Characterization of the neuronal microtubule regulator SCG10 in transfected cells and " in vivo "

SUMMARY The ability of neuronal processes to find their way along complex paths and to establish appropriate connections depends on continual rearrangements of the cytoskeletal components. The regulation of microtubules plays an important role for morphological changes underlying nevrite outgrowth, axonal elongation, and growth cone steering. SCG10 (superior cervical ganglion clone 10) is a neuronal growthassociated protein developmentally regulated and highly enriched in the neuronal growth cones. SCG10 presents a microtubule destabilizing activity that could participate to the regulation of microtubule dynamics and thus explain microtubule behaviors in the growth cone during axonal elongation and turning. It is here suggested that a tight control of the opposite effects on microtubules of SCG10 and the stabilizing microtubule-associated protein MAP1B allows a fine tuning of cytoskeletal rearrangement and may provide the required microtubule dynamic instability to promote axonal growth. Moreover, antibodyblockade of SCG10 function, that leads to growth cone pauses similar as those triggered by the guidance molecule EphB, and the modulation of SCG10 activity by the Rho GTPase Rnd1 suggest a potential role for SCG10 in the signal transduction pathways of extracellular guidance cues. The identification of the active zone protein Bassoon as a potential interaction partner for the SCG10-related protein NPC2, using atomic force microscopy as well as COS-7 and neuronal cell cultures, also gives new insights for a role of this protein family into the processes of synapse genesis or plasticity. Finally, SCG10 mutant mice generated by gene targeting and expressing a soluble form of the protein have been characterized during early postnatal development and in the adulthood. Due to the deletion of its membrane binding domain, SCG10 specific subcellular targeting to growth cones is compromised and results in impairments of motor and coordination development. Further histological analysis in the sciatic nerve reveal that these symptoms are associated with neurodegenerative signs. RESUME Une navigation correcte des prolongements cellulaires neuronaux leur permettant de former des connections appropriées repose sur de continuels réarrangements des constituants de leur cytosquelette. La régulation des microtubules joue notamment un rôle important dans les changements morphologiques qui accompagnent la croissance axonale et les réorientations du cône de croissance. SCG10 (superior cervical ganglion clone 10) est une protéine étroitement associée à la croissance neuronale, hautement régulée durant le développement et abondante au niveau du cône de croissance. SCG10 présente une activité déstabilisatrice sur les microtubules qui pourrait permettre une régulation des paramètres dynamiques propres aux microtubules et ainsi expliquer leur comportement durant la navigation du cône de croissance. Il est ici proposé qu'un contrôle précis des effets opposés de SCG10 et d'une autre protéine stabilisante associée aux microtubules (MAP1 B) permette un réglage fin des réarrangements du cytosquelette et puisse ainsi produire l'instabilité dynamique nécessaire à la croissance anale. Par ailleurs, le blocage de la fonction de SCG10 par un anticorps spécifique, conduisant à des pauses du cônes de croissance similaires à celles provoquées par la molécule de guidage EphB, ainsi que la modulation de l'activité de SCG10 par la Rho GTPase Rnd1 suggèrent une potentielle implication de SCG10 dans les voies de transduction des signaux provenant de molécules de guidage extracellulaires. L'identification d'une interaction de la protéine synaptique Bassoon avec la protéine NPC2 apparentée à SCG10, au moyen de la microscopie à force atomique et dans des cultures de cellules neuronales et COS-7, ouvre des perspectives concernant ces protéines dans la formation et la plasticité synaptiques. Finalement, des souris mutantes pour SCG10 produites par ciblage de gène et exprimant une forme soluble de la protéine ont été caractérisées durant la phase précoce du développement et à l'âge adulte. La délétion du domaine permettant l'ancrage de SCG10 aux membranes compromet sa sub-localisation au niveau du cône de croissance et résulte en l'apparition de troubles moteurs et de la coordination. Des analyses histologiques complémentaires au niveau du nerf sciatique montrent que ces symptômes sont associés avec des signes neurodégénératifs.

Signalling pathways in skin homeostasis

SUMMARY The results presented here contribute to a better understanding of the crucial molecular relationships and signalling cues exchanged by several fundamental cell types (epidermal keratinocytes, dermal fibroblasts, immune and endothelial cells) of the skin. Importantly we provide evidence to directly implicate Wnt/ß-catenin signalling as a putative player in different cell types (keratinocytes and neutrophils) in mediation of the cutaneous inflammatory response (Fart A). Finally we highlight the importance of several molecules, specifically expressed in the hair follicle stem cell niche to the morphogenesis and homeostasis of the hair follicle (Part B). PART A Currently the body of work pertaining to Wnt signalling and immune cells largely focuses on Wnt signalling in the development of these cells. The data presented here suggests a novel mechanism in which Wnt signalling appears to modulate immune cell recruitment to the skin. Keratinocytes are major contributors to early inflammatory responses by the release of chemokines which recruit immune cells. The resultant inflammatory response is a dynamic process of sequentially infiltrating immune cells governed by a network of growth factors, chemokines and cytokines. In wild type mice the response is typified by a rapid and substantial infiltration of neutrophils followed at later time points by macrophages and Tcells. The expression of the canonical Wnt pathway activating ligand, Wnt3a, is able to induce a strong neutrophil infiltration in the dermis. This response originates in keratinocytes, as it is abrogated upon keratinocyte-specific ablation of ß-catenin. Notably, this suggests that the crucial cross talk between these resident cells and recruited immune cells is, in part, mediated by Wnt signalling. In corroboration of this role of Wnt-mediated recruitment of neutrophils, expression of the Wnt inhibitory ligand sFRPI during acute inflammation results in a dramatic 'dampening' of immune cell infiltration in particular of neutrophil chemoattraction. Importantly, an intrinsic Wnt signalling pathway is essential for neutrophil chemoattraction in response to inflammatory stimuli. There is a marked reduction of neutrophil infiltration in mice grafted with a ß-catenin deficient bone marrow upon TPA induced cutaneous inflammation. Additionally, neutrophils lacking Wnt/ß-catenin fail to respond to IFNγ, an early inflammatory cue, in vitro. In combination, these data indicate a potent function of Wnt signalling in immune cell recruitment and the modulation of the inflammatory response. PART B Tissue specific stem cells form the cellular base on which tissue homeostasis and repair of adult tissue relies. The maintenance of this stem cell pool is highly dependent on the immediate environment or niche. We have identified three genes, the fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1), serpin protease inhibitor (serpin F1) and the haematopoietic cell phosphatase (Hcph) to be specifically expressed in a small population of stromal cells which are in close contact to bulge stem cells. These specialized stromal cells might represent an essential mesenchymal component of the skin stem cell niche and may regulate stem cell proliferation and differentiation. Multiple FGFR1 isoforms are generated through alternate transcript splicing and are able to interact with both FGFs and cell adhesion molecules. Two predominant forms of the receptor are FGFR1-α and FGFR1-ß. Expression of a dominant negative form of the alpha isoform prevents hair follicle morphogenesis altogether. Given that FGFR1-ß signals principally through the FGF ligands, this data indicates that FGF signalling is dispensable for follicle morphogenesis. Moreover the loss of follicular morphogenesis upon suggests a requirement for signalling via cell adhesion molecule association with the receptor as FGFR1 α has a greater affinity for these molecules. The expression of the second candidate niche gene serpin f1, lead to the complete ablation of hair follicle morphogenesis. The serpin f1 product, pigment-epithelial derived factor (PEDF) has potent anti-angiogenic effects. Immunohistochemical analysis using CD31, a endothelial cell marker, revealed that although these cells are present, they have are disorganised and do not form vessels. Interestingly, endothelial cells have been found to contribute to the neuronal stem cell niche and our results suggest a similar mechanism in the skin. SHP1, the Hcph gene product, is a phosphatase which acts in the haematopoetic system. Motheaten mice carrying spontaneous mutations in the Hcph gene have patchy alopecia in their skin and severe defects in their haematopoietic system. However the haematopoietic rescue of the mouse does not result in normal follicular homeostasis. Additionally, ablation of Hcph in either the dermal or keratinocyte compartments of the skin produces hair follicles with abberant morphologies. This data indicates that although SHP1 is not essential for hair follicle morphogenesis it is required in both epidermal and dermal compartments to maintain follicular morphology. RÉSUMÉ PARTIE A Jusqu'à présent, les travaux dédiés à l'étude de la voie de signalisation Wnt dans le système immunitaire se sont essentiellement concentrés sur son rôle dans le développement des cellules immunitaires. Les données présentées ici suggèrent fortement et de manière nouvelle, l'existence d'un mécanisme par lequel la voie de signalisation Wnt/ß-caténine module le recrutement de cellules immunitaires dans un tissu périphérique, la peau, et ainsi la réponse inflammatoire cutanée. La réponse inflammatoire cutanée est un processus dynamique d'infiltration séquentielle de diverses cellules immunitaires, orchestré par un réseau de facteurs de croissance, chémokines et cytokines. Les kératinocytes sont des contributeurs majeurs à la réponse inflammatoire précoce par la libération de chémokines qui permettent ensuite de recruter les cellules immunitaires. Dans des souris sauvages, la réponse est d'abord caractérisée par une infiltration rapide et substantielle de neutrophiles, suivie par celle des macrophages et des lymphocytes T. L'expression d'un ligand activateur de le voie canonique de signalisation Wnt (après injection infra-dermique de fibroblastes sur-exprimant Wnt-3a) induit une infiltration dermique très marquée de neutrophiles. De plus, la réponse est éliminée en l'absence de ß-caténine spécifiquement dans les kératinocytes, indiquant que ces cellules sont à l'origine de la réponse. De manière remarquable, ceci suggère qu'une signalisation cruciale entre ces cellules résidentes de la peau et les cellules immunitaires recrutées est, au moins en partie, médiée par la voie Wnt. Corroborant ce rôle de la voie Wnt/ß-caténine dans le recrutement des neutrophiles, l'expression d'un ligand inhibiteur de la voie (sFRP1) résulte au cours d'une inflammation aigüe en une réduction spectaculaire de l'infiltration des cellules immunitaires en général, et des neutrophiles en particulier. De manière importante, la voie de signalisation Wnt est intrinsèquement requise pour la chémoattraction des neutrophiles en réponse à un stimulus inflammatoire. En effet, suite à une inflammation cutanée induite par un ester de phorbol (TPA), une réduction notable de l'infiltration des neutrophiles est observée dans des souris préalablement greffées avec de la moelle osseuse constituée de cellules déficientes en ß-caténine. De plus, in vitro, les neutrophiles sans ß-caténine ne répondent pas à une stimulation par l'interféron γ, qui est pourtant un signal inflammatoire établi in vivo. En conclusion, nos données indiquent que la voie de signalisation Wnt/ß-caténine joue une fonction active dans le recrutement des cellules immunitaires vers un organe périphérique, la peau, ainsi que dans la modulation, à plusieurs niveaux, de la réponse inflammatoire cutanée. PARTIE B Les cellules souches tissu-spécifiques forment la base cellulaire sur laquelle repose l'homéostase et la réparation tissulaires chez l'adulte. La maintenance de ce réservoir de cellules souches est hautement dépendante de leur environnement cellulaire immédiat, encore appelé «niche des cellules souches». Dans la peau, ces cellules stromales spécialisées représentent un compartiment mésenchymateux essentiel de la niche des cellules souches en régulant leurs prolifération et différentiation. Nous avons identifié trois gènes, le «récepteur 1 àux facteurs de croissance des fibroblastes » (Fgfr1 ), l' «inhibiteur de protéase à sérine » (serpinf1 ou pedf) et la « phosphatase des cellules hématopoiétiques » (Hcph ou Ptpn6), comme spécifiquement exprimés par une petite population de cellules stromales qui sont étroitement associées aux cellules souches de la peau (localisées au niveau du bombement du follicule pileux). Pour analyser leur fonction dans ce contexte, nous avons utilisé un test de reconstitution complète de peau murine en combinaison à des. transductions géniques basées sur l'utilisation de lentivirus. Ce test repose sur le mélange de deux compartiments cellulaires, épidermique (kératinocytes) et dermique (fibroblastes), greffés sur une zone ouverte de peau du dos d'une souris pour ensemble reconstituer la peau. Des isoformes multiples de FGFR1 sont générées par épissage alternatif de transcrits et sont capables d'interagir à la fois avec les FGFs (facteurs de croissance des fibroblastes) et les molécules d'adhésion cellulaires. Les deux formes prédominantes du récepteur, FGFR1-α et FGFR1-ß, ne différent que par le «domaine ressemblant aux immunoglobulines 1 » (immunoglobulin-like 1 domain), absent de FGFR1-ß. De plus, FGFR1-ß a une affinité plus grande pour les FGFs et plus faible pour les molécules d'adhésion cellulaires telles que la Ncadhérine (connue pour activer FGFR). La sur-expression de l'une ou l'autre des formes n'empêche pas la morphogenèse folliculaire mais conduit à la formation de follicules aberrants. Toutefois, une différence phénotypique majeure est observée lorsqu'une forme «Dominant-Négatif » (DN) est exprimée dans le compartiment dermique. La sur-expression de FGFR1-ß DN conduit en effet à la formation de follicules petits et tronqués, avec des gaines épithéliales et un bulbe élargis ainsi qu'une petite papille dermique. Par contre, l'expression de FGFR1-α DN abolit complètement la morphogenèse folliculaire. Etant donné que la signalisation par FGFR1-ß est principalement dépendante des ligands FGFs, ces données indiquent que la signalisation par ceux-cì est non-nécessaire à la morphogenèse folliculaire. De plus, l'abolition du processus par la sur-expression de FGFR1-a DN suggëre une signalisation nécessaire entre le récepteur FGFR1 et une ou des molécules d'adhésion cellulaire. L'expression de notre second candidat comme gène spécifique de la niche des cellules souches de la peau, serpinf1, prévient la morphogenèse folliculaire. Seules de petites structures ressemblant à des cystes sont observées après reconstitution de la peau. De plus, dans ces transplants, aucune cellule CD34-positive (marqueur des cellules souches) n'est retrouvée associé à ces cystes. Le produit du gène serpin f1, le «facteur dérivé d'épithélium pigmentaire » (PEDF) est un puissant facteur anti-angiogénique. Nous avons donc analysé la vascularisation des transplants par immunohistochirnies utilisant CD31, un marqueur des cellules endothéliales. Nos résultats révèlent que les cellules endothéliales sont bien présentes, mais de manière désorganisée et ne formant pas de vaisseaux. De manière intéressante, les cellules endothéliales contribuent activement à la niche des cellules souches neuronales, et nos résultats suggèrent donc l'existence possible d'un mécanisme similaire dans la peau. SHP1, le produit du gène Hcph, est une phosphatase quì agit dans le système hématopoiétique. Les souris « motheaten »qui portent des mutations spontanées du gène ont une alopécie inégale au niveau de la peau et de sévères troubles du système hématopoiétique. Pour s'assurer que le phénotype observé au niveau de la peau n'est pas une conséquence d'un défaut du système hématopoiétique, nous avons transplanté des souris Hcph -/- avec de la moelle osseuse sauvage afin de restaurer la fonction de SHP 1 dans le système hématopoiétique. Toutefois, le défaut de morphologie folliculaire est maintenu. De plus, l'ablation d'Hcph dans le compartiment dermique ou épidermique d'essais de reconstitution de peau conduit à la production de follicules pileux avec des morphologies aberrantes. Ces données indiquent que SHP1 n'est pas essentiel à la morphogenèse folliculaire mais est toutefois requis à la fois dans les compartiments épidermiques et dermiques pour la maintenance de la forme du follicule.

Regulation of dendritic development by neurotrophic factors

AbstractEstablishment of a functional nervous system occurs through an orchestrated multistep process during embryogenesis. As dendrites are the primary sites of synaptic connections, development of dendritic arborization is essential for the formation of functional neural circuits. Maturation of dendritic arbor occurs through dynamic processes that are regulated by intrinsic genetic factors and external signals, such as environmental stimuli, neuronal activity and growth factors. Among the latter, the neurotrophic factor BDNF is a key regulator of dendritic growth. However, the mechanisms by which BDNF controls dendritic development remain elusive.In this study, we first showed that activation of the MAPK signaling pathway and phosphorylation of the transcription factor CREB are required to mediate the effects of BDNF on dendritic development of cortical neurons. However, phosphorylation of CREB alone is not sufficient to induce dendritic growth in response to BDNF. Thus, by using a mutant form of CREB unable to bind its coactivator CRTC1, we demonstrated that BDNF-induced dendritic elaboration requires the functional interaction between CREB and CRTC1. Consistent with these observations, inhibition of CRTC1 expression by shRNA-mediated knockdown was found to suppress the effects of BDNF on dendritic length and branching of cortical neurons.The nuclear translocation of CRTC1, a step necessary for the interaction between CREB and CRTC1, was shown to result from the activation of NMD A receptors by glutamate, leading to the dephosphorylation of CRTC1 by the protein phosphatase calcineurin. In line with these findings, prevention of CRTC1 nuclear translocation in the absence of glutamate, or by inhibiting NMDA receptors or calcineurin suppressed the promotion of dendritic growth by BDNF.Increasing evidence supports a role for the growth factor HGF in the regulation of dendritic morphology during brain development. Despite these observations, little is known about the cellular mechanisms underlying the effects of HGF on dendritic elaboration of cortical neurons. The second part of this study was aimed at elucidating the cellular processes that mediate the effects of HGF on dendritic differentiation. We found that HGF increases cortical dendritic growth through mechanisms that involve MAPK-dependent phosphorylation of CREB, and interaction of CREB with its coactivator CRTC1. These data indicate that the mechanisms underlying the promotion of dendritic growth by HGF are similar to those that mediate the effects of BDNF, suggesting that the role of CREB and CRTC1 in the regulation of dendritic development may not be limited to HGF and BDNF, but may extend to other neurotrophic factors that control dendritic differentiation.Together, these results identify a previously unrecognized mechanism by which CREB and its coactivator CRTC1 mediate the effects of BDNF and HGF on dendritic growth of cortical neurons. Moreover, these data highlight the important role of the cooperation between BDNF/HGF and glutamate that converges on CREB to stimulate the expression of genes that contribute to the development of dendritic arborization.RésuméL'établissement d'un système nerveux fonctionnel s'accomplit grâce à des mécanismes précis, orchestrés en plusieurs étapes au cours de l'embryogenèse. Les dendrites étant les principaux sites de connexions synaptiques, le développement de l'arborisation dendritique est essentiel à la formation de circuits neuronaux fonctionnels. La maturation de l'arbre dendritique s'effectue grâce à des processus dynamiques qui sont régulés par des facteurs génétiques intrinsèques ainsi que par des facteurs externes tels que les stimuli environnementaux, l'activité neuronale ou les facteurs de croissance. Parmi ces derniers, le facteur neurotrophique BDNF est - connu pour être un régulateur clé de la croissance dendritique. Cependant, les mécanismes par lesquels BDNF contrôle le développement dendritique demeurent mal connus.Au cours de cette étude, nous avons montré dans un premier temps que l'activation de la voie de signalisation de la MAPK et la phosphorylation du facteur de transcription CREB sont nécessaires aux effets du BDNF sur le développement dendritique des neurones corticaux. Toutefois, la phosphorylation de CREB en tant que telle n'est pas sûffisante pour permettre la pousse des dendrites en réponse au BDNF. Ainsi, en utilisant une forme mutée de CREB incapable de se lier à son coactivateur CRTC1, nous avons démontré que l'élaboration des dendrites induite par le BDNF nécessite également une interaction fonctionnelle entre CREB et CRTC1. Ces résultats ont été confirmés par d'autres expériences qui ont montré que l'inhibition de l'expression de CRTC1 par l'intermédiaire de shRNA supprime les effets du BDNF sur la longueur et le branchement dendritique des neurones corticaux.Les résultats obtenus au cours de ce travail montrent également que la translocation nucléaire de CRTC1, qui est une étape nécessaire à l'interaction entre CREB et CRTC1, résulte de l'activation des récepteurs NMDA par le glutamate, entraînant la déphosphorylation de CRTC1 par la protéine phosphatase calcineurine. De plus, le blocage de la translocation nucléaire de CRTC1 en absence de glutamate, ou suite à l'inhibition des récepteurs NMDA ou de la calcineurine, supprime complètement la pousse des dendrites induite par le BDNF.De nombreuses d'évidences indiquent que le facteur de croissance HGF joue également un rôle important dans la régulation de la morphologie dendritique au cours du développement cérébral. Malgré ces observations, peu d'éléments sont connus quant aux mécanismes cellulaires qui sous-tendent les effets du HGF sur la croissance dendritique des neurones corticaux. Le but de la seconde partie de cette étude a eu pour but d'élucider les processus cellulaires responsables des effets du HGF sur la différenciation dendritique des neurones corticaux. Au cours de ces expériences, nous avons pu mettre en évidence que le HGF induit la pousse dendritique par des mécanismes qui impliquent la phosphorylation de CREB par la MAPK, et l'interaction de CREB avec son coactivateur CRTC1. Ces données indiquent que les mécanismes impliqués dans la stimulation de la croissance dendritique par le HGF sont similaires à ceux régulant les effets du BDNF, ce qui suggère que le rôle de CREB et de CRTC1 dans la régulation du développement dendritique n'est vraisemblablement pas limité aux effets du HGF ou du BDNF, mais pourrait s'étendre à d'autres facteurs neurotrophiques qui contrôlent la différenciation dendritique.En conclusion, ces résultats ont permis l'identification d'un nouveau mécanisme par lequel CREB et son coactivateur CRTC1 transmettent les effets du BDNF et du HGF sur la croissance dendritique de neurones corticaux. Ces observations mettent également en évidence le rôle important joué par la coopération entre BDNF/HGF et le glutamate, dans l'activation de CREB ainsi que dans l'expression de gènes qui participent au développement de l'arborisation dendritique des neurones corticaux.

La conception du "dialogue" de Mikhaïl Bakhtine et ses sources sociologiques (l'exemple des "Problèmes de l'oeuvre de Dostoïevski" [1929])

Résumé: L'article porte sur la conception du « dialogue » de Mikhaïl Bakhtine dans laquelle s'articulent deux groupes d'idées : 1) la notion de « dialogue » en tant que forme de l'interaction verbale interindividuelle (l'échange des répliques) et 2) la notion de « dialogisme » comme principe qui prévoit un rapport particulier entre le « Moi » (le « Je ») et l'« Autrui ». Son but consiste à 1) analyser ces notions au sens de Bakhtine, en s'appuyant sur le texte russe des Problèmes de l'oeuvre de Dostoïevski (1929) ; et à 2) montrer leurs sources sociologiques (principalement russes). Il y est également question de la notion de « polyphonie » introduite par Bakhtine pour caractériser la particularité de la construction des romans de Dostoïevski et d'une facette des réflexions bakhtiniennes sur le rôle de la « polyphonie » chez Dostoïevski, contenues dans le texte russe de 1929, abandonnées dans la version de 1963 et, de ce fait, méconnues des chercheurs francophones n'ayant accès qu'à la traduction des Problèmes de la poétique de Dostoïevski (1963). This paper examines the conception of "dialogue" elaborated by Mikhaïl Bakhtin in which are articulated two groups of ideas : 1) the notion of "dialogue" as a form of verbal interindividual interaction (an exchange of speech) and 2) the notion of "dialogism" as a principle which implies a relation between the "Me" (the "I") and the "Other". Its aim is 1) to analyse these notions in the sens of Bakhtin, on the base of russian text of Problems of Dostoyevsky's Art (1929) and 2) to show their sociological (mainly russian) origins. The paper also deals with the notion of "polyphony" introduced by Bakhtin to characterize the particularity of Dostoyevsky's method of constructing novels and with one facet of bakhtinian reflections (expounded in the text of 1929, omitted in the version of 1963, thereby unknown by francophone researchers who have access only to the translation of Problems of Dostoyevsky's Poetics (1963)) on the role of "polyphony" in Dostoyevsky's works.

Écrire la musique. Baudelaire face à Wagner

Baudelaire a consacré un seul essai à la musique, dans les dernières années de sa vie. Cet essai porte sur un unique compositeur, Richard Wagner, à une époque où l'esthétique du regard du poète est déjà formée depuis longtemps. De plus, Baudelaire « ne sait pas la musique », comme il l'écrit lui-même au musicien dans une longue lettre. Et pourtant, l'essai sur Wagner s'inscrit parfaitement dans les textes critiques de Baudelaire consacrés à l'art : l'image et l'imagination tiennent lieu, ici aussi, de modèles épistémologiques. La méconnaissance du langage musical est ainsi rachetée par la connaissance de l'image - mais la connaissance de l'image, de sa dimension scripturale, demeure quant à elle impensée. Ce point aveugle caractérise ce que l'on peut appeler l'esthétique de la Modernité.

Investigation phytochimique d'une plante médicinale malgache Hypoestes serpens (Vahl) R. Br. (Acanthaceae) variété glabre et étude comparative avec la variété poilue

Résumé A Madagascar, comme dans plusieurs pays en développement, une grande partie de la population utilise les plantes pour se soigner. Plusieurs espèces des plantes sont ainsi utilisées en médecine traditionnelle malgache. Par ailleurs, la plupart de ces plantes ne font l'objet que de très peu d'étude scientifique. En effet, dans le cadre de l'investigation phytochimique de plantes utilisées en médecine traditionnelle malgache et dans la recherche des nouvelles substances biologiquement actives, Hypoestes serpens (Vahl) R. Br. (Acanthaceae) a été étudiée. Elle se présente sous deux variétés (glabre et poilue) qui sont tous utilisées dans la région sud-centre de Madagascar pour traiter la blennorragie. De l'extrait dichlorométhanique des feuilles de H. serpens (Vahl) R. Br. variété glabre, 12 diterpénoides dont 8 nouveaux ont été isolés. Ils ont tous montré une activité antifongique contre un champignon pathogène des plantes, Cladosporium cucumerinum, dans la bioautographie directe sur CCM. Quelques-uns ont également présenté une activité contre une levure saprophyte chez l'homme, Candida albicans et une activité inhibitrice de l'enzyme acétylcholinesterase. Les diterpènoïdes sont déjà considérés comme les principaux métabolites secondaires du genre Hypoestes. Le fractionnement de l'extrait méthanolique a conduit à l'isolement de 5 glycosides des flavonoïdes dont 4 sous formes C-g,lycosides qui n'ont jamais été identifiés dans la famille Acanthaceae. Ces flavonoïdes ont présenté une activité antiradicalaire contre le DPPH. Le fractionnement et la purification des extraits ont été effectués à l'aide des différentes techniques chromatographiques telles que la chromatographie sur colonne ouverte, la filtration sur gel, la chromatographie liquide à haute pression, la chromatographie liquide à moyenne pression et la chromatographie liquide à basse pression. Par ailleurs, les structures des composés isolés ont été élucidées par des techniques spectroscopiques (UV, MS, RMN) et de méthode chimique (hydrolyse acide). En plus de ces techniques, certaines méthodes physiques (cristallographie par rayons-X, mesure de rotation optique) ont été réalisées pour confirmer certaines structures. Comme l'espèce Hypoestes serpens (Vahl) R. Br. se présente en deux variétés, une étude comparative a été effectuée. Cette étude avait montré que ces deux variétés ont une activité biologique similaire. Finalement, une technique analytique couplée, HPLC-UV-APC1-MS a permis de montrer la présence de toutes les substances isolées de la variété glabre dans la variété poilue. Second résumé Depuis des milliers d'almées, l'homme utilise les plantes pour se soigner. De nos jours, même avec le développement de la médecine moderne, la phytothérapie reste toujours la forme des soins de santé abordable et accessible pour la majorité des populations rurales des pays en développement. En outre, les plantes médicinales constituent une source potentielle de molécules biologiquement actives pour les industries pharmaceutiques et actuellement, on estime que 25% des médicaments commercialisés dans le monde sont à base de plantes Dans le cadre de la recherche des nouvelles molécules à intérêt thérapeutique qui pourraient devenir un médicament ou un modèle de structure ("lead compound") pour le développement de nouveaux médicaments, nous avons fait une étude sur l'espèce, Hypoestes serpens (Vahl) R. Br, plante utilisée en médecine traditionnelle malgache. Cette espèce existe en deux variétés, une glabre et une autre poilue qui sont tous utilisées dans la région sud-centre de Madagascar pour traiter la blennorragie. Par ailleurs, les tradipraticiens utilisent de préférence la variété poilue. Dans la première partie de ce présent travail, une investigation phytochimique de H serpens, variété glabre (variété moins utilisée) a d'abord été effectuée afm d'isoler et d'identifier le maximum des molécules biologiquement actives qu'elle contient. De ce fait, 17 composés dont 8 nouveaux ont été isolés. Les potentiels d'activités thérapeutiques des substances isolées ont ensuite été dépistés sur les différents cibles suivants.: deux souches de champignons (Cladosporium cucumerinum et Candida albicans), l'enzyme acétylcholinesterase et le radical DPPH. La deuxième partie de ce travail a été consacrée sur l'étude comparative des deux variétés (glabre et poilue) de H. serpens à la fois sur le plan biologique et sur le plan phytochimique. A l'issue de cette comparaison, nous avons constaté que l'utilisation de ces deux variétés en médecine traditionnelle malgache n'est pas un hasard ; les deux variétés avaient présenté une activité biologique très remarquable et contiennent les mêmes substances actives. Ces résultats démontrent les potentiels thérapeutiques de H serpens en médecine traditionnelle malgache et pourraient également encourager les tradipraticiens à utiliser la variété glabre tout en protégeant la variété poilue qui est en voie de disparition actuellement. En bref, l'investigation phytochimique de H. serpens justifiée par l'isolement et l'identification de certains de ses principes actifs ouvre la voie aux recherches des médicaments d'origine naturelle. Abstract In Madagascar, as in many developing countries, most people use plants to cure. A large number of plant species are employed in Malagasy traditional medicine. Moreover, most of these plants have been subject only very little scientific study. As part of a phytochemical investigation of plants used in Malagasy traditional medicine and in the search for new biologically active substances, Hypoestes serpens (Vah1) R.Br. (Acanthaceae) was investigated. This species exists in two varieties (glabrous and hairy) which are used in the south-center part of Madagascar to treat gonorrhoea. From the dichloromethane extract of the leaves of H. serpens (Vah1) R. Br. glabrous variety, 12 diterpenoids 8 of which were new, were isolated. They showed antifungal activity against the plant pathogen Cladosporium cucumerinum, in the direct TLC bioautography. Some of them also had activity against the yeast Candida athicans and inhibited acetylcholinesterase. The diterpenes are considered as the principal secondary metabolites of the genus Hypoestes. Fractionation of the methanol extract led to the isolation of 5 flavonoid glycosides, 4 of which were C-glycosides, never before identified in the Acanthaceae family. These flavonoids showed radical scavenging activity against DPPH. The fractionation and the purification of the extracts were achieved by different chromatographic techniques such as open-column chromatography, gel filtration, high- pressure liquid chromatography, medium-pressure liquid chromatography and low-pressure liquid chromatography. Moreover, the structures of the isolated compounds were elucidated by spectroscopic techniques (UV, MS, NMR) and chemical technique (acid hydrolysis). In addition, some physical methods (X-ray crystallography, measurement of optical rotation) were performed to confirm some structures. As the species Hypoestes serpens (Vah1) R. Br. is present in two varieties, a comparative study was carried out. This study showed that these two varieties had similar biological activity. Finally, a coupled analytical technique HPLC-UV-APCI-MS showed the presence of the same compounds in both the glabrous and hairy varieties.

Machine learning for geospatial data : algorithms, software tools and case studies

Résumé Cette thèse est consacrée à l'analyse, la modélisation et la visualisation de données environnementales à référence spatiale à l'aide d'algorithmes d'apprentissage automatique (Machine Learning). L'apprentissage automatique peut être considéré au sens large comme une sous-catégorie de l'intelligence artificielle qui concerne particulièrement le développement de techniques et d'algorithmes permettant à une machine d'apprendre à partir de données. Dans cette thèse, les algorithmes d'apprentissage automatique sont adaptés pour être appliqués à des données environnementales et à la prédiction spatiale. Pourquoi l'apprentissage automatique ? Parce que la majorité des algorithmes d'apprentissage automatiques sont universels, adaptatifs, non-linéaires, robustes et efficaces pour la modélisation. Ils peuvent résoudre des problèmes de classification, de régression et de modélisation de densité de probabilités dans des espaces à haute dimension, composés de variables informatives spatialisées (« géo-features ») en plus des coordonnées géographiques. De plus, ils sont idéaux pour être implémentés en tant qu'outils d'aide à la décision pour des questions environnementales allant de la reconnaissance de pattern à la modélisation et la prédiction en passant par la cartographie automatique. Leur efficacité est comparable au modèles géostatistiques dans l'espace des coordonnées géographiques, mais ils sont indispensables pour des données à hautes dimensions incluant des géo-features. Les algorithmes d'apprentissage automatique les plus importants et les plus populaires sont présentés théoriquement et implémentés sous forme de logiciels pour les sciences environnementales. Les principaux algorithmes décrits sont le Perceptron multicouches (MultiLayer Perceptron, MLP) - l'algorithme le plus connu dans l'intelligence artificielle, le réseau de neurones de régression généralisée (General Regression Neural Networks, GRNN), le réseau de neurones probabiliste (Probabilistic Neural Networks, PNN), les cartes auto-organisées (SelfOrganized Maps, SOM), les modèles à mixture Gaussiennes (Gaussian Mixture Models, GMM), les réseaux à fonctions de base radiales (Radial Basis Functions Networks, RBF) et les réseaux à mixture de densité (Mixture Density Networks, MDN). Cette gamme d'algorithmes permet de couvrir des tâches variées telle que la classification, la régression ou l'estimation de densité de probabilité. L'analyse exploratoire des données (Exploratory Data Analysis, EDA) est le premier pas de toute analyse de données. Dans cette thèse les concepts d'analyse exploratoire de données spatiales (Exploratory Spatial Data Analysis, ESDA) sont traités selon l'approche traditionnelle de la géostatistique avec la variographie expérimentale et selon les principes de l'apprentissage automatique. La variographie expérimentale, qui étudie les relations entre pairs de points, est un outil de base pour l'analyse géostatistique de corrélations spatiales anisotropiques qui permet de détecter la présence de patterns spatiaux descriptible par une statistique. L'approche de l'apprentissage automatique pour l'ESDA est présentée à travers l'application de la méthode des k plus proches voisins qui est très simple et possède d'excellentes qualités d'interprétation et de visualisation. Une part importante de la thèse traite de sujets d'actualité comme la cartographie automatique de données spatiales. Le réseau de neurones de régression généralisée est proposé pour résoudre cette tâche efficacement. Les performances du GRNN sont démontrées par des données de Comparaison d'Interpolation Spatiale (SIC) de 2004 pour lesquelles le GRNN bat significativement toutes les autres méthodes, particulièrement lors de situations d'urgence. La thèse est composée de quatre chapitres : théorie, applications, outils logiciels et des exemples guidés. Une partie importante du travail consiste en une collection de logiciels : Machine Learning Office. Cette collection de logiciels a été développée durant les 15 dernières années et a été utilisée pour l'enseignement de nombreux cours, dont des workshops internationaux en Chine, France, Italie, Irlande et Suisse ainsi que dans des projets de recherche fondamentaux et appliqués. Les cas d'études considérés couvrent un vaste spectre de problèmes géoenvironnementaux réels à basse et haute dimensionnalité, tels que la pollution de l'air, du sol et de l'eau par des produits radioactifs et des métaux lourds, la classification de types de sols et d'unités hydrogéologiques, la cartographie des incertitudes pour l'aide à la décision et l'estimation de risques naturels (glissements de terrain, avalanches). Des outils complémentaires pour l'analyse exploratoire des données et la visualisation ont également été développés en prenant soin de créer une interface conviviale et facile à l'utilisation. Machine Learning for geospatial data: algorithms, software tools and case studies Abstract The thesis is devoted to the analysis, modeling and visualisation of spatial environmental data using machine learning algorithms. In a broad sense machine learning can be considered as a subfield of artificial intelligence. It mainly concerns with the development of techniques and algorithms that allow computers to learn from data. In this thesis machine learning algorithms are adapted to learn from spatial environmental data and to make spatial predictions. Why machine learning? In few words most of machine learning algorithms are universal, adaptive, nonlinear, robust and efficient modeling tools. They can find solutions for the classification, regression, and probability density modeling problems in high-dimensional geo-feature spaces, composed of geographical space and additional relevant spatially referenced features. They are well-suited to be implemented as predictive engines in decision support systems, for the purposes of environmental data mining including pattern recognition, modeling and predictions as well as automatic data mapping. They have competitive efficiency to the geostatistical models in low dimensional geographical spaces but are indispensable in high-dimensional geo-feature spaces. The most important and popular machine learning algorithms and models interesting for geo- and environmental sciences are presented in details: from theoretical description of the concepts to the software implementation. The main algorithms and models considered are the following: multi-layer perceptron (a workhorse of machine learning), general regression neural networks, probabilistic neural networks, self-organising (Kohonen) maps, Gaussian mixture models, radial basis functions networks, mixture density networks. This set of models covers machine learning tasks such as classification, regression, and density estimation. Exploratory data analysis (EDA) is initial and very important part of data analysis. In this thesis the concepts of exploratory spatial data analysis (ESDA) is considered using both traditional geostatistical approach such as_experimental variography and machine learning. Experimental variography is a basic tool for geostatistical analysis of anisotropic spatial correlations which helps to understand the presence of spatial patterns, at least described by two-point statistics. A machine learning approach for ESDA is presented by applying the k-nearest neighbors (k-NN) method which is simple and has very good interpretation and visualization properties. Important part of the thesis deals with a hot topic of nowadays, namely, an automatic mapping of geospatial data. General regression neural networks (GRNN) is proposed as efficient model to solve this task. Performance of the GRNN model is demonstrated on Spatial Interpolation Comparison (SIC) 2004 data where GRNN model significantly outperformed all other approaches, especially in case of emergency conditions. The thesis consists of four chapters and has the following structure: theory, applications, software tools, and how-to-do-it examples. An important part of the work is a collection of software tools - Machine Learning Office. Machine Learning Office tools were developed during last 15 years and was used both for many teaching courses, including international workshops in China, France, Italy, Ireland, Switzerland and for realizing fundamental and applied research projects. Case studies considered cover wide spectrum of the real-life low and high-dimensional geo- and environmental problems, such as air, soil and water pollution by radionuclides and heavy metals, soil types and hydro-geological units classification, decision-oriented mapping with uncertainties, natural hazards (landslides, avalanches) assessments and susceptibility mapping. Complementary tools useful for the exploratory data analysis and visualisation were developed as well. The software is user friendly and easy to use.

Faire une pause ou bifurquer ? Essai de typologie des trajectoires de formation

Cette analyse de l'évolution de la formation en Suisse s'appuie sur la forme des itinéraires suivis. La typologie construite permet de mesurer l'évolution, sur près de soixante-dix ans, des trajectoires empruntées selon l'origine sociale et de montrer l'émergence de nouveaux parcours. Les données attestent un accroissement des parcours atypiques, à cheval sur plusieurs filières, comportant des interruptions ou composés de formations complémentaires. Plus qu'à une égalisation du niveau d'éducation, on assiste à une inflation des diplômes, caractérisée par une multiplication des périodes de formations tardives, plutôt mesurable à la complexification des parcours qu'au niveau final atteint. On peut donc faire l'hypothèse que ce n'est plus le diplôme atteint qui détermine la valeur de la formation suivie mais le nombre et la pertinence des reformations.

Insulin resistance in mice lacking neuronal nitric oxide synthase is related to an alpha-adrenergic mechanism

Rapport de synthèse : Le monoxyde d'azote (NO) joue un rôle important dans la régulation de l'homéostasie du système cardiovasculaire et du glucose. Les souris déficientes pour le gène codant l'isoforme neuronale de la synthase de monoxyde d'azote (nNOS) sont résistantes à l'insuline, mais les mécanismes sous-jacents sont inconnus. Le manque de NO produit par la nNOS pourrait être à l'origine d'une diminution de la perfusion du muscle squelettique et ainsi d'une diminution de l'apport de substrat. Alternativement, le déficit de nNOS normalement hautement exprimé dans le tissu musculaire squelettique pourrait directement y perturber la consommation de glucose. Finalement l'absence de l'action sympatholytique du NO neuronal pourrait diminuer la sensibilité à l'insuline. Afin de tester ces hypothèses nous avons étudié, chez des souris déficientes en nNOS et des souris-contrôle, la consommation corporelle totale de glucose et le flux musculaire squelettique pendant des clamps hyperinsulinémiques euglycémiques in vivo, ainsi que la consommation de glucose dans le muscle squelettique in vitro. De plus nous avons analysé les effets d'une inhibition alpha-adrénergique sur la consommation de glucose pendant les clamps hyperinsulinémiques euglycémiques in vivo. Le taux de perfusion de glucose pendant les clamps était grossièrement 15 pourcent plus bas (P<0.001) chez les souris déficientes en nNOS que chez les souris-contrôle. Cette résistance à l'insuline chez les souris déficientes en nNOS n'était due ni à une stimulation déficiente du flux sanguin musculaire par l'insuline ni à un défaut intrinsèque de la consommation de glucose du muscle (qui étaient comparables dans les deux groupes), mais à un mécanisme alpha-adrénergique, car l'administration de phentolamine rétablissait la sensibilité à l'insuline chez les souris déficientes en nNOS. Ces résultats suggèrent qu'une hyperactivité sympathique, potentiellement due à la perte de l'inhibition neuronale centrale du flux sympathique par le NO provenant de nNOS, contribue à la résistance à l'insuline des souris déficientes en nNOS. Par ailleurs ces résultats tendent à prouver qu'un défaut de production de NO provoquerait une résistance à l'insuline par des mécanismes différents selon l'isoforme de NO synthase déficiente (par exemple chez les souris déficientes pour la forme endothéliale de NO synthase, il a été montré que la résistance à l'insuline est due à un défaut de stimulation de la perfusion musculaire par l'insuline et à un défaut du signalling de l'insuline dans la cellule musculaire squelettique). Chez l'être humain il est établi que les états de résistance à l'insuline sont associés à une synthèse défectueuse et/ou une mauvaise biodisponibilité du NO, ainsi qu'à une hyperactivité sympathique. Nous spéculons que la perte d'inhibition centrale du flux sympathique représente un mécanisme contribuant à la résistance à l'insuline et ses complications cardiovasculaires chez l'être humain.

Entre résistance et contestation. La genèse du squat comme mode d'action

Cette contribution vise plusieurs objectifs théoriques : questionner les implicites du concept de répertoire d'action pour proposer une typification des modes d'action, indiquer des pistes pour une analyse conjointe des répertoires instrumentaux et discursifs mis en oeuvre par les organisations, reconsidérer les ruptures historiques mises au jour par Charles Tilly, et enfin réfléchir aux conditions organisationnelles et contextuelles favorisant l'usage de formes d'actions directes. Elle se fonde empiriquement sur l'étude de la genèse d'un mode d'action spécifique, le squat, entre 1880 et 1914, au moyen d'un travail d'archives et d'un travail d'étymologie. On montre notamment que le passage de la « résistance » à la « contestation », dans laquelle prédomine le « revendiqué », suppose une forme particulière de rapport au politique qui, au début de ce siècle, constituait en soi un enjeu de luttes important entre différents groupes.

Origin of needle fibre calcite (NFC) : a geochemical approach

ABSTRACTNeedle fibre calcite (NFC) is one of the most widespread habits of pedogenic calcite. It is a monocrystal of calcite, in the shape of a needle, with a diameter of one micron and a length between 4 and 103 times its width. NFC occurs in soils with different macroscopic and microscopic morphologies. Macroscopically, two main habits of NFC exist: "cotton ball'Mike clusters and as "powder" coating on pebbles inside the soil. It can also act as nucleation sites for precipitation of calcite cements of purely physicochemical origin (LCC - Late Calcitic Cement). Although many studies have been conducted on needle fibre calcite, its origin remains a subject of debate. The NFC having never been reproduced in the laboratory whatever the considered approach, the processes responsible for its precipitation as a so particular morphology remain unexplained. The shift between the length orientation of the needle crystal and the normal axis of calcite growth (c-axis) is also unresolved.Samples taken in two soils observed in quarries (Villiers and Savagnier) in the Swiss Jura Mountains are used to investigate the processes involved in the formation of these calcite crystals in pedogenic environments. Three groups of microscopic morphologies are distinguished: (i) simple needles (SN), (ii) simple needles with overgrowths (SNO), and (iii) simple needles with nanofibres (SNN), nanofibres being either organic or mineral in nature. These groups correspond to different stages in the formation and evolution of NFC.Comparison of carbon and oxygen isotope compositions of NFC with LCC, in relationship with the composition of the carbonate host rock (CHR), and the carbon isotope signature of dissolved inorganic carbon (DIC) from the soil waters, indicates that both NFC and LCC are precipitated in isotopic equilibrium with the soil solution. Similar Ô13C and Ô180 values of the elongated NFC and the rhombohedral calcite crystals of the LCC suggest that the precipitation of these different calcite habits is not due to changes in physicochemical conditions. The growth of NFC crystals inside an organic mould formed by the fungal hyphae could explain the formation of calcite ciystals in the shape of a needle in isotopic equilibrium with the local environment.Strontium and calcium isotope compositions of the three microscopic groups of NFC and LCC were also studied, in order to determine the origin of calcium (Ca2+) entrapped in the calcite lattice and to elucidate the processes responsible for the precipitation of NFC. The 87Sr/86Sr ratio of the SN is closer to the 87Sr/86Sr ratio of the carbonate host rock than the LCC, SNO, and SNN. This could be another clue for the formation of SN inside fungal hyphae, because fungi are known to dissolve the rocks to release and translocate through their hyphae nutrients necessary for their growth. SN and SNN are depleted in Sr and enriched in ^Ca compared to the LCC. In the context of Villiers quarry, where the two ciystal shapes precipitate at similar temperature (in a range of 0,6°C), such variations are the result of a slower precipitation rate of NFC, which is inconsistent with a purely physicochemically precipitated elongate crystal.Finally, NFC is enriched in major and trace elements (i.e. Fe, Zn, Cu, and Mo) compared to the LCC. This enrichment is ascribed to modification in precipitation processes between the NFC and LCC. Right now, it is not possible to preclude the influence of the particular shape of NFC or the biological influence. REEs are not fractionated in NFC, contrary to LCC. Thus, NFC does not precipitate from a percolation solution circulating downward the soil, which should lead to the fractionation of the REEs. As explained above, fungi, are able to dissolve and translocate nutrients. This kind of processes allows releasing elements in the soil solution without fractionation and could explain the particular chemical signature of NFC regarding the REEs.The geochemical approach to investigate the origin of NFC presented in this study does not allow providing direct clues to the fungal origin of NFC, but brings several new insights in the understanding of the formation of such a particular mineral, calcite needles, by precluding definitively their physicochemical origin.RESUMELa calcite en aiguilles (NFC) est l'une des formes les plus ubiquiste de calcite pédogénique. Il s'agit d'un monocrystal de calcite d'un diamètre d'un micron et d'une longueur 4 à 102 fois supérieure à sa largeur. A l'échelle macroscopique, la NFC a été observée sous deux principaux aspects : l'une « cotonneuse » et l'autre formant un mince croûte autour des graviers du sol. La NFC peut également servir de support à la nucléation de ciments secondaires précipités de manière purement physico-chimique (LCC). Malgré les nombreuses études menées sur la NFC, son origine demeure encore inconnue. A ce jour, aucune expérience en laboratoire n'a permis de créer de la calcite en aiguilles, et ce, quelque soit l'approche abordée. Par conséquent, les processus précis responsables de la précipitation calcite avec une telle morphologie restent inconnus. Le décalage existant entre l'axe d'allongement des aiguilles de calcite et l'axe normal de croissance de la calcite (axe c) reste inexpliqué.Des échantillons de NFC, LCC, roche mère, eau de pluie des différents horizons du sol ont été prélevés principalement au front de deux carrières de graviers, ainsi que dans un profil de sol adjacent à ces carrières, dans le but de mieux comprendre les processus à l'origine de la précipitation de calcite en forme d'aiguille. Trois micro-morphologies ont été distinguées: les aiguilles simples (SN), les aiguilles simples avec surcroissances calcitiques (SNO) et enfin les aiguilles simples avec nanofibres (SNN), celles-ci pouvant être de minérales ou organiques. Ces groupes, d'après nos résultats et les études antérieures pourraient correspondre à différentes étapes de formation de la calcite en aiguilles.Dans un premier temps, la comparaison des signatures isotopiques de la calcite en aiguilles, du LCC, de la roche mère et du carbone inorganique dissout dans la solution du sol (CID) indique que la NFC, tout comme le LCC, précipite en équilibre avec la solution du sol. Les valeurs similaires en Ô13C et δ180 de cristaux de calcite allongés (NFC) et rhombohédriques (LCC) formés dans un même milieu suggère que ces différences morphologiques ne peuvent pas être attribuées à des modifications purement physico-chimiques. La croissance de NFC à l'intérieur d'un moule organique comme les hyphes de champignons semble être la seule hypothèse plausible permettant d'expliquer la formation de monocrystaux allongés de calcite en équilibre avec leur environnement.La composition isotopique en strontium (Sr) et calcium (Ca) des LCC et des trois micro¬morphologies de la NFC ont été étudiées également, afin de déterminer l'origine du Ca2+ présent dans le réseau cristallin de la calcite en aiguilles, ainsi que les processus responsables de la formation de NFC. Les valeurs du rapport 87Sr/86$r de la forme SN sont les plus proches de celles de la roche mère par rapport aux formes SNN et SNO et du LCC. Ceci pourrait être un nouvel indice de l'implication des champignons dans la précipitation de calcite en aiguilles, puisqu'ils sont connus pour avoir la capacité de dissoudre les roches afin de libérer les nutriments nécessaires à leur croissance, ainsi que de les transloquer par leurs hyphes. De plus, les formes SN et SNN sont appauvries en Sr et enrichies en "Ca, comparativement au LCC. Dans le sol étudié, tous les carbonates de calcium précipitent à la même température, par conséquent, de telles variations sont dues à un taux de précipitation plus lent de SN et SNN, ce qui est contradictoire avec l'hypothèse physico-chimique. Pour finir, la NFC est enrichie en certains éléments majeurs et traces (i.e. Fe, Zn, Cu et Mo) par rapport au LCC. Ceci peut être attribué à différents processus de formation entre la NFC et le LCC. Pour le moment il est impossible d'exclure l'influence de la forme particulière de la NFC ou celle du champignon. Les terres rares (REEs) ne sont pas fractionnées dans la NFC, contrairement au LCC. Ceci peut être expliqué par le fait que la NFC précipite à partir d'une solution qui n'a pas percolé à travers le sol. Les champignons en dissolvant les roches mettent en solution éléments sans les fractionner. L'approche géochimique de l'étude de la calcite en aiguilles ne permets pas de produire des preuves directes sur sa potentielle origine fongique, mais permet de mieux comprendre comment un minéral aussi singulier que la NFC peut se former. D'autre pare cette étude permets d'exclure définitivement l'hypothèse physico-chimique de l'origine de la calcite en aiguilles

Bayesian networks and the evaluation of scientific evidence in forensic science

Résumé Ce travail de thèse étudie des moyens de formalisation permettant d'assister l'expert forensique dans la gestion des facteurs influençant l'évaluation des indices scientifiques, tout en respectant des procédures d'inférence établies et acceptables. Selon une vue préconisée par une partie majoritaire de la littérature forensique et juridique - adoptée ici sans réserve comme point de départ - la conceptualisation d'une procédure évaluative est dite 'cohérente' lors qu'elle repose sur une implémentation systématique de la théorie des probabilités. Souvent, par contre, la mise en oeuvre du raisonnement probabiliste ne découle pas de manière automatique et peut se heurter à des problèmes de complexité, dus, par exemple, à des connaissances limitées du domaine en question ou encore au nombre important de facteurs pouvant entrer en ligne de compte. En vue de gérer ce genre de complications, le présent travail propose d'investiguer une formalisation de la théorie des probabilités au moyen d'un environment graphique, connu sous le nom de Réseaux bayesiens (Bayesian networks). L'hypothèse principale que cette recherche envisage d'examiner considère que les Réseaux bayesiens, en concert avec certains concepts accessoires (tels que des analyses qualitatives et de sensitivité), constituent une ressource clé dont dispose l'expert forensique pour approcher des problèmes d'inférence de manière cohérente, tant sur un plan conceptuel que pratique. De cette hypothèse de travail, des problèmes individuels ont été extraits, articulés et abordés dans une série de recherches distinctes, mais interconnectées, et dont les résultats - publiés dans des revues à comité de lecture - sont présentés sous forme d'annexes. D'un point de vue général, ce travail apporte trois catégories de résultats. Un premier groupe de résultats met en évidence, sur la base de nombreux exemples touchant à des domaines forensiques divers, l'adéquation en termes de compatibilité et complémentarité entre des modèles de Réseaux bayesiens et des procédures d'évaluation probabilistes existantes. Sur la base de ces indications, les deux autres catégories de résultats montrent, respectivement, que les Réseaux bayesiens permettent également d'aborder des domaines auparavant largement inexplorés d'un point de vue probabiliste et que la disponibilité de données numériques dites 'dures' n'est pas une condition indispensable pour permettre l'implémentation des approches proposées dans ce travail. Le présent ouvrage discute ces résultats par rapport à la littérature actuelle et conclut en proposant les Réseaux bayesiens comme moyen d'explorer des nouvelles voies de recherche, telles que l'étude de diverses formes de combinaison d'indices ainsi que l'analyse de la prise de décision. Pour ce dernier aspect, l'évaluation des probabilités constitue, dans la façon dont elle est préconisée dans ce travail, une étape préliminaire fondamentale de même qu'un moyen opérationnel.

Tolerogenic dendritic cells and their role in induction of immune tolerance

Les cellules dendritiques sont des cellules du système immunitaire qui permettent d'instruire les lymphocytes T, autres cellules de ce système, pour mettre en place une réponse immunitaire adaptée afin de combattre et vaincre une infection. Ces cellules dendritiques vont reconnaître des motifs spécifiquement exprimés par des pathogènes par l'intermédiaire de récepteurs exprimés à leur surface. En détectant ces molécules, elles vont s'activer et subir diverses modifications pour pouvoir activer les lymphocytes T. Elles vont alors interagir avec les lymphocytes Τ et transférer les informations nécessaires pour que ces cellules s'activent à leur tour et produisent différentes protéines de façon à éliminer le pathogène. En fonction du type de pathogène, les informations transférées entre les cellules dendritiques et les lymphocytes seront différentes de manière à produire la réponse immunitaire la mieux adaptée pour supprimer l'élément infectieux. Dans le corps, les cellules dendritiques circulent continuellement afin de détecter les éléments étrangers. Quand elles reconnaissent une protéine étrangère, elles la phagocytent, c'est-à-dire qu'elles la mangent afin de pouvoir la présenter aux lymphocytes T. Mais quand elles phagocytent un élément étranger, elles peuvent également prendre des éléments du soi, comme par exemple quand elles phagocytent une cellule infectée par un virus. Les cellules dendritiques doivent alors être capables de différentier les molécules du soi et du non-soi de façon à ne pas induire une réponse en présentant un antigène du soi aux lymphocytes T. D'autant plus que lors de leur développement, les lymphocytes Τ qui sont capables de reconnaître le soi sont éliminés mais ce système n'est pas parfait et donc certains lymphocytes Τ auto-reactifs peuvent se trouver dans le corps. Il existe ainsi d'autres mécanismes en périphérie du site de développement pour inhiber ces lymphocytes Τ auto-reactifs. Ce sont les mécanismes de tolérance. Quand les lymphocytes Τ induisent une réponse aux antigènes du soi, cela résulte à des maladies auto-immunes. Dans mon projet de recherche, nous avons travaillé avec des lignées de cellules dendritiques, c'est-à-dire des cellules dendritiques semblables à celles que l'on peut trouver in vivo mais qui sont immortalisées, elles peuvent donc être cultiver et manipuler in vitro. Nous avons génétiquement modifiées ces lignées cellulaires pour qu'elles expriment des molécules immunosuppressives afin d'étudier comment induire une tolérance immunitaire, c'est-à-dire si l'expression de ces molécules permet d'éviter de générer une réponse immunitaire. Pour cela, nous avons utilisé des modèles murins de tumeurs et de maladies auto-immunes. Nous avons démontré que ces lignées de cellules dendritiques peuvent être un grand outil de recherche pour étudier les bénéfices de différentes molécules immuno-modulatrices afin d'induire une tolérance immunitaire à différents antigènes. - Les cellules dendritiques sont responsables de l'induction des réponses immunitaires adaptatives. Suite à une infection microbienne, les cellules dendritiques s'activent, elles induisent l'expression de molécules de costimulation à leur surface, sécrètent des cytokines et induisent la différentiation des cellules Τ effectrices et mémoires. De plus, les cellules dendritiques ont un rôle important dans l'induction et la maintenance de la tolérance immunitaire au niveau du thymus et en périphérie, en induisant l'anergie, la délétion ou la conversion des cellules Τ naïves en cellules régulatrices. Dans notre groupe, une nouvelle lignée de cellules dendritiques appelée MuTu a été crée par la culture de cellules dendritiques tumorales isolées à partir d'une rate d'une souris transgénique, dans laquelle l'expression de l'oncogène SV40 et du GFP sont sous le contrôle du promoteur CD1 le, et sont ainsi spécifiquement exprimés dans les cellules dendritiques. Ces nouvelles lignées appartiennent au sous-type des cellules dendritiques conventionnelles exprimant CD8a. Elles ont conservé leur capacité d'augmenter l'expression des marqueurs de costimulation à leur surface ainsi que le production de cytokines en réponse à des ligands des récepteurs Toll, ainsi que leur capacité à présenter des antigènes associés aux molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I ou II pour activer la prolifération et la différentiation des lymphocytes T. En utilisant un système de transduction de lentivirus de seconde génération, ces nouvelles lignées de cellules dendritiques ont été génétiquement modifiées pour sur-exprimer des molécules immunosuppressives (IL-10, TGFP latent, TGFp actif, Activin A, Arginase 1, IDO, B7DC et CTLA4). Ces lignées permettent d'étudier de manière reproductible le rôle de ces molécules potentiellement tolérogènes sur les réponses immunitaires in vitro et in vivo. Ces lignées potentiellement tolérogènes ont été testées, tout d'abord, in vitro, pour leur capacité à inhiber l'activation des cellules dendritiques, à bloquer la prolifération des cellules Τ ou à modifier leur polarisation. Nos résultats démontrent qu'en réponse à une stimulation, la sur-expression des molécules costimulatrices et la sécrétion de molécules pro- inflammatoires est réduite quand les cellules dendritiques sur-expriment l'IL-10. La sur¬expression de TGFp sous sa forme active induit le développement de cellules régulatrices CD4+ CD25+ Foxp3+ et bloque la réponse CD8 cytotoxique tandis que la sur-expression de CTLA4 à la surface des cellules dendritiques inhibe une réponse Thl et induit des lymphocytes Τ anergiques. Ces lignées ont également été utilisées pour étudier l'induction de tolérance in vivo. Tout d'abord, nous avons étudié l'induction de tolérance dans un modèle de développement de tumeurs. En effet, quand les lignées tumorales sont transférées dans les lignées de souris C57BL/6, elles sont reconnues comme du non-soi du à l'expression de l'oncogène SV40 et du GFP et sont éliminées. Ce mécanisme d'élimination a été étudié en utilisant une lignée de cellules dendritiques modifiée pour exprimer la luciférase et qui a permis de suivre le développement des tumeurs par de l'imagerie in vivo dans des animaux vivants. Ces lignées de cellules dendritiques MuTu sont éliminées dans la souris C57BL/6 par les lymphocytes CD8 et l'action cytotoxique de la perforine. Après plusieurs injections, les cellules dendritiques sur-exprimant CTLA4 ou l'actif TGFp peuvent casser cette réponse immunitaire inhérente aux antigènes de la lignée et induire le développement de la tumeur dans la souris C57BL/6. Le développement tumoral a pu être suivi en mesurant la bioluminescence émise par des cellules dendritiques modifiées pour exprimer à la fois l'actif TGFp et la luciférase. Ces tumeurs ont pu se développer grâce à la mise en place d'un microenvironnement suppressif pour échapper à l'immunité en recrutant des cellules myéloïde suppressives, des lymphocytes CD4 régulateurs et en induisant l'expression d'une molécule inhibitrice PD-1 à la surface des lymphocytes CD8 infiltrant la tumeur. Dans un deuxième temps, ces lignées tolérogènes ont également été testées dans un modèle murin de maladies auto-immunes, appelé l'encéphalomyélite auto-immune expérimental (EAE), qui est un modèle pour la sclérose en plaques. L'EAE a été induite dans la souris par le transfert de cellules de ganglions prélevées d'une souris donneuse préalablement immunisée avec une protéine du système nerveux central, la glycoprotéine myéline oligodendrocyte (MOG) émulsifiée dans de l'adjuvant complet de Freund. La vaccination des souris donneuses et receveuses avec les cellules sur-exprimant l'actif TGFP préalablement chargées avec la protéine MOG bloque l'induction de l'EAE. Nous sommes actuellement en train de définir les mécanismes qui permettent de protéger la souris du développement de la maladie auto-immune. Dans cette étude, nous avons ainsi démontré la possibilité d'induire la tolérance in vivo et in vitro à différents antigènes en utilisant nos nouvelles lignées de cellules dendritiques et en les modifiant pour exprimer des molécules immunosuppressives. En conséquence, ces nouvelles lignées de cellules dendritiques représentent un outil pour explorer les bénéfices de différentes molécules ayant des propriétés immuno-modulatrices pour manipuler le système immunitaire vers un phénotype tolérogène. - Dendritic cells (DC) are widely recognized as potent inducers of the adaptive immune responses. Importantly, after microbial infections, DC become activated, induce co- stimulation, secrete cytokines and induce effector and memory Τ cells. DC furthermore play an important role in inducing and maintaining central and peripheral tolerance by inducing anergy, deletion or commitment of antigen-specific naïve Τ cells into regulatory Τ cells. In our group, stable MuTu DC lines were generated by culture of splenic DC tumors from transgenic mice expressing the SV40 large Τ oncogene and the GFP under DC-specific CDllc promoter. These transformed DC belong to the CD8a+ conventional DC subtype and have fully conserved their capacity to upregulate co-stimulatory markers and produce cytokines after activation with Toll Like Receptors-ligands, and to present Major Histocompatibility class-I or MHCII-restricted antigens to activate Τ cell expansion and differentiation. Using a second- generation lentiviral transduction system, these newly developed MuTu DC lines were genetically modified to overexpress immunosuppressive molecules (IL-10, latent TGFp, active TGFp, Activin A, Arginase 1, IDO, B7DC and CTLA4). This allows to reproducibly investigate the role of these potentially tolerogenic molecules on in vitro and in vivo immune responses. These potentially tolerogenic DC were tested in vitro for their ability to inhibit DC activation, to prevent Τ cell proliferation and to modify Τ cell polarization. Our results show that the upregulation of costimulatory molecules and the secretion of pro-inflammatory cytokines were reduced upon stimulation of DC overexpressing IL-10. The overexpression of active TGFP induced the development of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory Τ cells and inhibited the cytotoxic CD8 Τ cell response as shown by using the OT-II Τ cell system whereas the surface expression of CTLA-4 on DC prevented the Thl response and prompted an anergic antigen-specific Τ cell response. These MuTu DC lines were also used in vivo in order to study the induction of tolerance. First we addressed the induction of tolerance in a model of tumorogenesis. The adoptively transferred tumor cell lines were cleared in C57BL/6 mice due to the foreign expression of SV40 LargeT and GFP. The mechanism of clearance of MuTu DC line into C57BL/6 mice was investigated by using luciferase-expressing DC line. These DC line allowed to follow, by in vivo imaging, the tumor development in living animals and determined that MuTu DC lines were eliminated in a perforin-mediated CD8 Τ cell dependent and CD4 Τ cell independent response. After multiple injections, DC overexpressing CTLA4 or active TGFp could break the immune response to these inherent antigens and induced DC tumorogenesis in wild type mice. The tumor outgrowth in C57BL/6 mice was nicely observed by double-transduced DC lines to express both luciferase and active TGFp. actTGFp-DC tumor was shown to recruit myeloid-derived suppressor cells, induce CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory Τ cells and induce the expression of the inhibitory receptor PD-1 on tumor- infiltrating CD8+ Τ cells in order to escape tumor immunity. Tolerogenic DC lines were also tested for the induction of tolerance in a murine model of autoimmune disease, the experimental autoimmune encephalitis (EAE) model for human multiple sclerosis. EAE was induced in C57BL/6 mice by the adoptive transfer of lymph node cells isolated from donor mice previously immunized by a protein specific to the central nervous system, the myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) emulsified in the complete freund adjuvant. The vaccination of donor and recipient mice with MOG-pulsed actTGFP-DC line prevented EAE induction. We are still investigating how the active TGFP protect mice from EAE development. We generated tolerogenic DC lines inducing tolerance in vitro and in vivo. Thereby these MuTu DC lines represent a great tool to explore the benefits of various immuno-modulatory molecules to manipulate the immune system toward a tolerogenic phenotype.

ACID-SENSING ION CHANNELS: functional and molecular characterization in putative nociceptors, and modulation by nerve injury and serine protease

Résumé Les canaux ioniques ASICs (acid-sensing ion channels) appartiennent à la famille des canaux ENaC/Degenerin. Pour l'instant, quatre gènes (1 à 4) ont été clonés dont certains présentent des variants d'épissage. Leur activation par une acidification rapide du milieu extracellulaire génère un courant entrant transitoire essentiellement sodique accompagné pour certains types d'ASICs d'une phase soutenue. Les ASICs sont exprimés dans le système nerveux, central (SNC) et périphérique (SNP). On leur attribue un rôle dans l'apprentissage, la mémoire et l'ischémie cérébrale au niveau central ainsi que dans la nociception (douleur aiguë et inflammatoire) et la méchanotransduction au niveau périphérique. Toutefois, les données sont parfois contradictoires. Certaines études suggèrent qu'ils sont des senseurs primordiaux impliqués dans la détection de l'acidification et la douleur. D'autres études suggèrent plutôt qu'ils ont un rôle modulateur inhibiteur dans la douleur. De plus, le fait que leur activation génère majoritairement un courant transitoire alors que les fibres nerveuses impliquées dans la douleur répondent à un stimulus nocif avec une adaptation lente suggère que leurs propriétés doivent être modulés par des molécules endogènes. Dans une première partie de ma thèse, nous avons abordé la question de l'expression fonctionnelle des ASICs dans les neurones sensoriels primaires afférents du rat adulte pour clarifier le rôle des ASICs dans les neurones sensoriels. Nous avons caractérisé leurs propriétés biophysiques et pharmacologiques par la technique du patch-clamp en configuration « whole-cell ». Nous avons pu démontrer que près de 60% des neurones sensoriels de petit diamètre expriment des courants ASICs. Nous avons mis en évidence trois types de courant ASIC dans ces neurones. Les types 1 et 3 ont des propriétés compatibles avec un rôle de senseur du pH alors que le type 2 est majoritairement activé par des pH inférieurs à pH6. Le type 1 est médié par des homomers de la sous-unité ASIC1 a qui sont perméables aux Ca2+. Nous avons étudié leur co-expression avec des marqueurs des nocicepteurs ainsi que la possibilité d'induire une activité neuronale suite à une acidification qui soit dépendante des ASICs. Le but était d'associer un type de courant ASIC avec une fonction potentielle dans les neurones sensoriels. Une majorité des neurones exprimant les courants ASIC co-expriment des marqueurs des nocicepteurs. Toutefois, une plus grande proportion des neurones exprimant le type 1 n'est pas associée à la nociception par rapport aux types 2 et 3. Nous avons montré qu'il est possible d'induire des potentiels d'actions suite à une acidification. La probabilité d'induction est proportionnelle à la densité des courants ASIC et à l'acidité de la stimulation. Puis, nous avons utilisé cette classification comme un outil pour appréhender les potentielles modulations fonctionnelles des ASICs dans un model de neuropathie (spared nerve injury). Cette approche fut complétée par des expériences de «quantitative RT-PCR ». En situation de neuropathie, les courants ASIC sont dramatiquement changés au niveau de leur expression fonctionnelle et transcriptionnelle dans les neurones lésés ainsi que non-lésés. Dans une deuxième partie de ma thèse, suite au test de différentes substances sécrétées lors de l'inflammation et l'ischémie sur les propriétés des ASICs, nous avons caractérisé en détail la modulation des propriétés des courants ASICs notamment ASIC1 par les sérines protéases dans des systèmes d'expression recombinants ainsi que dans des neurones d'hippocampe. Nous avons montré que l'exposition aux sérine-protéases décale la dépendance au pH de l'activation ainsi que la « steady-state inactivation »des ASICs -1a et -1b vers des valeurs plus acidiques. Ainsi, l'exposition aux serine protéases conduit à une diminution du courant quand l'acidification a lieu à partir d'un pH7.4 et conduit à une augmentation du courant quand l'acidification alleu à partir d'un pH7. Nous avons aussi montré que cette régulation a lieu des les neurones d'hippocampe. Nos résultats dans les neurones sensoriels suggèrent que certains courants ASICs sont impliqués dans la transduction de l'acidification et de la douleur ainsi que dans une des phases du processus conduisant à la neuropathie. Une partie des courants de type 1 perméables au Ca 2+ peuvent être impliqués dans la neurosécrétion. La modulation par les sérines protéases pourrait expliquer qu'en situation d'acidose les canaux ASICs soient toujours activables. Résumé grand publique Les neurones sont les principales cellules du système nerveux. Le système nerveux est formé par le système nerveux central - principalement le cerveau, le cervelet et la moelle épinière - et le système nerveux périphérique -principalement les nerfs et les neurones sensoriels. Grâce à leur nombreux "bras" (les neurites), les neurones sont connectés entre eux, formant un véritable réseau de communication qui s'étend dans tout le corps. L'information se propage sous forme d'un phénomène électrique, l'influx nerveux (ou potentiels d'actions). A la base des phénomènes électriques dans les neurones il y a ce que l'on appelle les canaux ioniques. Un canal ionique est une sorte de tunnel qui traverse l'enveloppe qui entoure les cellules (la membrane) et par lequel passent les ions. La plupart de ces canaux sont normalement fermés et nécessitent d'être activés pour s'ouvrire et générer un influx nerveux. Les canaux ASICs sont activés par l'acidification et sont exprimés dans tout le système nerveux. Cette acidification a lieu notamment lors d'une attaque cérébrale (ischémie cérébrale) ou lors de l'inflammation. Les expériences sur les animaux ont montré que les canaux ASICs avaient entre autre un rôle dans la mort des neurones lors d'une attaque cérébrale et dans la douleur inflammatoire. Lors de ma thèse je me suis intéressé au rôle des ASICs dans la douleur et à l'influence des substances produites pendant l'inflammation sur leur activation par l'acidification. J'ai ainsi pu montrer chez le rat que la majorité des neurones sensoriels impliqués dans la douleur ont des canaux ASICs et que l'activation de ces canaux induit des potentiels d'action. Nous avons opéré des rats pour qu'ils présentent les symptômes d'une maladie chronique appelée neuropathie. La neuropathie se caractérise par une plus grande sensibilité à la douleur. Les rats neuropathiques présentent des changements de leurs canaux ASICs suggérant que ces canaux ont une peut-être un rôle dans la genèse ou les symptômes de cette maladie. J'ai aussi montré in vitro qu'un type d'enryme produit lors de l'inflammation et l'ischémie change les propriétés des ASICs. Ces résultats confirment un rôle des ASICs dans la douleur suggérant notamment un rôle jusque là encore non étudié dans la douleur neuropathique. De plus, ces résultats mettent en évidence une régulation des ASICs qui pourrait être importante si elle se confirmait in vivo de part les différents rôles des ASICs. Abstract Acid-sensing ion channels (ASICs) are members of the ENaC/Degenerin superfamily of ion channels. Their activation by a rapid extracellular acidification generates a transient and for some ASIC types also a sustained current mainly mediated by Na+. ASICs are expressed in the central (CNS) and in the peripheral (PNS) nervous system. In the CNS, ASICs have a putative role in learning, memory and in neuronal death after cerebral ischemia. In the PNS, ASICs have a putative role in nociception (acute and inflammatory pain) and in mechanotransduction. However, studies on ASIC function are somewhat controversial. Some studies suggest a crucial role of ASICs in transduction of acidification and in pain whereas other studies suggest rather a modulatory inhibitory role of ASICs in pain. Moreover, the basic property of ASICs, that they are activated only transiently is irreconcilable with the well-known property of nociception that the firing of nociceptive fibers demonstrated very little adaptation. Endogenous molecules may exist that can modulate ASIC properties. In a first part of my thesis, we addressed the question of the functional expression of ASICs in adult rat dorsal root ganglion (DRG) neurons. Our goal was to elucidate ASIC roles in DRG neurons. We characterized biophysical and pharmacological properties of ASIC currents using the patch-clamp technique in the whole-cell configuration. We observed that around 60% of small-diameter sensory neurons express ASICs currents. We described in these neurons three ASIC current types. Types 1 and 3 have properties compatible with a role of pH-sensor whereas type 2 is mainly activated by pH lower than pH6. Type 1 is mediated by ASIC1a homomultimers which are permeable to Ca 2+. We studied ASIC co-expression with nociceptor markers. The goal was to associate an ASIC current type with a potential function in sensory neurons. Most neurons expressing ASIC currents co-expressed nociceptor markers. However, a higher proportion of the neurons expressing type 1 was not associated with nociception compared to type 2 and -3. We completed this approach with current-clamp measurements of acidification-induced action potentials (APs). We showed that activation of ASICs in small-diameter neurons can induce APs. The probability of AP induction is positively correlated with the ASIC current density and the acidity of stimulation. Then, we used this classification as a tool to characterize the potential functional modulation of ASICs in the spared nerve injury model of neuropathy. This approach was completed by quantitative RT-PCR experiments. ASICs current expression was dramatically changed at the functional and transcriptional level in injured and non-injured small-diameter DRG neurons. In a second part of my thesis, following an initial screening of the effect of various substances secreted during inflammation and ischemia on ASIC current properties, we characterized in detail the modulation of ASICs, in particular of ASIC1 by serine proteases in a recombinant expression system as well as in hippocampal neurons. We showed that protease exposure shifts the pH dependence of ASIC1 activation and steady-state inactivation to more acidic pH. As a consequence, protease exposure leads to a decrease in the current response if ASIC1 is activated by a pH drop from pH 7.4. If, however, acidification occurs from a basal pH of 7, protease-exposed ASIC1a shows higher activity than untreated ASIC1a. We provided evidence that this bi-directional regulation of ASIC1a function also occurs in hippocampal neurons. Our results in DRG neurons suggest that some ASIC currents are involved in the transduction of peripheral acidification and pain. Furthermore, ASICs may participate to the processes leading to neuropathy. Some Ca 2+-permeable type 1 currents may be involved in neurosecretion. ASIC modulation by serine proteases may be physiologically relevant, allowing ASIC activation under sustained slightly acidic conditions.

Pharmacogenetic Study on Antidementia Drugs

Differences in efficacy and safety of drugs among patients are a recognized problem in pharmacotherapy. The reasons are multifactorial and, therefore, the choice of a drug and its dosage for a particular patient based on different clinical and genetic factors is suggested to improve the clinical outcome. Four drugs are currently used for the treatment of Alzheimer's disease: three acetylcholinesterase inhibitors (donepezil, galantamine, rivastigmine) and the N-methyl-D-aspartate-antagonist memantine. For these drugs, a high interindividual variability in plasma levels was observed, which might influence the response to treatment. The main objective of this thesis was to provide a better understanding of clinical and genetic factors affecting the plasma levels of antidementia drugs. Furthermore, the relationship between plasma levels, genetic variations and side effects was assessed. For this purpose, a pharmacogenetic study was conducted including 300 patients from a naturalistic clinical setting. Analytical methods for the simultaneous measurement of antidementia drugs in plasma have been developed and validated using liquid chromatography methods coupled with mass spectrometry detection. Presently, these methods are used in the therapeutic drug monitoring service of our laboratory. The routine use of therapeutic drug monitoring for antidementia drugs cannot yet be recommended with the available data, but it may be beneficial for some patients in special clinical cases such as insufficient treatment response, side effects or drug interactions. Donepezil and galantamine are extensively metabolized by the liver enzymes cytochromes P450 (CYP) 2D6 and 3A and are substrates of the drug transporter P-glycoprotein. The relationship of variations in genes affecting the activity of these metabolic enzymes and drug transporter (CYP2D6, CYP3A, POR, NR1I2, ABCB1) with donepezil and galantamine plasma levels was investigated. The CYP2D6 genotype appeared to be the major genetic factor involved in the pharmacokinetics of these two drugs. Thus, CYP2D6 poor metabolizers demonstrated significantly higher drug plasma levels than extensive metabolizers. Additionally, in the donepezil study population, the frequency of side effects was significantly increased in poor metabolizers. Lower donepezil plasma levels were observed in ultra rapid metabolizers, which might expose those patients to the risk of non-response. Memantine is mainly eliminated unchanged by the kidney, with implication of tubular secretion by renal transporters. A population pharmacokinetic model was developed to quantify the effects of clinical factors and genetic variations in renal cation transporters (SLC22A1/2/5, SLC47A1, ABCB1), and nuclear receptors (NR1I2, NR1I3, PPARG) involved in transporter expression, on memantine plasma levels. In addition to the renal function and gender, a genetic variation in the nuclear receptor Pregnane-X-Receptor (NR1I2) significantly affected memantine elimination. These findings suggest that an individualized therapy approach for antidementia drugs, taking into account clinical characteristics and genetic background of a patient, might increase efficacy and safety of the treatment. - Les différences interindividuelles dans l'efficacité et la tolérance des médicaments sont un problème connu en pharmacothérapie. Les raisons sont multiples, et le choix du médicament et de la dose, basé sur des facteurs cliniques et génétiques spécifiques au patient, peut contribuer à améliorer la réponse clinique. Quatre médicaments sont couramment utilisés dans le traitement de la maladie d'Alzheimer : trois inhibiteurs de l'acétylcholinestérase (donépézil, galantamine, rivastigmine) et un antagoniste du récepteur N-méthyl-D-aspartate, la mémantine. Une forte variabilité interindividuelle dans les taux plasmatiques de ces quatre composés a été observée, ce qui pourrait influencer la réponse au traitement. L'objectif principal de ce travail de thèse est de mieux comprendre les facteurs cliniques et génétiques influençant les taux des médicaments pro-cognitifs. En outre, des associations entre les taux, la variabilité génétique et les effets secondaires ont été recherchées. Dans ce but, 300 patients sous traitement avec un médicament pro-cognitif ont été recrutés pour une étude pharmacogénétique. Des méthodes de dosage simultané de médicaments pro-cognitifs par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ont été développées et validées. Ces méthodes sont actuellement utilisées dans le service de suivi thérapeutique de notre unité. Malgré le fait qu'un suivi des taux sanguins des pro-cognitifs ne puisse pas encore être recommandé en routine, un dosage peut être utile dans des cas cliniques spécifiques, comme une réponse insuffisante, une intolérance ou une interaction médicamenteuse. Le donépézil et la galantamine sont fortement métabolisés par les cytochromes P450 (CYP) 2D6 et 3A, et sont également substrats du transporteur P-glycoprotéine. Les associations entre les polymorphismes génétiques de ces enzymes, cofacteur, récepteur nucléaire et transporteur (CYP2D6, CYP3A, POR, NR1I2, ABCB1) et les taux de donépézil et de galantamine ont été étudiées. Le génotype du CYP2D6 a été montré comme le facteur génétique majeur impliqué dans la pharmacocinétique de ces deux médicaments. Ainsi, les métaboliseurs déficients du CYP2D6 ont démontré des taux plasmatiques significativement plus élevés comparé aux bons métaboliseurs. De plus, dans la population traitée avec le donépézil, la fréquence des effets secondaires était plus élevée chez les métaboliseurs déficients. Des taux plasmatiques bas ont été mesurés chez les métaboliseurs ultra-rapides traités avec le donépézil, ce qui pourrait être un facteur de risque à une non-réponse au traitement. La mémantine est principalement éliminée sous forme inchangée par les reins, et partiellement par sécrétion tubulaire grâce à des transporteurs rénaux. Un modèle de cinétique de population a été développé pour quantifier les effets des différents facteurs cliniques et de la variabilité génétique des transporteurs rénaux (SLC22A1/2/5, SLC47A1, ABCB1) et des récepteurs nucléaires (NR1I2, NR1I3, PPARG, impliqués dans l'expression des transporteurs) sur les taux plasmatiques de mémantine. En plus de la fonction rénale et du genre, une variation génétique dans le récepteur nucléaire Pregnane-X-Receptor (NR1I2) a montré une influence significative sur l'élimination de la mémantine. Ces résultats suggèrent qu'une approche thérapeutique individualisée, prenant en compte des facteurs cliniques et génétiques du patient, pourrait améliorer l'efficacité et la sécurité du traitement pro-cognitif.