Modulation de la stabilité de l'ARNm alphaENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires : détermination du rôle des séquences 3' non traduites

Le transport actif de sodium par les cellules épithéliales alvéolaires est le principal mécanisme impliqué dans la régulation du niveau de liquide dans le poumon distal. Le canal épithélial sodique (ENaC) exprimé par les cellules épithéliales alvéolaires est essentiel à la résorption du liquide des poumons à la naissance ainsi que la résolution de l'œdème pulmonaire chez l'adulte. L'activité et l'expression du canal ENaC sont modulées par de nombreux stress pathophysiologiques. L'inflammation pulmonaire constitue un facteur important dans l'inhibition de l'expression du canal ENaC et pourrait favoriser la formation d'œdème pulmonaire. Nous avons précédemment démontré que différentes cytokines pro-inflammatoires, ainsi que les lipopolysaccharides (LPS) de Pseudomonas aeruginosa, inhibent l'expression de l'ARNm αENaC par des mécanismes de régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle. Ces résultats suggèrent que les mécanismes qui modulent la stabilité des ARNm αENaC pourraient jouer un rôle important dans la régulation du niveau d’expression du transcrit en condition inflammatoire. Le principal objectif de mes travaux était de caractériser les mécanismes de modulation de l’ARNm αENaC dans les cellules épithéliales alvéolaires lors de différents stress pathophysiologiques et déterminer si cette modulation pouvait s’expliquer en partie par une régulation de la stabilité du transcrit. Mes travaux montrent que les LPS et la cycloheximide inhibent l’expression de l’ARNm αENaC de façon similaire via l’activation des voies de signalisation des MAPK ERK1/2 et p38. Cependant, les mécanismes de modulation de l’expression de l'ARNm αENaC sont différents puisque les LPS répriment la transcription du gène, alors que la cycloheximide diminuerait la stabilité du transcrit via des mécanismes post-transcriptionnels impliquant la région 3' non traduite (3'UTR) de l'ARNm αENaC. Pour mieux étudier le rôle du 3'UTR dans ce processus, nous avons développé un modèle Tet-Off nous permettant de mesurer la demi-vie de l’ARNm αENaC indépendamment de l’utilisation d’un inhibiteur de la transcription comme l'actinomycine D (Act. D). Nous avons montré que la demi-vie de l’ARNm αENaC était de 100min, un temps beaucoup plus court que celui rapporté dans la littérature. Nous avons démontré que l’Act. D a un effet stabilisateur important sur l’ARNm αENaC et qu’il ne peut être utilisé pour évaluer la stabilité du transcrit. À l’aide de différents mutants de délétion, nous avons entrepris de déterminer la nature des régions du 3’UTR impliquées dans la modulation de la stabilité du transcrit. Nous avons trouvé que le 3’UTR joue un rôle à la fois de stabilisation (région 3’UTR proximale) et de déstabilisation (région 3’UTR distale) du transcrit. Notre système nous a finalement permis de confirmer que la diminution de l’ARNm αENaC observée en présence de TNF-α s’expliquait en partie par une diminution importante de la stabilité du transcrit induite par cette cytokine. Enfin, nous avons identifié la nature des protéines pouvant se lier au 3’UTR de l’ARNm αENaC et déterminé lesquelles pouvaient moduler la stabilité du transcrit. Des trois protéines candidates trouvées, nous avons confirmé que la surexpression de DHX36 et TIAL1 diminue le niveau de transcrit par un mécanisme impliquant la stabilité du messager. Les travaux présentés ici montrent la complexité des voies de signalisation induites par différents stress sur les cellules épithéliales alvéolaires et montrent comment la stabilité de l’ARNm αENaC et en particulier, les séquences du 3’UTR jouent un rôle important dans la modulation du niveau de transcrit. Le modèle Tet-Off que nous avons développé permet d’estimer le temps de demi-vie réel de l’ARNm αENaC et montre que le 3’UTR du messager joue un rôle complexe dans la stabilisation du messager en condition de base ainsi qu’en condition pro-inflammatoire. Enfin, nous avons identifié deux protéines liant l’ARNm qui pourraient jouer un rôle important dans la modulation de la stabilité du transcrit.

Déterminants moléculaires de la scoliose idiopathique de l'adolescent

La scoliose est la déformation de la colonne vertébrale la plus répandue. Elle atteint 3 à 4% de la population pédiatrique et dans 85% des cas, aucune cause n’a été identifiée. Ces cas sont appelés idiopathiques et les symptômes apparaissent durant la puberté; d’où le terme de ‘scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA). Cette pathologie atteint le plus souvent les jeunes filles, en nombre et en sévérité. Ces dernières années, plusieurs hypothèses ont été proposées afin d’élucider l’étiologie de cette pathologie. Celles-ci ont mis de l’avant différents facteurs génétiques, biochimiques, mécaniques, neurologiques, musculaires ou hormonaux. Plusieurs études ont rapporté des formes familiales de scoliose, soutenant la thèse d’une prédisposition génétique. Nous avons démontré que les patients souffrant de SIA présentent un défaut de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi et un taux élevé d’ostéopontine (OPN) circulante. En utilisant une approche de type ‘gène candidat’, nous avons montré que la protéine tyrosine phosphatase μ (PTPμ) régule l’activité du complexe d’intégrines α5/β1 (récepteur de l’OPN) via la protéine kinase PIPKIγ. Dans ce but, nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de biopsies de patients et de cas traumatiques comme sujets contrôles. Les biopsies osseuses de patients ont été obtenues lors de l’intervention chirurgicale à partir des vertèbres T3 à L4, selon les différentes procédures. Les biopsies issues de cas traumatiques proviennent d’autres types d’os (tibia, crête iliaque, fémur). Les profils d’expression du gène PTPRM (codant pour la protéine PTPμ) ont été étudiés par PCR quantitative (qPCR). Les taux de protéines PTPμ ont été analysés par immunoprécipitation suivi d’un western blot. Pour évaluer le rôle de cette protéine, nous avons bénéficié d’un modèle murin. Machida et al. ont démontré qu’il existe un taux plus élevé de scoliose parmi les souris C57Bl/6 bipèdes obtenues suite à l’amputation des membres supérieurs, sous anesthésie, cinq semaines après la naissance. Nous avons utilisé des cultures primaires d’ostéoblastes issues de la colonne ii vertébrale de souris C57Bl/6 bipèdes, délétées du gène PTPRM (souris dites ‘KO’), afin d’évaluer le niveau de signalisation cellulaire spécifique des protéines Gi par un test fonctionnel: la technique de spectroscopie cellulaire di-électrique (SCD). Selon nos données, 85% des souris bipédales ‘KO’ pour le géne PTPRM développent une scoliose (modérée à sévère) contre 55% des souris contrôles C57Bl6 bipèdes. De plus, les niveaux de PTPμ exprimée par les ostéoblastes de 34 patients SIA se trouvent diminués par comparaison à 17 sujets contrôles. Nos études de souris bipèdes ont montré que l’inactivation du gène PTPRM augmente l’incidence et la sévérité de la scoliose, sans pour autant affecter les taux circulant d’OPN ou l’expression de ses récepteurs. Par ailleurs, dans ce même contexte, nous avons remarqué une augmentation de l’interaction entre l’OPN et l’intégrine β1 en l’absence du gène PTPRM. Les cellules issues de ces souris bipèdes KO montrent une réduction dans leurs niveaux de signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi après stimulation par l’OPN. Cette diminution est en grande partie récupérée après traitement des cellules par un siRNA spécifique de la protéine PIPK1γ, substrat de PTPμ qui favorise la fixation de ligands aux intégrines. Ces études apportent les premières indications que la perte d’expression de PTPμ est impliquée dans le développement de la SIA, en amplifiant probablement l’effet inhibiteur de l’OPN sur la signalisation cellulaire médiée par les protéines Gi. Ces études permettent une meilleure compréhension de l’étiologie de la SIA. Elles pourraient avoir une contribution importante dans le développement futur de méthodes diagnostique et thérapeuthique dans le but d'arrete l’apparition et l’évolution de la maladie chez les enfants atteints.

Characterization of polycystin-1 in ADPKD pathogenetic mechanism : biogenesis and functional implications by genetic approaches in mouse

La polykystose rénale autosomique dominante (ADPKD) est une des maladies génétiques les plus communes. ADPKD se manifeste le plus souvent au stade adulte par la présence de kystes rénaux, et bien souvent de kystes hépatiques, avec une progression très variable. ADPKD mène à une insuffisance rénale: les seuls recours sont la dialyse puis la transplantation rénale. Les mutations dispersées sur les gènes PKD1 (majoritairement; la protéine polycystine-1, PC1) et PKD2 (la protéine polycystine-2, PC2) sont responsables de l’ADPKD. Le mécanisme pathogénétique de perte de fonction (LOF) et donc d’un effet récessif cellulaire est évoqué comme causatif de l’ADPKD. LOF est en effet supporté par les modèles murins d’inactivation de gènes PKD1/PKD2, qui développent de kystes, quoique in utéro et avec une rapidité impressionnante dans les reins mais pas dans le foie. Malgré de nombreuses études in vitro, le rôle de PC1/PC2 membranaire/ciliaire reste plutôt hypothétique et contexte-dépendant. Ces études ont associé PC1/PC2 à une panoplie de voies de signalisation et ont souligné une complexité structurelle et fonctionnelle exceptionnelle, dont l’implication a été testée notamment chez les modèles de LOF. Toutefois, les observations patho-cellulaires chez l’humain dont une expression soutenue, voire augmentée, de PKD1/PC1 et l’absence de phénotypes extrarénaux particuliers remet en question l’exclusivité du mécanisme de LOF. Il était donc primordial 1) d’éclaircir le mécanisme pathogénétique, 2) de générer des outils in vivo authentiques d’ADPKD en terme d’initiation et de progression de la maladie et 3) de mieux connaitre les fonctions des PC1/PC2 indispensables pour une translation clinique adéquate. Cette thèse aborde tous ces points. Tout d’abord, nous avons démontré qu’une augmentation de PKD1 endogène sauvage, tout comme chez l’humain, est pathogénétique en générant et caractérisant en détail un modèle murin transgénique de Pkd1 (Pkd1TAG). Ce modèle reproduit non seulement les caractéristiques humaines rénales, associées aux défauts du cil primaire, mais aussi extrarénales comme les kystes hépatiques. La sévérité du phénotype corrèle avec le niveau d’expression de Pkd1 ce qui supporte fortement un modèle de dosage. Dans un deuxième temps, nous avons démontré par les études de complémentations génétiques que ces deux organes reposent sur une balance du clivage GPS de Pc1, une modification post-traductionelle typique des aGPCR, et dont l’activité et l’abondance semblent strictement contrôlées. De plus, nous avons caractérisé extensivement la biogénèse de Pc1 et de ses dérivés in vivo générés suite au clivage GPS. Nous avons identifié une toute nouvelle forme et prédominante à la membrane, la forme Pc1deN, en plus de confirmer deux fragments N- et C-terminal de Pc1 (NTF et CTF, respectivement) qui eux s’associent de manière non-covalente. Nous avons démontré de façon importante que le trafic de Pc1deN i.e., une forme NTF détachée du CTF, est toutefois dépendant de l’intégrité du fragment CTF in vivo. Par la suite, nous avons généré un premier modèle humanisant une mutation PKD1 non-sens tronquée au niveau du domaine NTF(E3043X) en la reproduisant chez une souris transgénique (Pkd1extra). Structurellement, cette mutation, qui mimique la forme Pc1deN, s’est également avérée causative de PKD. Le modèle Pkd1extra a permis entre autre de postuler l’existence d’une cross-interaction entre différentes formes de Pc1. De plus, nos deux modèles murins sont tous les deux associés à des niveaux altérés de c-Myc et Pc2, et soutiennent une implication réelle de ces derniers dans l’ADPKD tou comme une interaction fonctionnelle entre les polycystines. Finalement, nous avons démontré un chevauchement significatif entre l’ADPKD et le dommage rénal aigüe (ischémie/AKI) dont une expression augmentée de Pc1 et Pc2 mais aussi une stimulation de plusieurs facteurs cystogéniques tel que la tubérine, la β-caténine et l’oncogène c-Myc. Nos études ont donc apporté des évidences cruciales sur la contribution du gène dosage dans l’ADPKD. Nous avons développé deux modèles murins qui serviront d’outil pour l’analyse de la pathologie humaine ainsi que pour la validation préclinique ADPKD. L’identification d’une nouvelle forme de Pc1 ajoute un niveau de complexité supplémentaire expliquant en partie une capacité de régulation de plusieurs voies de signalisation par Pc1. Nos résultats nous amènent à proposer de nouvelles approches thérapeutiques: d’une part, le ciblage de CTF i.e., de style chaperonne, et d’autre part le ciblage de modulateurs intracellulaires (c-Myc, Pc2, Hif1α). Ensemble, nos travaux sont d’une importance primordiale du point de vue informatif et pratique pour un avancement vers une thérapie contre l’ADPKD. Le partage de voies communes entre AKI et ADPKD ouvre la voie aux approches thérapeutiques parallèles pour un traitement assurément beaucoup plus rapide.

Elucidating the crosstalk between condensin subunits and its relevance in chromosome condensation

ADN subit une série de transformations structurelles complexes au cours de la division cellulaire, ce qui entraîne dans son compactage chromosomes mitotiques par un processus appelé la condensation des chromosomes. Le complexe de condensine pentamérique est fortement impliqué comme un effecteur majeur de ce phénomène. Il s'agit d'un complexe protéine de sous-unités multiples avec deux sous-unités catalytiques [SMC- Structural Maintenance of Chromosomes] et de trois sous-unités de régulation, hautement conservés de la levure à l'homme. Le complexe de condensine dans Saccharomyces cerevisiae est constitué de deux sous-unités de SMC [Smc2 et Smc4] et trois protéines non réglementaires [Brn1, Ycs4, Ycg1]. Malgré son importance, le mécanisme d'action de condensine reste largement inconnu. Par conséquent, l'objectif de cette recherche est de comprendre le mécanisme d'action de condensine et comment elle est affectée par l'interaction entre ses sous-unités réglementaires et non-réglementaires. Cette thèse identifie quatre morphologies dépendants du cycle cellulaire distincts du locus d'ADNr. Cette transformation du phénotype ADNr de G1 à la mitose dépend condensine. Afin de déterminer le rôle de l'interaction entre les sous-unités catalytiques et réglementaires de condensine dans la régulation du complexe condensine, nous avons identifié six résidus positifs sur l'extrémité C-terminale de BRN1 qui affectent la formation du complexe condensine, l'activité de la condensation et l'interaction avec tubuline, ce qui suggère que ces résidus ont un rôle dans la régulation de condensine. Ensemble, nos résultats suggèrent un modèle de règlement du condensine par l'interaction entre les sous-unités de condensine.

The orphan nuclear receptor, liver receptor homolog-1 (LRH-1, NR5A2) regulates decidualization

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro.

Detecting uterine cervical cancer cells using molecular biomarkers

Arrière-plan: les cellules tumorales circulantes (CTC) sont détectables dans de nombreux cancers et peuvent être utiles cliniquement pour le pronostic de la maladie, pour mesurer la récidive et pour prédire la sensibilité aux medicaments chimiothérapeutiques. Au cours des dernières années, l’études des CTC dans de nombreux cancers tels que le cancer du sein, du poumon, du côlon et de la prostate a grandement évolué. Alternativement, il y peu d'études à ce sujet concernant le cancer du col de l’utérus (CCU). Objectifs: Notre objectif est d’optimiser le processus d'enrichissement des CTC dans le CCU et la détection moléculaire des biomarqueurs E6 et E7. Matériel et Méthodes: Dans l’optique de mimer la présence de CTC dans le sang, nous avons dilué des cellules cancéreuses CaSki VPH16-positif provenant d’un CCU dans du sang humain prélevé sur des volontaires sains. Les CaSki ont été collectées suite à une centrifugation par densité avec le Ficoll, la lyse des globules rouges (RBC) et la lyse des RBC combinée avec un enrichissement positif et négatif à l’aide de marqueurs de surface cellulaire. Les CTC ont été détectées par la mesure d’expression des oncogènes E6 et E7 du virus du papillome humain (VPH), de la cytokératine 19 (CK19) et de la cycline p16INK4 en utilisant la technique quantitative en temps réel de Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR). Pour valider notre méthode de détection des CTC in vivo, nous avons recruté dix patientes atteintes d’un CCU VPH16 positif et six contrôles sains. Résultats: Dans le modèle de dilutions de cellules CaSki, la lyse des RBC seule ou combinée avec l'enrichissement négatif ou positif suggèrent des limites de détection de 1 CTC par mL de sang pour tous les biomarqueurs moléculaires utilisés. La sensibilité de détection est accrue lors de l'utilisation de l’enrichissement positif et négatif en réduisant le bruit de fond causé par les monocytes sanguins. Contrairement aux oncogènes E6 et E7, les marqueurs CK19 et p16INK4A ont été détectés chez des individus sains, les niveaux d'expression de base appropriés doivent donc être déterminés avec précision par rapport aux patientes CCU. Le gradient de densité par Ficoll a une limite de détection de seulement environ 1000 cellules par mL de sang. Enfin, les CTC ont été détectées dans 2/10 patientes en utilisant le marqueur CK19. Cependant, ces patientes étaient négatives pour les oncogènes E6/E7. Le marqueur p16INK4A était exprimé au même niveau dans tous les échantillons (CCU et normaux). Conclusion: Notre étude suggère que les oncogènes E6 et E7 du VPH16 sont les marqueurs biologiques les plus sensibles et spécifiques en qRT-PCR pour détecter les CTC dans le modèle de dilution de cellules de CCU dans le sang. Chez les patientes atteintes d’un CCU de stade précoce, seulement CK19 a révélé la présence potentielle de CTC, ce qui suggère que ces cellules sont rares à ce stade de la maladie. Mots clés: cancer du col de l’utérus, cellules tumorales circulantes, RT-qPCR, E6 et E7, CK19, p16INK4A, enrichissement immunomagnétique, détection moléculaire.

Caractérisation fonctionnelle du suppresseur de tumeurs BAP1

La déubiquitinase BAP1 (« BRCA1-Associated Protein1 ») a initialement été isolée pour sa capacité de promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 est muté de manière homozygote dans plusieurs cancers (tel que le cancer du rein, de la peau, de l’oeil et du sein) suggérant fortement que cette déubiquitinase est un suppresseur de tumeurs. Effectivement, la surexpression de BAP1 réduit la prolifération cellulaire et la croissance tumorale dans des modèles de xénogreffe de souris. Toutefois, la fonction biologique et le mécanisme d’action de cette déubiquitinase restent encore marginalement connus. Ainsi, les objectifs de cette thèse sont de caractériser la fonction biologique de BAP1 et de révéler les bases moléculaires de sa fonction suppressive de tumeurs. Pour déterminer la fonction biologique de BAP1, nous avons immuno-purifié et identifié les protéines associées à BAP1, qui s’avèrent être principalement des facteurs et co-facteurs de transcription. Ensuite, nous avons démontré que BAP1 est un régulateur de la transcription. Parallèlement, un autre groupe a montré que BAP1 chez la drosophile, Calypso, régule l’ubiquitination de H2A et la transcription génique. D’autre part, nos résultats d’analyse d’expression génique globale suggèrent que BAP1 jouerait un rôle important dans la réponse aux dommages à l’ADN. Effectivement, des expériences de gain et de perte de fonction (méthode de l’ARNi, modèle de cellules KO en BAP1 et de cellules déficientes en BAP1 re-exprimant BAP1) ont révélé que cette déubiquitinase régule la réponse aux bris double brin d’ADN par la recombinaison homologue. Nos résultats suggèrent que BAP1 exerce sa fonction suppressive de tumeurs en contrôlant la réparation sans erreur de l’ADN via la recombinaison homologue. En cas d’inactivation de BAP1, les cellules deviendront plus dépendantes du mécanisme de réparation par jonction d'extrémités non-homologues, qui est potentiellement mutagénique causant ainsi l’instabilité génomique. D’autres études seront nécessaires afin de déterminer le rôle exact de BAP1 dans la transcription et de comprendre comment la dérégulation de l’ubiquitination de H2A contribue au développement du cancer. Définir les mécanismes de suppression tumorale est de grand intérêt, non seulement pour comprendre la carcinogénèse mais également pour le développement de nouvelles thérapies contre cette maladie.

Immune potential and differentiation of equine induced pluripotent stem cells (eiPSC)

Induced pluripotent stem cells (iPSC) have the capacity to self renew and differentiate into a myriad of cell types making them potential candidates for cell therapy and regenerative medicine. The goal of this thesis was to determine the characteristics of equine iPSC (eiPSC) that can be harnessed for potential use in veterinary regenerative medicine. Trauma to a horse’s limb often leads to the development of a chronic non-healing wound that lacks a keratinocyte cover, vital to healing. Thus, the overall hypothesis of this thesis was that eiPSC might offer a solution for providing wound coverage for such problematic wounds. Prior to considering eiPSC for clinical applications, their immunogenicity must be studied to ensure that the transplanted cells will be accepted and integrate into host tissues. The first objective of this thesis was to determine the immune response to eiPSC. To investigate the immunogenicity of eiPSC, the expression of major histocompatibility complex (MHC) molecules by the selected lines was determined, then the cells were used in an intradermal transplantation model developed for this study. While transplantation of allogeneic, undifferentiated eiPSC elicited a moderate cellular response in experimental horses, it did not cause acute rejection. This strategy enabled the selection of weakly immunogenic eiPSC lines for subsequent differentiation into lineages of therapeutic importance. Equine iPSC offer a potential solution to deficient epithelial coverage by providing a keratinocyte graft with the ability to differentiate into other accessory structures of the epidermis. The second objective of this thesis was to develop a protocol for the differentiation of eiPSC into a keratinocyte lineage. The protocol was shown to be highly efficient at inducing the anticipated phenotype within 30 days. Indeed, the eiPSC derived vi keratinocytes (eiPSC-KC) showed both morphologic and functional characteristics of primary equine keratinocytes (PEK). Moreover, the proliferative capacity of eiPSC-KC was superior while the migratory capacity, measured as the ability to epithelialize in vitro wounds, was comparable to that of PEK, suggesting exciting potential for grafting onto in vivo wound models. In conclusion, equine iPSC-derived keratinocytes exhibit features that are promising to the development of a stem cell-based skin construct with the potential to fully regenerate lost or damaged skin in horses. However, since eiPSC do not fully escape immune surveillance despite low MHC expression, strategies to improve engraftment of iPSC derivatives must be pursued.

Influence du microenvironnement inflammatoire sur la sénescence contrôlée par la réponse aux dommages à l'ADN, et sa régulation par l’induction du stress à la chromatine

La sénescence cellulaire, ou l’arrêt irréversible de la prolifération, influence des processus physiologiques et pathologiques, comme le cancer. Parmi les caractéristiques de la sénescence, se retrouve le PSAS ou phénotype sécrétoire associé à la sénescence. Le PSAS est composé d’une variété de cytokines, facteurs de croissance et protéases. Ses actions pro- et anti-tumorale sont connues, mais l’on ignore laquelle prédomine. Mes travaux s’attardent aux effets du PSAS sur l’induction de la sénescence dans les cellules environnantes et à sa régulation. Nous avons démontré que le PSAS ne synergise pas avec la dysfonction télomérique chronique ou aigue, afin de causer un arrêt de croissance. Également, l’étude du mécanisme responsable de l’induction de la sénescence par stress à la chromatine, suggère que la kinase c-Abl n’est pas requise pour cette voie, contrairement à des publications antérieures. Mes travaux éclairent les mécanismes d’action et la régulation du PSAS dans la sénescence induite par dysfonction télomérique et par stress à la chromatine.

Rôle de protéines épididymaires humaines et murines dans les fonctions spermatiques

L’infertilité affecte jusqu’à 15-20% des couples en âge de se reproduire. C’est pourquoi, mieux comprendre les mécanismes à la base de la fécondation est essentiel pour l’identification de nouvelles causes d’infertilité et l’optimisation des techniques de reproduction assistée. La capacitation est une étape de la maturation des spermatozoïdes qui se déroule dans le tractus génital femelle. Elle est requise pour la fécondation d’un ovocyte. Notre laboratoire a démontré que des protéines du plasma séminal bovin, appelées protéines Binder of SPerm (BSP), se lient aux phospholipides portant des groupements choline à la surface de la membrane des spermatozoïdes lors de l’éjaculation et promeuvent la capacitation. Ces protéines exprimées par les vésicules séminales sont ubiquitaires chez les mammifères et ont été étudiées chez plusieurs espèces dont l’étalon, le porc, le bouc et le bélier. Récemment, l’expression de gènes homologues aux BSP a été découverte dans les épididymes d’humains (BSPH1) et de souris (Bsph1 et Bsph2). Notre hypothèse est que les BSP chez ces deux espèces sont ajoutées aux spermatozoïdes lors de la maturation épididymaire et ont des rôles dans les fonctions spermatiques, similaires à ceux des protéines BSP bovines. Les protéines BSP humaines et murines représentent une faible fraction des protéines totales du plasma séminal. Pour cette raison, afin d’étudier leurs caractéristiques biochimiques et fonctionnelles, des protéines recombinantes ont été produites. Les protéines recombinantes ont été exprimées dans des cellules Escherichia coli origami B(DE3)pLysS en utilisant un vecteur d’expression pET32a. Suivant la lyse cellulaire, les protéines ont été dénaturées avec de l’urée et purifiées par chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés. Une fois liées à la colonne, les protéines ont été repliées à l’aide d’un gradient d’urée décroissant avant d’être éluées. Cette méthode a mené à la production de trois protéines recombinantes (rec-BSPH1 humaine, rec-BSPH1 murine et rec-BSPH2 murine) pures et fonctionnelles. Des expériences de chromatographie d’affinité et de co-sédimentation nous ont permis de démontrer que les trois protéines peuvent se lier à des ligands connus des protéines BSP comme la gélatine et l’héparine en plus de pouvoir se lier aux spermatozoïdes. Nos études ont également révélées que les deux protéines rec-BSPH1 peuvent se lier aux liposomes de phosphatidylcholine (PC) et sont capable de promouvoir la capacitation des spermatozoïdes. À l’opposé, rec-BSPH2 ne peut ni se lier aux liposomes de PC, ni stimuler la capacitation. Finalement, les protéines recombinantes n’ont aucun effet sur la réaction acrosomique ou sur la motilité des spermatozoïdes. Chez les bovins, les protéines BSP induisent la capacitation grâce des interactions avec les lipoprotéines de haute densité (HDL) et les glycosaminoglycanes. Puisque le HDL est également un joueur important de la capacitation chez la souris, le rôle de la protéine native BSPH1 murine au niveau de la capacitation induite par le HDL a été étudié. Les résultats obtenus suggèrent que, in vivo, la protéine BSPH1 de souris serait impliquée dans la capacitation via une interaction directe avec le HDL. Comme les protéines BSPH1 humaines et murines sont orthologues, ces résultats pourraient aussi s’appliquer à la fertilité humaine. Les résultats présentés dans cette thèse pourraient mener à une meilleure compréhension de la fertilité masculine et aider à améliorer les techniques de reproduction assistée. Ils pourraient également mener au développement de nouveaux tests diagnostiques ou de contraceptifs masculins.

Effets de la reprogrammation sur le gène empreinté H19 chez les équins

Lors de la fécondation, le génome subit des transformations épigénétiques qui vont guider le développement et le phénotype de l’embryon. L'avènement des techniques de reprogrammation cellulaire, permettant la dédifférenciation d'une cellule somatique adulte, ouvre la porte à de nouvelles thérapies régénératives. Par exemple, les procédures de transfert nucléaire de cellules somatique (SCNT) ainsi que la pluripotence par induction (IP) visent à reprogrammer une cellule somatique adulte différentiée à un état pluripotent similaire à celui trouvé durant la fécondation chez l'embryon sans en impacter l'expression génique vitale au fonctionnement cellulaire. Cependant, la reprogrammation partielle est souvent associée à une mauvaise méthylation de séquences géniques responsables de la régulation des empreintes géniques. Ces gènes, étudiés chez la souris, le bovin et l'humain, sont exprimés de manière monoallélique, parent spécifique et sont vitaux pour le développement embryonnaire. Ainsi, nous avons voulu définir le statut épigénétique du gène empreinté H19 chez l'équin, autant chez le gamètes que les embryons dérivés de manière in vivo, SCNT ainsi que les cellules pluripotentes induites (iPSC). Une région contrôle empreinté (ICR) riche en îlots CpG a été observée en amont du promoteur. Couplé avec une analyse de transcrit parent spécifique du gène H19, nous avons confirmé que l'empreinte du gène H19 suit le modèle insulaire décrit chez les autres mammifères étudiés et résiste à la reprogrammation induite par SCNT ou IP. La déméthylation partielle de l'ICR observée chez certains échantillons reprogrammés n'était pas suffisante pour induire une expression biallélique, suggérant un contrôle des empreintes chez les équins durant la reprogrammation.

TDP-43 régule la dynamique et la fonction des Granules de Stress via G3BP1

Les Granule de Stress (GS) sont des inclusions cytoplasmiques contenant des protéines et des ARNm qui s’assemblent en réponse à l’exposition à un stress. Leur formation fait partie intégrante de la réponse cellulaire au stress et est considérée comme une étape déterminante pour la résistance au stress et la survie cellulaire. Actuellement, les GS sont reliés à divers pathologies allant des infections virales aux maladies neurovégétatives. L’une d’entre elle, la Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est particulièrement agressive, caractérisée par une perte des neurones moteurs aboutissant à la paralysie et à la mort du patient en cinq ans en moyenne. Les mécanismes de déclenchement de la pathologie restent encore à déterminer. TDP-43 (TAR DNA binding protein 43) et FUS (Fused in liposarcoma) sont deux protéines reliées à la pathologie qui présentent des similarités de structure et de fonction, suggérant un mécanisme commun de toxicité. TDP-43 et FUS sont toutes les deux recrutées au niveau des GS en condition de stress. Nous avons démontré pour la première fois que la fonction des GS est de protéger les ARNm de la dégradation induite par l’exposition au stress. Cette fonction n’était que suspectée jusqu’alors. De plus nous avons mis en évidence que G3BP1 (Ras GTPase-activating protein-binding protein 1) est l’effectrice de cette fonction via son implication dans la dynamique de formation des GS. TDP-43 étant un régulateur de G3BP1, nous prouvons ainsi que la perte de fonction de TDP-43/G3BP1 aboutit à un défaut de réponse au stress aboutissant à une vulnérabilisation cellulaire. Le mécanisme de toxicité emprunter par FUS diffère de celui de TDP-43 et ne semble pas passer par une perte de fonction dans le cadre de la réponse au stress.

Étude de la fonction de la protéine RPAP4 et de son association avec l’ARN polymérase II

L’ARN polymérase II (ARNPII), l’enzyme responsable de la transcription des ARN messagers, procède au décodage du génome des organismes vivants. Cette fonction requiert l’action concertée de plusieurs protéines, les facteurs généraux de la transcription, par exemple, formant un réseau d’interactions protéine-protéine, plusieurs étant impliquées dans la régulation de l’ARNPII à différents niveaux. La régulation de la transcription a été largement étudiée durant les quatre dernières décennies. Néanmoins, nous en connaissons peu sur les mécanismes qui régulent l’ARNPII avant ou après la transcription. Dans la première partie de cette thèse, nous poursuivons la caractérisation du réseau d’interactions de l’ARNPII dans la fraction soluble de la cellule humaine, travail qui a débuté précédemment dans notre laboratoire. Ce réseau, développé à partir de la méthode de la purification d’affinité en tandem couplée à la spectrométrie de masse (AP-MS) et à des méthodes d’analyses bioinformatiques, nous amène une foule d’informations concernant la régulation de l’ARNPII avant et après son interaction avec la chromatine. Nous y identifions des protéines qui pourraient participer à l’assemblage de l’ARNPII telles des chaperonnes et les protéines du complexe R2TP/prefoldin-like ainsi que des protéines impliquées dans le transport nucléocytoplasmique. Au centre de ce réseau se trouvent RPAP4, une GTPase qui semble se positionner à l’interface entre ces protéines régulatrices et l’ARNPII. Nous avons donc entamé l’étude la fonction de RPAP4, ce qui nous a menés à la conclusion que RPAP4 est essentielle à l’import nucléaire de l’ARNPII au noyau, où elle exerce sa fonction. Nous avons également montré que les motifs G et GPN sont essentiels à la fonction de RPAP4. Le traitement des cellules avec le bénomyl nous montre aussi que la fonction de RPAP4 et l’import nucléaire de l’ARNPII requièrent l’action des microtubules. La deuxième partie de la thèse s’intéresse à une autre protéine positionnée au centre du réseau, RPAP2. Cette dernière partage plusieurs interactions avec RPAP4. Elle est aussi essentielle à la localisation nucléaire de l’ARNPII et interagit directement avec celle-ci. RPAP4 et RPAP2 étant toutes deux des protéines cytoplasmiques qui font la navette entre le noyau et le cytoplasme, nous présentons des évidences que RPAP4 est impliquée dans l’export nucléaire de RPAP2 pour permettre à celle-ci d’être disponible dans le cytoplasme pour l’import de l’ARNPII dans le noyau. Dans la troisième partie de la thèse, nous étudions plus en profondeur les modifications post-traductionnelles de RPAP4, ce qui nous aide à mieux comprendre sa propre régulation et sa fonction auprès de l’ARNPII. RPAP4 est phosphorylée en mitose par la MAP kinase ERK5. Cette phosphorylation favorise l’interaction entre RPAP4 et RPAP2, ce qui empêche RPAP2 d’interagir avec l’ARNPII pendant la mitose, prévenant du même coup, son interaction avec la chromatine pendant cette phase du cycle cellulaire où la transcription est presque inexistante.

Régulation de la kinase Ste20 Slik de Drosophila par phosphorylation de la boucle d'activation

Les kinases constituent une famille majeure de protéines qui régulent divers processus par la phosphorylation de leurs substrats, mais aussi par leur activité non- catalytique. Ce rôle indépendant de l’activité kinase a été observé chez quelques protéines dont des membres de la famille Sterile-20. La kinase Ste20 Slik de Drosophila aide au maintien de l’intégrité des tissus épithéliaux en phosphorylant l’ERM Moesin et peut aussi induire une prolifération cellulaire non-autonome indépendamment de son activité catalytique. La méthode de régulation de ces deux rôles était jusqu’ici inconnue. Nous avons identifié 19 sites de phosphorylation chez Slik par spectrométrie de masse. À l’aide de mutants, nous démontrons que les deux fonctions de Slik sont régulées par la phosphorylation d’au moins 2 résidus conservés de son segment d’activation par un mécanisme d’auto- et/ou trans-phosphorylation. Cette étude amène une meilleure compréhension de la régulation de l’intégrité épithéliale et de la croissance, deux processus clés qui sont souvent déréglés dans le cancer et certaines maladies génétiques.

Feedback regulation of Gab2-dependent signaling by the Ras/MAPK pathway

La voie de signalisation des Récepteurs Tyrosine Kinase (RTK) occupe un rôle central dans la régulation de la croissance cellulaire, la prolifération, la différentiation et la motilité. Une régulation anormale des RTKs mène à plusieurs maladies humaines telles que le cancer du sein, la seconde cause de mortalité chez les femmes à cause de l’amplification et la mutation fréquente de la protéine tyrosine kinase HER2 (ERBB2). Grb2-associated binder (Gab) 2 est une protéine adaptatrice qui agit en aval de plusieurs RTKs, y compris HER2, pour réguler de multiples voies de signalisation. En réponse à la stimulation par de nombreux facteurs de croissances et cytokines, Gab2 est recruté à la membrane plasmique où il potentialise l’activation des voies de signalisation Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK) et PI3K (phosphatidylinositol-3-kinase)/Akt (protein kinase B). En plus d’occuper un rôle essentiel durant le développement du système hématopoïétique, Gab2 est souvent amplifié dans les cancers, notamment le cancer du sein et les mélanomes. Cependant, les mécanismes moléculaires qui régulent le fonctionnement de Gab2 sont peu connus. Il est établi que lors de l’activation des RTKs, Gab2 est phosphorylé au niveau de plusieurs résidus Tyrosine, menant à l’association de différentes protéines comme p85 et Shp2. En plus de la phosphorylation en Tyrosine, notre laboratoire ainsi que d’autres groupes de recherche avons identifié que Gab2 est aussi phosphorylé au niveau de résidus Ser/Thr suite à l’activation de la voie de signalisation MAPK. Cependant, la régulation des fonctions de Gab2 par ces modifications post-traductionnelles est encore peu connue. Dans le but de comprendre comment Gab2 est régulé par la voie de signalisation MAPK, nous avons utilisé différentes approches. Dans la première partie de ma thèse, nous avons déterminé un nouveau mécanisme démontrant que la voie de signalisation Ras/MAPK, par le biais des protéines kinases RSK (p90 ribosomal S6 kinase), phosphoryle Gab2. Ce phénomène se produit à la fois in vivo et in vitro au niveau de trois résidus Ser/Thr conservés. Des mutations au niveau de ces sites de phosphorylation entrainent le recrutement de Shp2 menant à l’augmentation de la motilité cellulaire, ce qui suggère que les protéines RSK restreignent les fonctions dépendantes de Gab2. Ce phénomène est le résultat de la participation de RSK dans la boucle de rétroaction négative de la voie de signalisation MAPK. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons démontré que les protéines ERK1/2 phosphorylent Gab2 au niveau de plusieurs résidus pS/T-P à la fois in vitro et in vivo, entrainant l’inhibition du recrutement de p85. De plus, nous avons établi pour la première fois que Gab2 interagit physiquement avec ERK1/2 dans des cellules lors de l’activation de la voie de signalisation MAPK. Par ailleurs, nous avons montré un nouveau domaine d’attache du module ERK1/2 sur Gab2. Des mutations sur les résidus essentiels de ce domaine d’attache n’entrainent pas seulement la dissociation de ERK1/2 avec Gab2, mais diminuent également la phosphorylation dépendante de ERK1/2 sur Gab2. Ainsi, nos données montrent que la voie de signalisation MAPK régule les fonctions de la protéine Gab2 par le biais des kinases RSK et ERK1/2. Cette thèse élabore par ailleurs un schéma complet des fonctions de Gab2 dépendantes de la voie de signalisation MAPK dans le développement de nombreux cancers.