various intracellular organelles and by moving Zn(2+) into extracellular space. Zips increase intracellular Zn(2+) by transporting it in the opposite direction. Thus the coordinated action of both is essential for the maintenance of Zn(2+) homeostasis in the cytoplasm, and accumulating evidence suggests that this is also true for the secretory pathway of growth hormone.

Characterization of the Agrobacterium tumefaciens VirB2 pilin of the VirB/D4 Type IV Secretion System

The Agrobacterium tumefaciens VirB/D4 type IV secretion system (T4SS) delivers oncogenic T-DNA and effector proteins to susceptible plant cells. This leads to the formation of tumors termed Crown Galls. The VirB/D4 T4SS is comprised of 12 subunits (VirB1 to VirB11 and VirD4), which assemble to form two structures, a secretion channel spanning the cell envelope and a T-pilus extending from the cell surface. In A. tumefaciens, the VirB2 pilin subunit is required for assembly of the secretion channel and is the main subunit of the T-pilus. The focus of this thesis is to define key reactions associated with the T4SS biogenesis pathway involving the VirB2 pilin. Topology studies demonstrated that VirB2 integrates into the inner membrane with two transmembrane regions, a small cytoplasmic loop, and a long periplasmic loop comprised of covalently linked N and C termini. VirB2 was shown by the substituted cysteine accessibility method (SCAM) to adopt distinct structural states when integrated into the inner membrane and when assembled as a component of the secretion channel and the T-pilus. The VirB4 and VirB11 ATPases were shown by SCAM to modulate the structural state of membrane-integrated VirB2 pilin, and evidence was also obtained that VirB4 mediates extraction of pilin from the membrane. A model that VirB4 functions as a pilin dislocase by an energy-dependent mechanism was further supported by coimmunoprecipitation and osmotic shock studies. Mutational studies identified two regions of VirB10, an N-terminal transmembrane domain and an outer membrane-associated domain termed the antennae projection, that contribute selectively to T-pilus biogenesis. Lastly, characterization of a VirB10 mutant that confers a ‘leaky’ channel phenotype further highlighted the role of VirB10 in gating substrate translocation across the outer membrane as well as T-pilus biogenesis. Results of my studies support a working model in which the VirB4 ATPase catalyzes dislocation of membrane-integrated pilin, and distinct domains of VirB10 coordinate pilin incorporation into the secretion channel and the extracellular T-pilus.

Characterization of Hsp70 binding and nucleotide exchange by the yeast Hsp110 chaperone Sse1.

SSE1 and SSE2 encode the essential yeast members of the Hsp70-related Hsp110 molecular chaperone family. Both mammalian Hsp110 and the Sse proteins functionally interact with cognate cytosolic Hsp70s as nucleotide exchange factors. We demonstrate here that Sse1 forms high-affinity (Kd approximately 10-8 M) heterodimeric complexes with both yeast Ssa and mammalian Hsp70 chaperones and that binding of ATP to Sse1 is required for binding to Hsp70s. Sse1.Hsp70 heterodimerization confers resistance to exogenously added protease, indicative of conformational changes in Sse1 resulting in a more compact structure. The nucleotide binding domains of both Sse1/2 and the Hsp70s dictate interaction specificity and are sufficient for mediating heterodimerization with no discernible contribution from the peptide binding domains. In support of a strongly conserved functional interaction between Hsp110 and Hsp70, Sse1 is shown to associate with and promote nucleotide exchange on human Hsp70. Nucleotide exchange activity by Sse1 is physiologically significant, as deletion of both SSE1 and the Ssa ATPase stimulatory protein YDJ1 is synthetically lethal. The Hsp110 family must therefore be considered an essential component of Hsp70 chaperone biology in the eukaryotic cell.

Evidence for VirB4-mediated dislocation of membrane-integrated VirB2 pilin during biogenesis of the Agrobacterium VirB/VirD4 type IV secretion system.

Agrobacterium VirB2 pilin is required for assembly of the VirB/VirD4 type IV secretion system (T4SS). The propilin is processed by signal sequence cleavage and covalent linkage of the N and C termini, and the cyclized pilin integrates into the inner membrane (IM) as a pool for assembly of the secretion channel and T pilus. Here, by use of the substituted cysteine accessibility method (SCAM), we defined the VirB2 IM topology and then identified distinct contributions of the T4SS ATPase subunits to the pilin structural organization. Labeling patterns of Cys-substituted pilins exposed to the membrane-impermeative, thiol-reactive reagent 3-(N-maleimidopropionyl)biocytin (MPB) supported a topology model in which two hydrophobic stretches comprise transmembrane domains, an intervening hydrophilic loop (residues 90 to 94) is cytoplasmic, and the hydrophilic N and C termini joined at residues 48 and 121 form a periplasmic loop. Interestingly, the VirB4 ATPase, but not a Walker A nucleoside triphosphate (NTP) binding motif mutant, induced (i) MPB labeling of Cys94, a residue that in the absence of the ATPase is located in the cytoplasmic loop, and (ii) release of pilin from the IM upon osmotic shock. These findings, coupled with evidence for VirB2-VirB4 complex formation by coimmunoprecipitation, support a model in which VirB4 functions as a dislocation motor to extract pilins from the IM during T4SS biogenesis. The VirB11 ATPase functioned together with VirB4 to induce a structural change in the pilin that was detectable by MPB labeling, suggestive of a role for VirB11 as a modulator of VirB4 dislocase activity.

Enterococcus faecalis PcfC, a spatially localized substrate receptor for type IV secretion of the pCF10 transfer intermediate.

Upon sensing of peptide pheromone, Enterococcus faecalis efficiently transfers plasmid pCF10 through a type IV secretion (T4S) system to recipient cells. The PcfF accessory factor and PcfG relaxase initiate transfer by catalyzing strand-specific nicking at the pCF10 origin of transfer sequence (oriT). Here, we present evidence that PcfF and PcfG spatially coordinate docking of the pCF10 transfer intermediate with PcfC, a membrane-bound putative ATPase related to the coupling proteins of gram-negative T4S machines. PcfC and PcfG fractionated with the membrane and PcfF with the cytoplasm, yet all three proteins formed several punctate foci at the peripheries of pheromone-induced cells as monitored by immunofluorescence microscopy. A PcfC Walker A nucleoside triphosphate (NTP) binding site mutant (K156T) fractionated with the E. faecalis membrane and also formed foci, whereas PcfC deleted of its N-terminal putative transmembrane domain (PcfCDelta N103) distributed uniformly throughout the cytoplasm. Native PcfC and mutant proteins PcfCK156T and PcfCDelta N103 bound pCF10 but not pcfG or Delta oriT mutant plasmids as shown by transfer DNA immunoprecipitation, indicating that PcfC binds only the processed form of pCF10 in vivo. Finally, purified PcfCDelta N103 bound DNA substrates and interacted with purified PcfF and PcfG in vitro. Our findings support a model in which (i) PcfF recruits PcfG to oriT to catalyze T-strand nicking, (ii) PcfF and PcfG spatially position the relaxosome at the cell membrane to stimulate substrate docking with PcfC, and (iii) PcfC initiates substrate transfer through the pCF10 T4S channel by an NTP-dependent mechanism.

Agrobacterium ParA/MinD-like VirC1 spatially coordinates early conjugative DNA transfer reactions.

Agrobacterium tumefaciens translocates T-DNA through a polar VirB/D4 type IV secretion (T4S) system. VirC1, a factor required for efficient T-DNA transfer, bears a deviant Walker A and other sequence motifs characteristic of ParA and MinD ATPases. Here, we show that VirC1 promotes conjugative T-DNA transfer by stimulating generation of multiple copies per cell of the T-DNA substrate (T-complex) through pairwise interactions with the processing factors VirD2 relaxase, VirC2, and VirD1. VirC1 also associates with the polar membrane and recruits T-complexes to cell poles, the site of VirB/D4 T4S machine assembly. VirC1 Walker A mutations abrogate T-complex generation and polar recruitment, whereas the native protein recruits T-complexes to cell poles independently of other polar processing factors (VirC2, VirD1) or T4S components (VirD4 substrate receptor, VirB channel subunits). We propose that A. tumefaciens has appropriated a progenitor ParA/MinD-like ATPase to promote conjugative DNA transfer by: (i) nucleating relaxosome assembly at oriT-like T-DNA border sequences and (ii) spatially positioning the transfer intermediate at the cell pole to coordinate substrate-T4S channel docking.

NOVEL MECHANISMS OF ANTIGEN PROCESSING THAT ENHANCE BCG VACCINE EFFICACY

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis, is the most lethal single infectious agent afflicting man today causing 2 million deaths per year. The World Health Organization recommends a vaccine as the best option to prevent this disease. The current vaccine, BCG, has a variable efficacy and does not protect adults. It is known that BCG vaccine becomes sequestered in special phagosome compartments of macrophages that do not fuse with lysosomes. Since lysosome fusion is necessary for peptide production and T cell priming leading to protective TH1 immunity, we hypothesized that vaccine efficacy is reduced and occurs perhaps due to non-lysosome dependent mechanisms. We therefore proposed an in depth analysis of phagosome environment, and its proteome to unravel mechanisms of antigen processing and presentation. We initially discovered that three mechanisms of pH regulation including vacuolar proton ATPase, phagocyte oxidase and superoxide dismutase (SOD) secretion from BCG vaccine affect antigen processing within phagosomes. These studies led to the discovery that a mutant of BCG vaccine which lacked SOD was a better vaccine. Subsequently, the proteomic analysis of vaccine phagosomes led to the discovery of novel protease (γ-secretase) enriched on BCG vaccine phagosomes. We then demonstrated that these proteases generated a peptide from the BCG vaccine which was presented through the MHC-II pathway to T cells and induced a TH1 response. The specificity of antigen production from γ-secretase was confirmed through siRNA knockdown of the components of the protease namely, nicastrin, presenilin and APH, which led to a decrease in antigen presentation. We therefore conclude that, even though BCG phagosomes are sequestered and do not fuse with lysosomes to generate peptide antigens, there are complex and novel in situ mechanisms within phagosomes that are capable of generating an immune response. We conclude that TH1 immunity to BCG vaccine arises mostly due to non-lysosome dependent immune mechanisms of macrophages and dendritic cells.

A study of xlcaax-1: Patterns of localization, possible function and usefulness as a developmental marker

Morphogenesis is the process by which the 3-dimensional structure of the developing embryo takes shape. We are studying xlcaax-1, a gene whose product can be used as a molecular marker for several morphogenetic events. We report here the cellular and subcellular localization of the xlcaax-1 protein during development of Xenopus laevis. Whole mount immunocytochemistry and immunoperoxidase staining of tissue sections showed that during development the xlcaax-1 protein accumulation was coincident with the differentiation of the epidermis, pronephros and mesonephros. In the pronephros and mesonephros the xlcaax-1 protein was localized to the basolateral membrane of differentiated tubule epithelial cells. Thus, the xlcaax-1 protein served as a marker for tubule formation and polarization during Xenopus kidney development. Xlcaax-1 may also be used as a marker for the functional differentiation of the epidermis and the epidermally derived portions of the lens and some cranial nerves. The xlcaax-1 protein was most abundant in kidney and immunogold EM analysis showed that the xlcaax-1 protein was highly enriched in the basal infoldings of the basolateral membrane of the epithelial cells in adult kidney distal tubules. The xlcaax-1 protein was also localized in other ion transporting epithelia. The localization pattern and preliminary functional assays of xlcaax-1 suggest that the protein may function in association with an ion transport channel or pump.^ Cell migration and cell-cell interactions play important roles in numerous processes during morphogenesis. One of these is the formation of the pronephric (wolffian) duct (PD), which connects the pronephros to the cloaca. It is currently accepted that in most amphibians the pronephric duct is formed by active migration of the pronephric duct rudiment (PDR) cells along a pre-determined pathway. However, there is evidence that in Xenopus, the PD may be formed entirely by in situ segregation of cells out of the lateral mesoderm. In this study, we showed, using PDR ablation and X. laevis - X. borealis chimeras, that PD elongation in Xenopus required both active cell migration and an induced recruitment of cells from the posterior lateral plate mesoderm. We also showed that PDR cell migration was limited to only a few stages during development and that this temporal control is due, at least in part, to changes in the competence of the PD pathway to support cell migration. In addition, our data suggested that an alkaline phosphatase (APase) adhesion gradient may be involved in determining this competence. ^