Analisi delle prestazioni di un codice di calcolo open-source per l'elaborazione dati GNSS in modalità cinematica finalizzata al monitoraggio di strutture e applicazione di filtri sequenziali

Il presente lavoro di tesi si pone come obbiettivo l’elaborazione di dati GNSS in modalità cinematica post-processing per il monitoraggio strutturale e, in una seconda fase, lo studio delle precisioni raggiungibili delle soluzioni ottenute utilizzando algoritmi di post-elaborazione del dato. L’oggetto di studio è la torre Garisenda, situata in piazza Ravegnana, accanto alla torre Asinelli, nel centro storico di Bologna, da tempo oggetto di studi e monitoraggi per via della sua inclinazione particolarmente critica. Per lo studio è stato utilizzato un data set di quindici giorni, dal 15/12/2013 al 29/12/2013 compresi. Per l’elaborazione dei dati è stato utilizzato un software open source realizzato da ricercatori del Politecnico di Milano, goGPS. Quest'ultimo, essendo un codice nuovo, è stato necessario testarlo al fine di poter ottenere dei risultati validi. Nella prima fase della tesi si è quindi affrontato l’aspetto della calibrazione dei parametri che forniscono le soluzioni più precise per le finalità di monitoraggio considerando le possibili scelte offerte dal codice goGPS. In particolare sono stati imposti dei movimenti calibrati e si è osservata la soluzione al variare dei parametri selezionati scegliendo poi quella migliore, ossia il miglior compromesso tra la capacità di individuare i movimenti e il rumore della serie. Nella seconda fase, allo scopo di poter migliorare le precisioni delle soluzioni si sono valutati metodi di correzione delle soluzioni basati sull'uso di filtri sequenziali e sono state condotte analisi sull'incremento di precisione derivante dall'applicazione di tali correzioni.

Emissione non termica in ammassi di galassie: analisi di radiosorgenti diffuse

Gli ammassi di galassie (galaxy clusters) sono aggregati di galassie legate dalla forza di attrazione gravitazionale. Essi sono le più grandi strutture virializzate dell’Universo e la loro luminosità è dovuta alle galassie che li compongono e al cosiddetto intracluster medium (ICM), gas intergalattico in grado di raggiungere temperature di milioni di gradi. L’ICM è caratterizzato da emissioni sia di tipo termico che non termico, rispettivamente nella banda X e nella banda Radio, dovute soprattutto al meccanismo di bremsstrahlung termica e all’emissione di sincrotrone. Lo studio delle radiazioni emesse da questo gas primordiale ha permesso di studiare alcuni processi caratteristici nella dinamica degli ammassi di galassie, come i fenomeni di merger e cooling flow , e di ottenere quindi una maggiore comprensione della formazione ed evoluzione degli ammassi. Essendo le più grandi strutture dell’Universo che abbiano raggiunto l’equilibrio viriale, il loro studio risulta infatti molto importante, in quanto fornisce un valido strumento per la formulazione di un Modello Cosmologico. Lo scopo di questo lavoro di tesi consiste in particolare nell'analisi di Aloni e Relitti radio, con maggiore approfondimento sui primi, e sulla ricerca di una correlazione della potenza Radio dei clusters sia con la loro luminosità nella banda X, che con la loro dimensione spaziale. La raccolta e l’elaborazione dei dati è stata svolta presso l’osservatorio di radioastronomia (ORA) situato nel CNR di Bologna.

Evidenze sperimentali di stati di spin-parità naturali in 26Mg: vincoli sulla sorgente di neutroni nelle giganti rosse

In questa tesi si è studiato uno dei principali processi nelle stelle responsabili della nucleosintesi degli elementi pesanti dopo il 56Fe, il processo-s. In particolare sono state illustrate le sorgenti di neutroni che alimentano questo processo e si è analizzata la reazione 22Ne (α,n) 25Mg. Per costruire un valido modello matematico di questo processo è necessario conoscere in maniera accurata il reaction rate di questa reazione. Conseguentemente è necessario conoscere la sezione d'urto di tale reazione in maniera molto accurata. Sono stati condotti diversi esperimenti nel tentativo di valutare la sezione d'urto per via diretta, facendo collidere un fascio di particelle α su un campione di 22Ne. Queste rilevazioni hanno dato esiti non soddisfacenti nell'intervallo di energie riguardanti il processo-s, in quanto, a causa di disturbi dovuti al fondo di raggi cosmici e alla barriera Coulombiana, non è stato possibile osservare risonanze per valori di energie delle particelle α minori di (832± 2) keV. Per colmare la mancanza di dati sperimentali si è deciso di studiare gli stati eccitati del nucleo composto 26Mg tramite la reazione inversa 25Mg+n alle facility n_TOF, situata al CERN, e GELINA al IRMM. Le misure effettuate hanno mostrato diverse risonanze al di sotto di (832±2) keV, compatibili con le spin-parità di 22Ne e α. In seguito è stato stimato il loro contributo al reaction rate e i risultati hanno mostrato che per temperature tipiche di stelle massive il contributo di queste risonanze è trascurabile ma risulta di grande rilevanza alle temperature tipiche delle stelle appartenenti al ramo asintotico delle giganti (AGB).

Analisi della composizione micropaleontologica di campioni di sedimento marino prelevati in Antartide

Nel presente lavoro di tesi è stata studiata dal punto di vista micropaleontologico una successione sedimentaria (carota C98) campionata nel Mare di Ross durante la campagna ANTA95 nell’ambito del progetto congiunto Korea -Italia Ross Slope, finanziato dal ProgrammaNazionale di Ricerca in Antartide (PNRA). L’indagine ha riguardato lo studio quantitativo delle associazioni a foraminiferi planctonici e bentonici con l’obiettivo di ricostruire gli scenari paleoambientali e paleoclimatici di quest’area durante il tardo Quaternario. In relazione alle associazioni di foraminiferi ed in base alla biostratigrafia a diatomee, l’intervallo studiato si è deposto durante lo stadio isotopico 5. La presenza di Neogloboquadrina pachyderma ad avvolgimento destrorso, associata ad un aumento delle forme bentoniche è stata messa in relazione con le fasi più calde dello stadio isotopico 5 in cui l’ambiente di mare aperto era caratterizzato da alta produttività primaria in superficie e presenza di materia organica sul fondale permettendo lo sviluppo dei foraminiferi bentonici sul fondale. Al contrario la presenza di intervalli con ridotto numero di specie e aumento della specie Miliammina arenacea è stata correlata con le fasi più fredde dello stadio isotopico 5, associate anche ad a un aumento della corrente fredda, salata HSSW che è una massa d’acqua e determina la corrosione dei carbonati. Il limite inferiore dello stadio isotopico 5 (passaggio stadio isotopico 6/ 5) è caratterizzato da un graduale aumento delle specie e del numero di individui con presenza di clasti centimetrici evidenziando un riscaldamento climatico e la presenza di icebergs. Il limite superiore dell’intervallo studiato (passaggio stadio isotopico 5/4) presenta una drastica riduzione di Foraminiferi bentonici probabilmente dovuta alla presenza di copertura glaciale.

A thermodynamic model for di-trioctahedral chlorite from experimental and natural data in the system MgO-FeO-Al2O3-SiO2-H2O. Applications to P-T sections and geothermometry

We present a new thermodynamic activity-composition model for di-trioctahedral chlorite in the system FeO–MgO–Al2O3–SiO2–H2O that is based on the Holland–Powell internally consistent thermodynamic data set. The model is formulated in terms of four linearly independent end-members, which are amesite, clinochlore, daphnite and sudoite. These account for the most important crystal-chemical substitutions in chlorite, the Fe–Mg, Tschermak and di-trioctahedral substitution. The ideal part of end-member activities is modeled with a mixing-on-site formalism, and non-ideality is described by a macroscopic symmetric (regular) formalism. The symmetric interaction parameters were calibrated using a set of 271 published chlorite analyses for which robust independent temperature estimates are available. In addition, adjustment of the standard state thermodynamic properties of sudoite was required to accurately reproduce experimental brackets involving sudoite. This new model was tested by calculating representative P–T sections for metasediments at low temperatures (<400 °C), in particular sudoite and chlorite bearing metapelites from Crete. Comparison between the calculated mineral assemblages and field data shows that the new model is able to predict the coexistence of chlorite and sudoite at low metamorphic temperatures. The predicted lower limit of the chloritoid stability field is also in better agreement with petrological observations. For practical applications to metamorphic and hydrothermal environments, two new semi-empirical chlorite geothermometers named Chl(1) and Chl(2) were calibrated based on the chlorite + quartz + water equilibrium (2 clinochlore + 3 sudoite = 4 amesite + 4 H2O + 7 quartz). The Chl(1) thermometer requires knowledge of the (Fe3+/ΣFe) ratio in chlorite and predicts correct temperatures for a range of redox conditions. The Chl(2) geothermometer which assumes that all iron in chlorite is ferrous has been applied to partially recrystallized detrital chlorite from the Zone houillère in the French Western Alps.

The Form in Dipoli. 1966, Raili&Reima Pietilä

La ponencia indaga sobre el proceso y evolución de la forma en el edificio de Dipoli, obra de los arquitectos Raili y Reima Pietilä y objeto de la tesis

Criterios de restauración, intervención y revitalización del patrimonio industrial : la fábrica de gas de San Paolo en Roma

La tesis está centrada en el patrimonio industrial, y trata de ahondar en los temas enunciados en el título, Criterios de restauración, intervención y revitalización del patrimonio industrial (capítulo 1). La fábrica de gas de San Paolo en Roma (capítulo 2): En el primer capítulo, se profundiza en los criterios institucionalizados de actuación en el patrimonio, pero también se habla sobre la singularidad, los valores originales, estratificados en cada construcción y su contexto. Ello resume la intención de la doctoranda al entender la necesidad del análisis de cada obra en modo profundo, concreto y abierto a novedosos acercamientos, antes de su transformación. Al hablar de intervención frente a restauración, se aborda la conocida polémica que plantea el modo de acercarse al legado histórico. Parece necesario enunciar cómo se consideran en el trabajo estos términos. Mientras la restauración (como diría Cesare Brandi, constituye el momento metodológico del reconocimiento de la obra de arte en su consistencia física y en su doble polaridad estética e histórica, en orden a su transmisión al futuro) es una acción más restrictiva, que implica atención suma a la recuperación y conservación de los valores significativos y únicos del bien, en comunicación con un (posible) equipo interdisciplinar; por intervención se entiende aquí un desarrollo más personal y libre por parte del proyectista, en el que se produce un proceso dialéctico entre la preexistencia y el posicionamiento crítico adoptado a la hora de dar un obligado nuevo uso a ese bien. Es decir, el contraste está en el diferente reconocimiento de la materialidad física y sus significados. En torno a la restauración/intervención, se analizan las perspectivas de actuación en España e Italia, contrastando factores como la formación del arquitecto o el entorno laboral-cultural, y utilizando el método analítico comparativo de casos. Habría un tercer concepto: el de revitalización del patrimonio industrial, Éste hace referencia a su transformación, a sus usos más comunes y compatibles, a la redimensión artística que ha experimentado la arquitectura industrial gracias al arte contemporáneo y a su relación con la Modernidad. Por último, se enuncia en el título el caso de estudio, la Fábrica, que ocupa el segundo capítulo. Se trata de un enorme conjunto industrial singular semi abandonado en el confín del centro histórico, cuyo protagonista es un gran gasómetro, que la autora ha tenido la oportunidad de descubrir en su estancia en la Ciudad Eterna. Este barrio constituyó el primer y único sector industrial de la Roma moderna a inicios del siglo XX. Por varias causas históricas y voluntad política, la ciudad prácticamente no tuvo más desarrollo industrial que el área mencionada, donde se implantaron servicios y actividades de gran transformación (Matadero, Mercados Generales, Almacenes Fluviales, Central Montemartini o esta fábrica). A partir de 1920, se empezó a construir un tejido productivo que la llevó de la situación de posguerra al milagro económico. Frente al mito de la Roma monumental o de la Roma cotidiana, aparece el aspecto industrial como mito de la contemporaneidad. Sin embargo, esta ciudad es demasiado antigua como para convertirse en moderna, y su proceso industrial en contraste con su larga historia resulta breve. La inmediata relación de la fase industrial romana con el resultado de este desarrollo viene identificada con las instalaciones señaladas, más significativas por su excepcionalidad que por la duración del momento irrepetible que representan. Su presencia física perdura a pesar de su abandono, aisladas tras su muro perimetral y casi desconocidas. Esto las hace apetecibles para la especulación inmobiliaria y resultan un caso de estudio ideal para realizar un Plan de Intervención Global, en el que determinar una serie de intervenciones necesarias, usos compatibles y directrices para la ordenación del conjunto, coherentes con los conceptos manejados en el primer capítulo. ABSTRACT The thesis focuses on industrial heritage, delving into the topics listed in its title, Criteria for the restoration, intervention and revitalisation of industrial heritage (chapter 1). The San Paolo gas factory in Rome (chapter 2): Chapter one elaborates on the official criteria to take action on heritage, but also deals with the singularity and original values unique to each construction and its context. This underlines the PhD candidate’s intentions by understanding the need for an in-depth and specific analysis, open to novel approaches to each site before its transformation. When speaking of intervention, as opposed to restoration, we address the well-known controversy that stems from the different ways of approaching historical heritage. It seems necessary to explain how these terms are interpreted in this piece of work. Whereas restoration (as Cesare Brandi would say, constitutes the methodological moment in which the work of art is appreciated in its material form and in its historical and aesthetic duality, with a view to transmitting it to the future) is a more restrictive action, demanding the utmost attention to the recovery and preservation of the piece of heritage’s defining and exceptional values, (ideally) in communication with a interdisciplinary team. By intervention, we hereby understand a more personal and free procedure carried out by the designer in which a dialectical process takes place between preexistence and the critical stance taken in order to give that good a much needed new use. That is, contrast lies in the different recognition of physical materiality and its meanings. As for the restoration/intervention dilemma, the different courses of action followed in Spain and Italy will be analysed, contrasting the architects’ training, the labourcultural environment and taking an analytical comparative case study method. There is a third concept: the revitalisation of industrial heritage, which refers to its transformation, its most common and compatible uses, the artistic redimensioning that industrial architecture has experienced thanks to contemporary art, and its relationship with Modernity. Lastly, the title refers to the case study, i.e., the analysis of the Factory, which makes up chapter 2. It is an enormous and semiabandoned peerless industrial complex on the edge of the historical city centre whose main landmark is a huge gasometer, which the author had the chance to discover during her stay in the Eternal City. This district made up the first and only industrial sector in the modern Rome of the early 20th century. Due to a number of reasons, both historical and political, barely no further industrial development took place in the city beyond the mentioned area, where processing services and activities were set up (Slaughterhouse, General Markets, Riverside Warehouses, Montemartini Power Plant or the said factory). In the 1920s began the construction of the productive fabric that raised the city from its postwar plight to the economic miracle. As opposed to the myth of monumental Rome and daily-life Rome, this industrial Rome rose as contemporaneity’s myth. However, this city is too ancient to become modern, and its industrial process strikes us as brief when confronted with its long history. The close relationship between Rome’s industrial stage and the consequences of this development is best represented by the aforementioned facilities, more relevant due to their uniqueness than the length of the once-in-a-lifetime moment they represent. Their physical presence lives on despite abandonment and isolation, as they stand vastly unknown behind their perimeter walls. This renders them appealing to property speculators, becoming an ideal case study for the creation of a Global Intervention Plan in which to determine a series of necessary actions, compatible uses and directives, all of them consistent with the concepts dealt with in chapter 1. RIASSUNTO La tesi è focalizzata sul patrimonio industriale e cerca di approfondire le tematiche contenute nel titolo, Criteri di restauro, intervento e rivitalizzazione del patrimonio industriale (capitolo 1). La Fabbrica del gas di San Paolo a Roma (capitolo 2): Nel primo capitolo vengono presi in esame i criteri istituzionalizzati di attuazione nel patrimonio, ma si parla anche della unicità, i valori originali, stratificati in ogni costruzione ed il suo contesto. Questo riassume l’intenzione della dottoranda di capire la necessità dell’analisi di ogni opera in modo profondo, concreto e aperto a nuovi approcci, prima della sua trasformazione. Nel parlare di intervento versus restauro, si affronta la famosa polemica che considera il modo di avicinarsi all’eredità storica. Appare necessario precisare come questi termini sono considerati in questo lavoro. Mentre il restauro (come direbbe Cesare Brandi, costituisce il momento metodologico del riconoscimento dell’opera d’arte nella sua consistenza fisica e nella duplice polarità estetica e storica, in vista della sua trasmissione nel futuro) è un’azione più restrittiva, e quindi implica massima attenzione al recupero e conservazione dei valori significativi ed unici del bene, in comunicazione con una (eventuale) squadra interdisciplinare; per intervento si intende qui un processo più personale e libero del progettista, nel quale si produce uno sviluppo dialettico tra la preesistenza e la posizione critica adottata quando si deve dare un nuovo uso di quel bene. Vale a dire che il contrasto risiede nel diverso riconoscimento della materialità fisica e i loro significati. Intorno al restauro / intervento, si analizzano le prospettive di attuazione in Spagna e Italia, contrastando diversi fattori come la formazione dell’architetto o l’ambiente lavorativo-culturale, ed impiegando il metodo analitico comparativo dei casi. Ci sarebbe un terzo concetto: quello della rivitalizzazione del patrimonio industriale. Questo fa riferimento alla sua trasformazione, ai suoi usi più comuni e compatibili, al ridimensionamento artistico vissuto dall’archeologia industriale grazie all’arte contemporanea ed al suo rapporto con la Modernità. In ultimo, si enuncia nel titolo il caso di studio, ovvero l’analisi della Fabbrica, che occupa il secondo capitolo. Si tratta di un enorme complesso industriale semi-abbandonato al confine con il centro storico, il cui protagonista è un grande gasometro, che l’autrice ha avuto modo di scoprire durante il suo soggiorno nella Città Eterna. Questo quartiere costituì il primo e unico moderno settore industriale della Roma moderna all’inizio del Novecento. Per diverse ragioni storiche e volontà politiche, la città praticamente non ha subito ulteriore sviluppo industriale oltre l’area citata, dove si impiantarono servizi e attività di grande trasformazione (Mattatoio, Mercati Generali, Magazzini Generali, Centrale Montemartini o questa fabbrica). Dal 1920, si inizió a costruire un tessuto prodottivo che portò la città dalla situazione post-bellica al miracolo economico. Di fronte al mito della Roma monumentale o della Roma quotidiana, appare questa Roma industriale come mito della contemporaneità. Tuttavia, questa città è troppo antica per diventare moderna, ed il suo processo industriale in contrasto con la sua lunga storia risulta breve. Il rapporto diretto della fase industriale romana con il risultato di questo sviluppo viene identificato con gli impianti segnalati, più significativi per la loro unicità che per la durata del momento irripetibile che rappresentano. La loro presenza fisica perdura nonostante l’abbandono, isolati dietro il loro muro di cinta e quasi sconosciuti. Questo li rende auspicabile per la speculazione immobiliare e sono un caso ideale per eseguire un Piano di Intervento Globale, che determini una serie di interventi necessari, usi compatibili e linee guida per la pianificazione del tutto, in linea con i concetti utilizzati nel primo capitolo.

Habitat e genoma: possibili adattamenti di H. pylori allo stomaco umano

Helicobacter pylori è un batterio patogeno che infetta e abita lo stomaco umano. La sua diffusione è ubiquitaria nel mondo ed esso è responsabile di varie patologie, sia gastriche che extra-gastriche. Vista l’estrema ostilità del suo habitat, H. pylori necessita di specifici adattamenti che lo rendono unico nella sua capacità di tollerare l’estrema acidità dello stomaco umano, oltre ad evitare la risposta immunitaria dell’ospite. In questa tesi verranno adottati degli approcci bioinformatici per cercare di individuare quali possano essere gli adattamenti e le caratteristiche del genoma di questo batterio correlati con la sopravvivenza nell’ambiente gastrico e l’adattamento all’ospite umano.

Identificazione di miRNA correlati ad EGFR: nuovi potenziali biomarcatori di risposta alla terapia di 2a-3a linea in pazienti con NSCLC metastatico

La diagnosi di neoplasia epiteliale maligna polmonare è legata tradizionalmente alla distinzione tra carcinoma a piccole cellule (small-cell lung cancer, SCLC) e carcinoma non-a piccole cellule del polmone (non-small-cell lung cancer, NSCLC). Nell’ambito del NSCLC attualmente è importante di-stinguere l’esatto istotipo (adenocarcinoma, carcinoma squamocellulare e carcinoma neuroendocrino) perchè l’approccio terapeutico cambia a seconda dell’istotipo del tumore e la chemioterapia si dimostra molto spesso inefficace. Attualmente alcuni nuovi farmaci a bersaglio molecolare per il gene EGFR, come Erlotinib e Gefitinib, sono utilizzati per i pazienti refrattari al trattamento chemioterapico tradizionale, che non hanno risposto a uno o più cicli di chemioterapia o che siano progrediti dopo questa. I test per la rilevazione di specifiche mutazioni nel gene EGFR permettono di utilizzare al meglio questi nuovi farmaci, applicandoli anche nella prima linea di trattamento sui pazienti che hanno una maggiore probabilità di risposta alla terapia. Sfortunatamente, non tutti i pazienti rispondono allo stesso modo quando trattati con farmaci anti-EGFR. Di conseguenza, l'individuazione di biomarcatori predittivi di risposta alla terapia sarebbe di notevole importanza per aumentare l'efficacia dei questi farmaci a target molecolare e trattare con farmaci diversi i pazienti che con elevata probabilità non risponderebbero ad essi. I miRNAs sono piccole molecole di RNA endogene, a singolo filamento di 20-22 nucleotidi che svolgono diverse funzioni, una delle più importanti è la regolazione dell’espressione genica. I miRNAs possono determinare una repressione dell'espressione genica in due modi: 1-legandosi a sequenze target di mRNA, causando così un silenziamento del gene (mancata traduzione in proteina), 2- causando la degradazione dello specifico mRNA. Lo scopo della ricerca era di individuare biomarcatori capaci di identificare precocemente i soggetti in grado di rispondere alla terapia con Erlotinib, aumentando così l'efficacia del farmaco ed evitan-do/riducendo possibili fenomeni di tossicità e il trattamento di pazienti che probabilmente non ri-sponderebbero alla terapia offrendo loro altre opzioni prima possibile. In particolare, il lavoro si è fo-calizzato sul determinare se esistesse una correlazione tra la risposta all'Erlotinib ed i livelli di espressione di miRNAs coinvolti nella via di segnalazione di EGFR in campioni di NSCLC prima dell’inizio della terapia. Sono stati identificati 7 microRNA coinvolti nel pathway di EGFR: miR-7, -21, 128b, 133a, -133b, 146a, 146b. Sono stati analizzati i livelli di espressione dei miRNA mediante Real-Time q-PCR in campioni di NSCLC in una coorte di pazienti con NSCLC metastatico trattati con Erlotinib dal 1° gennaio 2009 al 31 dicembre 2014 in 2°-3° linea dopo fallimento di almeno un ciclo di chemioterapia. I pazienti sottoposti a trattamento con erlotinib per almeno 6 mesi senza presentare progressione alla malattia sono stati definiti “responders” (n=8), gli altri “non-responders” (n=25). I risultati hanno mostrato che miR-7, -133b e -146a potrebbero essere coinvolti nella risposta al trat-tamento con Erlotinib. Le indagini funzionali sono state quindi concentrate su miR-133b, che ha mo-strato la maggiore espressione differenziale tra i due gruppi di pazienti. E 'stata quindi studiata la capacità di miR-133b di regolare l'espressione di EGFR in due linee di cellule del cancro del polmone (A549 e H1299). Sono stati determinati gli effetti di miR-133b sulla crescita cellulare. E’ stato anche analizzato il rapporto tra miR-133b e sensibilità a Erlotinib nelle cellule NSCLC. L'aumento di espressione di miR-133b ha portato ad una down-regolazione del recettore di EGF e del pathway di EGFR relativo alla linea cellulare A549. La linea cellulare H1299 era meno sensibili al miR-133b up-regulation, probabilmente a causa dell'esistenza di possibili meccanismi di resistenza e/o di com-pensazione. La combinazione di miR-133b ed Erlotinib ha aumentato l'efficacia del trattamento solo nella linea cellulare A549. Nel complesso, questi risultati indicano che miR-133b potrebbe aumentare / ripristinare la sensibilità di Erlotinib in una frazione di pazienti.

Applicazione della spettrometria di massa MALDI-TOF in microbiologia clinica

Riassunto La spettrometria di massa (MS) nata negli anni ’70 trova oggi, grazie alla tecnologia Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI-TOF), importanti applicazioni in diversi settori: biotecnologico (per la caratterizzazione ed il controllo di qualità di proteine ricombinanti ed altre macromolecole), medico–clinico (per la diagnosi di laboratorio di malattie e per lo sviluppo di nuovi trattamenti terapeutici mirati), alimentare ed ambientale. Negli ultimi anni, questa tecnologia è diventata un potente strumento anche per la diagnosi di laboratorio in microbiologia clinica, rivoluzionando il flusso di lavoro per una rapida identificazione di batteri e funghi, sostituendo l’identificazione fenotipica convenzionale basata su saggi biochimici. Attualmente mediante MALDI-TOF MS sono possibili due diversi approcci per la caratterizzazione dei microrganismi: (1) confronto degli spettri (“mass spectra”) con banche dati contenenti profili di riferimento (“database fingerprints”) e (2) “matching” di bio-marcatori con banche dati proteomiche (“proteome database”). Recentemente, la tecnologia MALDI-TOF, oltre alla sua applicazione classica nell’identificazione di microrganismi, è stata utilizzata per individuare, indirettamente, meccanismi di resistenza agli antibiotici. Primo scopo di questo studio è stato verificare e dimostrare l’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF MS mediante approccio di comparazione degli spettri di differenti microrganismi di interesse medico per i quali l’identificazione risultava impossibile a causa della completa assenza o presenza limitata, di spettri di riferimento all’interno della banca dati commerciale associata allo strumento. In particolare, tale scopo è stato raggiunto per i batteri appartenenti a spirochete del genere Borrelia e Leptospira, a miceti filamentosi (dermatofiti) e protozoi (Trichomonas vaginalis). Secondo scopo di questo studio è stato valutare il secondo approccio identificativo basato sulla ricerca di specifici marcatori per differenziare parassiti intestinali di interesse medico per i quali non è disponibile una banca dati commerciale di riferimento e la sua creazione risulterebbe particolarmente difficile e complessa, a causa della complessità del materiale biologico di partenza analizzato e del terreno di coltura nei quali questi protozoi sono isolati. Terzo ed ultimo scopo di questo studio è stata la valutazione dell’applicabilità della spettrometria di massa con tecnologia MALDI-TOF per lo studio delle resistenze batteriche ai carbapenemi. In particolare, è stato messo a punto un saggio di idrolisi dei carbapenemi rilevata mediante MALDI-TOF MS in grado di determinare indirettamente la produzione di carbapenemasi in Enterobacteriaceae. L’efficacia identificativa della metodica MALDI-TOF mediante l’approccio di comparazione degli spettri è stata dimostrata in primo luogo per batteri appartenenti al genere Borrelia. La banca dati commerciale dello strumento MALDI-TOF MS in uso presso il nostro laboratorio includeva solo 3 spettri di riferimento appartenenti alle specie B. burgdorferi ss, B. spielmani e B. garinii. L’implementazione del “database” con specie diverse da quelle già presenti ha permesso di colmare le lacune identificative dovute alla mancanza di spettri di riferimento di alcune tra le specie di Borrelia più diffuse in Europa (B. afzelii) e nel mondo (come ad esempio B. hermsii, e B. japonica). Inoltre l’implementazione con spettri derivanti da ceppi di riferimento di specie già presenti nel “database” ha ulteriormente migliorato l’efficacia identificativa del sistema. Come atteso, il ceppo di isolamento clinico di B. lusitaniae (specie non presente nel “database”) è stato identificato solo a livello di genere corroborando, grazie all’assenza di mis-identificazione, la robustezza della “nuova” banca dati. I risultati ottenuti analizzando i profili proteici di ceppi di Borrelia spp. di isolamento clinico, dopo integrazione del “database” commerciale, indicano che la tecnologia MALDI-TOF potrebbe essere utilizzata come rapida, economica ed affidabile alternativa ai metodi attualmente utilizzati per identificare ceppi appartenenti a questo genere. Analogamente, per il genere Leptospira dopo la creazione ex-novo della banca dati “home-made”, costruita con i 20 spettri derivati dai 20 ceppi di riferimento utilizzati, è stata ottenuta una corretta identificazione a livello di specie degli stessi ceppi ri-analizzati in un esperimento indipendente condotto in doppio cieco. Il dendrogramma costruito con i 20 MSP-Spectra implementati nella banca dati è formato da due rami principali: il primo formato dalla specie non patogena L. biflexa e dalla specie a patogenicità intermedia L. fainei ed il secondo che raggruppa insieme le specie patogene L. interrogans, L. kirschneri, L. noguchii e L. borgpetersenii. Il secondo gruppo è ulteriormente suddiviso in due rami, contenenti rispettivamente L. borgpetersenii in uno e L. interrogans, L. kirschneri e L. noguchii nell’altro. Quest’ultimo, a sua volta, è suddiviso in due rami ulteriori: il primo comprendente la sola specie L. noguchii, il secondo le specie L. interrogans e L. kirshneri non separabili tra loro. Inoltre, il dendrogramma costruito con gli MSP-Spectra dei ceppi appartenenti ai generi Borrelia e Leptospira acquisiti in questo studio, e appartenenti al genere Brachyspira (implementati in un lavoro precedentemente condotto) mostra tre gruppi principali separati tra loro, uno per ogni genere, escludendo possibili mis-identificazioni tra i 3 differenti generi di spirochete. Un’analisi più approfondita dei profili proteici ottenuti dall’analisi ha mostrato piccole differenze per ceppi della stessa specie probabilmente dovute ai diversi pattern proteici dei distinti sierotipi, come confermato dalla successiva analisi statistica, che ha evidenziato picchi sierotipo-specifici. È stato, infatti, possibile mediante la creazione di un modello statistico dedicato ottenere un “pattern” di picchi discriminanti in grado di differenziare a livello di sierotipo sia i ceppi di L. interrogans sia i ceppi di L. borgpetersenii saggiati, rispettivamente. Tuttavia, non possiamo concludere che i picchi discriminanti da noi riportati siano universalmente in grado di identificare il sierotipo dei ceppi di L. interrogans ed L. borgpetersenii; i picchi trovati, infatti, sono il risultato di un’analisi condotta su uno specifico pannello di sierotipi. È stato quindi dimostrato che attuando piccoli cambiamenti nei parametri standardizzati come l’utilizzo di un modello statistico e di un programma dedicato applicato nella routine diagnostica è possibile utilizzare la spettrometria di massa MALDI-TOF per una rapida ed economica identificazione anche a livello di sierotipo. Questo può significativamente migliorare gli approcci correntemente utilizzati per monitorare l’insorgenza di focolai epidemici e per la sorveglianza degli agenti patogeni. Analogamente a quanto dimostrato per Borrelia e Leptospira, l’implementazione della banca dati dello spettrometro di massa con spettri di riferimento di miceti filamentosi (dermatofiti) si è rilevata di particolare importanza non solo per l’identificazione di tutte le specie circolanti nella nostra area ma anche per l’identificazione di specie la cui frequenza nel nostro Paese è in aumento a causa dei flussi migratori dalla zone endemiche (M. audouinii, T. violaceum e T. sudanense). Inoltre, l’aggiornamento del “database” ha consentito di superare la mis-identificazione dei ceppi appartenenti al complesso T. mentagrophytes (T. interdigitale e T. mentagrophytes) con T. tonsurans, riscontrata prima dell’implementazione della banca dati commerciale. Il dendrogramma ottenuto dai 24 spettri implementati appartenenti a 13 specie di dermatofiti ha rivelato raggruppamenti che riflettono quelli costruiti su base filogenetica. Sulla base dei risultati ottenuti mediante sequenziamento della porzione della regione ITS del genoma fungino non è stato possibile distinguere T. interdigitale e T. mentagrophytes, conseguentemente anche gli spettri di queste due specie presentavano picchi dello stesso peso molecoalre. Da sottolineare che il dendrogramma costruito con i 12 profili proteici già inclusi nel database commerciale e con i 24 inseriti nel nuovo database non riproduce l’albero filogenetico per alcune specie del genere Tricophyton: gli spettri MSP già presenti nel database e quelli aggiunti delle specie T. interdigitale e T. mentagrophytes raggruppano separatamente. Questo potrebbe spiegare le mis-identificazioni di T. interdigitale e T. mentagrophytes con T. tonsurans ottenute prima dell’implementazione del database. L’efficacia del sistema identificativo MALDI-TOF è stata anche dimostrata per microrganismi diversi da batteri e funghi per i quali la metodica originale è stata sviluppata. Sebbene tale sistema identificativo sia stato applicato con successo a Trichomonas vaginalis è stato necessario apportare modifiche nei parametri standard previsti per l’identificazione di batteri e funghi. Le interferenze riscontrate tra i profili proteici ottenuti per i due terreni utilizzati per la coltura di questo protozoo e per i ceppi di T. vaginalis hanno, infatti, reso necessario l’utilizzo di nuovi parametri per la creazione degli spettri di riferimento (MSP-Spectra). L’importanza dello sviluppo del nuovo metodo risiede nel fatto che è possibile identificare sulla base del profilo proteico (e non sulla base di singoli marcatori) microorganismi cresciuti su terreni complessi che potrebbero presentare picchi nell'intervallo di peso molecolare utilizzato a scopo identificativo: metaboliti, pigmenti e nutrienti presenti nel terreno possono interferire con il processo di cristallizzazione e portare ad un basso punteggio identificativo. Per T. vaginalis, in particolare, la “sottrazione” di picchi dovuti a molecole riconducibili al terreno di crescita utilizzato, è stata ottenuta escludendo dall'identificazione l'intervallo di peso molecolare compreso tra 3-6 kDa, permettendo la corretta identificazione di ceppi di isolamento clinico sulla base del profilo proteico. Tuttavia, l’elevata concentrazione di parassita richiesta (105 trofozoiti/ml) per una corretta identificazione, difficilmente ottenibile in vivo, ha impedito l’identificazione di ceppi di T. vaginalis direttamente in campioni clinici. L’approccio identificativo mediante individuazione di specifici marcatori proteici (secondo approccio identificativo) è stato provato ed adottato in questo studio per l’identificazione e la differenziazione di ceppi di Entamoeba histolytica (ameba patogena) ed Entamoeba dispar (ameba non patogena), specie morfologiacamente identiche e distinguibili solo mediante saggi molecolari (PCR) aventi come bersaglio il DNA-18S, che codifica per l’RNA della subunità ribosomiale minore. Lo sviluppo di tale applicazione ha consentito di superare l’impossibilità della creazione di una banca dati dedicata, a causa della complessità del materiale fecale di partenza e del terreno di coltura impiagato per l’isolamento, e di identificare 5 picchi proteici in grado di differenziare E. histolytica da E. dispar. In particolare, l’analisi statistica ha mostrato 2 picchi specifici per E. histolytica e 3 picchi specifici per E. dispar. L’assenza dei 5 picchi discriminanti trovati per E. histolytica e E. dispar nei profili dei 3 differenti terreni di coltura utilizzati in questo studio (terreno axenico LYI-S-2 e terreno di Robinson con e senza E. coli) permettono di considerare questi picchi buoni marcatori in grado di differenziare le due specie. La corrispondenza dei picchi con il PM di due specifiche proteine di E. histolytica depositate in letteratura (Amoebapore A e un “unknown putative protein” di E. histolytica ceppo di riferimento HM-1:IMSS-A) conferma la specificità dei picchi di E. histolytica identificati mediante analisi MALDI-TOF MS. Lo stesso riscontro non è stato possibile per i picchi di E. dispar in quanto nessuna proteina del PM di interesse è presente in GenBank. Tuttavia, va ricordato che non tutte le proteine E. dispar sono state ad oggi caratterizzate e depositate in letteratura. I 5 marcatori hanno permesso di differenziare 12 dei 13 ceppi isolati da campioni di feci e cresciuti in terreno di Robinson confermando i risultati ottenuti mediante saggio di Real-Time PCR. Per un solo ceppo di isolamento clinico di E. histolytica l’identificazione, confermata mediante sequenziamento della porzione 18S-rDNA, non è stata ottenuta mediante sistema MALDI-TOF MS in quanto non sono stati trovati né i picchi corrispondenti a E. histolytica né i picchi corrispondenti a E. dispar. Per questo ceppo è possibile ipotizzare la presenza di mutazioni geno/fenotipiche a livello delle proteine individuate come marcatori specifici per E. histolytica. Per confermare questa ipotesi sarebbe necessario analizzare un numero maggiore di ceppi di isolamento clinico con analogo profilo proteico. L’analisi condotta a diversi tempi di incubazione del campione di feci positivo per E. histolytica ed E. dipar ha mostrato il ritrovamento dei 5 picchi discriminanti solo dopo 12 ore dall’inoculo del campione nel terreno iniziale di Robinson. Questo risultato suggerisce la possibile applicazione del sistema MALDI-TOF MS per identificare ceppi di isolamento clinico di E. histolytica ed E. dipar nonostante la presenza di materiale fecale che materialmente può disturbare e rendere difficile l’interpretazione dello spettro ottenuto mediante analisi MALDI-TOF MS. Infine in questo studio è stata valutata l’applicabilità della tecnologia MALDI-TOF MS come saggio fenotipico rapido per la determinazione di ceppi produttori di carbapenemasi, verificando l'avvenuta idrolisi del meropenem (carbapeneme di riferimento utilizzato in questo studio) a contatto con i ceppi di riferimento e ceppi di isolamento clinico potenzialmente produttori di carbapenemasi dopo la messa a punto di un protocollo analitico dedicato. Il saggio di idrolisi del meropenem mediante MALDI-TOF MS ha dimostrato la presenza o l’assenza indiretta di carbapenemasi nei 3 ceppi di riferimento e nei 1219 (1185 Enterobacteriaceae e 34 non-Enterobacteriaceae) ceppi di isolamento clinico inclusi nello studio. Nessuna interferenza è stata riscontrata per i ceppi di Enterobacteriaceae variamente resistenti ai tre carbapenemi ma risultati non produttori di carbapenemasi mediante i saggi fenotipici comunemente impiegati nella diagnostica routinaria di laboratorio: nessuna idrolisi del farmaco è stata infatti osservata al saggio di idrolisi mediante MALDI-TOF MS. In un solo caso (ceppo di K. pneumoniae N°1135) è stato ottenuto un profilo anomalo in quanto presenti sia i picchi del farmaco intatto che quelli del farmaco idrolizzato. Per questo ceppo resistente ai tre carbapenemi saggiati, negativo ai saggi fenotipici per la presenza di carbapenemasi, è stata dimostrata la presenza del gene blaKPC mediante Real-Time PCR. Per questo ceppo si può ipotizzare la presenza di mutazioni a carico del gene blaKPC che sebbene non interferiscano con il suo rilevamento mediante PCR (Real-Time PCR positiva), potrebbero condizionare l’attività della proteina prodotta (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia negativi) riducendone la funzionalità come dimostrato, mediante analisi MALDI-TOF MS, dalla presenza dei picchi relativi sia all’idrolisi del farmaco sia dei picchi relativi al farmaco intatto. Questa ipotesi dovrebbe essere confermata mediante sequenziamento del gene blaKPC e successiva analisi strutturale della sequenza amminoacidica deducibile. L’utilizzo della tecnologia MALDI-TOF MS per la verifica dell’avvenuta idrolisi del maropenem è risultato un saggio fenotipico indiretto in grado di distinguere, al pari del test di Hodge modificato impiegato comunemente nella routine diagnostica in microbiologia, un ceppo produttore di carbapenemasi da un ceppo non produttore sia per scopi diagnostici che per la sorveglianza epidemiologica. L’impiego del MALDI-TOF MS ha mostrato, infatti, diversi vantaggi rispetto ai metodi convenzionali (Saggio di Hodge modificato e Test di Sinergia) impiegati nella routine diagnostica di laboratorio i quali richiedono personale esperto per l’interpretazione del risultato e lunghi tempi di esecuzione e di conseguenza di refertazione. La semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questa tecnica un metodo accurato e rapido. Inoltre, il metodo risulta conveniente dal punto di vista economico, con un costo totale stimato di 1,00 euro per ceppo analizzato. Tutte queste considerazioni pongono questa metodologia in posizione centrale in ambito microbiologico anche nel caso del rilevamento di ceppi produttori di carbapenemasi. Indipendentemente dall’approccio identificativo utilizzato, comparato con i metodi convenzionali il MALDI-TOF MS conferisce in molti casi un guadagno in termini di tempo di lavoro tecnico (procedura pre-analititca per la preparazione dei campioni) e di tempo di ottenimento dei risultati (procedura analitica automatizzata). Questo risparmio di tempo si accentua quando sono analizzati in contemporanea un maggior numero di isolati. Inoltre, la semplicità e la facilità richieste per la preparazione dei campioni e l’immediata acquisizione dei dati rendono questo un metodo di identificazione accurato e rapido risultando più conveniente anche dal punto di vista economico, con un costo totale di 0,50 euro (materiale consumabile) per ceppo analizzato. I risultati ottenuti dimostrano che la spettrometria di massa MALDI-TOF sta diventando uno strumento importante in microbiologia clinica e sperimentale, data l’elevata efficacia identificativa, grazie alla disponibilità sia di nuove banche dati commerciali sia di aggiornamenti delle stesse da parte di diversi utenti, e la possibilità di rilevare con successo anche se in modo indiretto le antibiotico-resistenze.

Valutazione della risposta immunitaria cellulare e fenotipizzazione linfocitaria nel suino in corso di infezione naturale da virus della PRRS (“Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome”) e dopo stimolazione di PBMC (“Peripheral Blood Mononuclear Cells”) in vitro con Peptide Killer (KP)

SUMMARY The Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS) virus is one of the most spread pathogens in swine herds all over the world and responsible for a reproductive and respiratory syndrome that causes severe heath and economical problems. This virus emerged in late 1980’s but although about 30 years have passed by, the knowledge about some essential facets related to the features of the virus (pathogenesis, immune response, and epidemiology) seems to be still incomplete. Taking into account that the development of modern vaccines is based on how innate and acquire immunity react, a more and more thorough knowledge on the immune system is needed, in terms of molecular modulation/regulation of the inflammatory and immune response upon PRRSV infection. The present doctoral thesis, which is divided into 3 different studies, is aimed to increase the knowledge about the interaction between the immune system and the PRRS virus upon natural infection. The objective of the first study entitled “Coordinated immune response of memory and cytotoxic T cells together with IFN-γ secreting cells after porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) natural infection in conventional pigs” was to evaluate the activation and modulation of the immune response in pigs naturally infected by PRRSV compared to an uninfected control group. The course of viremia was evaluated by PCR, the antibody titres by ELISA, the number of IFN-γ secreting cells (IFN- SC) by an ELISPOT assay and the immunophenotyping of some lymphocyte subsets (cytotoxic cells, memory T lymphocytes and cytotoxic T lymphocytes) by flow cytometry. The results showed that the activation of the cell-mediated immune response against PRRSV is delayed upon infection and that however the levels of IFN-γ SC and lymphocyte subsets subsequently increase over time. Furthermore, it was observed that the course of the different immune cell subsets is time-associated with the levels of PRRSV-specific IFN-γ SC and this can be interpreted based on the functional role that such lymphocyte subsets could have in the specific production/secretion of the immunostimulatory cytokine IFN-γ. In addition, these data support the hypothesis that the age of the animals upon the onset of infection or the diverse immunobiological features of the field isolate, as typically hypothesized during PRRSV infection, are critical conditions able to influence the qualitative and quantitative course of the cell-mediated immune response during PRRSV natural infection. The second study entitled “Immune response to PCV2 vaccination in PRRSV viremic piglets” was aimed to evaluate whether PRRSV could interfere with the activation of the immune response to PCV2 vaccination in pigs. In this trial, 200 pigs were divided into 2 groups: PCV2-vaccinated (at 4 weeks of age) and PCV2-unvaccinated (control group). Some piglets of both groups got infected by PRRSV, as determined by PRRSV viremia detection, so that 4 groups were defined as follows: PCV2 vaccinated - PRRSV viremic PCV2 vaccinated - PRRSV non viremic PCV2 unvaccinated - PRRSV viremic PCV2 unvaccinated - PRRSV non viremic The following parameters were evaluated in the 4 groups: number of PCV2-specific IFN-γ secreting cells, antibody titres by ELISA and IPMA. Based on the immunological data analysis, it can be deduced that: 1) The low levels of antibodies against PCV2 in the PCV2-vaccinated – PRRSV-viremic group at vaccination (4 weeks of age) could be related to a reduced colostrum intake influenced by PRRSV viremia. 2) Independently of the viremia status, serological data of the PCV2-vaccinated group by ELISA and IPMA does not show statistically different differences. Consequently, it can be be stated that, under the conditions of the study, PRRSV does not interfere with the antibody response induced by the PCV2 vaccine. 3) The cell-mediated immune response in terms of number of PCV2-specific IFN-γ secreting cells in the PCV2-vaccinated – PRRSV-viremic group seems to be compromised, as demonstrated by the reduction of the number of IFN-γ secreting cells after PCV2 vaccination, compared to the PCV2-vaccinated – PRRSV-non-viremic group. The data highlight and further support the inhibitory role of PRRSV on the development and activation of the immune response and highlight how a natural infection at early age can negatively influence the immune response to other pathogens/antigens. The third study entitled “Phenotypic modulation of porcine CD14+ monocytes, natural killer/natural killer T cells and CD8αβ+ T cell subsets by an antibody-derived killer peptide (KP)” was aimed to determine whether and how the killer peptide (KP) could modulate the immune response in terms of activation of specific lymphocyte subsets. This is a preliminary approach also aimed to subsequently evaluate such KP with a potential antivural role or as adjuvant. In this work, pig peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were stimulated with three KP concentrations (10, 20 and 40 g/ml) for three time points (24, 48 and 72 hours). TIME POINTS (hours) KP CONCENTRATIONS (g/ml) 24 0-10-20-40 48 0-10-20-40 72 0-10-20-40 By using flow cytometry, the qualitative and quantitative modulation of the following immune subsets was evaluated upon KP stimulation: monocytes, natural killer (NK) cells, natural killer T (NKT) cells, and CD4+ and CD8α/β+ T lymphocyte subsets. Based on the data, it can be deduced that: 1) KP promotes a dose-dependent activation of monocytes, particularly after 24 hours of stimulation, by inducing a monocyte phenotypic and maturation shift mainly involved in sustaining the innate/inflammatory response. 2) KP induces a strong dose-dependent modulation of NK and NKT cells, characterized by an intense increase of the NKT cell fraction compared to NK cells, both subsets involved in the antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC). The increase is observed especially after 24 hours of stimulation. 3) KP promotes a significant activation of the cytotoxic T lymphocyte subset (CTL). 4) KP can modulate both the T helper and T cytotoxic phenotype, by inducing T helper cells to acquire the CD8α thus becoming doube positive cells (CD4+CD8+) and by inducing CTL (CD4-CD8+high) to acquire the double positive phenotype (CD4+CD8α+high). Therefore, KP may induce several effects on different immune cell subsets. For this reason, further research is needed aimed at characterizing each “effect” of KP and thus identifying the best use of the decapeptide for vaccination practice, therapeutic purposes or as vaccine adjuvant. RIASSUNTO Il virus della PRRS (Porcine Reproductive Respiratory Syndrome) è uno dei più diffusi agenti patogeni negli allevamenti suini di tutto il mondo, responsabile di una sindrome riproduttiva e respiratoria causa di gravi danni ad impatto sanitario ed economico. Questo virus è emerso attorno alla fine degli anni ’80 ma nonostante siano passati circa una trentina di anni, le conoscenze su alcuni punti essenziali che riguardano le caratteristiche del virus (patogenesi, risposta immunitaria, epidemiologia) appaiono ancora spesso incomplete. Considerando che lo sviluppo dei vaccini moderni è basato sui principi dell’immunità innata e acquisita è essenziale una sempre più completa conoscenza del sistema immunitario inteso come modulazione/regolazione molecolare della risposta infiammatoria e immunitaria in corso di tale infezione. Questo lavoro di tesi, suddiviso in tre diversi studi, ha l’intento di contribuire all’aumento delle informazioni riguardo l’interazione del sistema immunitario, con il virus della PRRS in condizioni di infezione naturale. L’obbiettivo del primo studio, intitolato “Associazione di cellule memoria, cellule citotossiche e cellule secernenti IFN- nella risposta immunitaria in corso di infezione naturale da Virus della Sindrome Riproduttiva e Respiratoria del Suino (PRRSV)” è stato di valutare l’attivazione e la modulazione della risposta immunitaria in suini naturalmente infetti da PRRSV rispetto ad un gruppo controllo non infetto. I parametri valutati sono stati la viremia mediante PCR, il titolo anticorpale mediante ELISA, il numero di cellule secernenti IFN- (IFN- SC) mediante tecnica ELISPOT e la fenotipizzazione di alcune sottopopolazioni linfocitarie (Cellule citotossiche, linfociti T memoria e linfociti T citotossici) mediante citofluorimetria a flusso. Dai risultati ottenuti è stato possibile osservare che l’attivazione della risposta immunitaria cellulo-mediata verso PRRSV appare ritardata durante l’infezione e che l’andamento, in termini di IFN- SC e dei cambiamenti delle sottopopolazioni linfocitarie, mostra comunque degli incrementi seppur successivi nel tempo. E’ stato inoltre osservato che gli andamenti delle diverse sottopopolazioni immunitarie cellulari appaiono temporalmente associati ai livelli di IFN- SC PRRSV-specifiche e ciò potrebbe essere interpretato sulla base del ruolo funzionale che tali sottopopolazioni linfocitarie potrebbero avere nella produzione/secrezione specifica della citochina immunoattivatrice IFN-. Questi dati inoltre supportano l’ipotesi che l’età degli animali alla comparsa dell’infezione o, come tipicamente ipotizzato nell’infezione da PRRSV, le differenti caratteristiche immunobiologiche dell’isolato di campo, sia condizioni critiche nell’ influenzare l’andamento qualitativo e quantitativo della risposta cellulo-mediata durante l’infezione naturale da PRRSV. Il secondo studio, dal titolo “Valutazione della risposta immunitaria nei confronti di una vaccinazione contro PCV2 in suini riscontrati PRRSV viremici e non viremici alla vaccinazione” ha avuto lo scopo di valutare se il virus della PRRS potesse andare ad interferire sull’attivazione della risposta immunitaria indotta da vaccinazione contro PCV2 nel suino. In questo lavoro sono stati arruolati 200 animali divisi in due gruppi, PCV2 Vaccinato (a 4 settimane di età) e PCV2 Non Vaccinato (controllo negativo). Alcuni suinetti di entrambi i gruppi, si sono naturalmente infettati con PRRSV, come determinato con l’analisi della viremia da PRRSV, per cui è stato possibile creare quattro sottogruppi, rispettivamente: PCV2 vaccinato - PRRSV viremico PCV2 vaccinato - PRRSV non viremico PCV2 non vaccinato - PRRSV viremico PCV2 non vaccinato - PRRSV non viremico Su questi quattro sottogruppi sono stati valutati i seguenti parametri: numero di cellule secernenti IFN- PCV2 specifiche, ed i titoli anticorpali mediante tecniche ELISA ed IPMA. Dall’analisi dei dati immunologici derivati dalle suddette tecniche è stato possibile dedurre che:  I bassi valori anticorpali nei confronti di PCV2 del gruppo Vaccinato PCV2-PRRSV viremico già al periodo della vaccinazione (4 settimane di età) potrebbero essere messi in relazione ad una ridotta assunzione di colostro legata allo stato di viremia da PRRSV  Indipendentemente dallo stato viremico, i dati sierologici del gruppo vaccinato PCV2 provenienti sia da ELISA sia da IPMA non mostrano differenze statisticamente significative. Di conseguenza è possibile affermare che in questo caso PRRSV non interferisce con la risposta anticorpale promossa dal vaccino PCV2.  La risposta immunitaria cellulo-mediata, intesa come numero di cellule secernenti IFN- PCV2 specifiche nel gruppo PCV2 vaccinato PRRS viremico sembra essere compromessa, come viene infatti dimostrato dalla diminuzione del numero di cellule secernenti IFN- dopo la vaccinazione contro PCV2, comparata con il gruppo PCV2 vaccinato- non viremico. I dati evidenziano ed ulteriormente sostengono il ruolo inibitorio del virus della PRRSV sullo sviluppo ed attivazione della risposta immunitaria e come un infezione naturale ad età precoci possa influenzare negativamente la risposta immunitaria ad altri patogeni/antigeni. Il terzo studio, intitolato “Modulazione fenotipica di: monociti CD14+, cellule natural killer (NK), T natural killer (NKT) e sottopopolazioni linfocitarie T CD4+ e CD8+ durante stimolazione con killer peptide (KP) nella specie suina” ha avuto come scopo quello di stabilire se e come il Peptide Killer (KP) potesse modulare la risposta immunitaria in termini di attivazione di specifiche sottopopolazioni linfocitarie. Si tratta di un approccio preliminare anche ai fini di successivamente valutare tale KP in un potenziale ruolo antivirale o come adiuvante. In questo lavoro, periferal blood mononuclear cells (PBMC) suine sono state stimolate con KP a tre diverse concentrazioni (10, 20 e 40 g/ml) per tre diversi tempi (24, 48 e 72 ore). TEMPI DI STIMOLAZIONE (ore) CONCENTRAZIONE DI KP (g/ml) 24 0-10-20-40 48 0-10-20-40 72 0-10-20-40 Mediante la citometria a flusso è stato dunque possibile analizzare il comportamento qualitativo e quantitativo di alcune sottopopolazioni linfocitarie sotto lo stimolo del KP, tra cui: monociti, cellule Natural Killer (NK), cellule T Natural Killer (NKT) e linfociti T CD4 e CD8+. Dai dati ottenuti è stato possibile dedurre che: 1) KP promuove un’attivazione dei monociti dose-dipendente in particolare dopo 24 ore di stimolazione, inducendo uno “shift” fenotipico e di maturazione monocitaria maggiormente coinvolto nel sostegno della risposta innata/infiammatoria. 2) KP induce una forte modulazione dose-dipendente di cellule NK e NKT con un forte aumento della frazione delle cellule NKT rispetto alle NK, sottopopolazioni entrambe coinvolte nella citotossicità cellulare mediata da anticorpi (ADCC). L’aumento è riscontrabile soprattutto dopo 24 ore di stimolazione. 3) KP promuove una significativa attivazione della sottopopolazione del linfociti T citotossici (CTL). 4) Per quanto riguarda la marcatura CD4+/CD8+ è stato dimostrato che KP ha la capacità di modulare sia il fenotipo T helper che T citotossico, inducendo le cellule T helper ad acquisire CD8 diventando quindi doppio positive (CD4+CD8+) ed inducendo il fenotipo CTL (CD4-CD8+high) ad acquisire il fenotipo doppio positivo (CD4+CD8α+high). Molti dunque potrebbero essere gli effetti che il decapeptide KP potrebbe esercitare sulle diverse sottopopolazioni del sistema immunitario, per questo motivo va evidenziata la necessità di impostare e attuare nuove ricerche che portino alla caratterizzazione di ciascuna “abilità” di KP e che conducano successivamente alla scoperta del migliore utilizzo che si possa fare del decapeptide sia dal punto di vista vaccinale, terapeutico oppure sotto forma di adiuvante vaccinale.