Effet de Streptococcus Suis sur la capacité de présentation antigénique de cellules dendritiques

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et humain, causant méningites et septicémies. Des études suggèrent que S. suis dispose de facteurs de virulence, notamment sa capsule polysaccharidique (CPS), qui lui permettent de moduler les fonctions des cellules dendritiques (DCs), situées à l’interface entre l’immunité innée et adaptative. Les difficultés à développer un vaccin efficace suggèrent aussi une altération de la voie T dépendante. L’objectif général du projet était d’évaluer l’effet de S. suis sur l’activation des cellules T CD4+ ainsi que sur la capacité de présentation antigénique des DCs. Nous avons étudié dans un modèle murin in vivo la réponse T CD4+ mémoire lors d’infections primaire et secondaire. Une faible réponse mémoire centrale a été obtenue, suggérant que la réponse adaptative générée contre S. suis est limitée. Étant donné l’importance du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) de classe II dans la présentation antigénique, nous avons évalué in vitro et in vivo l’expression de ces molécules chez les DCs. Une modulation de l’expression du MHC-II par S. suis a été observée. L’analyse de la transcription de gènes impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du MHC-II nous permet de suggérer que S. suis régule à la baisse la synthèse de nouvelles molécules et favorise leur dégradation lysosomale. Cette stratégie, dans laquelle la CPS ne jouerait qu’un rôle partiel, permettrait à S. suis d’échapper à la réponse adaptative T dépendante. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles perspectives dans la compréhension de la réponse adaptative lors de l’infection par S. suis.

Étude des voies de signalisation activées par la prostaglandine F2α dans les cellules de cancer colorectal

Le cancer colorectal représente la troisième forme de cancer la plus fréquente au Canada. Malgré les récents développements, aucun traitement curatif n’est disponible pour les patients diagnostiqués à un stade avancé de la maladie. Plusieurs évidences supportent un rôle important des prostaglandines dans cette maladie. En effet, une surexpression des récepteurs de type EP et FP est remarquée. Ces derniers ainsi que les molécules de signalisations intracellulaires qu’ils activent représentent donc de nouvelles cibles pour traiter ce cancer. Nous et d’autres groupes avons démontré que les protéines G monomériques sont des petits interrupteurs moléculaires importants dans la signalisation intracellulaire engagée par les récepteurs dans des cellules saines mais qu’un dérèglement de celles-ci est associé au cancer. L’objectif principal de ce projet de recherche vise donc à identifier les voies de signalisations par lesquelles le récepteur FP contribue aux capacités invasives des cellules tumorales d’origine colorectale. Notre hypothèse est que la protéine ARF6, une des 6 isoformes des ARFs, et la protéine RhoA, agissent pour coordonner l’activation des voies de signalisations associées à la migration et l’invasion cellulaire. Nos résultats ont indiqué que la stimulation des cellules HEK293 exprimant de façon stable le récepteur FP (HA-FP) ainsi que les cellules SW480, une lignée invasive de cancer colorectal, par le PGF2α augmentait les niveaux d’activation d’ARF6 mais également de la protéine RhoA. De plus, d’autres médiateurs et intermédiaires associés à la réorganisation du cytosquelette comme la cofiline et la chaine légère de la myosine (MLC) ont été hautement phosphorylés suite à la stimulation par la prostaglandine. Ces observations sont associées avec une augmentation des fibres de stress dans les cellules. Nous avons tenté de déterminer si l’inhibition de ces protéines G affectait la capacité du PGF2α à activer ces intermédiaires de signalisation ainsi que certains effets biologiques. Ainsi, nos expériences contribueront à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles pour le traitement du cancer colorectal.

Understanding the role of CAP proteins in the polarization process of C. elegans

La division cellulaire asymétrique est un processus crucial dans le développement des organismes multicellulaires puisqu’elle permet la génération de la diversité cellulaire. Les cellules qui se divisent de façon asymétrique doivent tout d’abord se polariser et correctement orienter leur fuseau mitotique pour ségréger des déterminants cellulaires en deux entités distinctes. L’embryon du nématode C. elegans est un modèle robuste et largement utilisé pour étudier la division cellulaire asymétrique. Dans cet embryon, le point d'entrée du spermatozoïde détermine l'axe de polarité antéro-postérieur. Suite à la fécondation, le cortex embryonnaire est uniformément contractile et un complexe conservé formé des protéines PAR-3, PAR-6 et PKC-3 (nommé complexe PAR-3 ci-dessous) est localisé sur l'ensemble du cortex. La complétion de la méiose maternelle induit une relaxation corticale au postétieur et un flux cortical vers l’antérieur de l’embryon. Ces contractions corticales asymétriques mènent à la formation d'un domaine antérieur contenant le complexe PAR-3, tandis que le cortex postérieur, dont le complexe PAR-3 s’est délocalisé, est enrichi avec les protéines PAR-2 et PAR-1. Par conséquent, les domaines formés par les protéines PAR définissent un pôle antérieur et un pôle postérieur dans l'embryon suite au remodelage du cytosquelette. Les protéines PAR-4 et PAR-5 restent localisées de façon uniforme dans l'embryon. Curieusement, les protéines PAR exercent une régulation par rétroaction sur la contractilité corticale. Il a été montré qu’une des protéines PAR récemment identifiée, PAR-5, est orthologue à la protéine adaptatrice 14-3-3 et joue un rôle important dans la contractilité corticale. En dépit de son rôle central dans la contractilité corticale et le processus de polarisation cellulaire, le mécanisme par lequel PAR-5 régule la contractilité corticale n’est pas bien compris. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment PAR-5 et ses interacteurs contrôlent la régulation des contractions corticales et, de ce fait, la polarité cellulaire. Dans un essai de capture de la protéine GST (GST pull-down), nous avons identifié plusieurs nouveaux interacteurs de PAR-5. Parmi ceux-ci, nous avons trouvé CAP-2 (protéine de coiffage de l'actine), qui a été identifiée dans des éxpériences de capture de 14-3-3 dans trois systèmes modèles différents. CAP-2 est un hétérodimère des protéines CAP, qui sont impliquées dans la régulation de l'actine. Nous avons trouvé que la déplétion des protéines CAP par interférence à l’ARN dans des vers de type sauvage mène à une augmentation létalité embryonnaire, ce qui suggère que ces protéines jouent un rôle important dans le développement embryonnaire. L'imagerie en temps réel d'embryons déplétés pour les protéines CAP montre qu’ils ont une diminution des contractions corticales avec un sillon de pseudoclivage mois stable, suggérant un défaut dans la régulation du cytosquelette d'actine-myosine. Ceci a également été confirmé par la diminution de la vitesse et du nombre de foci de NMY-2::GFP. En outre, ces embryons montrent une légère diminution de la taille du croissant cortical de PAR-2 lors de la phase d’établissement de la polarité. Les embryons déplétés en CAP-2 montrent également un retard dans la progression du cycle cellulaire, mais le lien entre ce phénotype et la régulation des contractions corticales reste à être précisé. La caractérisation des protéines CAP, des régulateurs du remodelage du cytosquelette, permettra d'améliorer notre compréhension des mécanismes qui sous-tendent l'établissement et le maintien de la polarité cellulaire, et donc la division cellulaire asymétrique.

Caractérisation des structures de septines hautement organisées chez la drosophile et leur interaction avec le cytosquelette d’actine

Les septines sont des GTPases conservées dérégulées dans le cancer et les maladies neurodégénératives. Elles servent de protéines d’échafaudage et forment une barrière de diffusion à la membrane plasmique et au corps central lors de la cytokinèse. Elles interagissent avec l’actine et s’organisent en complexes qui polymérisent et forment des structures hautement organisées (anneaux et filaments). Leur dynamique d’assemblage et leur rôle dans la cellule restent à être élucidés. La Drosophile est un modèle simple pour l’étude des septines puisqu’on n’y retrouve que 5 gènes (sep1, sep2, sep4, sep5, peanut) comparativement aux 13 gènes chez l’humain. À l’aide d’un anticorps contre Pnut, nous avons identifié des structures tubulaires dans 30% des cellules S2 de Drosophile. Mon projet a comme but de caractériser ces tubes en élucidant leurs constituants, leur comportement et leurs propriétés pour mieux clarifier le mécanisme par lequel les septines forment des structures hautement organisées et interagissent avec le cytosquelette d’actine. Par immunofluorescence, j’ai pu démontrer que ces tubes sont cytoplasmiques, en mitose ou interphase, ce qui suggère qu’ils ne sont pas régulés par le cycle cellulaire. Pour investiguer la composition et les propriétés dynamiques de ces tubes, j’ai généré une lignée cellulaire exprimant Sep2-GFP qui se localise aux tubes et des ARNi contre les cinq septines. Trois septines sont importantes pour la formation de ces tubes et anneaux notamment Sep1, Sep2 et Pnut. La déplétion de Sep1 cause la dispersion du signal GFP en flocons, tandis que la déplétion de Sep2 ou de Pnut mène à la dispersion du signal GFP uniformément dans la cellule. Des expériences de FRAP sur la lignée Sep2-GFP révèlent un signal de retour très lent, ce qui indique que ces structures sont très stables. J’ai aussi démontré une relation entre l’actine et les septines. Le traitement avec la Latrunculin A (un inhibiteur de la polymérisation de l’actine) ou la Jasplakinolide (un stabilisateur des filaments d’actine) mène à la dépolymérisation rapide (< 30 min) des tubes en anneaux flottants dans le cytoplasme, même si ces tubes ne sont pas reconnus suite à un marquage de la F-actine. L’Actin05C-mCherry se localise aux tubes, tandis que le mutant déficient de la polymérisation, Actin05C-R62D-mCherry perd cette localisation. On observe aussi que la déplétion de la Cofiline et de l’AIP1 (ce qui déstabilise l’actine) mène au même phénotype que le traitement avec la Latrunculine A ou la Jasplakinolide. Alors on peut conclure qu’un cytosquelette d’actine dynamique est nécessaire pour la formation et le maintien des tubes de septines. Les futures études auront comme but de mieux comprendre l’organisation des septines en structures hautement organisées et leur relation avec l’actine. Ceci sera utile pour l’élaboration du réseau d’interactions des septines qui pourra servir à expliquer leur dérégulation dans le cancer et les maladies neurodégénératives.

The human organic cation transporter OCT1 mediates high affinity uptake of the anticancer drug daunorubicin

Les anthracyclines tels que la doxorubicin et la daunorubicin sont une famille de médicaments anticancéreux hydrophiles qui doivent être transportés dans les cellules afin d’exercer leur action par intercalation à l’ADN dans le noyau cellulaire. Ceci mène à la perturbation du métabolisme de l’ADN et entraine la mort cellulaire. Les anthracyclines sont utilisés pour le traitement d’une variété de cancers incluant la leucémie, les lymphomes, le cancer du sein, le cancer des poumons et le cancer des ovaires. Étant donné que le transport actif des anthracyclines dans les cellules a partiellement été démontré, le transporteur spécifique impliqué dans ce processus n’est pas encore connu. En utilisant un modèle de cancer des ovaires, la lignée cellulaire TOV2223G, nous avons démontré que des substrats spécifiques au transporteur de cations organiques 1 (OCT1), notamment la ergothionéine, la thiamine et la phenformin, ont partiellement inhibé l’absorption de la daunorubicin en différence de la carnitine qui est un substrat de haute affinité des transporteurs CT2 et OCTN2. Ces résultats suggèrent que les transporteurs organiques spécifiques au transport de la carnitine ne sont pas impliqués dans le transport des anthracyclines. Ainsi, nos résultats ont démontré que l’absorption de la daunorubicin est orchestrée par le transporteur OCT1 dans les cellules TOV2223G (Km ~ 5 μM) et des concentrations micromolaires de choline ont complètement abolies l’absorption de la drogue. De plus, un ARN sh dirigé contre OCT1 a réprimé son expression protéique, ce qui a été confirmé par la technique d’immuno-buvardage en utilisant un anti-OCT1 anticorps. Les cellules déficientes en OCT1 n’ont pas été capables d’absorber la daunorubicin et ont été plus résistantes à l’action de la drogue par rapport aux cellules contrôle. La transfection des cellules HEK293T avec un plasmide construit de façon à faire exprimer OCT1 comme protéine de fusion avec la protéine fluorescente EYFP a montré que celle-ci est localisée dans la membrane plasmique. Les cellules transfectées ont été capables d’absorber cinq fois plus de daunorubicin comparé aux cellules contrôles. Cette étude est, selon nous, la première à démontrer que OCT1 est un transporteur de haute affinité des anthracyclines. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que des défauts de OCT1 peuvent contribuer à l’efficacité de la réponse des cellules cancéreuses à la chimiothérapie avec les anthracyclines.

Caractérisation de l’activité transcriptionnelle antivirale et immunorégulatrice dépendante de STAT2 et IRF9, mais indépendante de STAT1, induite par la costimulation par TNF

Les cellules épithéliales pulmonaires constituent la première ligne de défense face aux virus respiratoires via la sécrétion de mucus, de peptides, de cytokines et chimiokines qui déterminent l'élimination ou la progression de l’infection. Les principales cytokines antivirales produites par les cellules épithéliales alvéolaires (AEC) sont les interférons (IFN) type I (α/β) et III (λ). La liaison d’IFNβ à son récepteur induit une voie antivirale bien caractérisée qui aboutit à l’activation du complexe ISGF3 (STAT1, STAT2 et IRF9) qui permet la transcription de multiples gènes codant pour des protéines à activité antivirale et immunorégulatrice. Il a récemment été démontré que la costimulation des cellules épithéliales pulmonaires par l’IFNβ et le Tumor Necrosis Factor α (TNFα), également produit lors d’une infection, synergisent pour induire un état antiviral tardif distinct. D’autre part, il a été montré que la synergie entre le TNFα et l'IFNβ induit une voie de signalisation impliquant STAT2 et IRF9, mais indépendante de STAT1 permettant l’expression du gène DUOX2. Notre but est de déterminer l’importance de cette nouvelle voie de signalisation induite par la costimulation du TNFα+IFNβ, impliquant STAT2 et IRF9 indépendamment de STAT1 dans la régulation d’un programme transcriptionnel antiviral et immunorégulateur tardif. Notre premier objectif est de déterminer si des gènes antiviraux et immunorégulateurs qui sont induits par la costimulation par TNFα+IFNβ sont dépendants de la voie STAT2/IRF9, indépendamment de STAT1. En utilisant la technique de qRT-PCR, nous avons identifié 3 gènes immunorégulateurs, CXCL10, IDO et APOBEC3G, induits de manière synergique en réponse à TNFα+IFNβ dans les cellules A549, un modèle de cellules épithéliales pulmonaires. Afin de confirmer que ces gènes sont induits indépendamment de STAT1, nous avons validé leur expression dans la lignée cellulaire U3A déficiente en STAT1. Par l'utilisation d'ARN interférants (ARNi) dirigés contre STAT2 et IRF9, nous avons confirmé que l’induction de ces gènes est dépendante de STAT2 et IRF9. Finalement, l’analyse de l’activité du promoteur de CXCL10 en réponse à TNFα+IFNβ par des essais rapporteurs luciférases a permis de montrer que la régulation se fait au niveau transcriptionnel. Notre deuxième objectif, est de déterminer si STAT6 pourrait remplacer STAT1 dans la voie de signalisation induite par TNFα+IFNβ. En effet, STAT6 est un inducteur connu de l’expression de DUOX2 en réponse à IL4+IL13. Contrairement à notre hypothèse, l’inhibition de STAT6 par ARNi augmente l’expression de DUOX2 en réponse à TNFα+IFNβ suggérant que STAT6 est un régulateur négatif. Nos résultats ont permis de comprendre de manière plus détaillée les mécanismes mis en place dans le développement d’une réponse antivirale. D’autre part, l’étude de l’effet de l’IFNβ et du TNFα est également pertinente pour les maladies chroniques inflammatoires et autoimmunes. De plus, nos résultats illustrent un nouveau paradigme concernant les mécanismes de signalisation cellulaire impliqués dans la synergie entre deux cytokines qui pourrait être applicable à des combinaisons de cytokines autres que TNFα+IFNβ.

Fonctionnalité in vivo d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de cellules endothéliales cornéennes dans la chambre antérieure d’un modèle félin

Introduction : Malgré leur état non-prolifératif in vivo, les cellules endothéliales cornéennes (CEC) peuvent être amplifiées in vitro. Leur transplantation subséquente par injection intracamérale pourrait surmonter la pénurie de tissus associée à l’allo-greffe traditionnelle – l’unique traitement définitif disponible pour les endothéliopathies cornéennes. Objectif : Évaluer la fonctionnalité d’un endothélium cornéen reconstitué par injection de CEC dans la chambre antérieure du félin. Méthodes : Les yeux droits de 16 animaux ont été opérés. Huit ont été désendothélialisés centralement avec injection de 2x10e5 (n=4) ou 1x10e6 (n=4) CEC félines supplémentées avec Y-27632 et marquées avec SP-DiOC18(3). Deux ont été désendothélialisés complètement et injectés avec 1x10e6 CEC et Y-27632. Six contrôles ont été désendothélialisés centralement (n=3) ou complètement (n=3) et injectés avec Y-27632 sans CEC. La performance clinique, l’intégrité anatomique, le phénotype fonctionnel et l’expression de SP-DiOC18(3) du nouvel endothélium ont été étudiés. Résultats : Les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement ont réussi le mieux cliniquement. Les contrôles désendothélialisés complètement sont restés opaques. L’histopathologie a révélé une monocouche endothéliale fonctionnelle dans les cornées greffées avec 2x10e5 CEC et les contrôles désendothélialisés centralement, une multicouche endothéliale non-fonctionnelle dans les cornées désendothélialisées centralement et greffées avec 1x10e6 CEC, et un endothélium fibrotique non-fonctionnel dans les cornées désendothélialisées complètement. L’expression de SP-DiOC18(3) était rare dans les greffes. Conclusion : La thérapie par injection cellulaire a reconstitué un endothélium partiellement fonctionnel, auquel les CEC injectées n’ont contribué que peu. L’injection de Y-27632 sans CEC a reconstitué l’endothélium le plus sain. Des études additionnelles investiguant l’effet thérapeutique de Y-27632 seul sont justifiées.

Proscillaridin A effects on histone acetylation and C-MYC degradation in acute lymphoblastic leukemia

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) représente environ 25% des cancers pédiatriques diagnostiqués chaque année. Dans 80 % des cas, une rémission complète est observée. Cependant, les patients résistants aux traitements ainsi que les patients en rechute présentent un mauvais pronostique. Les altérations épigénétiques sont des facteurs essentiels dans le développement et la progression de la maladie, ainsi qu’à la résistance aux traitements. Lors d’un criblage de médicaments approuvés par la FDA, nous avons découvert des molécules ayant des caractéristiques anticancéreux et épigénétiques. Pour évaluer l’activité de ces molécules, nous avons procédé à un criblage secondaire sur plusieurs lignées cellulaires leucémiques. Nous avons découvert qu’une de ces molécules, un glucoside cardiotonique appelé la proscillaridine A, avait une activité anticancéreuse spécifique pour des cellules leucémiques. Nous faisons donc l’hypothèse que la proscillaridine A pourrait avoir des effets épigénétiques et anticancéreux dans des modèles précliniques de LLA. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité deux lignées cellulaires de LLA Nalm-6 (LLA pre-B) et Molt-4 (T-LLA) in vitro pendant 2 à 96 heures à des doses pertinentes sur le plan clinique. Nous avons alors pu observer une inhibition de croissance qui était dépendante de la dose administrée dans les deux lignées cellulaires, avec des valeurs de 50% d’inhibition de croissance (CI50) de 3.0 nM pour les Nalm-6 et de et 2.3 nM pour les Molt-4. De plus, nos études sur le cycle cellulaire par BrdU démontrent un arrêt en phase G2/M. Nous avons également détecté par immunobuvardage de type western des baisses significatives de l’acétylation de résidus de l’histone 3. Les niveaux d’expression des enzymes responsables de cette acétylation, les histones acétyltransférases CBP, P300 et TIP60 ainsi que de l’oncogène C-MYC étaient également diminuées. Par des analyses de séquençage de l’ARN, nous avons observé une augmentation de l’expression des gènes impliquées dans les processus d’apoptose et de différentiation cellulaire, ainsi qu’une diminution des gènes impliqués dans la prolifération cellulaire comme en particulier les gènes cibles de C-MYC. Ces résultats prometteurs suggèrent le potentiel prometteur de la proscillaridine A comme nouvelle thérapie pour les patients atteints de LLA.

Étude du rôle de la membrane basale spécialisée dans la maturation de l'émail

Les cellules épithéliales qui produisent l’émail, les améloblastes, sont séparées de l'émail au niveau de la zone de maturation par une membrane basale spécialisée (MBS) enrichie en laminine 332 (LM-332). Cette protéine hétérotrimérique (composée des chaînes α3, ß3 et γ2) assure l'intégrité structurelle des membranes basales (MB) et influence divers processus cellulaires épithéliaux tels que l'adhésion et la différenciation cellulaire. Des modèles de souris « knockout » (KO), où les gènes codant pour LM-332 ont été supprimés, meurent peu après la naissance. Néanmoins, ce phénotype létal peut être contourné en substituant chez la souris le gène produisant la chaîne γ2 de la laminine (LAMC2) par sa forme humaine, sous le contrôle de l’expression du promoteur-rtTA, de la cytokératine 14, inductible par la prise de doxycycline (Dox) - (Tet-on). Le but de ce projet est d’examiner si l’utilisation de cette protéine humaine chez la souris a un effet sur la structuration de la MBS ainsi que sur la maturation de l'émail. La phase de maturation de l’organe de l’émail chez la souris transgénique a été sévèrement altérée par rapport à une souris normale (WT). La MBS n’est plus visible, une matrice dystrophique s’est formée dans la couche d'émail dans la phase de maturation, et la présence d’une matrice résiduelle de l'émail est observée durant la phase tardive de maturation. Des micro-analyses tomographiques ont révélé une usure excessive des surfaces occlusales des molaires, un écroulement de l'émail sur les pointes des incisives et une hypominéralisation de l'émail. Cependant, aucune altération structurale due à cette recombinaison transgénique n’a été observée dans d'autres sites épithéliaux, tels que la peau, le palais et la langue. Ces résultats indiquent que, bien que ce modèle de souris humanisée soit capable de rétablir ses fonctions dans divers tissus épithéliaux, il est incapable de soutenir la structuration d'une MBS à l'interface entre les améloblastes et l’émail en maturation. Cet échec peut être lié à la composition spécifique de la MBS dans la phase de maturation et supporte l’hypothèse que la MBS est essentielle pour la maturation adéquate de l'émail.

Rôle de la qualité des tapis de cellules endométriales en co-culture autologue sur le développement embryonnaire

Introduction : La fécondation in vitro est de mieux en mieux connue et en amélioration constante, cependant les taux d’implantation et de grossesse sont encore bas (environ 35% par fécondation in vitro). Un des enjeux de l’amélioration de la fécondation in vitro est le développement embryonnaire et l’implantation. Pour cela, la co-culture des embryons sur un tapis de cellules endométriales maternelles autologues peut être utilisée pour améliorer le développement embryonnaire (taux d’embryon se développant jusqu’à J5 : blastocyste) et l’implantation. L’objectif de l’étude est d’étudier le lien entre la qualité du tapis cellulaire et le développement embryonnaire. Matériel et méthodes : Cette étude est une sous analyse de l’essai clinique randomisé en double aveugle OvoGen, comparant le taux de blastulation et de grossesse dans deux groupes randomisés : le groupe étude, dans lequel les embryons se développent sur un tapis cellulaire endométrial maternel et le groupe contrôle, dans lequel les embryons sont cultivés dans du milieu conventionnel. Nous avons analysé la qualité des tapis cellulaire du groupe étude (confluence des cellules, taux de cellules épithéliales et vitalité des cellules stromales) par rapport au développement embryonnaire et au taux de grossesse. Résultats : 50 tapis de cellules endométriales maternelles et 291 embryons sur les puits ont été analysés de 2012 à 2015 à la clinique ovo (Montréal, Québec). La qualité des embryons n’était pas changée par la qualité des tapis (p=0,65 pour la confluence, p=0,25 pour le taux de glande et p=0,92 pour la viabilité des cellules). En revanche, le taux de grossesse augmentait quand la confluence diminuait (p=0,022) et lorsque la viabilité des cellules stromales augmentait (p=0,001). De plus, la qualité des tapis était dépendante de la date de la biopsie : la biopsie faite à J7 après l’ovulation permettait une meilleure qualité de puits (confluence augmentée, p=0,045, taux de glande augmenté p=0,004 et viabilité stromales augmentée p=0,001) que la biopsie faite à J5 post ovulation. Discussion : Aucune des nombreuses études sur la co-culture ne porte sur la qualité des tapis cellulaire. Il est intéressant de noter que le taux de grossesse augmente avec la diminution de la confluence et l’augmentation de la viabilité des cellules stromales dans les puits contenant les embryons transférés. Comme il a déjà été démontré, (1)le jour de la biopsie endométriale influe sur la qualité du tapis cellulaire en coculture et pour que celui-ci soit de bonne qualité, il faut que l’endomètre soit réceptif (après J19 du cycle). Conclusion : Nous avons montré que la qualité des tapis cellulaires dépendait du jour de la biopsie d’endomètre et que cette qualité pouvait influencer le bénéfice de la co-culture. Il serait intéressant d’étudier la réceptivité de l’endomètre au moment de la biopsie avant utilisation des cellules en co-culture pour optimiser la qualité du tapis cellulaire.

Études de la réponse du métabolisme énergétique à la carence en fer dans les cultures cellulaires de Solanum tuberosum

Le fer est un micronutriment important pour la croissance et le développement des plantes. Il agit comme cofacteur pour plusieurs enzymes et il est important pour des processus tels que la photosynthèse et la respiration. Souvent, le Fe dans le sol n’est pas bio-disponible pour la plante. Les plantes ont développé des stratégies pour solubiliser le Fe du sol pour le rendre disponible et assimilable pour elles. Il y a deux stratégies, la première est caractéristique des dicotylédones et la seconde est caractéristique des monocotylédones. Le modèle utilisé dans cette étude est une culture cellulaire de Solanum tuberosum. Une partie de la recherche effectuée a permis la mesure d’activité et d’expression relative de certaines enzymes impliquées dans le métabolisme énergétique et la fourniture de précurseurs pour la synthèse d’ADN : la Nucléoside diphosphate kinase, la Ribonucléotide reductase, la Glucose 6-phosphate déshydrogénase et la 6-Phosphogluconate déshydrogénase dans les cellules en présence ou en absence de Fe. Chez certains organismes, la déficience en Fe est associée à une perte de croissance qui est souvent liée à une diminution de la synthèse d’ADN. Chez les cultures de cellules de S. tuberosum, les résultats indiquent que la différence de biomasse observée entre les traitements n’est pas due à une variation de l’activité ou l’expression relative d’une de ces enzymes. En effet, aucune variation significative n’a été détectée entre les traitements (+/- Fe) pour l’activité ni l’expression relative de ces enzymes. Une autre partie de la recherche a permis d’évaluer l’activité des voies métaboliques impliquées dans la stratégie 1 utilisée par S. tuberosum. Cette stratégie consomme des métabolites énergétiques: de l’ATP pour solubiliser le Fe et du pouvoir réducteur (NAD(P)H), pour réduire le Fe3+ en Fe2+. Des études de flux métaboliques ont été faites afin d’étudier les remaniements du métabolisme carboné en déficience en Fe chez S. tuberosum. Ces études ont démontré une baisse du régime dans les différentes voies du métabolisme énergétique dans les cellules déficientes en Fe, notamment dans le flux glycolytique et le flux de C à travers la phosphoenolpyruvate carboxylase. En déficience de Fe il y aurait donc une dépression du métabolisme chez S. tuberosum qui permettrait à la cellule de ralentir son métabolisme pour maintenir sa vitalité. En plus des flux, les niveaux de pyridines nucléotides ont été mesurés puisque ceux-ci servent à réduire le Fe dans la stratégie 1. Les résultats démontrent des niveaux élevés des formes réduites de ces métabolites en déficience de Fe. L’ensemble des résultats obtenus indiquent qu’en déficience de Fe, il y a une baisse du métabolisme permettant à la cellule de s’adapter et survivre au stress.

Régulation de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires par l’activation in vivo du récepteur natriurétique de type C

Le remodelage vasculaire dû à l’hyper-prolifération cellulaire des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) observé chez les rats spontanément hypertendus (RSH) est associé à l’hypertension artérielle. Nous avons précédemment démontré que le traitement in vivo des RSH par l’agoniste spécifique du récepteur du peptide natriurétique de type C (NPR-C), le C-ANP4-23 atténue l’hyper-prolifération des CMLVs. Nous avons entrepris cette étude afin d’investiguer si l’effet antiprolifératif du C-ANP4-23 agit par l’entremise de l’inhibition de la surexpression des protéines du cycle cellulaire, et afin d’en explorer les mécanismes sous-jacents. Pour cette étude, des RSH et des rats Wistar Kyoto (WKYs) âgés de deux semaines ont été injectés en intra-péritonéale par le C-ANP4-23 de 2 jusqu’à 8 semaines d’âge, deux fois par semaine et sacrifiés à la 9ème semaine. La pression artérielle a été mesurée par méthode Queue-coiffe, la prolifération des CMLVs a été déterminée par incorporation de thymidine et par test MTT, et l’expression des protéines a été quant à elle déterminée par technique d’immunobuvardage de type Western. Les CMLVs des RSH ont démontré une prolifération élevée en comparaison avec celles des WKYs, et le traitement par le C-ANP4-23 a atténué l’hyperprolifération à un niveau de contrôle. De plus, la surexpression des cyclines D1/A/E, des kinases cyclines dépendantes 2 et 4 (cdk2, cdk4), de la forme phosphorylée de la protéine du rétinoblastome et des protéines Gαi des CMLV des RSH a été atténuée à un niveau de contrôle. Par ailleurs, l’hyperphosphorylation d’ERK1/2, AKT, EGF-R, PDGF-R, IGF-R et de c-Src a significativement diminué par le traitement au C-ANP4-23. En outre, le niveau élevé de l’anion superoxyde (O2-), l’activité de la NADP(H) oxydase et de ses sous unités chez les RSH ont été atténués par le C-ANP4-23 .Ces résultats indiquent que l’activation in vivo de NPR-C atténue la surexpression des protéines du cycle cellulaire via l’inhibition de l’activité élevée du stress oxydatif, de c-Src et de l’activation de EGF-R, PDGF- R, IGF-R, de la signalisation de MAPK et la surexpression des protéines Gαi résultant ainsi en l’inhibition de l’hyperprolifération des CMLVs des RSH. Ainsi, il peut être suggéré que le C-ANP4-23 pourrait être utilisé comme agent thérapeutique pour le traitement des complications vasculaires associées à l’hypertension et à l’athérosclérose.

Role of 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Type 5 in Breast Cancer Studied by Intracrinology

Dans cette thèse, je présente une étude (1) du rôle de la 17β-HSD5 dans la modulation des taux d’hormones et dans la prolifération, et l’impact de l’expression de la 17β-HSD5 sur d’autres protéines de BC cellules; (2) une étude comparative sur trois enzymes (17β-HSD1, 17β-HSD7 et 3α-HSD3) avec la provision de DHEA et ses substrats directes soit l’E1 ou la DHT. Les principaux résultats obtenus dans cette étude sont les suivants: (1) en utilisant l’ARN d’interférence de la 17β-HSD5, des immunodosages enzymatiques et des tests de prolifération de cellules démontrent que l’expression de la 17β-HSD5 est positivement corrélée à un niveau de T et de DHT dans les BCC, mais négativement corrélée pour l’E2 et la prolifération des cellules de BC (2) les analyses quantitatives de PCR en temps réel et de Western blot ont démontré que l’inhibition de l’expression de la 17β-HSD5 régule à la hausse l’expression de l’aromatase dans les cellules MCF-7. (3) L’analyse d’ELISA de la prostaglandine E2 a vérifié que l’expression accrue de l’aromatase a été modulée par des niveaux élevés de PGE2 après l’inactivation de l’expression du gène de la 17β-HSD5. (4) Le test de cicatrisation a montré que l’inactivation de l’expression du gène de la 17β-HSD5 favorise l’augmentation de la migration cellulaire. (5) L’expression du gène 17β-HSD5 dans des échantillons cliniques, à partir de l’analyse de base de données ONCOMINE, a montré que sa plus faible expression a été corrélée avec le statut de l’HER-2 et de la métastase de la tumeur. (6) Les données protéomiques révèlent également que des protéines impliquées dans les voies métaboliques sont fortement exprimées dans les cellules MCF-7 après l’inactivation de l’expression du gène de la 17β-HSD5. (7) L’étude n’a démontré aucune différence dans la fonction biologique de la 17β-HSD1 et de la 17β-HSD7 lorsqu’elles sont cultivées avec différentes stéroïdes: tel que les niveaux de stéroides, la prolifération cellulaire et les protéines régulées. (8) Toutefois, la supplémentation du milieu de culture se révèle avoir un impact marqué sur l’étude de la 3α-HSD3. (9). Nous avons proposé que l’utilisation de la DHEA comme source d’hormone puisse entraîner une meilleure imitation des conditions physiologiques post-ménopausales en culture cellulaire selon l’intracrinologie.

Le pore oméga, un défaut biophysique commun aux mutations des canaux Nav1.5 causant le développement des arythmies associées à la cardiomyopathie dilatée

Les canaux sodiques dépendants du voltage (Nav) sont des protéines transmembranaires largement exprimées au sein de l’organisme. Ils sont responsables de l’initiation des potentiels d’action au niveau des cellules excitables et régissent ainsi de nombreuses fonctions physiologiques telles que les fonctions cognitives et sensorielles, les fonctions motrices et la fonction cardiaque. Au niveau du coeur, le sous-type Nav1.5 est majoritairement exprimé à la surface des cardiomyocytes. Leurs dysfonctions sont traditionnellement associées à de nombreux troubles électriques cardiaques. Des mutations de ces canaux ont récemment été reliées au développement d’un phénotype clinique complexe associant diverses arythmies et la cardiomyopathie dilatée (DCM), une atteinte morphologique. L’objectif de mon doctorat a donc été l’identification mais aussi la caractérisation d’un potentiel défaut biophysique commun à l’ensemble des mutations Nav1.5 associées au développement de ce phénotype clinique atypique. Premièrement, nous nous sommes intéressés à deux mutations des canaux Nav1.5 retrouvées chez des patients atteints de DCM, et dont les altérations biophysiques ont été décrites comme divergentes. L’étude parallèle de ces deux mutants nous a amenés à identifier une caractéristique commune : la création d’une nouvelle voie de perméation alternative au sein des canaux Nav1.5, le pore oméga. Dans un second temps, nous avons souhaité consolider l’association entre la création du pore oméga et le développement pathologique. Cette seconde étude portant sur deux autres mutants Nav1.5 a permis de confirmer l’apparition d’un pore oméga et ainsi d’accroître la suspicion du caractère délétère de ce pore oméga. Finalement, à l’aide d’une cinquième mutation des canaux Nav1.5, nous avons investigué les conséquences physiopathologiques de la création d’un pore oméga. Cette étude, a clairement démontré les conséquences néfastes d’un tel pore au niveau de l’homéostasie ionique cellulaire. Ces perturbations se répercutent par la suite sur les signaux électriques, les propriétés morphologiques mais aussi fonctionnelles des cardiomyocytes. Les études menées lors de mon doctorat ont ainsi abouti à l’identification du pore oméga comme étant une caractéristique biophysique commune aux mutations des canaux Nav1.5 associées au développement des arythmies et de la dilatation cardiaque.

Caractérisation de différents mécanismes immunologiques conduisant au dommage glomérulaire chez le greffé rénal avec rejet humoral; les effets des anticorps anti-HLA sur l’expression endothéliale et les niveaux sériques de thrombomoduline chez les patients transplantés

La greffe rénale est le meilleur traitement de l’insuffisance rénale terminale. Par contre, la perte prématurée du greffon est un problème majeur chez les greffés qui est due majoritairement au rejet. La classification de Banff reconnait 2 catégories de rejets : une réaction médiée par les anticorps (ABMR) et/ou une réaction cellulaire (TCMR). L’ABMR est caractérisé par le développement de novo d’anticorps contre le donneur (DSA) en circulation et des dommages histologiques, comme la glomérulopathie du transplant. De novo, les DSA anti-HLA-II sont plus fréquemment associés à la glomérulopathie du transplant que les anti-HLA-I et sont associés à un moins bon pronostic clinique. Toutefois, le mécanisme par lequel les anti-HLA-II sont plus dommageables demeure mal connu. Mon hypothèse est que les anticorps anti-HLA sont suffisants pour perturber l’hémostase de l’endothélium glomérulaire. Plus particulièrement, nous croyons que les anticorps anti-HLA-II, diminuent l’expression de la thrombomoduline (TBM), ce qui pourrait mener aux lésions endothéliales glomérulaires associées à la glomérulopathie du transplant. Pour évaluer cette hypothèse, j’ai utilisé un modèle in vitro d’endothélium glomérulaire humain et du sérum de patients transplantés rénaux. Nous avons observé que l’expression membranaire de la TBM augmentait de manière dosedépendante en présence d‘anti-HLA-I, mais pas anti-HLA-II. Toutefois, lors de la mesure intracellulaire nous avons observé une accumulation cytosolique en réponse à une stimulation par les anti-HLA-II. De plus, nous avons observé une association significative entre la présence de DSA circulants anti-HLA-II dans les patients transplantés rénaux et un faible taux de TBM sérique. Ces résultats indiquent que la liaison des anticorps anti-HLA-I et II produit des effets différents sur l’expression endothéliale de la TBM. Les anticorps anti-HLA-II pourraient être associés à un état prothrombotique qui pourrait expliquer l’occurrence plus élevée de lésions microangiopathiques dans l’allogreffe et la moins bonne condition observée chez les patients ayant ces anticorps.