A Infância na latitude zero: as brincadeiras da criança 'global' africana

Tese de Doutoramento em Estudos da Criança (área de especialização em Sociologia da Infância).

Agressividade de algumas gramíneas forrageiras na região de Piracicaba

O Autor relata suas observações sôbre o comportamento de doze Gramíneas forrageiras consideradas agressivas na região de Piracicaba, Estado de S. Paulo, Brasil, admitindo que as mesmas podem ser confirmadas em condições tropicais ou subtropicais semelhantes. Estuda a agressividade como uma propriedade inerente à planta, mas dependente de condições edáfico-climático-bióticas para manifestar-se de uma ou outra maneira. Admite que a agressividade, que se verifica em consequência de uma competição pela luz, pelo alimento e pela reprodução, seja uma resultante da intensidade de duas principais condições endogenas: multiplicação e crescimento, debaixo de condições de adatação exógenas favoráveis. Condições favoráveis para certas espécies são desfavoráveis para outras dando margem à dominância ora de uma ora de outra espécie, o que deve ser levado em conta quer no manejo da pastagem quer no controle às pragas. Forrageiras importantes podem vir a constituir pragas tão sérias que venham a anular tôdas as vantagens de sua introdução pelas despezas que seu contrôle possa acarretar. Entretanto, como a agressividade é uma qualidade desejável numa forrageira, o estudo de seu comportamento em cada ambiente edáfico-climático-biótico típico e de seu controle deve preceder a sua recomendação aos fazendeiros. São discutidos os prejuízos decorrentes das plantas invasoras, assinalando-se muitas Gramíneas como tais. Sendo o assunto pouco estudado no Brasil, aventa a necessidade de se criarem organizações para tal fim, considerando a importância do problema. As seguintes espécies foram objeto da crítica do A: 1. Capim Colonião (Panicum maximum, var.). Altamente invasor por sementes e disseminável pela aração. Erradicação muito custosa em terras argilosas. Pode vir a constituir uma praga muito séria num futuro próximo. Dada a expansão de sua área cultivada, recomenda: a. limitar sua plantação, recomendando-se outras espécies produtivas e menos perigosas; b. pesquizar meios eficientes e baratos de seu contrôle, achando injustificável sua presença nas fazendas velhas colonizadas. 2. Capim Sempre-vêrde (Panicum maximum, var. gongyloides). Embora igualmente agressivo é de mais fácil contrôle por possuir touceiras mais fracas, podendo ser arrancadas com arado. E' menos perigoso que o Colonião. 3. Capim Gordura (Melinis minutiflora). Conquanto muito disseminado e tipicamente invasor é de contrôle relativamente fácil. 4. Capim Jaraguá (Hyparrhenia rufa). E' pouco menos invasor que o Gordura e facilmente erradicável, sobretudo porque dificilmente se propaga vegetativamente. 5. Capim do Pará (Panicum purpurascens). De uma agressividade extremamente alta, pode ser eliminado com mediana dificuldade. Mais difícil que ns. 3 e 4 e menos de que 1 e 2. 6. Capim da Bermuda (Cynodon dactylon). Compara-se em agressividade e facilidade de controle com a Gramínea anterior. 7. Capim de Kikuiu (Pennisetum clandestinum). De comportamento variável. Em boas condições supera o C. de Bermuda na agressividade e dificuldade de erradicação. E' praga mais séria que as Gramíneas de 2 a 6. 8. Capim da Bahia (Paspalum notatum). Extremamente agressivo, embora de formação lenta. Pode vir a tornar-se uma praga séria se não fôr controlado, pois tem tendência de dominar quase todas as espécies associadas. Seu contrôle merece ser estudado, parecendo não ser muito difícil de erradicar por métodos racionais. 9. Capim de Castela (Panicum repens). E' a Gramínea estudada que maior agressividade revelou. Seu emprego deve ser limitado a quem dela possa tirar partido. E' possível que possam desenvolver-se métodos de controle práticos e eficazes, devido ao seu pequeno porte. 10. Capim de Natal (Tricholaena rosea). Dissemina-se muito por sementes, praguejando fàcilmente as terras. Tem pequeno valor forrageiro. Deve ser desaconselhado e combatido como praga. 11. Capim de Rhodes (Chloris gayana). Muito disseminado à beira dos caminhos, não é praga da lavoura e é nesta lista é mais fácil de ser erradicado. 12. Capim de Johnson (Sorghum halepense). Conhecida praga, já introduzida no Brasil. Comporta-se mal, não tendo valor como forrageira, devendo todos seus focos serem eliminados. Em Piracicaba propaga-se mais comumente por rizomas durante a aração. Foram observados casos de intoxicação de animais.

Contribuição para o estudo da influência da profundidade de trabalho do arado na produção agrícola

A aradura é a principal das operações agrícolas para o desenvolvimento das diversas culturas. A sua importância é conhecida desde as mais remotas eras. Assim, os romanos já tinham sua teoria sobre aradura. Desta forma o arado, a mais antiga das máquinas agrícolas, foi sempre motivo de atenção dos agricultores, fabricantes e técnicos em mecânica agrícola. A sua evolução foi bastante grande. O estudo do arado sob o ponto de vista agrícola e econômico, para exata aplicação da máquina, nas diversas condições de solo, é de máximo interêsse para a mecânica agrícola. Assim sendo, para orientar a correta aplicação do arado, o que constitui a presente tese, foi experimentado num solo arenoso, de características mecânicas (areia total 75,7%, argila 13,5 e lôdo 10,8%) a diversas profundidades de aração, (5, 10, 15, 20, 25, 30cm), plantando nos mesmos, milho para verificar o efeito na produção. Num terceiro ano de experiência, foi realizada uma experiência a mais, isto é, uma subsolagem a 40 cm. Foi plantado milho nos canteiros assim trabalhados, e que eram repetidos em número de 4, porque o milho é uma cultura muito frequente e de fácil contrôle. As experiências com as diversas profundidades, demostraram que nestas condições de solo, à medida que aumenta a profundidade, aumenta também a produção. Do exposto, conclui-se pela experimentação que para esse solo é aconselhável: fazer o arado trabalhar a maior profundidade em que comumente é empregado até o limite de 25 cm, que foi o valor máximo examinado.

Variabilidade de Fusarium oxysporum F. lycopersici (Wr) Sny & Hans em São Paulo

A Murcha de Fusarium em tomateiro não está sendo eficientemente controlada no Estado de São Paulo, devido a falta de variedades resistentes, adequadas ao mercado. Como na produção destas, variedades resistentes é necessário um estudo sôbre a variabilidade do fango quanto a raças fisiológicas os autores pesquisaram 48 linhagens de Fusarium coletados em todo o Estado de São Paulo e através de testes em variedades diferenciais Bonny Best., Santa Cruz (Kobayashi) e S-34 em condições de casa de vegetação com contrôle parcial de temperatura e inoculaçôes artificiais. Concluiram que das 48 linhagens estudadas uma desta apresentava reação de raça 2 as demais 47 a da raça 1 sendo possível reparar as linhagens pelo gráu de patogenicidade.

Determinação das raças fisiológicas do Fusarium do tomateiro de Pernambuco

Os autôres, utilizaram as variedades de tomates Santa Cruz e S-34 como variedade sdiferericiais, para determinar raças fisiológicas de Fusarium oxysporum f. lycopersici (Wr) Sny & Hans. Testaram 7 isolamentos do patógeno, retirados de material proveniente de Pernambuco, em condições de casa de vegetação com contrôle parcial de temperatura e concluiram que todos os 7 isolamentos reagiram como sendo da raça 1, e que houve variação na patogenicidade entre eles.

Nova raça de Fusarium do tomateiro em São Paulo

Os autôres, trabalhando em condições de casa de vegetação com contrôle parcial de temperatura do ar e fazendo inoculações artificiais, testaram as reações de 9 variedades, e de 10 progênies de tomateiro e da espécie L. pimpinellifolium (P.I. 126915-1-8) quanto à resistência a um isolamento de Fusarium do Estado de São Paulo. Os resultados, permitiram chegar às seguintes conclusões: 1) as variedades comerciais com resistência às, raças 1 e 2 são suscetíveis ao fungo em estudo. 2) a espécie L pimpinellifolium (P.I. 126915-1-8) possui resistência à nova raça. 3) O isolamento em estudo pode ser considerado raça 3 de Fusarium oxysporum f. lycopersici (Wr) Sny & Hans.

Ensaios terapêuticos com penicilina: II - Sífilis: (Nota prévia)

Seis sifiliticos foram tratados com penicilina em doses baixas, no Hospital Evandro Chagas, do Instituto Oswaldo Cruz. Protossifilomas foram bacterioscópicamente negativos entre 3 e 6 dias e cicatrizaram completamente entre 10 e 13 idas, com a aplicação de 1.200 a 2.400 unidades Oxford por 24 horas. Condilomas sifiliticos e placas mucosas hipertróficos tiveram bacterioscopia negativa entre 6 e 8 dias, cicatrizaram completamente entre 10 e 20 dias, com a aplicação de 1.200 unidades por 24 horas. Porém, doses de 4.800 unidades, no mesmo espaço de tempo, forma insuficientes para controlar outras manifestações luéticas secundárias (roséolas, placas mucosas). Em 3 casos sob contrõle sorológico, verificou-se que a negatividade das reações não acompanha imediatamente a cura clínica. Além disso, conforme já foi observado também com a bouba, os resultados dos testes sorológicos oscilam mezes a fio, negativando e voltando à positividade.

Estudos anatômicos e histológicos sôbre a subfamília Triatominae (Hetroptera, Reduviidae): III parte: pesquisas sôbre o mecanismo da picada dos Triatominae

É analisado o mecanismo da picada dos Triatominae sob a consideração das observações até hoje conhecidas em Heteroptera e Homoptera. Leva à conclusão que os dados da literatura não chegam para esclarecer o mecanismo da picada dos Triatominae. Dos resultados das pesquisas e observações do animal vivo surge o seguinte quadro: Uma contração extremamente forte do músculo protrator pode mover as mandíbulas do adulto de Triatoma infestans para frente no máximo por 500 micra. Uma fonte de alimentação suficiente pode ser encontrada na epiderme do hospedeiro (homen) apenas numa profundidade de pelo menos 1000 a 1500 micra. O lábio nem pode ser encurtado nem dobrado. Correspondendo aos "fingerfoermigen Fortsaetzen" (WEBER) encontra-se na ponta do último segmento labial um mecanismo para a fixação das mandíbulas numa certa posição. Depois do esgotamento das possibilidades de contração dos protratores das mandíbulas as últimas são fixadas na posição atual. Em seguida segue uma dilatação dos protratores e depois do relaxamento do aparelho de fixação das mandíbulas os protratores são capazes de mover novamente as mandíbulas por quasi 500 micra para frente. Êsse processo pode ser repetido umas vêzes . Com o aparelho de fixação é ligado um mecanismo para a limpeza das mandíbulas na parte apical do último segmento labial em forma de uma escova. Na cabeça dos Triatominae é situado um órgão de contrôle muito complicado para estímulos mecânicos controlando a entrada das mandíbulas no tecido do hospedeiro. (O órgão receptivo correspondente para estímulos químicos é o órgão gustativo da epifaringe, já descrito umas vêzes.) O órgão representa um prolongamento do fim do tentório tubiforme dirigindo-se para frente. Perto da alavanca de articulação das mandíbulas o tubo, cheio de um líquido, aumenta-se formando uma vesícula que se insere na alavanca citada e na parede da cabeça diretamente ou por meio de tonofibrilas. Daqui o tubo continua pela antena inteira e insere-se, fechado no fim, por dois feixes de tonofibrilas fortes na extremidade do último segmento antenal. Imediatamente antes do órgão de Johnston insere-se no tubo do órgão de contrôle um scolopídio grande com a contrainserção na parede da antena (pedicelo). Cada tensão na vesícula na alavanca de articulação da mandíbula altera a pressão no líquido do órgão. A alteração da pressão é percebida pelo scolopídio. O scolopídio possui um aparelho terminal que representa uma invaginação da cutícula da parede antenal. Esta formação encontra-se também nos scolopídios do orgão de Johnston. O órgão pertence tanto às formas hematófagas dos gêneros Triatoma e Rhodnius como também à várias formas predatoras e fitófagas. Pode-se supor que o órgão é presente num grande número dos Heteroptera e que, eventualmente, representa uma parte do plano geral da ordem. O grau da evolução muito elevada deste órgão de controle indica que tem um papel importante para a manutenção da vida das espécies.

A doença de Chagas em Minas Gerais: esbôco crítico dos trabalhos publicados até 1951

O grande impulso que têm tornado, nestes últimos anos, as investigações sôbre a doença de Chagas, não sòmente em Minas Gerais, como também em outros Estados do Brasil e países do novo continente atingidos pela endemia; o interêsse cada vez mais crescente por parte dos médicos em geral e a facilidade com que vêm sendo por êles assimiladas as recentes contribuições ao estudo desta entidade mórbida; a importância médico-social e a repercussão econômica que tem sido atribuída à esquizotripanose como fator de letalidade e de incapacidade relativa ou total para o trabalho, depois de conhecidos os resultados de inquéritos clínico-epidemiológicos realizados em zonas infestadas por triatomíneos; a recente adoção, por parte das autoridades responsáveis pela saúde publica, de medidas concretas de contrôle da doença pelo combate aos seus transmissores domiciliares, por meio de inseticidas de ação residual aplicados em larga escala; e, principalmente, a escassez de trabalhos de conjunto e de fácil acesso, com referencias bibliográficas adequadas e extensas, que facilitassem aos não especializados no assunto, o conhecimento e a consulta das investigações já realizadas sôbre êste importante problema de medicina tropical; tais são os principais motivos que sugeriram a elaboração de um esbôço crítico do desenvolvimento dos trabalhos até agora publicados sôbre a esquizotripanose em Minas Gerais. De fato, foi aí descoberta a nova entidade mórbida do homem, foram aí estudados e esclarecidos problemas relativos à etiologia, epidemiologia, aspectos clínicos e anatomo-patológicos da esquizotripanose, foram aí realizadas investigações experimentais e desenvolvidos métodos de profilaxia, constituindo, em conjunto, os trabalhos realizados sôbre a esquizotripanose em Minas Gerais, fundamentados nos alicerces sólidos legados pelo seu grande descobridor, uma obra verdadeiramente monumental, que tanto orgulha e engrandece a ciência latino-americana. Os trabalhos publicados sôbre a doença de Chagas em Minas Gerais, compreendendo tôdas as inves tigações aí realizadas e as contribuições que com material procedente do Estado se realizaram fora dêle, foram divididos em cinco grandes grupos: l.º) — Trabalhos realizados em Lassance 2.º) — Trabalhos realizados em Bambuí 3.º) — Trabalhos realizados em Belo Horizonte 4.º) — Trabalhos realizados em outras zonas do Estado 5.º) — Profilaxia da doença de Chagas em larga escala. I) — Os trabalhos realizados em Lassance cobrem um longo período de quase 30 anos, período êsse que vai desde 1909, data da descoberta de um novo tripanosoma e da descrição da nova entidade mórbida do homem feita por CHAGAS, ate 1936, data da publicação de trabalhos de pesquisadores de Manguinhos, apresentados no ano anterior à Nona Reunião da Sociedade Argentina de Patologia Regional convocada em homenagem à memória do grande tropicalista brasileiro CARLOS CHAGAS. Pràticamente, as pesquisas desenvolvidas em Lassance e os trabalhos realizados com o abundante material que de lá foi canalizado para o Instituto Oswaldo Cruz — investigações condensadas em uma centena de publicações — foram feitas por CHAGAS e colaboradores durante a vida do descobridor da esquizotripanose. Neste período, CHAGAS e pesquisadores que, sob sua orientação, trabalharam em Lassance e Manguinhos, descreveram a nova doença nas suas diversas...

Development of metabolic labeling strategies to study changes in protein expression

Résumé : Les progrès techniques de la spectrométrie de masse (MS) ont contribué au récent développement de la protéomique. Cette technique peut actuellement détecter, identifier et quantifier des milliers de protéines. Toutefois, elle n'est pas encore assez puissante pour fournir une analyse complète des modifications du protéome corrélées à des phénomènes biologiques. Notre objectif était le développement d'une nouvelle stratégie pour la détection spécifique et la quantification des variations du protéome, basée sur la mesure de la synthèse des protéines plutôt que sur celle de la quantité de protéines totale. Pour cela, nous volions associer le marquage pulsé des protéines par des isotopes stables avec une méthode d'acquisition MS basée sur le balayage des ions précurseurs (precursor ion scan, ou PIS), afin de détecter spécifiquement les protéines ayant intégré les isotopes et d'estimer leur abondance par rapport aux protéines non marquées. Une telle approche peut identifier les protéines avec les plus hauts taux de synthèse dans une période de temps donnée, y compris les protéines dont l'expression augmente spécifiquement suite à un événement précis. Nous avons tout d'abord testé différents acides aminés marqués en combinaison avec des méthodes PIS spécifiques. Ces essais ont permis la détection spécifique des protéines marquées. Cependant, en raison des limitations instrumentales du spectromètre de masse utilisé pour les méthodes PIS, la sensibilité de cette approche s'est révélée être inférieure à une analyse non ciblée réalisée sur un instrument plus récent (Chapitre 2.1). Toutefois, pour l'analyse différentielle de deux milieux de culture conditionnés par des cellules cancéreuses humaines, nous avons utilisé le marquage métabolique pour distinguer les protéines d'origine cellulaire des protéines non marquées du sérum présentes dans les milieux de culture (Chapitre 2.2). Parallèlement, nous avons développé une nouvelle méthode de quantification nommée IBIS, qui utilise des paires d'isotopes stables d'acides aminés capables de produire des ions spécifiques qui peuvent être utilisés pour la quantification relative. La méthode IBIS a été appliquée à l'analyse de deux lignées cellulaires cancéreuses complètement marquées, mais de manière différenciée, par des paires d'acides aminés (Chapitre 2.3). Ensuite, conformément à l'objectif initial de cette thèse, nous avons utilisé une variante pulsée de l'IBIS pour détecter des modifications du protéome dans des cellules HeLa infectée par le virus humain Herpes Simplex-1 (Chapitre 2.4). Ce virus réprime la synthèse des protéines des cellules hôtes afin d'exploiter leur mécanisme de traduction pour la production massive de virions. Comme prévu, de hauts taux de synthèse ont été mesurés pour les protéines virales détectées, attestant de leur haut niveau d'expression. Nous avons de plus identifié un certain nombre de protéines humaines dont le rapport de synthèse et de dégradation (S/D) a été modifié par l'infection virale, ce qui peut donner des indications sur les stratégies utilisées par les virus pour détourner la machinerie cellulaire. En conclusion, nous avons montré dans ce travail que le marquage métabolique peut être employé de façon non conventionnelle pour étudier des dimensions peu explorées en protéomique. Summary : In recent years major technical advancements greatly supported the development of mass spectrometry (MS)-based proteomics. Currently, this technique can efficiently detect, identify and quantify thousands of proteins. However, it is not yet sufficiently powerful to provide a comprehensive analysis of the proteome changes correlated with biological phenomena. The aim of our project was the development of ~a new strategy for the specific detection and quantification of proteomé variations based on measurements of protein synthesis rather than total protein amounts. The rationale for this approach was that changes in protein synthesis more closely reflect dynamic cellular responses than changes in total protein concentrations. Our starting idea was to couple "pulsed" stable-isotope labeling of proteins with a specific MS acquisition method based on precursor ion scan (PIS), to specifically detect proteins that incorporated the label and to simultaneously estimate their abundance, relative to the unlabeled protein isoform. Such approach could highlight proteins with the highest synthesis rate in a given time frame, including proteins specifically up-regulated by a given biological stimulus. As a first step, we tested different isotope-labeled amino acids in combination with dedicated PIS methods and showed that this leads to specific detection of labeled proteins. Sensitivity, however, turned out to be lower than an untargeted analysis run on a more recent instrument, due to MS hardware limitations (Chapter 2.1). We next used metabolic labeling to distinguish the proteins of cellular origin from a high background of unlabeled (serum) proteins, for the differential analysis of two serum-containing culture media conditioned by labeled human cancer cells (Chapter 2.2). As a parallel project we developed a new quantification method (named ISIS), which uses pairs of stable-isotope labeled amino acids able to produce specific reporter ions, which can be used for relative quantification. The ISIS method was applied to the analysis of two fully, yet differentially labeled cancer cell lines, as described in Chapter 2.3. Next, in line with the original purpose of this thesis, we used a "pulsed" variant of ISIS to detect proteome changes in HeLa cells after the infection with human Herpes Simplex Virus-1 (Chapter 2.4). This virus is known to repress the synthesis of host cell proteins to exploit the translation machinery for the massive production of virions. As expected, high synthesis rates were measured for the detected viral proteins, confirming their up-regulation. Moreover, we identified a number of human proteins whose synthesis/degradation ratio (S/D) was affected by the viral infection and which could provide clues on the strategies used by the virus to hijack the cellular machinery. Overall, in this work, we showed that metabolic labeling can be employed in alternative ways to investigate poorly explored dimensions in proteomics.

Role of cytokines in secondary lymphoid organ development

Summary Secondary lymphoid organs are sites of antigen presentation, clonal expansion of B and lymphocytes, and affinity maturation of B lymphocytes. In the intestine, these immune functions occur mainly in Peyer's patches (PP). PP develop through the interplay of two main cell types, haematopoietic cells and meserichyrnal cells. One particular haematopoietic cell type was identified as the inductive cell type in the formation of both PP and lymph nodes and was therefore designated as lymphoid tissue inducer cell. For a successful PP organogenesis, the crucial molecular components involved in the crosstalk of inducer cells and their mesenchymal target cells are adhesion molecules, lymphotoxin (LT) family members, and cytokines. In particular, the interleukin 7 receptor (IL-7R) expressed on inducer cells is absolutely required. To investigate the contribution of the ligand for the IL-7R. the cytokine IL-7, in the process of PP formation, we analyzed double transgenic (TG) mice. These mice resulted from an interbreeding of an IL-7TG mouse strain where the transgene is under the control of the MHC class II promoter with a second transgenic mouse strain, which overexpresses a transactivator for MHC class II genes. Double TG offsprings revealed higher levels of IL-7 mRNA occuring earlier in embryogenesis. Consequently, double TG mice showed a striking phenotype with a 3- to 5-fold increase in PP numbers compared to single IL-7TG or control littermates. Analysis of embryonic double TG intestines demonstrated that the process of PP development was already elevated during development as early as the embryonic day 16.5. Importantly, inducer cells were significantly increased in numbers in these embryonic intestines. Furthermore, the expression of LT? mRNA, which at this early time point is exclusively expressed by inducer cells, was also increased in double TG animals. These data clearly indicate a direct influence of IL-7 on the expansion of lymphoid tissue inducer cells and on the availability of LT? leading to a higher frequency of developing PP in fetal life. Interestingly, in addition to an enhanced frequency of PP development, in double TG mice, three additional phenotypic differences were observed. i) Lymphocyte infiltration in various non-lymphoid organs, such as stomach, salivary gland, and liver. Subsequent analysis demonstrated that B lymphocytes were predominant within these tertiary lymphoid structures. ii) Ectopic lymph node-like structures containing both B and T lymphocytes were found near the inguinal lymph node. iii) Double TG mice had a severe bone resorption syndrome most likely as a consequence of the pro-osteoclastic effect of IL-7. Taken together, these results show that IL-7 plays a key role in the homeostasis of inducer cells, in the generation of PP in the gut, in the formation of ectopic lymphoid tissue, and in bone resorption. Résumé Les organes lymphoïdes secondaires sont les lieux de présentation des antigènes aux lymphocytes, permettant l'expansion des lymphocytes B et T et la maturation d'affinité des lymphocytes B. Dans l'intestin, ces fonctions immunitaires se déroulent dans les plaques de Peyer (PP). Ces plaques se développent grâce à l'interaction des cellules hématopoïétiques avec des cellules mésenchymales. Un type particulier de cellules hématopoïétiques a été identifié comme cellule inductrice dans la formation des PP et des ganglions lymphatiques et de ce fait a été désigné cellule inductrice des tissus lymphoïdes. Durant l'organogénèse des PP, les composants moléculaires cruciaux impliqués dans l'interaction des cellules inductrices et des cellules mésenchymales sont les molécules d'adhésion, les membres de la famille des lymphotoxines (LT) et les cytokines. En particulier, le récepteur de l'interleukine 7 (IL-7R) exprimé par les cellules inductrices est absolument nécessaire. Pour étudier le rôle du ligand de l'IL-7R, l'interleukine IL-7, dans la formation des PP, nous avons croisé une lignée de souris transgénique (TG) surexprimant IL-7 sous contrôle du promoteur MHC class Il avec une lignée de souris transgénique surexprimant un transactivateur des genes MHC class II. Les souris doubles TG présentent une concentration élevée d'ARNm de l'IL-7 durant l'embryogénèse, ce qui résulte en une augmentation du nombre de PP de 3 à 5 fois en comparaison aux souris ayant seul le transgène IL-7 et aux souris contrôles. L'analyse des intestins des souris doubles TG démontre que le processus de développement des PP était élevé dès le jour 16.5 du développement embryonnaire. L'augmentation du nombre des cellules inductrices dans ces intestins embryonnaires est signilicative. De plus l'expression de l'ARNm LT?, qui à ce stade précoce est exclusivement exprimé dans les cellules inductrices, est également augmenté dans les doubles TG. Ces résultats indiquent clairement une influence directe d'IL-7 sur l'expansion des cellules inductrices des tissues lymphoïdes et sur la synthèse de LT? induisant une augmentation des PP se développant durant la vie foetale. En plus du développement accru des PP dans les souris doubles TG, trois différences phénotypiques ont été observées. i) L'infiltration lymphocytaire dans différents organes non-lymphoïdes, comme l'estomac, les glandes salivaires et le foie. Des analyses complémentaires ont demontré que les lymphocytes B étaient prédominants dans ces structures lymphoïdes tertiaires. ii) Des structures de ganglions lymphatiques ectopiques contenant des lymphocytes B et T ont été trouvées près des ganglions lymphatiques inguinaux. iii) Les souris doubles TG présentent un syndrome de résorption osseuse sévère probablement dû à l'effet pro-osteoclaste d'IL-7. Globalement, ces résultats montrent que IL-7 joue un rôle clé dans l'homéostasie des cellules inductrices dans la génèse de PP de l'intestin, dans la formation des tissus lymphoïdes ectopiques et dans la résorption osseuse.

Regulatory RNA binding molecules : implication for diabetes pathogenesis

Le glucose est notre principale source d'énergie. Après un repas, le taux de glucose dans le sang (glycémie) augmente, ce qui entraine la sécrétion d'insuline. L'insuline est une hormone synthétisée au niveau du pancréas par des cellules dites bêta. Elle agit sur différents organes tels que les muscles, le foie ou le tissu adipeux, induisant ainsi le stockage du glucose en vue d'une utilisation future.¦Le diabète est une maladie caractérisée par un taux élevé de glucose dans le sang (hyperglycémie), résultant d'une incapacité de notre corps à utiliser ou à produire suffisamment d'insuline. A long terme, cette hyperglycémie entraîne une détérioration du système cardio-vasculaire ainsi que de nombreuses complications. On distingue principalement deux type de diabète : le diabète de type 1 et le diabète de type 2, le plus fréquent (environ 90% des cas). Bien que ces deux maladies diffèrent sur beaucoup de points, elles partagent quelques similitudes. D'une part, on décèle une diminution de la quantité de cellules bêta. Cette diminution est cependant partielle dans le cas d'un diabète de type 2, et totale dans celui d'un diabète de type 1. D'autre part, la présence dans la circulation de médiateurs de l'inflammation nommés cytokines est décelée aussi bien chez les patients de type 1 que de type 2. Les cytokines sont sécrétées lors d'une inflammation. Elles servent de moyen de communication entre les différents acteurs de l'inflammation et ont pour certaines un effet néfaste sur la survie des cellules bêta.¦L'objectif principal de ma thèse a été d'étudier en détail l'effet de petites molécules régulatrices de l'expression génique, appelées microARNs. Basé sur le fait que de nombreuses publications ont démontré que les microARNs étaient impliqués dans différentes maladies telles que le cancer, j'ai émis l'hypothèse qu'ils pouvaient également jouer un rôle important dans le développement du diabète.¦Nous avons commencé par mettre des cellules bêta en culture en présence de cytokines, imitant ainsi un environnement inflammatoire. Nous avons pu de ce fait identifier les microARNs dont les niveaux d'expression étaient modifiés. A l'aide de méthodes biochimiques, nous avons ensuite observé que la modulation de certains microARNs par les cytokines avaient des effets néfastes sur la cellule bêta : sur sa production et sa sécrétion d'insuline, ainsi que sur sa mort (apoptose). Nous avons en conséquence pu démontrer que ces petites molécules avaient un rôle important à jouer dans le dysfonctionnement des cellules bêta induit par les cytokines, aboutissant au développement du diabète.¦-¦La cellule bêta pancréatique est une cellule endocrine présente dans les îlots de Langerhans, dans le pancréas. L'insuline, une hormone sécrétée par ces cellules, joue un rôle essentiel dans la régulation de la glycémie. Le diabète se développe si le taux d'insuline relâché par les cellules bêta n'est pas suffisant pour couvrir les besoins métaboliques corporels. Le diabète de type 1, qui représente environ 5 à 10% des cas, est une maladie auto-immune qui se caractérise par une réaction inflammatoire déclenchée par notre système immunitaire envers les cellules bêta. La conséquence de cette attaque est une disparition progressive des cellules bêta. Le diabète de type 2 est, quant à lui, largement plus répandu puisqu'il représente environ 90% des cas. Des facteurs à la fois génétiques et environnementaux sont responsables d'une diminution de la sensibilité des tissus métabolisant l'insuline, ainsi que d'une réduction de la sécrétion de l'insuline par les cellules bêta, ce qui a pour conséquence le développement de la maladie. Malgré les différences entre ces deux types de diabète, ils ont pour points communs la présence d'infiltrat immunitaire et la diminution de l'état fonctionnel des cellules bêta.¦Une meilleure compréhension des mécanismes aboutissant à l'altération de la cellule bêta est primordiale, avant de pouvoir développer de nouvelles stratégies thérapeutiques capables de guérir cette maladie. Durant ma thèse, j'ai donc étudié l'implication de petites molécules d'ARN, régulatrices de l'expression génique, appelées microARNs, dans les conditions physiopathologiques qui aboutissent au développement du diabète. J'ai débuté mon étude par l'identification de microARNs dont le niveau d'expression était modifié lorsque les cellules bêta étaient exposées à des conditions favorisant à la fois le développement du diabète de type 1 (cytokines) et celui du diabète de type 2 (palmitate). Nous avons découvert qu'une modification de l'expression des miR-21, -34a et -146a était commune aux deux traitements. Ces changements d'expressions ont également été confirmés dans deux modèles animaux : les souris NOD qui développent un diabète s'apparentant au diabète de type 1 et les souris db/db qui développent plutôt un diabète de type 2. Puis, à l'aide de puces à ADN, nous avons comparé l'expression de microARNs chez des souris NOD pré-diabétiques. Nous avons alors retrouvé des changements au niveau de l'expression des mêmes microARNs mais également au niveau d'une famille de microARNs : les miR-29a, -29b et -29c. De manière artificielle, nous avons ensuite surexprimé ou inhibé en conditions physiopathologiques l'expression de tous ces microARNs et nous nous sommes intéressés à l'impact d'un tel changement sur différentes fonctions de la cellule bêta comme la synthèse et la sécrétion d'insulinè ainsi que leur survie. Nous avons ainsi pu démontrer que les miR-21, -34a, -29a, -29b, -29c avaient un effet délétère sur la sécrétion d'insuline et que la surexpression de tous ces microARNs (excepté le miR-21) favorisait la mort. Finalement, nous avons démontré que la plupart de ces microARNs étaient impliqués dans la régulation d'importantes voies de signalisation responsables de l'apoptose des cellules bêta telles que les voies de NFKB, BCL2 ou encore JNK.¦Par conséquent, nos résultats démontrent que les microARNs ont un rôle important à jouer dans le dysfonctionnement des cellules bêta lors de la mise en place du diabète.

Coevolution of restriction factors and retroviruses

Les virus exploitent la machinerie cellulaire de l'hôte pour se répliquer. Ils doivent s'adapter pour infecter la cellule hôte de manière optimale tout en échappant à la vigilance du système de défense de l'hôte. Ainsi l'hôte et les virus se livrent à de constantes batailles évolutives. Mon travail de thèse a porté sur l'étude des signatures évolutives de facteurs de l'hôte agissant comme des 'facteurs de restriction' en bloquant la réplication rétrovirale chez les primates. Plus spécifiquement, mon travail a visé à utiliser des données évolutives pour renseigner les analyses fonctionnelles et la biologie. Nous avons étudié le facteur anti-VIH-1 nommé TRIM5a (i) chez les prosimiens pour mieux comprendre son rôle dans le contrôle d'un lentivirus endogène, (ii) dans son activité contre d'autres anciennes infections représentées par des rétrovirus endogènes humains et (iii) en tant que protéine capable de générer des mutants de la capside. Premièrement nous nous sommes intéressés à TRIM5a chez deux espèces de lémuriens dont Microcebus murinus qui porte le lentivirus endogène PSIV dans son génome depuis plusieurs millions d'années,. Nous avons observé que TRIM5a chez M. murinus a un spectre d'activité antivirale réduit à l'opposé de TRIM5a chez le Lemur catta - non porteur du PSIV endogène - qui bloque une large variété de rétrovirus dont le PSIV. De ce fait TRIM5a aurait pu contribuer à protéger certaines espèces de lémuriens vis-à-vis d'anciennes infections par le PSIV. A l'inverse du PSIV, des virus dérivés des rétrovirus endogènes humains HERV-K and HERV-H se sont révélés largement résistants à l'inhibition par TRIM5a. Ces données illustrent une absence de protection par TRIM5a face à d'autres anciennes infections rétrovirales. Puis, pour évaluer l'impact de la protéine TRIM5a humaine sur le VIH-1, nous avons testé l'effet de mutations des résidues sous sélection positive dans la capside du VIH-1 sur l'inhibition par TRIM5a. Nos résultats montrent que TRIM5a ne jouerait pas un rôle significatif dans l'évolution de la capside du VIH-1. Enfin notre travail a porté sur le facteur anti-VIH-1 SAMHD1 récemment découvert, que nous avons séquencé chez 25 espèces de primates. L'analyse évolutive des sites sous sélection positive et des expériences fonctionnelles ont permis d'identifier le domaine de SAMHD1 interagissant avec la protéine lentivirale Vpx. De même que d'autres protéines virales contrecarrent les facteurs de restriction en les menant à la dégradation, nous avons observé que Vpx induit la dégradation de SAMHD1 de manière spécifique à l'espèce. Ces découvertes contribuent à comprendre comment les facteurs de restriction et les virus co-évoluent pour se neutraliser l'un l'autre. - Viruses hijack the host cellular machinery to replicate. They adapt to infect optimally host cells while escaping host defense systems. Viruses and the host coevolve in an evolutionary struggle. My thesis work has been devoted to study the evolutionary signatures of host factors acting as restriction factors that block retroviral replication in primates. Specifically, my work aimed at using evolutionary data to inform functional analyses and biology. We studied the anti-HIV-1 factor TRIM5a (i) in prosimians to better understand its possible role in the control of an endogenous lentivirus, (ii) in its activity against other ancient infections - as represented by HERVs, and (iii) as a protein capable of generating escape mutants in the viral capsid. First, my work focused on two lemur species, one of which was the gray mouse lemur that carries the endogenous lentivirus PSIV integrated in its genome for several million years. TRIM5a from gray mouse lemur exhibited a limited antiviral spectrum as opposed to TRIM5a from ring-tailed lemur - not a host of PSIV - that is able to block diverse retroviruses notably PSIV. These results support the possible contribution of TRIM5a in protecting lemur species from ancient infection by PSIV. In contrast, chimeric viruses derived from two human endogenous retroviruses were broadly resistant to TRIM5a-mediated restriction, suggesting TRIM5a lack of activity against other types of ancient infections. To evaluate the recent impact of human TRIM5a on HIV-1 evolution, we tested whether variants at positively selected sites in the HIV-1 capsid affected the ability of human TRIM5a alleles to restrict HIV-1. Our results indicate that TRIM5a does not play a significant role in the evolution of HIV1 capsid. At last, our work concentrated on the newly discovered anti-HIV-1 restriction factor SAMHD1. We determined its coding sequence in a panel of 25 species of primates. Evolutionary analyses of positively selected sites in SAMHD1 domains and functional assays identified the domain of SAMHD1 interacting with the lentiviral protein Vpx. Similar to other viral countermeasures targeting cellular restriction factors, Vpx was responsible of the degradation of SAMHD1 orthologs in a species-specific manner. These findings contributed to understanding how restriction factors and viruses evolve to counteract each other.

New methods for detecting antibiotic resistant bacteria and preventing their spread

Methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) bacteria have emerged in the early 1980's in numerous health care institutions around the world. The main transmission mechanism within hospitals and healthcare facilities is through the hands of health care workers. Resistant to several antibiotics, the MRSA is one of the most feared pathogens in the hospital setting since it is very difficult to eradicate with the standard treatments. There are still a limited number of anti-MRSA antibiotics but the first cases of resistance to these compounds have already been reported and their frequency is likely to increase in the coming years. Every year, the MRSA infections result in major human and financial costs, due to the high associated mortality and expenses related to the required care. Measures towards a faster detection of resistant bacteria and establishment of appropriate antibiotic treatment parameters are fundamental. Also as part as infection prevention, diminution of bacteria present on the commonly touched surfaces could also limit the spread and selection of antibiotic resistant bacteria. During my thesis, projects were developed around MRSA and antibiotic resistance investigation using innovative technologies. The thesis was subdivided in three main parts with the use of atomic force microscopy AFM for antibiotic resistance detection in part 1, the importance of the bacterial inoculum size in the selection of antibiotic resistance in part 2 and the testing of antimicrobial surfaces creating by sputtering copper onto polyester in part 3. In part 1 the AFM was used two different ways, first for the measurement of stiffness (elasticity) of bacteria and second as a nanosensor for antibiotic susceptibility testing. The stiffness of MRSA with different susceptibility profiles to vancomycin was investigated using the stiffness tomography mode of the AFM and results have demonstrated and increased stiffness in the vancomycin resistant strains that also paralleled with increased thickness of the bacterial cell wall. Parts of the AFM were also used to build a new antibiotic susceptibility-testing device. This nano sensor was able to measure vibrations emitted from living bacteria that ceased definitively upon antibiotic exposure to which they were susceptible but restarted after antibiotic removal to which they were resistant, allowing in a matter of minute the assessment of antibiotic susceptibility determination. In part 2 the inoculum effect (IE) of vancomycin, daptomycin and linezolid and its importance in antibiotic resistance selection was investigated with MRSA during a 15 days of cycling experiment. Results indicated that a high bacterial inoculum and a prolonged antibiotic exposure were two key factors in the in vitro antibiotic resistance selection in MRSA and should be taken into consideration when choosing the drug treatment. Finally in part 3 bactericidal textile surfaces were investigated against MRSA. Polyesters coated after 160 seconds of copper sputtering have demonstrated a high bactericidal activity reducing the bacterial load of at least 3 logio after one hour of contact. -- Au cours des dernières décennies, des bactéries multirésistantes aux antibiotiques (BMR) ont émergé dans les hôpitaux du monde entier. Depuis lors, le nombre de BMR et la prévalence des infections liées aux soins (IAS) continuent de croître et sont associés à une augmentation des taux de morbidité et de mortalité ainsi qu'à des coûts élevés. De plus, le nombre de résistance à différentes classes d'antibiotiques a également augmenté parmi les BMR, limitant ainsi les options thérapeutiques disponibles lorsqu'elles ont liées a des infections. Des mesures visant une détection plus rapide des bactéries résistantes ainsi que l'établissement des paramètres de traitement antibiotiques adéquats sont primordiales lors d'infections déjà présentes. Dans une optique de prévention, la diminution des bactéries présentes sur les surfaces communément touchées pourrait aussi freiner la dissémination et l'évolution des bactéries résistantes. Durant ma thèse, différents projets incluant des nouvelles technologies et évoluant autour de la résistance antibiotique ont été traités. Des nouvelles technologies telles que le microscope à force atomique (AFM) et la pulvérisation cathodique de cuivre (PCC) ont été utilisées, et le Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) a été la principale BMR étudiée. Deux grandes lignes de recherche ont été développées; la première visant à détecter la résistance antibiotique plus rapidement avec l'AFM et la seconde visant à prévenir la dissémination des BMR avec des surfaces crées grâce à la PCC. L'AFM a tout d'abord été utilisé en tant que microscope à sonde locale afin d'investiguer la résistance à la vancomycine chez les SARMs. Les résultats ont démontré que la rigidité de la paroi augmentait avec la résistance à la vancomycine et que celle-ci corrélait aussi avec une augmentation de l'épaisseur des parois, vérifiée grâce à la microscopie électronique. Des parties d'un AFM ont été ensuite utilisées afin de créer un nouveau dispositif de test de sensibilité aux antibiotiques, un nanocapteur. Ce nanocapteur mesure des vibrations produites par les bactéries vivantes. Après l'ajout d'antibiotique, les vibrations cessent définitivement chez les bactéries sensibles à l'antibiotique. En revanche pour les bactéries résistantes, les vibrations reprennent après le retrait de l'antibiotique dans le milieu permettant ainsi, en l'espace de minutes de détecter la sensibilité de la bactérie à un antibiotique. La PCC a été utilisée afin de créer des surfaces bactéricides pour la prévention de la viabilité des BMR sur des surfaces inertes. Des polyesters finement recouverts de cuivre (Cu), connu pour ses propriétés bactéricides, ont été produits et testés contre des SARMs. Une méthode de détection de viabilité des bactéries sur ces surfaces a été mise au point, et les polyesters obtenus après 160 secondes de pulvérisation au Cu ont démontré une excellente activité bactéricide, diminuant la charge bactérienne d'au moins 3 logio après une heure de contact. En conclusion, l'utilisation de nouvelles technologies nous a permis d'évoluer vers de méthodes de détection de la résistance antibiotique plus rapides ainsi que vers le développement d'un nouveau type de surface bactéricide, dans le but d'améliorer le diagnostic et la gestion des BMR.

Role of intracellular signaling pathways activated in fibroblasts in response to lipoproteins

Summary The best described physiological function of low-density lipoproteins (LDL) is to transport cholesterol to target tissues. LDL deliver their cholesterol cargo to cells following their interaction with the LDL receptor. LDL, when their vascular concentrations increase, have also been implicated in pathologies such as atherosclerosis. Among the cell types that are found in blood vessels, endothelial and smooth muscle cells have dominated cellular research on atherosclerotic mechanisms and LDL activation of signaling pathways, while very little is known about adventitial fibroblast activation caused by elevated lipoprotein levels. Since fibroblasts participate in wound repair and since it has recently been recognized that fibroblasts may play pivotal roles in vascular remodeling and repair of injury, we assessed whether lipoproteins affect fibroblast function. We have found that LDL specifically mediate the activation of a class of mitogen-activated protein kinases (MAPKs): the p38 MAPKs. The activation of this pathway in turn modulates cell shape by promoting lamellipodia formation and extensive cell spreading. This is of particular interest because it provides a mechanism by which LDL can promote wound healing or vessel wall remodeling as observed during the development of atherosclerosis. In order to understand the molecular mechanisms by which LDL induce p38 activation we searched for the component in the LDL particle responsible for the induction of this pathway. We found that cholesterol is the major component of lipoprotein particles that mediates their ability to stimulate the p38 MAPK pathway. Furthermore, we investigated the cellular mechanisms underlying the ability of LDL to induce cell shape changes and whether this could participate in wound repair. Our recent data demonstrates that the capacity of LDL to induce fibroblast spreading relies on their ability to stimulate IL-8 secretion, which in turn leads to accelerated wound healing. LDL-induced IL-8 production and subsequent wound closure are impaired upon inhibition of the p38 MAPK pathway indicating that the LDL-induced spreading and accelerated wound sealing rely on the ability of LDL to stimulate IL-8 secretion in a p38 MAPK-dependent manner. Therefore, regulation of fibroblast shape and migration by lipoproteins may be relevant to atherosclerosis that is characterized by increased LDL-cholesterol levels, IL-8 production and extensive remodeling of the vessel wall. Résumé: La fonction physiologique des lipoprotéines à faible densité (LDL) la mieux décrite est celle du transport du cholestérol aux tissus cibles. Les LDL livrent leur cargaison de cholestérol aux cellules après leur interaction avec le récepteur au LDL. Une concentration vasculaire des LDL augmenté est également impliquée dans le développement de l'athérosclérose. Parmi les types de cellule présents dans les vaisseaux sanguins, les cellules endothéliales et les cellules du muscle lisse ont dominé la recherche cellulaire sur les mécanismes athérosclérotiques et sur l'activation par les LDL des voies de signalisation intracellulaire. A l'inverse peu de choses sont connues sur l'activation des fibroblastes de l'adventice par les lipoprotéines. Puisqu'il a été récemment reconnu que les fibroblastes peuvent jouer un rôle central dans la remodélisation vasculaire et la réparation tissulaire, nous avons étudié si les lipoprotéines affectent la fonction des fibroblastes. Nous avons constaté que les LDL activent spécifiquement une classe de protéines kinases: les p38 MAPK (mitogen-activated protein kinases). L'activation de cette voie module à son tour la forme de la cellule en favorisant la formation de lamellipodes et l'agrandissement des cellules. Cela a un intérêt particulier car il fournit un mécanisme par lequel les LDL peuvent promouvoir la cicatrisation ou la remodélisation des parois vasculaires comme observés lors du développement de l'athérosclérose. Pour comprendre les mécanismes moléculaires par lesquels les LDL provoquent l'activation des p38 MAPK, nous avons cherché à identifier les composants dans la particule de LDL responsables de l'induction de cette voie. Nous avons constaté que le cholestérol est l'élément principal des particules de lipoprotéine qui contrôle leur capacité à stimuler la voie des p38 MAPK. En outre, nous avons examiné les mécanismes cellulaires responsables de la capacité des LDL à induire des changements dans la forme des cellules. Nos données récentes démontrent que la capacité des LDL à induire l'agrandissement des cellules, ainsi que leur aptitude à favoriser la cicatrisation, reposant sur leur capacité à stimuler la sécrétiond'IL-8. La production d'IL-8 induite par les LDL est bloquée par l'inhibition de la voie p38 MAPK, ce qui indique que l'étalement des cellules induit par les LDL ainsi que l'accélération de la cicatrisation sont liés à la capacité des LDL à stimuler la sécrétion d'IL8 via l'activation des p38 MAPK. La régulation de la forme et de la migration des fibroblastes par les lipoprotéines peuvent donc participer au développement de l'athérosclérose qui est caractérisée par l'augmentation des niveaux de production de LDL-cholestérol et d'IL-8 ainsi que par une remodélisation augmentée de la paroi du vaisseau.