Parâmetros bioquímicos de alterações do citoesqueleto no modelo experimental da doença do Xarope do Bordo

A Doença do Xarope do Bordo (DXB) é um erro inato do metabolismo causado pela deficiência na atividade do complexo desidrogenase dos cetoácidos de cadeia ramificada, levando ao acúmulo de concentrações milimolares dos seguintes α-cetoácidos de cadeia ramificada (CACR): ácidos α-cetoisocapróico (CIC), α-ceto-β-metilvalérico (CMV), α-cetoisovalérico (CIV) e dos seus aminoácidos precursores, leucina, isoleucina e valina em tecidos de pacientes afetados. Essa doença é caracterizada por severos sintomas neurológicos que incluem edema e atrofia cerebral, entretanto, os mecanismos envolvidos na neuropatologia da DXB ainda não são bem estabelecidos. Neste trabalho utilizamos um modelo experimental de DXB com o objetivo de verificar os efeitos dos CACR que se acumulam nessa desordem neurodegenerativa sobre o citoesqueleto de células neurais de ratos. Nesse modelo fatias de córtex cerebral de ratos de diferentes idades, ou culturas de células neurais foram incubados com concentrações variando de 0,1 a 10 mM de cada metabólito. Inicialmente demonstramos que o CIC, CMV e CIV inibiram a captação de glutamato em fatias de córtex cerebral de ratos durante o desenvolvimento. O CIC inibiu a captação de glutamato em ratos de 9, 21 e 60 dias de idade, enquanto o CMV e o CIV inibiram a captação de glutamato em animais de 21 e 60 dias. Observamos que o CIC alterou a fosforilação de proteínas do citoesqueleto de um modo dependente do desenvolvimento através de receptores glutamatérgicos ionotrópicos em fatias de córtex cerebral de ratos. O metabólito causou diminuição da fosforilação dos filamentos intermediários (FI) em ratos de 9 dias de idade e aumento dessa fosforilação em animais de 21 dias de vida. Também demonstramos que em animais de 9 dias de idade o efeito do CIC foi mediado pelas proteínas fosfatases PP2A e principalmente pela PP2B, uma proteína fosfatase dependente de cálcio, enquanto que em animais de 21 dias de idade o efeito deste metabólito foi mediado pela proteína quinase dependente de AMP cíclico (PKA) e pela proteína quinase dependente de cálcio e calmodulina (PKCaMII). Além disso, verificamos que o CIC promoveu um aumento nos níveis intracelulares dos segundos mensageiros AMPc e Ca2+. O aumento do Ca2+ intracelular provocado pelo CIC foi demonstrado pelo uso de bloqueadores específicos de canais de cálcio dependentes de voltagem tipo L, por exemplo, nifedipina, canais de cálcio dependentes de ligantes, por exemplo, NMDA e de quelantes de cálcio intracelular, por exemplo, BAPTA-AM. Por outro lado, o CMV aumentou a fosforilação de FI somente em ratos de 12 dias de idade, sendo esse efeito mediado por receptores GABAérgicos do tipo A e B, desencadeando a ativação das proteínas quinases PKA e PKCaMII. É importante salientar que o CIV não alterou a atividade do sistema fosforilante em nenhuma das idades estudadas. Além dos efeitos causados pelos CACR que se acumulam na DXB sobre a atividade do sistema fosforilante associado aos FI em fatias de córtex cerebral de ratos, demonstramos que esses metabólitos foram capazes de alterar a fosforilação da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) na linhagem de glioma C6. Essa alteração de fosforilação causou uma reorganização do citoesqueleto de GFAP e um aumento no imunoconteúdo da GFAP na fração citoesquelética. Também verificamos que o CIC, o CMV e o CIV, em concentrações encontradas em pacientes portadores de DXB, levaram a uma reorganização dos filamentos de GFAP e do citoesqueleto de actina de astrócitos em cultura, causando uma importante alteração na morfologia destas células. As alterações do citoesqueleto levaram a morte celular progressiva quando os astrócitos foram expostos por várias horas aos metabólitos. Demonstramos também que os efeitos dos CACR sobre a morfologia dos astrócitos foram desencadeados por mecanismos de membrana que diminuíram a atividade da Rho GTPase. Esse mecanismo foi evidenciado utilizando-se ácido lisofosfatídico (LPA), um ativador específico da RhoA, o qual preveniu os efeitos causados pelos CACR em culturas de astrócitos. É importante salientar que as alterações morfológicas e a morte celular induzida pelos CACR em culturas de astrócitos foram totalmente evitadas com a suplementação de creatina às culturas. Também verificamos que a atividade da creatina quinase foi inibida pelos metabólitos, indicando que a homeostase energética provavelmente estaria envolvida nos efeitos causados pelos CACR. XI Sabe-se que as alterações do citoesqueleto estão relacionadas com inúmeras doenças neurodegenerativas. Portanto, é provável que as alterações causadas pelos CACR nos mecanismos de membrana que regulam níveis de segundos mensageiros intracelulares e cascatas de sinalização celular, na perda do equilíbrio fisiológico do sistema fosforilante associado ao citoesqueleto e conseqüentemente na sua reorganização, possam ter importantes conseqüências para a função neural. Com base nos presentes resultados demonstramos que os CACR que se acumulam na DXB levam à desorganização do citoesqueleto em um modelo experimental podendo ser uma contribuição importante para o estudo da patogênese do sistema nervoso central característica dos pacientes portadores de DXB.

Da escola do hardware para a escola do software : o processo educativo sob a lógica da compressão do tempo e do espaço

A presente pesquisa aborda os movimentos desencadeados na instituição escolar com a chegada dos ambientes informatizados nas escolas da rede municipal de Porto Alegre, tendo como interface de investigação as categorias de tempo e de espaço. Problematizo a relação escolarizaçãotecnologia no contexto de um cenário social que emerge na hegemonia tecnológica digital das redes de informação e comunicação, para que se tornem evidentes as configurações de tempo e de espaço forjadas no palco de uma proposta de organização da escola pública municipal que, ao reorganizar tempo e espaço escolares, marca a saída do modelo da escola seriada e a entrada da escola por ciclos de formação e autoriza uma forma de escolarização que coloca de forma oficial a materialidade e os saberes da informática educativa na rede de ensino municipal de Porto Alegre. Sob a lógica de uma perspectiva de investigação histórica e cultural, desnaturaliza-se a inserção da informática no tempo e no espaço ao considerá-la como não-imune aos efeitos do contemporâneo fenômeno de compressão do tempo e do espaço. Percorrendo as diferentes experiências espaço-temporais e as configurações assumidas pela sociedade ocidental, ganham visibilidade formas de escolarização que, num processo histórico, conquistaram legitimidade e produziram a escola pública, gratuita, obrigatória, tecnológica e ajustada às transformações e exigências de um cenário social regido por uma imensa acumulação de espetáculos. Continuidades e descontinuidades marcam a inserção das tecnologias de informação e de comunicação na maquinaria escolar, e o disciplinamento cognitivo e comportamental conquista novos dispositivos. Em um corpus de análise em que se entrelaçam documentos, entrevistas, observações e o complexo e ambivalente fenômeno implementado pela permanente revolução das redes digitais de comunicação e de informação, é que a inserção do saber e da materialidade da Informática na Educação no tempo e no espaço escolares passa a ser tematizada. Como um jogo de cara e coroa que, ao revelar sua face de veneno, tornando mais eficiente o controle individual e coletivo, faz, também, girar a moeda, para que o potencial participativo, socializante e emancipador da rede mundial de computadores aponte para a face do próprio remédio. A partir dessa faceta condicionante e nãodeterminista da relação escolarização-tecnologia, tempos e espaços para colonizar são problematizados a fim de fazer emergir, na mesma intensidade, tempos e espaços para fruir, para deixar espraiar a sensibilidade e a interação humanas, para potencializar o aprendizado e a aquisição dos saberes.

Primitivas para suporte à distribuição de objetos direcionados à pervasive computing

Renovados são os desa os trazidos à computação distribuída pelos recentes desenvolvimentos nas tecnologias de computação móvel. Tais avanços inspiram uma perspectiva na qual a computação tornar-se-á uma entidade ubíqua em um futuro próximo, estando presente nas mais simples atividades do dia-a-dia. Esta perspectiva é motivadora das pesquisas conduzidas no escopo do projeto ISAM, as quais investigam as questões relativas ao uso da computação em ambientes móveis de larga escala. Neste trabalho é apresentado o sistema PRIMOS (PRIMitives for Object Scheduling), o qual busca, pela complementação da plataforma Java, satisfazer as emergentes necessidades do ISAM. Especi camente, o PRIMOS constitui um conjunto de primitivas para instanciação remota e migração de objetos, comunicação e monitoração, direcionadas a um ambiente de computação distribuída de larga escala de características pervasivas. A primitiva de instanciação remota disponibilizada pelo PRIMOS aumenta a plataforma Java padrão com a possibilidade de criar e ativar objetos em nodos remotos do sistema. Por sua vez, a primitiva de migração faculta a relocação de objetos. A consecu- ção de tais semânticas tem como sub-produto a de nição de semânticas para ativação e desativação de objetos, assim como para captura e restauração de contexto de execução. Sob a perspectiva da comunicação, o PRIMOS de ne um esquema de endereçamento independente de protocolo de transporte, assim como uma interface neutra para acesso às facilidades de comunicação. A integração destas funcionalidades ao mecanismo de invocações remotas da plataforma Java, o RMI, permite a desvinculação deste da pilha TCP/IP. Por conseguinte, habilita a adoção de transportes otimizados ao hardware de comunicação disponibilizado pelo sistema. No que se refere à monitoração, o PRIMOS de ne um esquema exível e extensível baseado em sensores. A exibilidade vem principalmente da possibilidade dos sensores terem seus parâmetros de operação recon gurados a qualquer momento em resposta a novas necessidades do sistema. Por outro lado, o sistema é extensível pois o conjunto de sensores básicos, ditos nativos, pode ser aumentado por sensores providos pela aplicação. Com intuito de validar as idéias postuladas, um protótipo foi construído para o sistema. Sobre este, baterias de testes foram realizadas para cada uma das primitivas constituintes do PRIMOS.

Uma análise de aplicação do conceito funcional de integração mercadológica (4 AS) ás empresas que operam na prestação de serviços de fotoacabamento a cores no mercado brasileiro

Tomou-se por propósito da dissertação desenvolver um modelo sistêmico dos 4 AS - análise, adaptação, ativação e avaliação - como base comportamental para o planejamento e administração das atividades de marketing de uma empresa prestadora de serviços de fotoacabamento a cores. A abordagem adotada para enfatizar o problema central do estudo dividiu-se em dois estágios. Dentro deste enfoque, o estudo apresenta inicialmente a formulação do problema central, as hipóteses centrais desenvolvidas, os objetivos da dissertação e uma síntese da abordagem do problema.

Intervenções no sistema adenosinérgico : avaliação de aspectos neuroquímicos, locomotores e nociceptivos

A adenosina está presente em todos os tipos celulares exercendo um papel homeostático. Em sistema nervoso central e periférico seu papel neuromodulador é observado. A presença de adenosina no meio extracelular permite a ativação de receptores adenosinérgicos específicos, classificados em: A1, A2A, A2B e A3. A ativação dos receptores A1 e A2A, receptores de alta afinidade, está diretamente envolvida com o papel neuromodulador, visto que a sua ativação produz inibição e facilitação da liberação de neurotransmissores, respectivamente. A seleção de qual receptor será ativado, visto que exibem co-expressão em muitas regiões neurais, pode ser feita de acordo com os sítios de liberação ou produção de adenosina extracelular. Desta forma, receptores A1 seriam preferencialmente ativados pela adenosina liberada através dos transportadores bidirecionais de nucleosídeos e os receptores A2A preferencialmente ativados pela adenosina proveniente da degradação do ATP realizada por uma cascata enzimática. A hidrólise de ATP a adenosina é realizada pelas enzimas ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolases e ecto-5’-nucleotidase. Em ratos, a ativação do sistema adenosinérgico exerce seus efeitos neuromoduladores desde fases iniciais de desenvolvimento embrionário, alcançando o padrão adulto mesmo antes do nascimento. A ativação de receptores de adenosina na fase fetal e neonatal foi demonstrada ter como conseqüência o retardo no desenvolvimento global dos animais, bem como, ventriculomegalia e perda de massa cerebral branca. Esta informação levanta a questão da suscetibilidade do cérebro imaturo a certas drogas, tais como a cafeína. A cafeína é uma metilxantina com efeitos estimulantes, a qual exibe como base para seus efeitos o bloqueio inespecífico dos receptores de adenosina. No presente estudo, avaliou-se o efeito da administração de cafeína em diversos parâmetros. A administração aguda de cafeína, mas não a crônica, em ratos adultos foi capaz de alterar significativamente as atividades de hidrólise de ATP no hipocampo e de ADP no estriado. Este resultado poderia estar relacionado com a capacidade plástica do sistema adenosinérgico em restabelecer seu tônus em ratos adultos tratados cronicamente com cafeína. Além disto, verificou-se que a ação direta da cafeína afetou a produção de adenosina. A administração crônica de cafeína na água de beber de ratas mães durante a fase gestacional e lactacional alterou o padrão de hiperlocomoção induzido por MK-801, um antagonista de receptores NMDA glutamatérgicos, nos ratos filhotes aos 21 dias de vida, mesmo quando o acesso a cafeína foi retirado sete dias antes do teste. Além disto, o mesmo tratamento não alterou o limiar de dor de filhotes aos 14 e 50 dias de vida, bem como a analgesia induzida nestes animais aos 50 dias. Entretanto, quando os animais ainda recebiam cafeína no dia do teste, foi observado efeito analgésico somente nos ratos de 14 dias. A análise dos efeitos do tratamento sobre a degradação de acetilcolina e sobre a degradação de nucleotídeos em hipocampo de ratos jovens demonstrou que ambas as atividades foram alteradas. O conjunto de resultados desta tese indica que a intervenção no sistema adenosinérgico durante as fases gestacional e neonatal é capaz de desenvolver adaptações, provavelmente relacionadas ao aumento da expressão de receptores para adenosina, na tentativa de restabelecer o controle modulador adenosinérgico, considerada a importância dos sistemas avaliados para a manutenção do organismo.

Efeito da ingestão crônica de cafeína na atividade de enzimas antioxidantres, peroxidação de lipídeos e na produção de radicais livres em diferentes regiões do sistema nervoso central de ratos adultos

Estresse oxidativo é um desequilíbrio entre a geração de radicais livres e a capacidade de defesa do sistema antioxidante endógeno. Sabe-se também que o acúmulo extracelular de aminoácidos excitatórios leva a uma exacerbada estimulação de seus receptores, provocando insultos oxidativos no cérebro e pode levar a uma série de eventos que podem ser os causadores de diversas patologias como isquemia e doenças neurodegenerativas. A adenosina, ao ligar-se aos seus receptores, age como neuromoduladora da liberação desses neurotransmissores, protegendo as células contra o estresse oxidativo. Alem disso, sabe-se que a ativação de receptores de adenosina promove um aumento da atividade de enzimas antioxidantes. A Cafeína tem sua principal ação farmacológica através do antagonismo não seletivo dos receptores de adenosina, causando o bloqueio dos mesmos, e neste caso leva ao acúmulo de neurotransmissores no meio extracelular. Entretanto em altas concentrações, ela pode, por si só, ter ação antioxidante, “seqüestrando” radicais livres e, desta maneira, protegendo a célula do dano oxidativo. Por outro lado, alguns estudos demonstram que ela também pode ter ação pró-oxidante, quando em presença de altas concentrações de íons cobre e pode ter ação pró-apoptótica, via ativação da caspase 3. O objetivo deste trabalho foi a caracterização do efeito da ingestão crônica de cafeína (1g/L) por 7dias, sobre a atividade de enzimas de defesa antioxidantes (CAT, GSH-Px, SOD) em homogenato de hipocampo, cerebelo e estriado de ratos Wistar adultos. Nós também medimos a produção de radicais livres e a peroxidação de lipídeos Os resultados obtidos demonstraram que cafeína, administrada cronicamente, causa um aumento na peroxidação dos lipídeos de membranas e uma diminuição nas atividades das enzimas antioxidantes SOD e GSH-Px, nas três estruturas analisadas quando comparadas ao controle, porém não foi observada alteração na atividade da catalase. Além disso, não encontramos alteração nos níveis de produção de radicais livres. Portanto, embora alguns trabalhos demonstrem que a ingestão crônica de cafeína pode ter uma ação neuroprotetora, em nosso trabalho nós demonstramos que cafeína pode potencialmente provocar dano celular em estruturas cerebrais através da diminuição das enzimas antioxidantes. Provavelmente, esse efeito seja devido a uma diminuição da expressão e/ou número de receptores de adenosina (A1 ou A2) ou a cafeína está agindo somente como antagonista competitivo, bloqueando a ação da adenosina endógena. Outros experimentos são necessários para comprovar esta hipótese.

Papel pró-inflamatório do receptor CD40 em ilhotas pancreáticas

O transplante de ilhotas humanas, utilizado como reposição das células produtoras de insulina em pacientes portadores de diabetes mellitus tipo 1, está se tornando uma importante prática clínica. Entretanto, eventos inflamatórios não específicos presente nas ilhotas, são responsáveis pela vulnerabilidade das mesmas, e contribuem à diminuição do número celular durante o processo de isolamento e posterior transplante. CD40 é um membro da família do receptor de necrose tumoral, descrito em uma variedade de células. Em condições fisiológicas, o CD40 presente nas células apresentadoras de antígenos participa como molécula co-estimulatória na ativação dos linfócitos T. Porém, o CD40 também foi descrito em condições patológicas, como psoríase, aterosclerose e fibrose cística, onde sua expressão está envolvida em eventos crônicos inflamatórios. É interessante ressaltar que, o CD40 também tem sido descrito em neurônios, células que apresentam uma variedade de moléculas similares às expressas nas células M pancreáticas. Em vista desses achados, tentou-se determinar se a células M também poderiam expressar o receptor de CD40, e se presente, determinar possíveis conseqüências próinflamatórias após a sua ativação. Utilizaram-se diversas técnicas como RT-PCR, western blot, citometria de fluxo, imuno-histoquímica assim como imunofluorescência, para detectar a expressão de CD40 em ilhotas de camundongo, macaco e humano, e também na linhagem de células M NIT-1. Determinaram-se as vias de transdução de sinais de CD40 por western blot e ensaios com gene repórter. Foi determinada por tecnologia luminex, a secreção de citocinas e quimiocinas dependente de CD40 em ilhotas humanas, estimuladascom a proteína recombinante CD40L e em alguns casos confirmada por RT-PCR e imunofluorescência. Os resultados demonstram a expressão de CD40 nas células M, que pode ser aumentada pela ação de citocinas pró-inflamatórias, cuja ativação induz a secreção de mais citocinas e quimiocinas (IL-6, IL-8, MCP-1 e MIP-1M) dependentes das vias de transdução de sinais Raf/MEK/ERK e NF-VB. A interação CD40-CD40L aumentou a expressão de ICAM-1 e a induziu morte celular nas células M pancreáticas. Nesse sentido, a ativação de CD40 induz a secreção de mediadores solúveis próinflamatórios que podem comprometer a viabilidade das células M. O cenário próinflamatório sustentando pela ação de CD40 sugere que o mesmo poderia ter um papel ativo orquestrando um processo inflamatório

Desenvolvimento de ferramentas moleculares para indução de tolerância imunológica em transplante

As vacinas de DNA têm sido utilizadas para a indução de imunidade contra antígenos virais e bacterianos. A aplicação de modelos experimentais tem sido explorada visando a indução de tolerância imunológica através da expressão de genes cujos produtos podem modular o sistema imune para um estado de não responsividade. A terapia gênica oferece a possibilidade de manipulação do sistema imune do receptor, através de um sistema de administração de genes específicos sob condições pré-definidas. Sua eficácia depende dos níveis de expressão e da natureza do antígeno, da via de administração assim como de sua distribuição nos tecidos (a qual às vezes depende do promotor utilizado). Porém, sua aplicação clínica é limitada em parte devido aos baixos níveis de expressão obtidos in vivo. A VP22 é uma proteína do tegumento do vírus Herpes simples tipo 1, que tem a propriedade de fazer tráfego intercelular. Estudos recentes têm demonstrado a alta eficiência desta molécula no transporte de proteínas heterólogas como VP22-p53, VP22-β galactosidase e VP22-proteína verde fluorescente. Para a indução de tolerância imunológica, tem sido demonstrado que a persistência do antígeno, pelo menos por algum período, é muito importante. Moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) têm sido utilizadas para induzir tolerância a nível central ou periférico, em diferentes protocolos. Dentre estas, as moléculas da classe I do camundongo, Kb, têm sido utilizadas com sucesso. O objetivo desse trabalho foi de construir duas vacinas recombinantes: pVP22::Kb e pCIneo::Kb. A primeira contém dois genes clonados na mesma pauta de leitura: a cadeia pesada de classe I Kb e VP22. O cDNA que codifica para o Kb foi obtido pela extração de RNA total de baço de um camundongo C57BL/6 (haplótipo H-2b) seguido de transcrição reversa. Este produto foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase. Esta molécula também foi obtida pela amplificação direta do gene Kb previamente clonado no sítio EcoR I do plasmídeo pBluescriptIISK (Stratagene®). Ambos os produtos de PCR foram subclonados com extremidades cegas no plasmídeo pCRBluntII (Invitrogen®). Foram obtidos dezenove plasmídeos recombinantes, denominados pCRBluntII::Kb, e um deles foi escolhido e digerido com as enzimas de restrição Spe I e Xba I e defosforilado com a enzima fosfatase alcalina (CIAP). O fragmento digerido foi clonado nos plasmídeos pVP22-myc/His (Invitrogen®) e pCIneo (Promega®) previamente digeridos com a enzima Xba I. Os novos plasmídeos pVP22::Kb e pCIneo::Kb foram utilizados para transfectar a linhagem celular eucariótica CHO. A expressão do mRNA para o Kb foi confirmada pela transcrição reversa e PCR e a expressão da proteína por imunofluorescência e citometria de fluxo.

Diferenciação das espécies Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii utilizando a metodologia de PCR multiplex e determinação do perfil epidemiológico de pacientes com meningite criptocócica

Cryptococcus neoformans é uma levedura oportunista que pode se alojar no sistema nervoso central causando meningite, meningoencefalite e encefalite principalmente em indivíduos com algum comprometimento do sistema imune. É responsável por 4,5% das infecções oportunistas que acometem pacientes portadores do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV-positivos). Cryptococcus gattii é um patógeno primário responsável por uma alta incidência de criptococomas no pulmão e no cérebro e que apresenta uma alta morbidez neurológica e uma resposta retardada à terapia antifúngica. O diagnóstico da criptococose é, atualmente, baseado na detecção da levedura em amostras clínicas, no cultivo com posterior identificação bioquímica e na pesquisa de antígenos circulantes. A diferenciação entre as espécies C. neoformans e C. gattii, na maioria dos laboratórios, é realizada utilizando o meio de cultura ágar canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) e demora em torno de sete dias. Neste trabalho foi padronizada uma metodologia de PCR multiplex que pode vir a substituir as provas bioquímicas utilizadas atualmente para a identificação das espécies de Cryptococcus, reduzindo em 6 dias o tempo necessário para a identificação das espécies. A metodologia também se mostrou mais específica na identificação das espécies, concordando com os resultados das sorotipagens em todos os 132 isolados de Cryptococcus testados, enquanto o resultado obtido com o cultivo em ágar CGB foi discordante em 6 dos 132 isolados, sendo 5 falso-positivos e 1 falso negativo. Foi também realizado o primeiro estudo epidemiológico do perfil de pacientes com meningite criptocócica no estado do Rio Grande de Sul notificados no Laboratório Central de Saúde Pública IPB-LACEN/RS no período de 2000 a 2005. A maioria dos pacientes é do sexo masculino (77,12%), branco (83,5%), na faixa etária entre 30 a 39 anos (46,24%) e infectados pelo HIV (95%).

Obtenção e avaliação da proteína BYC (Boophilus Yolk pro-Cathepsin) recombinante em uma vacina contra o carrapato Boophilus microplus

O carrapato Boophilus microplus é um ectoparasita hematófago que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grande prejuízo à pecuária. O principal método de controle deste parasita baseia-se no uso de acaricidas, entretanto, o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle promissor. A Boophilus Yolk pro-Cathepsin (BYC) é uma aspártico proteinase presente no ovo do carrapato e envolvida na embriogênese que foi anteriormente testada como imunógeno vacinal. Neste estudo, o cDNA da BYC foi amplificado por PCR e clonado em dois vetores de expressão para produção de duas formas da proteína recombinante com cauda de histidina, rBYC e rBYC-Trx (fusionada com tioredoxina). As duas formas foram expressas em Escherichia coli na forma de corpúsculos de inclusão (CI) e comparadas quanto ao nível de expressão, solubilidade e rendimento na purificacão. Três agentes desnaturantes (N-lauroil sarcosina, hidrocloreto de guanidina e uréia) foram testados para solubilização dos CIs. Sarcosina foi o agente mais eficiente, solubilizando mais de 90 % de rBYC-Trx e rBYC. As duas proteínas recombinantes foram purificadas em cromatografia de afinidade por metal (Ni2+), sob condições desnaturantes. O rendimento na purificação da proteína solúvel foi de 84 % para r-BYC-Trx e 6 % para rBYC. As duas formas foram reconhecidas por soro de coelhos, camundongos e bovinos previamente imunizados com BYC nativa, demonstrando a existência de epítopos comuns entre a BYC nativa e as formas recombinantes expressas em E. coli. Para verificar o potencial vacinal da proteína recombinante, um grupo de bovinos Hereford foi imunizado com rBYC e desafiado com 20.000 larvas de B. microplus por animal. Os soros dos bovinos imunizados reconheceram a BYC nativa em ELISA e “Western blot”, com títulos entre 500 e 4.000. Os resultados do desafio mostraram uma proteção parcial contra a infestação, com 25 % de proteção global. O perfil de expressão de citocinas (IL-2, IL-4, IL-10, IFN-γ) foi verificado por RT-PCR, porém os resultados não permitiram identificar a polarização da resposta imune em Th1 ou Th2. Os resultados de imunoproteção obtidos com a BYC recombinante foram similares aos obtidos na imunização de bovinos com BYC nativa, indicando a possibilidade de uso da forma recombinante como imunógeno vacinal.

Avaliação do potencial genotóxico de amostras ambientais da região hidrográfica da bacia do Lago Guaíba

O uso de bioensaios genéticos é uma importante ferramenta na avaliação da contaminação ambiental. Esta poluição, que em grande parte tem origem nas atividades humanas, é liberada no ambiente tendo como destino final, preferencialmente, os corpos d’água. No Rio Grande do Sul, a maior parcela da população e da produção interna do estado estão localizados na Região Hidrográfica do Lago Guaíba, sendo este, por conseqüência, um grande receptor de contaminantes urbanos, industriais e rurais. Neste contexto, o bivalve exótico Limnoperna fortunei (mexilhão dourado) foi escolhido, com base em dados de sua população e distribuição, como possível organismo biomonitor nesta região. Neste estudo, foram padronizadas as metodologias do ensaio cometa e teste de micronúcleos para hemócitos de L. fortunei. A sensibilidade dos mexilhões in vitro, foi avaliada pela exposição das células à radiação ultravioleta e in vivo pela exposição dos organismos aos agentes químicos com potencial genotóxico sulfato de cobre e pentaclorofenol. A radiação ultravioleta induziu uma relação dose resposta, com dano máximo, detectado pelo ensaio cometa, na dose de 4.2 J/m2. Para as avaliações in vivo, os organismos foram expostos aos agentes químicos por duas horas para o ensaio cometa e 24 e 48 horas para o teste de micronúcleos. Ambos compostos induziram danos gerando uma curva dose-resposta. O sulfato de cobre induziu a maior genotoxicidade na dose de 20 μg/ml, apresentando toxicidade em 48 horas de exposição. Para pentaclorofenol, o máximo de dano foi observado na exposição de 150 μg/L em ambos os ensaios. Animais expostos a pentaclorofenol apresentaram 100% de reparação do DNA 2 horas após a exposição. Em exposição dos mexilhões por sete dias a amostras ambientais contaminadas por compostos genotóxicos, também foi possível a detecção de danos por ambos os ensaios. Após a padronização das metodologias e verificação da sensibilidade, o mexilhão dourado foi utilizado para avaliar o potencial genotóxico de amostras de água superficial e sedimento da Bacia do Guaíba. As amostras de água e sedimento foram coletadas em oito pontos da Região Hidrográfica do Lago Guaíba, cinco na região de foz dos principais rios formadores do lago Guaíba (Gravataí, Sinos, Caí, Jacuí e Taquarí), um na foz do arroio Dilúvio, que corta a cidade de Porto Alegre, e em dois pontos dentro do lago Guaíba (Guaíba PC e Guaíba BR), próximo a locais de liberação de esgoto urbano (Guaíba BR e Guaíba PC). Foram avaliadas as estações do ano inverno e primavera e verão. Os moluscos foram coletados no Parque Estadual de Itapuã e aclimatados por no mínimo 7 dias em laboratório. Os organismos foram expostos por 7 dias as diferentes amostras ambientais, sendo trocado ¼ do volume de água e sedimento a cada 24h. Foi evidenciada indução de dano ao DNA pelas amostras do rio Jacuí, possivelmente relacionado com atividades de extração de carvão nesta região. As amostras do rio Taquari também induziram genotoxicidade, provavelmente como conseqüência da intensa liberação de efluentes da indústria alimentícia na região. Foi possível observar uma fraca relação entre a presença de elementos inorgânicos, detectada pelo método de PIXE (Próton Induced X Ray Emission), no corpo mole dos moluscos e a indução de danos ao DNA. No entanto, mais de 60% dos resultados positivos encontrados em ambos os ensaios, foram relacionados a locais com ampla liberação de esgoto (rio Gravataí, do arroio Dilúvio e os dois locais de coleta no lago Guaíba). Entendendo que a contaminação de origem urbana parece ser o maior problema dentro desta Região Hidrográfica, dois dos locais de coleta que sofrem com esta influência, Guaíba BR e Guaíba PC, foram mais detalhadamente avaliados em duas estações do ano, inverno e verão. Amostras de água superficial e de lixiviado de sedimento foram testadas por método direto quanto à indução de mutagênese pelo ensaio Salmonella/microsoma. Exemplares de L. fortunei, também foram avaliados em dois tipos de exposição: in situ, onde exemplares coletados diretamente nos locais avaliados foram avaliados sem tratamento no laboratório e exposição em laboratório, onde os animais foram coletados em Itapuã e expostos as amostras em laboratório. Apenas uma amostra de água superficial, Guaíba BR no inverno, apresentou mutagenicidade na linhagem TA98 em presença de ativação metabólica. Esta mesma amostra induziu danos ao DNA, detectados pelo ensaio cometa, em hemócitos de moluscos expostos em laboratório e coletados in situ e também aumentou a freqüência de micronúcleos em animais expostos in situ. As amostras do ponto Guaíba PC induziram aumento significativo de micronúcleos em moluscos expostos tanto em laboratório quanto in situ. A influência de elementos inorgânicos, detectados pelo método de PIXE nas amostras de água e no corpo mole dos moluscos, parece ser menos importante do que a contaminação por compostos orgânicos. Estes resultados salientam a forte influência de contaminantes orgânicos nesta região, destacando o biomonitoramento com o mexilhão dourado como uma importante ferramenta no diagnóstico deste tipo de contaminação.

Toxicidade induzida pelos peptídeos AB42 e AB25-35 em modelo de cultura organotípica de hipocampo de ratos

O crescimento da expectativa de vida média da população mundial tem sido acompanhado do aumento na prevalência de doenças neurodegenerativas, como a doença de Parkinson, isquemia cerebral e, especialmente, a doença de Alzheimer. A doença de Alzheimer (DA) caracteriza-se por um crescente declínio na função mental e memória do paciente. Estes sintomas são explicados por uma profunda perda neuronal e pela presença de alterações estruturais no tecido cerebral: as placas senis, extracelulares e os emaranhados neurofibrilares, intracelulares. O passo que desencadeia a neurodegeneração na DA é ainda objeto de estudo, mas a hipótese mais aceita atualmente é a de que a secreção anormal do peptídeo β amilóide (Aβ), principal componente das placas senis, dê início ao processo. O presente trabalho teve como objetivos investigar a toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42 e seu fragmento, o peptídeo Aβ25-35 em culturas organotípicas de hipocampo de ratos. Na primeira parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pela exposição de culturas organotípicas de hipocampo de ratos a 10 ou 20 μM do peptídeo Aβ1-42, por 24 ou 72 h. Além disso, investigamos o envolvimento das proteínas iNOS e GSK-3β no mecanismo de morte celular induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Na segunda parte do trabalho, investigamos a toxicidade induzida pelo fragmento Aβ25-35 na concentração de 25 μM, nos tempos de 1, 3, 6, 12, 24 ou 48 h de exposição às culturas organotípicas, e seu efeito sobre as proteínas Akt, GSK-3β e PTEN. A morte celular foi quantificada pela incorporação do iodeto de propídeo, corante marcador excluído de células sadias, e as proteínas foram quantificadas por imunodetecção com o uso de anticorpos específicos. Nossos resultados mostraram que o peptídeo Aβ1-42 apresentou toxicidade nas concentrações de 10 e 20 μM, induzindo a uma considerável morte celular após 72 h de exposição. A análise do imunoconteúdo da proteína iNOS mostrou um aumento significativo em relação ao controle, após 72 h de exposição ao peptídeo e na concentração de 20 μM. Os resultados obtidos na segunda parte do trabalho mostraram uma morte celular significativa apenas após 48 h de exposição ao peptídeo Aβ25- 35 na concentração de 25 μM. O tratamento com peptídeo Aβ25-35 levou ao aumento no estado de fosforilação da proteína Akt após 6 h de exposição e também da proteína GSK-3β, um potencial substrato da Akt. Após 12 h de exposição ao peptídeo, observamos uma diminuição de ambas as proteínas (Akt e GSK-3β). Porém, após 24 h de exposição ao peptídeo, a proteína Akt continua menos fosforilada enquanto que a proteína GSK-3β apresenta um novo pico de fosforilação. O imunoconteúdo da proteína fosfatase PTEN apresentou um aumento significativo em 24 h e 48 h. Os resultados do presente estudo mostraram que o tratamento das culturas organotípicas de hipocampo de ratos com o peptídeo Aβ1-42 como com o fragmento Aβ25-35 apresentou toxicidade após um período de aproximadamente 48 h de tratamento, e mostrou ser um bom modelo para o estudo de sua toxicidade. Com relação ao mecanismo investigado, os dados sugerem que a proteína iNOS pode estar envolvida na toxicidade induzida pelo peptídeo Aβ1-42. Além disso, sugerem que o fragmento Aβ25-35 possa exercer sua toxicidade através da inibição da via de sobrevivência celular PI3-K, por diminuir a fosforilação/ativação da proteína Akt, parecendo envolver a proteína fosfatase PTEN, principal regulador negativo da via PI3-K/Akt.

Imunorreatividade à proteína c-FOS na medula espinal lombossacral e no gânglio da raiz dorsal de râs Rana catesbeiana 3 dias após a secção nervosa periférica

A dor constitui uma experiência complexa, mediada por distintos sistemas de transmissão sendo integrados por diversos mecanismos neurais. Um dos modelos mais empregados para o estudo da dor neuropática é a secção nervosa periférica, a qual resulta em alterações neuroquímicas e neuroanatômicas em neurônios sensoriais primários e em seus territórios de projeção. Após a secção do nervo ciático, os mamíferos apresentam um aumento na expressão de genes precocemente expressos, como o c-Fos e o c-Jun, no corno dorsal da medula espinal. Animais não mamíferos, como os anfíbios, também vem sendo utilizados como modelos para os estudos dos mecanismos acerca da nocicepção. No presente estudo foi analisado o padrão de imunorreatividade à proteína c-Fos na medula espinal lombossacral e no gânglio da raiz dorsal (GRD) de rãs Rana catesbeiana em condições basais, bem como de rãs submetidas à manipulação e à secção do nervo ciático. Para isso foram utilizados animais adultos, de ambos os sexos, sendo que os mesmos foram sacrificados 3 dias após o procedimento cirúrgico. A técnica imunoistoquímica utilizada foi a do anticorpo não marcado de Sternberger (1979), sendo utilizado anticorpo primário do tipo policlonal, na concentração de 1:700. As alterações no padrão de imunorreatividade a esta proteína no GRD dos três grupos experimentais foram quantificadas através das técnicas de densitometria óptica e contagem neuronal. Para a quantificação da proteína c-Fos na medula espinal lombossacral dos 3 grupos experimentais, utilizou-se a técnica de western blot. Em GRD, a imunorreatividade foi mais pronunciada no citoplasma de neurônios de pequeno (10-20μm), médio (25-35μm), e grande 40-50μm) diâmetro dos 3 grupos experimentais. A manipulação e a secção do nervo ciático provocou aumento no número de núcleos imunorreativos de células de pequeno diâmetro. A densitometria óptica foi significativamente maior no citoplasma das células dos GRDs localizados ipsilateralmente quando comparada com aquela das células pertencentes aos GRDs localizados contralateralmente à lesão. Todavia, não houve diferenças estatisticamente significativa entre a imunorreatividade nuclear nos GRDs entre os 3 grupos experimentais. O número de células imunorreativas nestes gânglios não mostrou mudanças significativas nos 3 grupos experimentais. Na medula espinal, a imunorreatividade à proteína c-Fos ocorreu predominantemente em núcleos localizados nos campos terminais dorsal e ventral, na banda mediolateral, na região ventral medial do corno ventral e nos funículos lateral e ventral medial. Os neurônios motores sempre foram imunorreativos. A manipulação e a secção do nervo ciático resultaram em um acréscimo no número de núcleos imunorreativos localizados nos campos terminais dorsal e ventral, e banda mediolateral, sendo este aumento maior na região do campo terminal dorsal. As demais regiões não mostraram modificações significantes no padrão de imunorreatividade da proteína c-Fos. A expressão desta proteína não modificou significativamente nos 3 grupos experimentais. Estes resultados mostram que, em rãs, similar ao que ocorre em mamíferos, a ativação de fibras aferentes primárias ativam a proteína c-Fos. No entanto, diferente de mamíferos, esta proteína ocorre no citoplasma de células sensoriais. Assim, apesar das rãs constituírem excelentes modelos para o estudo do papel do c-Fos nos mecanismos da transmissão nociceptiva, os estudos futuros abordando esta questão deverão considerar esta particularidade das rãs.

Efeitos do composto 3'3-ditrifluormetildifenil disseleneto em diferentes modelos biológicos

O 3’3-ditrifluormetildifenil disseleneto (DFDD) é um composto organoselenado análogo ao disseleneto de difenila (DPDS). No entanto, diferentemente do DPDS, maiores estudos em relação às atividades biológicas do DFDD ainda permanecem escassos na literatura. Com o objetivo de ampliar o conhecimento dos efeitos biológicos do DFDD, nesse estudo investigou-se a interferência desta molécula no neurocomportamento em camundongos. Além disso, as atividades genotóxicas deste organoselenado em linhagens de Salmonella typhimurium, Saccharomyces cerevisiae e em células de mamíferos em cultura (células V79) também foram avaliadas. Nos ensaios neurocomportamentais em camundongos, o DFDD apresentou uma interessante atividade bloqueadora da estereotipia induzida por apomorfina, que é um modelo animal de esquizofrenia, sem agir sobre outros parâmetros importantes como a memória, ansiedade, exploração e locomoção detectados nas tarefas de esquiva inibitória, campo aberto e habituação a um novo ambiente. Demonstrou-se também neste trabalho que o DFDD não foi mutagênico no Teste Salmonella/microssoma tanto na presença quanto na ausência de ativação metabólica. Entretanto, em linhagens de S. cerevisiae, o DFDD induziu mutações “forward” e reversa, porém lócus não-específico. Diferentemente do seu análogo estrutural DPDS, o DFDD não foi capaz de induzir mutações “frameshift” em S. typhimurium ou S. cerevisiae mesmo quando as linhagens foram tratadas em condições de crescimento. Deste modo, sugere-se que o DFDD não é capaz de se intercalar entre as bases do DNA e que, possivelmente, este efeito seja provocado por um impedimento alostérico causado pelos grupamentos CF3 presentes neste organoselenado. Além disso, o DFDD mostrou-se um fraco agente citotóxico e genotóxico em S. cerevisiae e células V79. Por outro lado, como foi demonstrado no Teste Salmonella/microssoma, o DFDD apresentou um efeito protetor contra a mutagenicidade induzida por peróxido de hidrogênio. De maneira interessante, utilizando um ensaio in vitro, mostrou-se que o DFDD possui uma atividade “catalase-like” até o momento não apresentada por nenhum outro composto organoselenado. No presente trabalho tornou-se evidente também que o DFDD atua de maneira distinta do seu análogo DPDS em vários modelos experimentais e que, provavelmente, os grupamentos CF3 presentes no DFDD sejam de fundamental importância para as interessantes atividades demonstradas por este disseleneto.

Essays on banking theory and history of financial arrangements

Esta tese contém dois capítulos, cada um lidando com a teoria e a história dos bancos e arranjos financeiros. No capítulo 1, busca-se extender uma economia Diamond-Dybvig com monitoramento imperfeito dos saques antecipados e realizar uma comparação do bem estar social em cada uma das alocações possíveis, como proposto em Presscott and Weinberg(2003). Esse monitoramento imperfeito é implementado a partir da comunicação indireta ( através de um meio de pagamento) entre os agentes e a máquina de depósitos e saques que é um agregado do setor produtivo e financeiro. A extensão consiste em estudar alocações onde uma fração dos agentes pode explorar o monitoramento imperfeito e fraudar a alocação contratada ao consumirem mais cedo além do limite, usando múltiplos meios de pagamento. Com a punição limitada no período de consumo tardio, essa nova alocação pode ser chamada de uma alocação separadora em contraste com as alocações agregadoras onde o agente com habilidade de fraudar é bloqueado por um meio de pagamento imune a fraude, mas custoso, ou por receber consumo futuro suficiente para tornar a fraude desinteressante. A comparação de bem estar na gama de parâmetros escolhida mostra que as alocações separadoras são ótimas para as economias com menor dotação e as agregadoras para as de nível intermediário e as ricas. O capítulo termina com um possível contexto histórico para o modelo, o qual se conecta com a narrativa histórica encontrada no capítulo 2. No capítulo 2 são exploradas as propriedade quantitativas de um sistema de previsão antecedente para crises financeiras, com as váriaveis sendo escolhidas a partir de um arcabouço de ``boom and bust'' descrito mais detalhadamente no apêndice 1. As principais variáveis são: o crescimento real nos preços de imóveis e ações, o diferencial entre os juros dos títulos governamentais de 10 anos e a taxa de 3 meses no mercado inter-bancário e o crescimento nos ativos totais do setor bancário. Essas variáveis produzem uma taxa mais elevada de sinais corretos para as crises bancárias recentes (1984-2008) do que os sistemas de indicadores antecedentes comparáveis. Levar em conta um risco de base crescente ( devido à tendência de acumulação de distorções no sistema de preços relativos em expansões anteriores) também provê informação e eleva o número de sinais corretos em países que não passaram por uma expansão creditícia e nos preços de ativos tão vigorosa.