Dor no Corpo ou Dor na Alma? Visões Contemporâneas sobre a Fibromialgia.

Dentro das síndromes de dor crônica, caracterizadas pela manifestação de sintomas somáticos na ausência de uma etiologia médica identificável, a fibromialgia constitui uma das categorias mais misteriosas, devido à presença de numerosos sintomas associados - tais como fadiga, perturbações do sono e alterações da memória e da concentração e pela elevada comorbidade com transtornos de ansiedade e de humor, especialmente com a depressão. Na atualidade, a fibromialgia atinge até 5% da população e afeta profundamente a qualidade de vida dos sujeitos diagnosticados, se instituindo como um importante problema de saúde pública, realidade que demanda o aumento dos estudos relativos à doença. Partindo da revisão bibliográfica das publicações cientificas sobre fibromialgia nos últimos anos (2010-2013), procurou-se alcançar uma melhor visão das abordagens contemporâneas sobre a doença em termos da sua compreensão, classificação e diagnóstico. Os resultados obtidos através desta revisão apontaram a existência de problemas inerentes à concepção da natureza ontológica e epistemológica da dor, cujas manifestações da ordem objetivo e subjetivo dor física/ dor psíquica - embaralham as categorias compreensivas que definem a visão moderna do ser humano nas suas diferentes dimensões existenciais, dificultando a construção de instrumentos de medida e de sistemas classificatórios que permitam uma abordagem mais sofisticada da fibromialgia.

O sagui-da-serra-escuro (Callithrix aurita) e os saguis invasores no Parque Nacional da Serra dos Órgãos, RJ, Brasil: distribuição espacial e estratégias de conservação

O sagui-da-serra-escuro (Callithrix aurita) (É.Geoffroy, 1812) é uma espécie endêmica da Mata Atlântica e ameaçada de extinção, considerada em perigo. Callithrix jacchus e C. penicillata são espécies invasoras no Estado do Rio de Janeiro, que competem com C. aurita pelos mesmos recursos, além de formarem híbridos. Nesse contexto, avaliamos a distribuição espacial das espécies de saguis (nativa e invasoras) no interior e entorno do Parque Nacional da Serra dos Órgãos (PARNASO), RJ, Brasil, através do método de playback, entrevistas, e a modelagem de ocupação e detecção. Além disso, comparamos os dados de distribuição atual com os registros de ocorrência anteriores a esse estudo. Os resultados mostraram que a população de saguis nativos e invasores presentes no interior no parque possuem probabilidade de ocupação (0,20 e 0,22), detecção (0,22 e 0,26) e abundância (12,65 e 13,68 grupos) semelhantes. A ocupação de C. aurita está relacionada às áreas do parque mais afastadas da estrada e com menor interferência humana, provavelmente pelo efeito da elevada altitude nessas regiões. Enquanto que a ocupação dos saguis invasores está relacionada à proximidade dos limites do parque e a maior interferência humana, tanto em maiores altitudes quanto em menores. Registramos o processo de hibridação entre saguis nativos e invasores, e a formação de grupos mistos entre eles, em diversos pontos da região de Petrópolis, inclusive no interior do parque, evidenciando as consequências do processo de invasão. Concluímos que a população de Callithrix aurita no PARNASO é pequena, restrita a uma única região do parque, e parte dela possui contato com grupos de saguis invasores, ou está bem próxima deles. As espécies de saguis invasores ocorrem em alguns locais no interior do parque e por todo o seu entorno. Portanto, há uma pressão dos saguis invasores em direção ao interior do PARNASO. Diante deste processo de extinção local de uma espécie endêmica, ameaçada de extinção, e com uma restrita distribuição geográfica, alertamos para a urgente necessidade de iniciar um eficiente programa de manejo das espécies de saguis invasores, juntamente com a reintrodução de grupos de Callithrix aurita.

A comunicação na prática homeopática: como a racionalidade homeopática se expressa na comunicação entre médico e paciente?

No atual contexto da prática médica no Brasil, observa-se o predomínio de uma comunicação de caráter informativo, normativo e com pouca ênfase na promoção da autonomia dos pacientes, secundarizando o diálogo e a compreensão do paciente sobre o processo saúde-doença-cuidado. Esse tipo de prática baseia-se fortemente no Modelo Biomédico, que enfoca prioritariamente a doença e as lesões orgânicas, o que em muitas situações colabora para a medicalização, a (super)especialização e fragmentação do cuidado, comprometendo a qualidade da relação médico-paciente e a resolutividade das ações de saúde. Em contrapartida, uma prática médica centrada no paciente e que valorize a compreensão de sua interpretação da saúde-doença favorece a construção da integralidade do cuidado e a maior efetividade das ações. A presente pesquisa exploratória, predominantemente qualitativa com componente quantitativo investiga as práticas comunicacionais na relação médico-paciente na consulta homeopática, pautada pelo paradigma Vitalista. Nessa especialidade médica oferecida desde 1988 pelo Sistema Único de Saúde, e desde 2006, integrante da Polícia Nacional de Práticas Integrativas e Complementares do Ministério da Saúde, compreender múltiplas dimensões da existência e adoecer humanos demanda competência narrativa para a prática de sua semiologia, baseada na escuta atenta e implicada dos contextos biopatográficos, valorizadora dos sentidos atribuídos às vivências pelos sujeitos. Foram gravadas oito consultas de primeira vez realizadas num ambulatório-escola por médicos experientes, transcritas e submetidas à Análise de Conteúdo, que permitiram analisar como os fundamentos da racionalidade homeopática podem contribuir para a produção compartilhada de sentidos. Os resultados estão organizados nas categorias: Tomada de Turnos e Controle de Tópicos, Concepção de Saúde-Doença-Cuidado, Itinerários Terapêuticos, Ethos científico e Ethos do Mundo da Vida, Capacidade empática (atitudes de apoio, legitimação e polidez) e O Papel do Médico. Observa-se que a comunicação que estabelecida nesse tipo de prática em saúde avança na construção da integralidade da atenção e pode contribuir para a maior resolutividade do cuidado em saúde na medida em que minimiza a dicotomia entre mental e somático, individual e social.

Synapses with short-term plasticity are optimal estimators of presynaptic membrane potentials.

The trajectory of the somatic membrane potential of a cortical neuron exactly reflects the computations performed on its afferent inputs. However, the spikes of such a neuron are a very low-dimensional and discrete projection of this continually evolving signal. We explored the possibility that the neuron's efferent synapses perform the critical computational step of estimating the membrane potential trajectory from the spikes. We found that short-term changes in synaptic efficacy can be interpreted as implementing an optimal estimator of this trajectory. Short-term depression arose when presynaptic spiking was sufficiently intense as to reduce the uncertainty associated with the estimate; short-term facilitation reflected structural features of the statistics of the presynaptic neuron such as up and down states. Our analysis provides a unifying account of a powerful, but puzzling, form of plasticity.

Maternal effects on fecundity and egg quality of the Patagonian stock of Argentine Hake (Merluccius hubbsi)

The influences of age, size, and condition of spawning females on fecundity and oocyte quality were analyzed for the Patagonian stock of Argentine Hake (Merluccius hubbsi). Samples of mature females were collected in the spawning area as part of 2 research surveys conducted in January 2010 and 2011, during the peak of the reproductive season. Batch fecundity (BF) ranged between 40,500 (29 cm total length [TL]) and 2,550,000 (95 cm TL) hydrated oocytes, and was positively correlated with TL, gutted weight, age, hepatosomatic index (HSI), and the relative condition factor (Kn). Relative fecundity ranged between 85 and 1040 hydrated oocytes g–1 and showed significant positive relationships with gutted weight, HSI, and Kn; however, coefficients of determination were low for all regressions. Dry weights of samples of 100 hydrated oocytes ranged between 1.8 and 3.95 mg and were positively correlated with all variables analyzed, including batch and relative fecundity. Multiple regression models created with data of the morphophysiological characteristics of females supported maternal influences on fecundity and egg weights. Within the studied size range (29–95 cm TL), larger individuals had better somatic and egg condition, mainly revealed by higher HSI and hydrated oocytes with larger oil droplets (275.71μm [standard error 1.49]). These results were associated with the higher feeding activity of larger females during the spawning season in comparison with the feeding activity of young individuals (<5 years old); the better nutritional state of larger females, assumed to result from more feeding, was conducive to greater production of high-quality eggs.

西洋参体细胞胚胎发生的研究

以西洋参(Panax quinquefolium L.)为材料，从胚、胚乳、多年生主根等外植体诱导筛选得到多种胚性及非胚性愈伤组织，胚来源的胚性愈伤组织经用附加1.0ppm 2,4-D的MS培养基继代保持三年后仍具旺盛的体细胞胚胎发生能力，以胚性愈伤组织建立的液体培养系统可得到大量游离的胚状体，将胚状体包埋制成的人工种子能在附加0.1ppm NAA和1.0ppm GA_3的B_s培养基上萌发形成根、茎、叶健全的再生植株，并且移栽成活。松软型根愈伤组织以过长期继代培养后，也得到了胚状体发生。比较了多种培养因素对体细胞胚胎发生和愈伤组织的影响，其中外植体来源、基本培养基的无机盐组成以及生长素是决定愈伤组织形态结构类型和体细胞胚胎发生能力的主要因素。胚乳愈伤组织、质密型根愈伤组织以及来源于胚的松软型非胚性愈伤组织在多种诱导条件下均未能发生胚状体。 从松软型的胚或根愈伤组织均容易游离大量原生质体，用悬浮培养物游离原生质体的得率更高，从早期胚状体也可酶解得到可用于培养量的原生质体。原生质体体积均很小，培养中的行为也相似，有些形成细胞壁，细胞变形，个别进行细胞分裂，形成少数细胞团，但未形成愈伤组织;有些原生质体仍保持球形，体积剧裂膨大几十倍，小液泡汇聚成大液泡，有些液泡中积累紫红色素。 用石蜡切片、半薄切片、透射电镜和扫描电镜等方法对各种愈伤组织的内部结构及外部形态进行了详细观察，发现胚状体起源于愈伤组织的表皮或表皮下层细胞，有单个发生和成丛发生两种发生方式，不同愈伤组织细胞的显微及超微结构各具特色。胚乳愈伤组织、松软型根愈作组织以及胚状体的细胞虽然都具有某些胚性细胞结构特征，例如细胞体积小、细胞核大、细胞质浓厚、细胞器丰富等，但它们并不具有现实的体细胞胚胎发生能力。发生胚状体的细胞含大量多核糖体和内质网片段，小液泡数量少且形成多泡复合体，细胞壁也由于在组织中所外的位置不同而有厚薄两种类型之分，细胞常形成胚性细胞复合体，位于愈伤组织的外围，边缘可分化为许多小细胞团。胚性细胞复合体的表面质密平整，有许多丝状物和颗粒，细胞轮廓不清，但有显著突出的小细胞，细胞表面具沟脊;而其它各型愈伤组织的表面均为球形或半球形的大型细胞，表面仅具细小的纹理、凸起或颗粒。 胚来源的胚性愈伤组织的总蛋白组成与来源相同，但形态结构截然不同的非胚性愈作组织的总蛋白组成差异显著，后者与形态结构特征相似的根本源公软型愈伤组织具有相似的蛋白质电泳带型，但多一条33KD的蛋白带;培养基中去掉2,4-D后，松软型根愈伤组织的蛋白质组成发生轻微变化。等电聚焦和SDS聚丙烯酰胺凝胶双向电泳揭示出在单向电泳扫描上呈现最高峰的17KD蛋白质在胚性愈伤组织中随等电点的不同而分离，在其它三种构软型愈伤组织中则仅集中在等电点为5.9处，为一个大而染色深的点。 同样培养基上培养的形态结构不同的愈伤组织所含元素的量不同，说明细胞对无机盐的吸收是有选择性的，不同类型的愈伤组织可积累不同的元素。培养基中的元素组成情况在愈伤组织中也有一定反映，在含钠、钾元素较多的B_5培养基上生长的愈伤组织中这两种元素的含量也较高，培养基的离子胁迫作用和细胞对离子一定程度的被动吸收会影响细胞的代谢方式，从而导致细胞类型的分化，基本培养基对愈伤组织类型的转变及体细胞胚胎发生能力的影响可能正是通过影响细胞的离子吸收、代谢平衡而实现。

普通烟草与毛曼陀罗族间体细胞杂交的研究

采用PEG／DMSO融合法，从普通烟草(Nicotiana tabacum L.cv.Xanthi nc)叶肉和毛曼陀罗(Datura innoxia Mill.)茎或叶愈伤组织原生质体融合获得I5株花盆中健康生长的族间体细胞杂种植株;其中11株是在没有选择压力的条件下获得，4株则是在有IOA和R6G选择系统存在下获得。同时获得一株试管开花且形态异常的植株和一株花盆中生长的嵌合植株。lOmM IOA和I5μ g／ml R6G均能分别有效地抑制烟草叶肉和毛曼陀罗愈伤组织原生质体的分裂;10% DMSO能显著提高原生质体融合率;PEG种类并不重要，但浓度则很重要;BAP较ZT，KT对植株分化有更好的诱导效果。杂种的形态、细胞、同工酶、Southern杂交，花粉育性分析结果如下：1、l5株杂种较双亲普遍株型矮小，生长缓慢，形态接近烟草但不很正常，根据形态特征可分为两种类型：(1)共有8株，其叶片大小、形状、颜色、开花习惯、花类型（单花）等均与毛曼陀罗接近，但子房败育;(2)共有7株，其株型、叶片形状、颜色、光滑度、花形状、类型（圆锥状花序）、颜色更接近烟草，但少数杂种开单花或先单花后圆锥状花序或先单花后两种花并存，且开花时间不一，部分子房败育。2、杂种染色体数目大都在60～90之间，个别者较少(48条)或较多(125条)，没有一株为双二倍体(2n=96)，并全部为混倍体。3、15株杂种植株均有双亲的细胞色素氧化酶同工酶特征谱带;大部分都有双亲的过氧化物酶同工酶特征谱带，少都仅具烟草的谱带。4、Hae Ⅲ／水稻rDNA的Southern杂交分析表明杂种1较双亲多一条谱带，杂种2较双亲也多一条弱带，其它杂种尚待定。5、花粉活力测定表明毛曼陀罗（种子再生而来）的为99%，烟草（原生质体再生而来）为80～90%，而杂种的为24～61%，育性普遍低于双亲。

通过体细胞杂交由大黍向水稻转移无融合生殖基因的研究

本论文以无融合生殖的大黍(Panicum maximum Jacp.)作为无融合生殖基因的供体，试图通过体细胞杂交方法向水稻(Oryza sativa L．)导入无融合生殖基因。结果如下：采用PEG融合法，诱导水稻原生质体与大黍原生质体融合，经过融合体筛选、培养，成功地获得了再生水稻植株。在融合前，水稻原生质体经过2.5 mM碘乙酰胺(IOA)在室温(22～25℃)条件下处理15分钟，大黍原生质体经过60Kr软x射线照射或不做任何处理。经双亲处理选择系统获得移栽成活的25株再生植株;经水稻单亲处理选择系统获得移栽成活再生植株3株。这两类融合再生植株（经双亲处理选择系统获得的25株和经单亲处理选择系统的3株）在花器官形态、结构及生殖特性上与对照亲本水稻植株有显著的差异，出现多花药（一朵颖花具7至11枚，甚至13枚花药）、多胚珠（一个子房内2～3个胚珠）及多胚囊（一个胚珠中2个以上胚囊）等现象;雌、雄性育性显著降低或完全消失，仅有5株能够少量结实，I-KI溶液着色的花粉从0至68%不等;胚胎学检查表明不能结实的植株雌性均不育，即不能分化出正常的胚囊结构。进一步的检查正在进行中。

Combining stable isotopes and skeletal growth marks to detect habitat shifts in juvenile loggerhead sea turtles Caretta caretta

Understanding the phase and timing of ontogenetic habitat shifts underlies the study of a species’ life history and population dynamics. This information is especially critical to the conservation and management of threatened and endangered species, such as the loggerhead sea turtle Caretta caretta. The early life of loggerheads consists of a terrestrial egg and hatchling stage, a posthatchling and juvenile oceanic, pelagic feeding stage, and a juvenile neritic, primarily benthic feeding stage. In the present study, novel approaches were applied to explore the timing of the loggerhead ontogenetic shift from pelagic to benthic habitats. The most recent years of somatic growth are recorded as annual marks in humerus cross sections. A consistent growth mark pattern in benthic juvenile loggerheads was identified, with narrow growth marks in the interior of the bone transitioning to wider growth marks at the exterior, indicative of a sharp increase in growth rates at the transitional growth mark. This increase in annual growth is hypothesized to correlate with the ontogenetic shift from pelagic to benthic habitats. Stable isotopes of carbon and nitrogen just interior and exterior to the transitional growth mark, as well as stable isotopes from pelagic and benthic flora, fauna and loggerhead stomach contents, were analyzed to determine whether this transition related to a diet shift. The results clearly indicate that a dietary shift from oceanic/pelagic to neritic/benthic feeding corresponds to a transitional growth mark. The combination of stable isotope analysis with skeletochronology can elucidate the ecology of cryptic life history stages during loggerhead ontogeny.

猕猴桃属两个种的原生质体培养与体细胞杂交

猕猴桃是重要的栽培果树，但目前栽培品种过于单一，不能满足生产和消费的需求。由于猕猴桃的雌雄异株特性、种间杂交亲合性差、遗传上高度杂合以及育种周期长等特点，常规杂交育种困难很大。现代生物技术，如原生质体培养和体细胞杂交等，为培育新品种提供了新途径。 毛花猕猴桃(Actinidia eriantha)和软枣猕猴桃(A.arguta)是猕猴桃属中具有重要利用价值的两个种。毛花猕猴桃果实大小在猕猴桃属中次于中华猕猴桃(A.chinensis)和美味猕猴桃(A.deliciosa)列第三位，果实维生素C含量达1014 mg/l00 g FW。软枣猕猴桃极耐寒，在-40℃下可安全越冬，其果实表面光滑无毛。这两个种是品种改良的重要种质资源。 作为生物技术基础的组织培养与植株再生系统，在毛花猕猴桃上尚未见报道。软枣猕猴桃的组织培养仅有一例报道，且芽分化率和分化系数都很低。这两个种的原生质体培养及与美味猕猴桃的原生质体融合也未见报道。针对这种情况，本试验对毛花猕猴桃和软枣猕猴桃的组织培养、原生质体培养及其与美味猕猴桃品种“Hayward”的原生质体融合进行研究，结果建立了较理想的毛花猕猴桃和软枣猕猴桃组织培养系统;首次从毛花猕猴桃原生质体得到再生植株和从软枣猕猴桃原生质体培养再生愈伤组织;通过改进融合方法，建立了毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的原生质体融合体系，并将异核体培养分裂得到细胞团。这些结果有利于今后毛花猕猴桃和软枣猕猴桃资源的开发利用。主要试验结果如下： 以毛花猕猴桃试管实生苗叶片和茎段为外植体，培养在附加一定浓度Zea或CPPU的MS培养基上，产生的愈伤组织不经转代就可分化芽。试管苗茎段在附加0.0025 mg/L CPPU和0.1 mg/LIAA的MS培养基上愈伤组织产生、芽分化和苗生长都较理想;试管苗叶片则以附加0.025 mg/L CPPU和0.l mg/LIAA或0.5 mg/L Zea和0.1 mg/LIAA的MS培养基较好。当苗生长至1.0 cm时经诱导生根形成完整植株。 在软枣猕猴桃组织培养中，外植体种类、诱导培养基的激素种类和诱导分化时细胞分裂素种类都有重要影响。无菌苗茎段容易愈伤组织化，但分化困难;叶片外植体产生愈伤组织较难，但分化容易。在含Zea的MS培养基上，两种外植体产生的愈伤组织不经转代即能分化芽。分化培养基中添加Zea能有效地诱导芽分化，其中以2.0 mg/L Zea芽的分化最好，而Kin和BAP在0.5- 2.0 mg/L浓度范围内愈伤组织不分化。 以毛花猕猴桃或软枣猕猴桃试管苗叶片为分离原生质体的材料。试管苗的培养条件对原生质体分离效果及其培养反应有显著影响。弱光培养条件对两个种试管苗的原生质体分离及其培养都有好处，试管苗培养基也有重要影响。毛花猕猴桃和软枣猕猴桃试管苗合适培养基分别为MS基本培养基（大量元素减半）和MS+0.00025 mg/L CPPU+ 0.1 mg/LIAA。在此条件下培养的两个种的试管苗叶片，经酶解后原生质体产量分别为0.7-1.8×l06和3.0-3.5×l06/1 g FW，其原生质体在合适培养基上能够分裂。 毛花猕猴桃原生质体培养在MS培养基（去除NH4N03）附加l.0mg/L2，4-D液体培养基中，约10天时发生第一次分裂，分裂能持续下去并在培养3个月时形成约2mm大小愈伤组织。直接将其转入固体培养基中使其增殖和分化。在附加Zea 0.5 mg/L+ O.l mg/L IAA的MS培养基上继代2次，愈伤组织开始分化芽。芽伸长后切下诱导生根，形成完整植株。软枣猕猴桃原生质体培养基中，MS培养基附加2，4-D配合Zea或Kin对启动分裂是必须的，其中以MS＋2，4-D 0.5 mg/L+ Zea 0.5 mg/L最好，在此培养基上原生质体第一次分裂发生在4-6天时，培养12-14天时见到第三次分裂，培养三周的分裂频率为23%。培养45天后形成许多小愈伤组织块。软枣猕猴桃原生质体再生的愈伤组织从液体培养基转入固体培养基后未见进一步分裂。 对18株毛花猕猴桃原生质体再生植株的体细胞染色体数目作了观察，其中12株为整倍体，二倍体和四倍体各六株;另外六株为混倍体，其染色体数目变化在59-203之间。还发现原生质体再生植株有丝分裂间期细胞存在多核现象，有多核细胞的共10株，细胞内多核数目以双核和三核较常见，最多的有七个核。原生质体供体植株为2n=2x=58，未发现多核细胞。原生质体再生植株体细胞多核现象未见报道。 利用毛花猕猴桃或软枣猕猴桃叶片原生质体分别与愈伤组织来源的美味猕猴桃原生质体进行融合，融合方法为高Ca++高pH值PEG法。对Kao等(1975)报道的融合步骤作了修改。影响融合效率的因素主要有PEG种类、融合作用时间和融合液中DMSO浓度。最佳的融合条件为40%PEG (Sigma，MW3350)+10%DMSO，作用40 min。毛花猕猴桃+美味猕猴桃和软枣猕猴桃+美味猕猴桃的融合频率分别可达14.5%和13.6%。异核体经培养可分裂并形成细胞团。

火炬松体细胞无性系建立及其形态发生调控的研究

火炬松（Pinus taeda L.）原产美国东南部，是世界南方松中最重要的绿化和造林用速生针叶树种，现广泛分布于全球亚热带和部分热带地区，在我国的栽植面积居世界第2位，仅次于美国。目前，火炬松离体快速繁殖、遗传转化和品种改良研究中最大的障碍是没有获得良好的植株再生体系。本研究以火炬松的成熟种子为试材，建立了可调控的体细胞胚胎发生和器官发生植株再生系统，并对再生过程中的形态学变化进行了细胞学观察和扫描电镜观察;建立了胚性细胞悬浮系，测定了其重要生长参数的变化动态，优化了悬浮条件下体细胞胚胎发生的培养条件及悬浮细胞原生质体直接体细胞胚胎发生的培养条件。 进行了HA、HB、HC、MA、MB、MC、LA和LB等8种不同基因型的成熟合子胚在BMS、DCR、GD、LM、LP、MNCI、MS、SH及自行设计的TE等9种不同基本培养基上的愈伤组织诱导试验，筛选获得了愈伤组织发生频率较高的基因型HB、MA和MC，及基本培养基DCR和TE。激素组合试验表明，2,4-D和BA最有利于愈伤组织发生。两因子5水平等重复的愈伤组织诱导试验及方差分析结果证实，8 mg•L~(-1)2,4-D和4 mg•L~(-1)BA是愈伤组织诱导的最佳激素组合。诱导产生的愈伤组织经2次继代后，可明显分为4种类型，它们是1）白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织（WTGM）;2）淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织（YLGG）;3）淡绿色、疏松的颗粒状愈伤组织（GLG）;和4）浅白色、水浸状的粘性愈伤组织（WMM）。其中白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织有较强的体细胞胚胎发生能力，淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织有较强的不定芽发生能力。这两种愈伤组织的最高诱导频率分别是28.1%和35.7%。 在附加2,4-D、IBA和BA的DCR体细胞胚诱导培养基上，白色、半透明、有光泽的粘性愈伤组织中的胚性细胞形成胚性胚柄细胞团和早期原胚。提高培养基中的渗透压后，早期原胚发育成后期原胚。在附加ABA、PEG和活性炭的DCR体细胞胚成熟培养基上，后期原胚发育成子叶胚。在无激素DCR培养基上，子叶胚萌发形成再生完整植株。体细胞胚转换成小植株的最高频率是18.4%。在直接体细胞胚诱导增养基和直接体细胞胚发育培养基的作用下，成熟合子胚的子叶和胚轴上直接形成体细胞胚。直接体细胞胚胎发生的最高频率是18%。 在附加NAA、IBA和BA的TE不定芽原基诱导培养基上，淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织中的胚性细胞形成不定芽原基。在附加IBA和BA的TE不定芽分化培养基上，不定芽原基分化产生不定芽。用基因型HB、MA和MC的淡黄色、疏松、有光泽的颗粒状愈伤组织进行的试验表明，不定芽分化的最佳低温（4 ℃）处理时间是5～6周，最佳蔗糖浓度是25～30 g•L~(-1)。分化产生的不定芽在附加IBA、GA_3和活性炭的TE培养基上，幼茎伸长。附加IBA、BA和GA_3的TE培养基上，伸长的不定芽生根形成完整植株。伸长不定芽的最高生根频率是46%。成熟合子胚在直接不定芽原基诱导培养基及直接不定芽分化培养基的作用下，从子叶和胚轴的不同部位产生直接不定芽。直接不定芽发生的最高频率是58.2%。 由成熟合子胚诱导愈伤组织形成过程中的形态学观察表明：在附加2,4-D和BA的DCR愈伤组织诱导培养基上，HB、MA和MC3种基因型中，MA主要在下胚轴形成愈伤组织，MC主要在子叶和胚根形成愈伤组织，HB主要在胚根形成体积较小的愈伤组织。在附加NAA和BA的TE愈伤组织诱导培养基上，HB、MA和MC3种基因型中，MA在单个子叶的顶端形成生长较快的愈伤组织，MC的所有子叶都形成愈伤组织，HB在所有子叶的顶端形成愈伤组织。 石蜡切片观察表明：4类愈伤组织的细胞组成不同．第1类愈伤组织主要由核大、质浓、体积小的园形胚性细胞及核呈柱状或新月形的体积较大的非胚性细胞组成;第2类愈伤组织主要由核大、质浓、体积小的园形胚性细胞组成，第3类愈伤组织主要由体积较大的棒状、葫芦形、新月形、盾片状细胞组成、第4类愈伤组织主要由体积较大的薄壁细胞和细胞壁加厚、细胞间连结紧密、无细胞核的分化细胞组成，第1类愈伤组织上形成的早期原胚的特点是：胚性头部由排列紧密、体积小的园形细胞组成，轮廓十分清晰、呈半圆形，胚柄由排列疏松的长形细胞组成，细胞体积大、细胞中有大的液泡，早期原胚在发育过程中和母体组织保持一定的隔离状态。第2类愈伤组织上形成的不定芽的特点是t结构上为单极性，其维管束和母体组织保持密切联系。扫描电镜观察表明;直接体细胞胚基部和母体组织保持较少的联系，其子叶是直立生长的．直接不定芽基部和母体组织保持较多的联系，其幼叶是向心卷曲生长的。 在培养周期内，基因型HB、MA和MC胚性细胞悬浮培养物的几个生长参数的变化动态相似。鲜重增长高峰在12—15 d，干重增长高峰在15～18 d，细胞体积增长高峰和胚数增长高峰在18—21 d。在培养的18—21 d，培养液中的pH值、电导率和蔗糖浓度接近或降到最低点。在悬浮培养条件下，体细胞胚形成的最佳起始细胞密度是5～6×103个／ml。继代培养时间延长，体细胞胚胎发生能力下降。热激处理促进基因型HB和MA体细胞胚的形成，抑制基因型MC体细胞胚的形成。在悬浮培养物中，观察到了裂生多胚。 对数生长期的火炬松胚性悬浮细胞，在以甘露醇作为渗透压稳定剂的酶混合液Cel-lulase“Onozuka”RS l%+Cellulase“Onozuka”R-10 2.5%+Pectolyase Y-23 0.2%的作用下，原生质体的产量和活力均最高。原生质体在DCR和KM8P两种培养基上形成了体细胞胚（包括胚性胚柄细胞团、早期原胚和后期原胚）．体细胞胚形成的最佳起始原生质体密度是7×l04个/ml，最佳ABA浓度是4 mg．L-I．

陆地棉组织培养及转化研究

1．以MS无机盐+B 5有机成分为基本培养基，附加2，4-D，KT，ZT等激素，以农艺性状良好，抗枯萎病的棉花品种“冀492”为材料，建立了愈伤组织诱导，体细胞胚胎发生和植株再生体系． 2．实验结果表明，2，4-D是诱导愈伤组织产生的促进因子，效果明显好于其它生长素类物质，但是随着培养基中2，4-D浓度的升高，愈伤组织状态也会变差，褐化严重，而且，附加O.lppm 2，4-D，O.lppm K T的培养基是较为合适的培养基．IAA，NAA对愈伤组织的诱导不十分理想，此外，愈伤组织的产生还同外植体，基因型和一些物理条件有关， 胚性愈伤组织的产生，需不断调节培养基中激素浓度，逐步降低2，4 -D浓度，并添加低浓度ZT，胚状体要在去除2，4-D的培养基上才能产生．虽然，2，4-D对于胚性愈伤组织的诱导是必须的，但是却抑制胚状体的发育． 3．培养基中硝态氮和氨态氮比例，激素浓度和种类，活性炭的添加，对于胚状体的萌发和成熟有重要影响，硝酸钾加倍，硝酸铵减半，并附加低浓度ABA和活性炭是胚状体诱导和成苗（去除ABA）的适宜培养基，而附加0.2ppm N A A，0.2ppm ZT和活性炭的M S2培养基是胚状体成熟的适宜培养基．通过对胚性愈伤组织的干燥处理，培养基中低浓度ABA和活性炭的添加，比较有效地抑制了畸形胚的产生，大大地提高了正常胚的比例． 4．对陆地棉“冀4 9 2”的下胚轴和子叶利用含Bt抗虫基因的根农杆菌(AgrobacterIIm tumefrens)进行了遗传转化研究，在筛选培养基上获得了大量生长旺盛的阳性愈伤组织，葡糖酸苷检测结果表明，大部分愈伤组织均有G us基因的表达． 5．通过花粉管通道法，进行了将含有Bt抗虫基因DNA的大肠杆菌质粒导入陆地棉“冀492”的实验，并收获了近1 0，000粒种子，为从大量种子中筛选出抗性种质材料，建立了卡那霉素田间初步筛选法． 6．利用活体压片和石蜡切片技术对体细胞胚胎发生过程和胚状体起源进行了观察，发现胚状体发生主要是通过类合子途径进行的，胚状体可能起源于单细胞． 7．通过对相同培养基上的非胚性愈伤组织，胚性愈伤组织和不同时期胚状体的可溶性蛋白SDS - PAGE电泳分析，发现16KD和50K D蛋白特异性地存在于胚性愈伤和各期胚状体中，该蛋白可作为胚性愈伤组织的筛选标记．对不同发育时期的愈伤组织进行了同工酶和可溶性蛋白的IE F/SD S-PA G E双向电泳分析，结果表明，不同发育时期的愈伤组织同工酶酶谱和可溶性蛋白电泳图谱之间具有较大的差别，分化前期的胚性愈伤组织酶的活性强，种类多，并且有新的蛋白斑点的出现，这些都可能与体细胞胚胎发生相关．

甘薯体细胞胚胎发生和原生质体培养及转化的研究

甘薯[Ipomoea batatm L.]胚性愈伤组织的诱导、生长及分化，受遗传背景、外植体来源、激素配比等多种因素的影响。以徐薯l8叶片为外植体，在Ms附加2mg／l2.4-D的培养基上，诱导、筛选出三种类型的愈伤组织（I型、Ⅱ型、IV型），虽然其来源和培养条件相同，但在外部形态、内部结构、分化途径、分化能力、同工酶酶谱、可溶性蛋白质组成以及DNA分子结构方面，都有显著差异。I型愈伤组织在Ms无激素培养基上分化出体细胞胚，其过氧化物酶及脂酶同工酶与Ⅱ型愈伤组织和lV型愈伤组织相比，酶带的数目、深浅不同，而与胚状体相类似，可以作为不回类型愈伤组织及其分化途径的生理指标。SDS-PAGE电泳分析表明：三种愈伤组织的总蛋白组成也有显著差异。I型愈伤组织与Ⅱ型愈伤组织相比，无论是酶带的数目，还是酶带的扫描高度，都占绝对优势，表明其具有相对较高的蛋白质合成代谢水平。RAPD分析表明，三种类型愈伤组织的遗传基础具有一定差异。在所用的10个随机引物中，引物G3(GAGCCCTCCA)扩增出了显著的多态性，在I型愈伤组织与胚状体中发现两个特异片段，有可能与体细胞胚胎发生过程特异相关。 以I型愈伤组织进行悬浮培养，建立了具有再生能力的胚性悬浮细胞系，并对其鲜重、干重、PCV体积、PH值等生长特性进行了测定，研究了在悬浮培养条件下，2.4-D浓度对体细胞胚胎发生的影响。在MS附加Img/12.4-D的培养基中，细胞呈园球型，细胞质浓厚，细胞核显著，分裂旺盛，转入不含2.4-D的分化培养基中，即可得到大量的游离胚状体：浓度过高（4-8mg／l）或过低（0.5mg/l），都不利于细胞的生长和分化。胞外同工酶研究发现：胞外过氧化物酶水平，随着2.4-D浓度升高、培养时间的延长、细胞生长速度的减缓而降低，随着体胚分化的开始而升高。这种变化趋势表明：2.4-D浓度、过氧化物酶及细胞的生长、分化之间，存在密切联系。蛋白质分析发现，2.4-D的浓度与细胞内可溶性蛋白质组成及含量也密切相关：在无激素培养基中的培养物，其蛋白质电泳图谱与在含有不同浓度2.4-D的培养基中的培养物相比，无论是谱带的数目还是谱带的峰值，都有深刻差异，表明在体胚分化和发育过程中，细胞内进行着旺盛的蛋白质合成代谢。 以胚性悬浮细胞为材料，进行原生质体培养。通过对游离条件的比较研究，发现采用PH值为6.0的E3酶液酶解2小时，可以得到大量具有旺盛活力的原生质体。采用液体浅层一固体平板双层培养方式进行培养，原生质体分裂旺盛，20天后形成肉眼可见的微型愈伤组织，在附加0.5mg/1 2.4-D的继代培养基中，出现根的分化，转入附加0.5mg/12.4-D和Img/16-BA的分化培养基中，有少量不定芽发生，并形成小苗，但无胚状体产生。 以来源于胚性悬浮细胞的原生质体为受体，通过与农杆菌共培养，将苏云金杆菌毒蛋白(Bt)基因导入甘薯细胞，经卡那霉素筛选，得到抗性愈伤组织，并有根的分化。经过PCR检测，证明了Bt基因在甘薯细胞染色体组中的整合。

白杄体细胞胚胎发生及其植株再生的研究

本文以白杄的合子胚为材料，建立了体细胞胚胎发生及其植株再生系统．通过对影响体细胞胚胎发生的主要因素的系统研究，实现了体细胞胚的高频率发生。运用扫描电镜、整体染色封片及石蜡切片等方法全面观察了体细胞胚胎发生过程中的形态学、细胞学及组织化学变化。建立了胚性细胞悬浮系，测定了几个重要生长参数的变化动态，优化了体细胞胚的液体培养条件。采用垂直平板聚丙烯酰胺电泳方法分析了体细胞胚胎发生过程中三种同工酶的变化。通过压片法观察了长期继代过程中胚性愈伤组织细胞及其再生植株根尖细胞染色体数目的变化。具体结果如下： 合子胚在4-6 ℃低温条件下保存1~3个月后，接种于LP+2mg/L2.4-D+lmg/L 6-BA的培养基上，黑暗条件下培养1个月后，产生浅黄色、褐色和白色半透明三种愈伤组织，其中白色半透明愈伤组织是胚性愈伤组织。黑暗中胚性愈伤组织在MS+lmg/L 2，4-D+lmg/L KT的继代培养基上可保持旺盛的增殖能力和分化潜力。当胚性愈伤组织转到MS+5mg/L ABA+50g/L PEG+5mg/L AgN03的分化培养基上，1个月后可产生大量正常的子叶期成熟体细胞胚。成熟体细胞胚在相对湿度为75%的条件下干化20天后，转到含0.5%活性炭的无激素1/2MS基本培养基上，约40天后长出1.5—2.5cm的根，约60天后长出真叶。光，ABA、蔗糖、AgN03 PEG浓度是影响体细胞胚胎发生的主要因素。 在相同的培养条件下，以新产生的子叶期体细胞胚为外植体，也可诱导体细胞胚胎发生。 胚性愈伤组织起源于合子胚子叶和下胚轴的表皮及表皮下的一些细胞。胚性愈伤组织中的一些单个胚性细胞经过第一次分裂产生两个细胞，即胚细胞和胚柄细胞，它们继续进行分裂几次以后形成胚性胚柄团结构。胚性胚柄团在分化培养基上可发育为成熟的子叶期胚。体细胞胚的成熟过程大致可分四个时期：胚性胚柄团、球形胚至鱼雷形胚、子叶前期胚和子叶期成熟胚。通过PAS反应研究后发现，在体细胞胚发育过程中，淀粉粒在胚性胚柄团时期开始积累，至心形胚时期达到积累高峰，子叶胚时期仅在器官原基及其附近细胞肉有淀粉粒分布。结果表明，淀粉是体细胞胚胎发生的一种重要能量来源。 在初始细胞密度为3.O%（鲜重）、摇床转速为150r/min的条件下，用与固体培养基成分相似的液体培养基对胚性愈伤组织进行悬浮培养，胚性愈伤组织的生长率大大提高。在悬浮培养过程中，培养物的鲜重、干重、紧实细胞体积及胚性胚柄团数目依次在6～10天内达到高峰。培养液的pH值和电导率分别在6—8天达到最低点。 胚性和非胚性愈伤组织的三种同工酶酶谱都明显不同;胚性愈伤组织的过氧化物酶和酸性磷酸酯酶活性较高，而非胚性愈伤组织的酯酶活性较高。体细胞胚发育过程中，三种同工酶酶谱都呈规律性变化;j活性都有逐渐增强的趋势，但酸性磷酸酯酶活性到了最后时期又突然下降。 胚性愈伤组织经过长期继代后，生长率和分化能力没有明显变化，但有些细胞内染色体数目发生了无规律的变化( 2n=7—24，2n>28)，而再生植株根尖细胞染色体数目比较稳定( 2n=28).