Évaluation pré-clinique et clinique de deux nouvelles stratégies dans le traitement des maladies cardiovasculaires : activité anti-thrombotique de l'inhibition du récepteur P2Y1 et activité anti-inflammatoire de l'inhibition du récepteur PAR-1.

Alors que la plaquette a un rôle prépondérant dans le maintient de l'hémostase, son implication dans la formation de la thrombose est également incontestée. Il existe à présent des traitements antiplaquettaires mais ceux-ci présentent quelques failles. Le but de ma maîtrise a donc été de caractériser de nouvelles voies d'inhibition de l'activité plaquettaire. Les deux études qui ont été réalisées concernent l'inhibition de récepteurs couplés aux protéines G, soit le récepteur à l'ADP P2Y1 et le récepteur à la thrombine PAR-1. Dans un premier temps, l'étude du récepteur P2Y1 suggère que l'inhibition de celui-ci seul ou en combinaison avec l'inhibition du récepteur P2Y12 présente un potentiel thérapeutique chez des patients coronariens stables. Dans un deuxième temps, l'étude d'un nouvel antiplaquettaire qui est présentement en phase III de son développement clinique, soit le SCH 530348, a été effectuée. Étant un antagoniste du récepteur PAR-1, le SCH 530348 a des effets qui se répercutent à la fois chez la plaquette et les leucocytes qui possèdent eux aussi ce récepteur. Cette deuxième étude suggère que complémentairement à son effet chez la plaquette, cet inhibiteur diminue les marqueurs de l'inflammation systémique.

Effet des angiopoïétines sur la survie des neutrophiles

Nous avons identifié l’expression du récepteur des angiopoïétines, le récepteur Tie2, à la surface des neutrophiles humains. De plus, nous avons démontré qu’Ang1 et Ang2 induisent des activités pro-inflammatoires sur les neutrophiles, comme l’adhésion aux cellules endothéliales (CEs) et la synthèse du facteur d’activation plaquettaire (PAF). Puisque le PAF augmente la viabilité des neutrophiles et que les angiopoïétines modulent la survie des CEs, nous avons voulu évaluer l’effet des angiopoïétines sur la survie des neutrophiles. Des neutrophiles humains ont été isolés à partir du sang de donneurs sains en accord avec le comité d’éthique de l’Institut de cardiologie de Montréal. La viabilité des neutrophiles a été mesurée par cytométrie en flux à l’aide de marqueurs d’apoptose et de nécrose. Un traitement avec des témoins positifs, soit l’interleukine 8 (IL-8; 25 nM) ou le PAF (100 nM), a augmenté la survie basale des neutrophiles de 34 et 27%, respectivement. De plus, un traitement avec Ang1 (1 pM – 10 nM) a augmenté la survie des neutrophiles jusqu’à 35%, alors qu’Ang2 n’a eu aucun effet. La combinaison de l’IL-8 ou du PAF avec Ang1 (10 nM) a eu un effet additif sur la viabilité des neutrophiles et a augmenté la survie de 56 et 60%, respectivement. Un prétraitement avec des anticorps bloquants contre l’IL-8 a permis d’inhiber l’activité anti-apoptotique de l’IL-8 et d’Ang1 de 92 et 80%, respectivement. Ainsi, notre étude est la première à démontrer la capacité d’Ang1 à prolonger la viabilité des neutrophiles, qui est principalement causée par la relâche d’IL-8.

Assessing the Activity of Agonistic Autoantibodies in Systemic Sclerosis and their Effects on Cultured Vascular Smooth Muscle Cells

La sclérose systémique (ScS) est une maladie auto-immune dévastatrice d'étiologie inconnue. Le dysfonctionnement immunitaire, la fibrose et la vasculopathie sont les trois principales caractéristiques de cette maladie. Une récente étude a révélé un nouveau lien entre l'auto-immunité et la fibrose, par la présence d'auto-anticorps stimulant le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR) des fibroblastes. Ces auto-anticorps sont capables de stimuler les espèces réactives de l'oxygène et d’activer la kinase régulée par un signal extracellulaire (ERK1/2). L’hypothèse que nous formulons est que les cellules musculaires lisses vasculaires (VSMCs) exprimant conjointement les PDGFR, répondront elles aussi aux autoanticorps anti-PDGF-R. Le travail présenté ici vise à valider la présence d'auto-anticorps PDGFR dans les sérums de patients ScS, et à caractériser ensuite la réponse de VSMCs exposées à de l'immunoglobuline G (IgG) de ces sérums, en mesurant l’activation des cascades de signalisation spécifiques, ainsi que l'induction des gènes impliqués dans la réponse fibrotique. Nos résultats démontrent la présence d'une fraction IgG stimulant une réponse phénotypique dans les cultures de VSMCs. Notamment, d’importantes régulations positive et négative des gènes pro-fibrotiques tgfb1 et tgfb2 respectivement, ont été observées dans les VSMCs exposées à des fractions de ScS-IgG. Les fractions de IgG positives pour l'activation de ERK étaient présentes dans la plupart, mais pas dans tous les échantillons de SSc (68%, 19/28), et moins présentes dans les contrôles 27% (11/3). Bien que, les fractions de SSc-IgG ont pu considérablement immunoprécipiter le PDGFR, l'utilisation d'un inhibiteur spécifique des récepteurs au PDGF (AG1296), n'a pas inhibé l'activation de ERK médiée par les fractions de SSc-IgG. Globalement, nos résultats indiquent la présence d'autoanticorps stimulants avec activité pro-fibrotique dans les sérums des patients ScS. Des travaux sont en cours pour identifier l'entité moléculaire responsable de la réponse d’IgG observée dans les cultures de VSMCs.

Activités inflammatoires des angiopoïétines sur les neutrophiles

L’angiogenèse, caractérisée par la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir de vaisseaux préexistants, est un processus accompagné par l’inflammation, impliquant la synthèse et la relâche de différents facteurs de croissance par les cellules inflammatoires. Parmi ces facteurs, seuls le vascular endothelial growth factor (VEGF) et les angiopoïétines (Ang1 et Ang2) peuvent participer à la régulation de l’inflammation et de l’angiogenèse. La famille des angiopoïétines comporte quatre membres, desquels l’Ang1 et l’Ang2 ont été les plus étudiés. Ces deux médiateurs inflammatoires sont capables d’activer le récepteur Tie2, dont l’expression a initialement été rapportée sur les cellules endothéliales (CE). Notre laboratoire a été le premier à démontrer l’expression de Tie2 à la surface des neutrophiles, ainsi que sa capacité, suite à son activation par l’Ang1 ou l’Ang2, à induire la synthèse du facteur d’activation plaquettaire (PAF), l’activation de la β2-intégrine, la migration des neutrophiles ainsi que leur adhésion aux CE. D’autres études ont montré que les CE emmagasinent et relâchent le VEGF et l’Ang2, tandis que les péricytes et les cellules musculaires lisses contiennent l’Ang1. Puisque les neutrophiles relâchent le VEGF et que les deux angiopoïétines ont la capacité d’activer Tie2 sur ces derniers, nous avons voulu déterminer si les neutrophiles contiennent l’Ang1 et/ou l’Ang2 et si elles peuvent être relâchées suite à une stimulation avec des agonistes proinflammatoires. Nous avons découvert que l’Ang1, mais pas l’Ang2 est présente dans les neutrophiles, et qu’elle est relâchée suite à une stimulation au phorbol myristate acetate (PMA). De plus, nous avons démontré que l’Ang1 est localisée au niveau du cytosol et que sa relâche est calcium-indépendante, contrairement au VEGF, qui est localisé dans les granules β et sa relâche est calcium-dépendante. Cette étude démontre pour la première fois l’expression et la localisation de l’Ang1 dans les neutrophiles. Une récente étude effectuée dans notre laboratoire a démontré que les angiopoïétines induisent la migration des neutrophiles en activant le récepteur Tie2 et la voie de la PI3K. De plus, les angiopoïétines ont potentialisé la migration induite par l’IL-8. Ainsi, nous avons émis l’hypothèse que l’Ang1 et/ou l’Ang2 seraient capables d’induire la relâche et/ou la synthèse de l’IL-8 par les neutrophiles. Nous avons démontré pour la première fois, la capacité de l’Ang1 à induire l’expression de l’ARNm, ainsi que la synthèse et la relâche d’IL-8 par les neutrophiles. Cependant, un traitement avec l’Ang2 seule ou en combinaison avec l’Ang1 n’a eu aucun effet sur les activités mentionnées ci-dessus. Nous avons aussi observé que la synthèse et la relâche d’IL-8 induite par l’Ang1 requièrent la transcription de l’ADN en ARNm, suivie par la stabilisation de ce dernier, qui ultimement induit la traduction de l’ARNm de l’IL-8 en sa protéine. Finalement, nous avons démontré que la stimulation des neutrophiles avec l’Ang1 induit ces activités en activant la voie de la p42/44 MAPK, tout en étant indépendantes de la p38 MAPK et la PI3K/Akt. Ces résultats sont en lien direct avec une récente étude dans laquelle nous avons observé que l’Ang1, mais pas l’Ang2 est capable d’augmenter la survie des neutrophiles via la relâche d’IL-8.

Rôle de l’axe CD40L/CD40 dans les cellules endothéliales progénitrices

Les cellules endothéliales progénitrices («Endothelial Progenitor Cells», EPCs) sont des précurseurs endothéliaux qui possèdent un potentiel considérable dans la réparation et la régénération vasculaire. Dans le contexte des maladies cardiovasculaires, la compréhension du rôle des EPCs dans la régulation de la thrombogenèse et la réparation endothéliale est pertinente et nécessaire pour comprendre leur potentiel thérapeutique. Nous avons rapporté que les EPCs interagissent avec les plaquettes via la P-sélectine et inhibent l’adhésion, l’activation et l’agrégation des plaquettes ainsi que la formation de thrombus. Plus récemment, nous avons démontré que les EPCs expriment le récepteur inflammatoire CD40 et il est bien connu que les plaquettes constituent la source principale de la forme soluble de son agoniste le CD40L («soluble CD40 Ligand», sCD40L). Ainsi, nous avons émis l’hypothèse principale que l’axe CD40L/CD40 dans les EPCs influence leurs fonctions anti-thrombotique et pro-angiogénique. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons réussi à générer des «early» et «late» EPCs à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique («Peripheral Blood Mononuclear Cells», PBMCs) en culture. Nous avons mis en évidence l’existence de l’axe CD40L/CD40 dans ces EPCs en démontrant l’expression des protéines adaptatrices, nommées les facteurs associés au récepteur du facteur de nécrose tumorale («TNF Receptor Associated Factors», TRAFs). Dans une première étude, nous avons investigué l’effet du sCD40L sur la fonction des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. En effet, nous avons démontré que le sCD40L renverse leur effet inhibiteur sur l’agrégation plaquettaire, et ce sans avoir un effet significatif sur la sécrétion de prostacycline (PGI2) et d’oxyde nitrique («Nitric Oxide», NO) par ces cellules. De plus, aucun effet du sCD40L n’a été noté sur l’apoptose et la viabilité de ces cellules. Par contre, nous avons noté une augmentation importante du stress oxydatif dans les «early» EPCs suite à leur stimulation avec le sCD40L. L’inhibition du stress oxydatif renverse l’effet du sCD40L sur les «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire. Ces résultats pourraient expliquer, en partie, la fonction réduite des EPCs chez les individus présentant des niveaux élevés de sCD40L en circulation. Dans une deuxième étude, nous avons étudié l’effet de sCD40L dans la fonction des «early» EPCs en relation avec l’angiogenèse. Nous avons identifié, dans un premier temps,les métalloprotéinases de la matrice («Matrix Metalloproteinases», MMPs) qui sont sécrétées par ces cellules. Nous avons trouvé que les «early» EPCs relâchent principalement la MMP-9 et que cette relâche est augmentée par le sCD40L. Le sCD40L induit aussi la phosphorylation de la p38 MAPK qui contribue à augmenter la sécrétion de MMP-9. Des études fonctionnelles ont démontré que le prétraitement des «early» EPCs au sCD40L potentialise la réparation endothéliale des HUVECs. En conclusion, l’ensemble de nos travaux, dans le cadre de ce projet de doctorat, nous a permis d’élucider les mécanismes responsables de l’action du sCD40L sur les effets inhibiteur et angiogénique des «early» EPCs dans l’agrégation plaquettaire et l’angiogenèse, respectivement. Ces résultats ajoutent de nouvelles connaissances sur le rôle des EPCs et pourront constituer la base pour des études futures permettant de corréler les niveaux élevés du sCD40L circulant et l’incidence des maladies cardiovasculaires, particulièrement l’athérothrombose.

Mesure de la génération de thrombine et son application pour la surveillance pharmacothérapeutique de l'héparine de faible poids moléculaire chez le chien

Chez le chien, la daltéparine est un anticoagulant utilisé pour la prévention et le traitement de la thrombose. La surveillance thérapeutique de la daltéparine par l’activité anti-facteur Xa (FXa) n’est pas un test fonctionnel. Cette étude avait pour but d’étudier l’emploi de la génération de thrombine (GT) pour évaluer les effets in vitro de la daltéparine sur du plasma canin, ainsi que pour détecter les effets pharmacodynamiques de la daltéparine administrée chez des chiens sains. Premièrement, les paramètres normaux de la GT ont été établis à partir du plasma de 25 beagles et 11 chiens sains de clients. Ensuite, des pools de plasma canin fortifié avec de la daltéparine, à dose croissante, ont été analysés selon la GT, l’activité anti-FXa et selon le temps de thromboplastine partielle activée (aPTT). Finalement, 24 beagles sains répartis au hasard dans 4 groupes on reçu soit une dose sous-cutanée (SC) de 50U/kg, 100U/kg ou 150U/kg de daltéparine ou un placebo. Du plasma pauvre en plaquettes (PPP) a été récolté pendant 24 heures et analysé selon la GT, l’anti-FXa et l’aPPT. In vitro, la daltéparine a démontré un effet anticoagulant sur la GT qui était concentration-dépendant. Les tests de GT et anti-FXa étaient plus sensibles aux effets de la daltéparine que l’aPPT. L’étude pharmacodynamique a démontré que le temps, la dose ainsi qu’une interaction temps*dose avaient un effet significatif sur les paramètres de GT et anti-FXa. La GT peut mesurer les effets pharmacodynamiques de la daltéparine à des doses variées chez des chiens sains.

Genomic architecture of sickle cell disease clinical variation in children from West Africa : a case-control study design

Contexte : L’anémie falciforme ou drépanocytose est un problème de santé important, particulièrement pour les patients d’origine africaine. La variation phénotypique de l’anémie falciforme est problématique pour le suivi et le traitement des patients. L’architecture génomique responsable de cette variabilité est peu connue. Principe : Mieux saisir la contribution génétique de la variation clinique de cette maladie facilitera l’identification des patients à risque de développer des phénotypes sévères, ainsi que l’adaptation des soins. Objectifs : L’objectif général de cette thèse est de combler les lacunes relatives aux connaissances sur l’épidémiologie génomique de l’anémie falciforme à l’aide d’une cohorte issue au Bénin. Les objectifs spécifiques sont les suivants : 1) caractériser les profils d’expressions génomiques associés à la sévérité de l’anémie falciforme ; 2) identifier des biomarqueurs de la sévérité de l’anémie falciforme ; 3) identifier la régulation génétique des variations transcriptionelles ; 4) identifier des interactions statistiques entre le génotype et le niveau de sévérité associé à l’expression ; 5) identifier des cibles de médicaments pour améliorer l’état des patients atteints d’anémie falciforme. Méthode : Une étude cas-témoins de 250 patients et 61 frères et soeurs non-atteints a été menée au Centre de Prise en charge Médical Intégré du Nourrisson et de la Femme Enceinte atteints de Drépanocytose, au Bénin entre février et décembre 2010. Résultats : Notre analyse a montré que des profils d’expressions sont associés avec la sévérité de l’anémie falciforme. Ces profils sont enrichis de génes des voies biologiques qui contribuent à la progression de la maladie : l’activation plaquettaire, les lymphocytes B, le stress, l’inflammation et la prolifération cellulaire. Des biomarqueurs transcriptionnels ont permis de distinguer les patients ayant des niveaux de sévérité clinique différents. La régulation génétique de la variation de l’expression des gènes a été démontrée et des interactions ont été identifiées. Sur la base de ces résultats génétiques, des cibles de médicaments sont proposées. Conclusion: Ce travail de thèse permet de mieux comprendre l’impact de la génomique sur la sévérité de l’anémie falciforme et ouvre des perspectives de développement de traitements ciblés pour améliorer les soins offerts aux patients.

Etude d'un anticoagulant oral (le rivaroxaban) sur les paramètres hémostatiques de chiens en santé

Chez le chien, les thromboses représentent une complication majeure de nombreuses conditions qui sont revues dans ce manuscrit. L’arsenal thérapeutique actuel présente certaines limites: des effets anticoagulants variables d’un patient à l’autre, des hémorragies et une administration par voie sous-cutanée pour l’héparine. Le rivaroxaban est un nouvel anticoagulant oral approuvé pour la prévention et le traitement des thromboses chez l’humain. C’est un inhibiteur direct du facteur Xa. La présente étude a pour objectif d’évaluer les effets hémostatiques du rivaroxaban chez des chiens en santé, en utilisant les tests de coagulation suivants: temps de prothrombine (PT), temps partiel de thromboplastine (aPTT), activité anti-facteur X, génération de thrombine (GT) et thromboélastographie (TEG®). Tout d’abord, l’effet anticoagulant du rivaroxaban a été évalué in vitro : le plasma citraté pauvre en plaquettes provenant de 20 Beagle en santé a été aliquoté et enrichi avec des solutions de rivaroxaban à des concentrations de 0 à 1000 mg/L d’anticoagulant. Une prolongation concentration-dépendante de tous les tests de coagulation a été notée. Les concentrations de 0.024 et 0.053 mg/L diminuent respectivement de 50% la vitesse de propagation de la GT et la densité optique de l’activité anti-facteur X. Ces derniers tests sont les plus sensibles et précis pour détecter l’effet anticoagulant du rivaroxaban. Ensuite, 24 Beagle en santé ont été répartis aléatoirement en 3 groupes (n=8). Chaque groupe a reçu par voie orale un placebo, ou 20 mg de rivaroxaban une ou deux fois à 8h d’intervalle. Quinze échantillons sanguins ont été prélevés pour chaque chien sur 30 heures. Pour tous les tests de coagulation excepté la TEG®, une différence significative a été notée dans les résultats entre les groupes traités et le groupe placebo (p<0.0001). La durée de l’effet anticoagulant du rivaroxaban était de 7.9-18.7h dans le groupe traité une fois; et de 17.5-26.8h dans le groupe traité deux fois. Le pic d’action de l’effet anticoagulant était d’environ 2h. Seul le paramètre R de la TEG® était significativement affecté dans les groupes traités. En conclusion, le rivaroxaban exerce un effet anticoagulant chez le chien à la dose de 2 mg/kg. Une administration biquotidienne semble appropriée pour un effet de 24h.

Studies on IL-18 in HIV infection : effects of the cytokine on intestinal integrity, and platelets as a new source of the cytokine

L'interleukine IL-18 (IL-18), un membre de la famille de l’IL-1, est une cytokine pro-inflammatoire multifonctionnelle. Elle est produite par les monocytes, les macrophages, les cellules dendritiques, les cellules épithéliales, les kératinocytes et le cortex surrénal dans le corps humain. Cette cytokine est d'abord produite comme une protéine précurseure inactive, qui est par la suite clivée en une forme mature par la caspase-1 activée. La caspase, en elle-même, existe comme précurseur inactif dans les cellules humaines et requiert l'assemblage d'inflammasomes pour son activation. L'IL-18 pour joue un rôle clé dans la médiation des conditions inflammatoires. Notre laboratoire et d'autres ont montré que l'infection par le VIH est accompagnée d'une augmentation des taux circulants d'IL-18 avec une diminution des niveaux de son antagoniste, l'interleukine-18 binding protein (IL-18BP). Dans cette thèse, nous démontrons pour que l'IL-18 est également produite et sécrétée par les plaquettes humaines lors de leur activation. Les plaquettes contiennent des composants de l'inflammasome. Ils assemblent et activent la caspase-1, qui ensuite traite le précurseur de l'IL-18 dans sa forme mature au cours du processus d'activation des plaquettes. La cytokine est synthétisée de novo lors de l'activation des plaquettes. Contrairement à l'IL-18, les plaquettes expriment constitutivement l’IL-18BP, et la libèrent de manière constitutive, ainsi que lors de l'activation. L'IL-18 et l'IL-18BP sont colocalisés avec CD63, un marqueur pour les granules α des plaquettes. L'IL-18 libéré des plaquettes constitue la source principale de cette cytokine dans la circulation humaine chez les individus sains. Nous avons identifié des concentrations faibles de cette cytokine dans les lysats de plaquettes chez les individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. D'autre part, les concentrations ont été augmentées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes chez les individus infectés. Des résultats similaires ont été obtenus avec l'IL-18BP dans les lysats de plaquettes d'individus sains et infectés par le VIH. Cependant, des quantités plus faibles de cet antagoniste ont été trouvées dans le sérum et le plasma pauvre en plaquettes d'individus infectés par le VIH par rapport à ceux en santé. Nos résultats ont des implications importantes pour les maladies inflammatoires chroniques dans laquelle une activité accrue de l'IL-18 joue un rôle pathogène. Le VIH est également accompagné par une inflammation intestinale et une diminution de l'intégrité intestinale, mesurée par la réparation de la muqueuse, la régénération et la perméabilité. Cependant, on en sait peu sur la relation entre le niveau élevé de l'IL-18 associé à l'infection au VIH et la perméabilité intestinale: ceci n'a jamais été étudié. Dans cette thèse, nous démontrons le rôle du virus et sa protéine Tat à augmenter la production d'IL-18 chez deux lignées de cellules épithéliales intestinales (HT29 et Caco2) ainsi qu'une diminution de l'IL-18BP. L'IL-18 induit une hyperperméabilité de la barrière épithéliale en perturbant à la fois les jonctions serrées et adhérentes, et ce, en modulant l'expression et la distribution de l'occludine, de claudine-2 et de la bêta-caténine. Une désorganisation de l'actine F a également été observée dans les cellules lors de l'incubation avec l'IL-18. Les mêmes observations ont été faites avec la protéine Tat du VIH-1. Après une incubation prolongée, l'IL-18 a causé la mort des cellules intestinales et induit l'apoptose par l'activation de la caspase-1 et la caspase-3. Fait intéressant, les taux plasmatiques de lipopolysaccharides chez trois catégories différentes de patients au VIH (ART-naïf, ART-traitée et contrôleurs élite) sont en corrélation avec les niveaux plasmatiques de l'IL-18. Enfin, nous avons étudié la voie de signalisation à travers laquelle l'IL-18 induit une perméabilité intestinale accrue. En bref, nos études identifient les plaquettes comme une source importante d'IL-18, et leur activation lors d'une infection à VIH contribue à des concentrations accrues de cette cytokine. Le virus entraine également l'augmentation de la production de cytokines par les cellules épithéliales intestinales. L'activité biologique accrue de ces cytokines contribue à la pathogenèse du sida en augmentant la perméabilité intestinale et en causant la mort des cellules intestinales. L'IL-18 pourrait servir de cible moléculaire pour retarder la progression du sida et réduire l'inflammation chronique dans un stade précoce d'une infection à VIH.

Lipoprotein-associated phospholipase A2 (Lp-PLA2) in acute coronary syndrome

La phospholipase A2 liée aux lipoprotéines (Lp-PLA2) est une biomarqueur de plusieurs maladies inflammatoires et une niveau sérique élevé est associé à l’instabilité de la plaque artérioscléreuse. Comme son nom l’indique, la Lp-PLA2 est liée aux lipoprotéines plasmatiques (LDL et HDL) et son rôle est de prévenir l’accumulation de phospholipides oxidés a la surface des lipoprotéines. Toutefois, les produits de dégradation des phospholipides oxidés par la Lp-PLA2 - le lysophosphatidyl choline par les acides gras oxidés peuvent aussi promouvoir l’inflammation. Mieux comprendre le métabolisme de la Lp-PLA2 pourrait nous permettre de mieux apprécier son rôle dans la formation d’une plaque artérioscléreuse instable, car des études antérieures ont démontré une forte expression de la Lp-PLA2 dans la plaque. De plus, il existe une forte corrélation entre les niveaux et l’activité plasmatiques de la Lp-PLA2 et la maladie coronarienne, les accidents cérébraux-vasculaires et la mortalité cardiaque. L’inhibition de la Lp-PLA2 avec une petite molécule, le darapladib, n’a pas démontré de bénéfice sur les évènements cardiovasculaires dans deux études cliniques. Cette thèse présentera d’abord une revue de la littérature sur la Lp-PLA2 et les maladies cardiovasculaires et les deuxième et troisième chapitres, une étude clinique réalisée sur des patients avec un syndrome coronarien aigu.

L’expression des cyclo-oxygénases et des oxydes nitriques synthases avec les protéines adaptatrices TRAFs dans les cellules progénitrices endothéliales

L’interaction du CD40L plaquettaire avec le CD40 exprimé par les mono-lymphocytaires, dont les cellules progénitrices endothéliales (EPCs), médie l’hémostase. Deux sous-types d’EPCs induisent la réparation vasculaire : les early outgrowth cells (EOCs) et les endothelial colony forming cells (ECFCs). Les EOCs expriment des protéines adaptatrices s’associant aux récepteurs du facteur de nécrose tumorale (TRAFs) nécessaires à la signalisation du CD40. L’association des TRAFs au CD40 contribuerait à la fonction antiplaquettaire d’EOCs prétraitées au CD40L, via la libération de prostacycline (PGI2) ou d'oxyde nitrique (NO). Toutefois, la contribution des TRAFs des ECFCs dans la libération de PGI2 et de NO via la régulation des cyclo-oxygénases (COX) et des NO synthases (NOS) demeure inexplorée. Cette étude vise à comprendre le rôle des TRAFs, COX et NOS dans les ECFCs. Nous avons différencié des EPCs via la culture de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMCs) dans un milieu à croissance endothéliale (EGM-2) et révélé, par microscopie optique et confocale, le phénotype monocytaire de nos EOCs et de cellules endothéliales (ECs) de nos ECFCs, incluant leurs caractéristiques endothéliales par cytométrie en flux. L’expression constitutive de l’eNOS, l’iNOS, la COX-1 et faiblement la COX-2 dans nos ECFCs et ECs, des enzymes absentes de nos EOCs, a été décelée par Western Blot. Le profil d'expression des TRAFs dans nos EOCs, ECFCs, PBMCs et ECs a démontré la présence variée du CD40 et celle des TRAF1, 2, 3, 5 et 6, selon le type cellulaire. En conclusion, nous avons révélé la présence de TRAFs, COX et NOS, ainsi que leur expression différentielle dans les EOCs et ECFCs. Des études portant sur l’association des TRAFs au CD40 éclaireront sur les mécanismes intracellulaires impliqués dans la régulation de la synthèse de PGI2 et de NO et la fonction antiplaquettaire des EPCs.

Expansion des mégacaryocytes par HoxB4 pour accélérer la reconstitution plaquettaire

La greffe de cellules souches hématopoïétiques est parfois le seul traitement efficace contre les cancers hématologiques ainsi que plusieurs autres désordres reliés au système hématopoïétique. La greffe autologue est souvent le traitement de choix pour les patients atteints de lymphome ou de myélome. Dans ce cas, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) du patient sont récoltées et congelées. Le patient subit ensuite des traitements de chimiothérapie et/ou radiothérapie qui éliminent les cellules malignes, mais détruisent aussi son système hématopoïétique. Ce dernier sera ensuite reconstitué par la greffe de CSH. Ces traitements ont pour conséquence de plonger le patient en état d’aplasie pour une période variant de 2 à 4 semaines. La thrombocytopénie (faible taux de plaquettes) est une complication majeure nécessitant des transfusions plaquettaires répétées et associée à une augmentation de la mortalité hémorragique post-transplantation. Il serait particulièrement intéressant de développer une thérapie accélérant la reconstitution des mégacaryocytes (MK), ce qui aurait pour effet de raccourcir la période de thrombopénie et donc de diminuer les besoins transfusionnels en plaquettes et potentiellement augmenter la survie. HOXB4 est un facteur de transcription qui a déjà démontré sa capacité à expandre les CSH et les progéniteurs multipotents (CFU-GEMM) donnant naissance aux MK. Il est donc un bon candidat pour l’expansion des progéniteurs MK. Comme la protéine HoxB4 a par contre une courte demi-vie (~1.1h), des protéines HoxB4 de deuxième génération avec une plus grande stabilité intracellulaire ont été créées (1423 (HoxB4L7A), 1426 (HoxB4Y23A) et 1427 (HoxB4Y28A)). Nous avons donc étudié la capacité d’HoxB4 sauvage et de deuxième génération à expandre les CSH, ainsi que les MK donnant naissance aux plaquettes. La surexpression rétrovirale de ces protéines HoxB4Y23A et HoxB4Y28A conduit à une expansion des progéniteurs MK murins in vitro supérieure à HoxB4-wt, 1423 et au contrôle GFP. La reconstitution plaquettaire in vivo dans un modèle murin a ensuite été évaluée par des transplantations primaires et secondaires. Les résultats révèlent que la surexpression rétrovirale des différents HoxB4 n’apporte pas de bénéfice significatif à la reconstitution plaquettaire des souris. Lorsque cultivées dans un milieu favorisant la différenciation mégacaryocytaire, le traitement de cellules CD34+ dérivées du sang de cordon ombilical avec les protéines recombinantes TATHoxB4WT ou de seconde génération n’a pas augmenté la production plaquettaire. Par contre, de manière intéressante, les cellules CD34+ provenant de sang mobilisé de patients atteints de myélome et mises en culture dans un milieu favorisant l’expansion des CSH ont montré des différences significatives dans la différenciation des progéniteurs MK en présence de la protéine recombinante TATHoxB4. La protéine HOXB4 possède donc un avenir prometteur quant à une amélioration de l’état thrombocytopénique chez les patients.

Rôle de la PKC delta dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine via le récepteur GPIb alpha

La famille des protéines kinases C (PKC) est essentielle pour la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine qui signale et active les plaquettes via les proteases activated receptors (PAR-1 et PAR-4) et le GPIbα. Ces derniers constituent les récepteurs de moyenne/faible et de hautes affinités pour la thrombine, respectivement. L’isoforme PKCδ régule positivement ou négativement la fonction des plaquettes tout dépendamment de la nature du stimulus. Cependant, son importance dans la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine en aval de la GPIbα reste inconnue. L’objectif principal de ce projet de doctorat était de déterminer l'implication de l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans la fonction plaquettaire et d’évaluer le rôle de cet axe dans la régulation de la thrombose. Dans les plaquettes humaines, le prétraitement avec l'inhibiteur spécifique de la PKCδ δ(V1-1)TAT, a significativement potentialisé l'activation et l’agrégation des plaquettes en réponse à de faibles concentrations de α-thrombine, mais pas en réponse à la γ-thrombine ou aux agonistes des PARs. Ce phénomène de potentialisation a été associé à une sécrétion accrue de granules, de génération de thromboxane A2 (TXA2) et une phosphorylation de la PKCδ sur la Tyr311, qui ont toutes été prévenues par l’inhibition spécifique du GPIbα à l’aide d’un anticorps monoclonal bloquant. En outre, l'inhibition de la p38 MAPK, ERK1/2 et le TXA2 a inversé ce processus de potentialisation. Les plaquettes murines déficientes en PKCδ étaient aussi plus réactives à la thrombine et ont montré une augmentation significative de l'agrégation, alors qu’une étude menée in vivo chez la souris PKCδ- /- a montré, suite à une stimulation par α-thrombine, une réaction thrombotique accrue caractérisée par une diminution significative du temps de saignement ainsi qu’une formation de thrombo-embolies pulmonaires. En bloquant le GPIbα, ces effets ont été renversés. Cette étude ouvre de nouvelles perspectives quant au rôle de la PKCδ dans les plaquettes en aval de GPIbα, où elle régule négativement la fonction plaquettaire en réponse à la thrombine. Ainsi, l'axe thrombine/GPIbα/PKCδ dans les plaquettes pourrait représenter un régulateur critique de la fonction plaquettaire et l'hémostase, et le dysfonctionnement de cette voie pourrait conduire à des événements thrombotiques.

Biological Routes to Gold Nanoplates

Much effort has been devoted to the synthesis of gold nanoparticles with different shapes, including the zero-dimensional nanospheres, one dimensional nanorods, and two-dimensional nanoplates. Compared to zero or one dimensional nanostructures, the synthesis of two-dimensional nanostructures in high yield has always been more involved, often requiring complex and time-consuming steps such as morphology transformation from the nanospheres, or the seeded growth process. Herein we report a high yield method for gold nanoplate synthesis using the extract of unicellular green alga Chlorella vulgaris, which can be carried out under ambient conditions. More than 90% of the total nanoparticle population is of the platelet morphology, surpassing the previously reported value of 45%. The control of the anisotropic growth of different planes; as well as the lateral size, has also been partially optimized.

Prevalencia de resistencia plaquetaria a clopidogrel en pacientes sometidos a intervencion coronaria percutanea

Los agentes antiplaquetarios son el principal tratamiento para pacientes con síndromes coronarios agudos, han demostrado reducción en el riesgo de muerte, infarto del miocardio, y necesidad de revascularización urgente. Algunos pacientes presentan eventos cardiacos mayores a pesar de recibir estos medicamentos. El impacto de la resistencia a los medicamentos ha sido material de múltiples estudios. En Colombia no existen estadísticas sobre la resistencia al Clopidogrel.En nuestro estudio la prevalencia de resistencia a Clopidogrel por el método de agregometria plaquetaria por transferencia de luz con muestras tomadas entre el día 7 y el 10 post angioplastia, está por encima del promedio internacional en nuestra población, lo que amerita la realización de nuevos estudios por las implicaciones pronosticas que pudieran tener en términos de eventos cardiovasculares adversos.