Protein glycosylation of exosomes from ovarian carcinoma cells: structures and biological roles

Dissertation presented to obtain the Ph.D. degree in Biology

The removal of xenobiotic compounds from wastewater through the use of biological processes and advanced oxidation technologies

Dissertação apresentada para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia Química e Bioquímica pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

Avaliação e Otimização do Consumo de Água no Processo e do Sistema de Tratamento de Efluentes

O elevado consumo de água associado à escassez deste recurso contribuiu para que alternativas de reutilização/reciclagem de água fossem estudadas que permitam diminuir o seu consumo e minimizar a dependência das indústrias. Monitorizar e avaliar os consumos de água, a nível industrial, é imprescindível para assegurar uma gestão sustentável dos recursos hídricos, sendo este o objetivo da presente dissertação. As alternativas encontradas na unidade industrial em estudo foram a substituição do equipamento sanitário e o aproveitamento do efluente tratado para operações de lavagem e/ou arrefecimento por contacto direto. A maioria do equipamento sanitário não é eficiente, tendo-se proposto a substituição desse sistema por um de menor consumo que permitirá uma poupança de 30 % no consumo de água, que corresponderá a 12 149,37 €/ano, sendo o retorno do investimento estimado em 3 meses. O efluente industrial na entrada da ETAR e nas diferentes etapas - tratamento primário de coagulação/floculação; tratamento secundário ou biológico em SBR; tratamento terciário de coagulação/floculação - foi caracterizado através da medição da temperatura, pH, oxigénio dissolvido e pela determinação da cor, turvação, sólidos suspensos totais (SST), azoto total, carência química de oxigénio (CQO), Carência Bioquímica de Oxigénio ao fim de 5 dias (CBO5) e razão CBO5/CQO. Esta caracterização permitiu avaliar o efluente industrial bruto que se caracteriza por um pH alcalino (8,3 ± 1,7); condutividade baixa (451 ± 200,2 μS/cm); elevada turvação (11 255 ± 8812,8 FTU); cor aparente (63 670 ± 42293,4 PtCo) e cor verdadeira (33 621 ± 19547,9 PtCo) elevadas; teores elevados de CQO (24 753 ± 11806,7 mg/L O2) SST (5 164 ± 3845,5 mg/L) e azoto total (718 mg/L) e um índice de biodegradabilidade baixo (razão CBO5/CQO de 1,4). Este estudo permitiu verificar que a eficiência global do tratamento do efluente foi 82 % na remoção da turvação, 83 % na remoção da cor aparente, 96 % na remoção da cor verdadeira, 85 % na remoção da CQO e 30 % na remoção dos SST. Quanto às eficiências de remoção associadas ao tratamento primário no que diz respeito à turvação, cor aparente, CQO e SST, apresentam valores inferiores aos referidos na literatura para o mesmo tipo de tratamento em efluentes similares. As eficiências de remoção obtidas no tratamento secundário são inferiores às do tratamento primário: turvação, cor aparente, CQO e SST, pelo que procurou-se otimizar a primeira etapa do processo de tratamento Neste estudo de otimização estudou-se a influência de cinco coagulantes – Sulfato de Alumínio, PAX XL – 10, PAX 18, cloreto de ferro e a conjugação de PAX 18 com sulfato de ferro - e seis floculantes – Superfloc A 150, Superfloc A 130, PA 1020, Ambifloc 560, Ambifloc C58 e Rifloc 54 - no tratamento físico-químico do efluente. O PAX 18 e o Ambifloc 560 UUJ foram os que apresentaram as mais elevadas eficiências de remoção (99,85 % na cor, 99,87 % na turvação, 90,12 % na CQO e 99,87 % nos SST). O custo associado a este tratamento é de 1,03 €/m3. Pela comparação com os critérios de qualidade no guia técnico ERSAR, apenas o parâmetro da CQO excede o valor, contudo o valor obtido permite diminuir os custos associados a um tratamento posterior para remoção da CQO remanescente no efluente residual tratado.

Characterization and Biological Activities of Ocellatin Peptides from the Skin Secretion of the Frog Leptodactylus pustulatus

Eight new peptides were isolated from the skin secretion of the frog Leptodactylus pustulatus and their amino acid sequences determined by de novo sequencing and by cDNA cloning. Structural similarities between them and other antimicrobial peptides from the skin secretion of Leptodactylus genus frogs were found. Ocellatins-PT1 to -PT5 (25 amino acid residues) are amidated at the C-terminus, while ocellatins-PT6 to -PT8 (32 amino acid residues) have free carboxylates. Antimicrobial activity, hemolytic tests, and cytotoxicity against a murine fibroblast cell line were investigated. All peptides, except for ocellatin-PT2, have antimicrobial activity against at least one Gram negative strain. Ocellatin-PT8 inhibited the growth of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, and Salmonella choleraesuis strains with MICs in the 60−240 μM range. No significant effect was observed in human erythrocytes and in a murine fibroblast cell line after exposure to the peptides at MICs. A comparison between sequences obtained by both direct HPLC-MS de novo sequencing and cDNA cloning demonstrates the secretion of mature peptides derived from a pre-pro-peptide structure.

Biological implications of the phenotypic plasticity in the Schistosoma mansoni - Nectomys squamipes model

The water-rat Nectomys squamipes is mostly important non-human host in schistosomiasis mansoni transmission in Brazil, due to its susceptibility, high abundance and water-contact pattern. During experimental infection of N. squamipes with Schistosoma mansoni, adult worms show phenotypic plasticity. This finding led us to investigate whether biological behavior is also affected. This was assessed comparing the biological characteristics of four S. mansoni strains: BE (State of Belém do Pará), CE (State of Pernambuco), CMO (State of Rio Grande do Norte) and SJ (State of São Paulo) using laboratory-bred N. squamipes. The infection was monitored by determination of the pre-patent period, fecal egg output, egg viability, intestinal egg count and, infectivity rate. No biological modification was observed in these parameters. Overall results highlight that N. squamipes was susceptible to several S. mansoni strains, suggesting that it might contribute to the maintenance of schistosomiasis mansoni in Brazil.

(Un)suitability of the use of pH buffers in biological, biochemical and environmental studies and their interaction with metal ions – a review

The use of buffers to maintain the pH within a desired range is a very common practice in chemical, biochemical and biological studies. Among them, zwitterionic N-substituted aminosulfonic acids, usually known as Good’s buffers, although widely used, can complex metals and interact with biological systems. The present work reviews, discusses and updates the metal complexation characteristics of thirty one commercially available buffers. In addition, their impact on biological systems is also presented. The influences of these buffers on the results obtained in biological, biochemical and environmental studies, with special focus on their interaction with metal ions, are highlighted and critically reviewed. Using chemical speciation simulations, based on the current knowledge of the metal–buffer stability constants, a proposal of the most adequate buffer to employ for a given metal ion is presented.

Biological predictors of survival in limphoma and mechanisms underlying follicular lymphoma transformaion into diffuse large B cell lymphoma (vol I e II)

RESUMO: Os biomarcadores tumorais permitem identificar os doentes com maior risco de recorrência da doença, predizer a resposta tumoral à terapêutica e, finalmente, definir candidatos a novos alvos terapêuticos. Novos biomarcadores são especialmente necessários na abordagem clínica dos linfomas. Actualmente, esses tumores são diagnosticados através de uma combinação de características morfológicas, fenotípicas e moleculares, mas o prognóstico e o planeamento terapêutico estão quase exclusivamente dependentes de características clínicas. Estes factores clínicos são, na maioria dos linfomas, insuficientes numa proporção significativa dos doentes, em particular, aqueles com pior prognóstico. O linfoma folicular (LF) é, globalmente, o segundo subtipo mais comum de linfoma. É tipicamente uma doença indolente com uma sobrevida média entre os 8 e 12 anos, mas é geralmente fatal quando se transforma num linfoma agressivo de alto grau, habitualmente o linfoma difuso de grandes células B (LDGCB). Morfologicamente e funcionalmente, as células do LF recapitulam as células normais do centro germinativo na sua dependência de sobrevivência do microambiente não-tumoral, especialmente das células do sistema imunológico. Biomarcadores preditivos de transformação não existem pelo que um melhor conhecimento da biologia intrínseca de progressão do LF poderá revelar novos candidatos. Nesta tese descrevo duas abordagens distintas para a descoberta de novos biomarcadores. A primeira, o estudo da expressão global de genes ('genomics') obtidos por técnicas de alto rendimento que analisam todo o genoma humano sequenciado, permitindo identificar novas anomalias genéticas que possam representar mecanismos biológicos importantes de transformação. São descritos novos genes e alterações genómicas associados à transformação do LF, sendo especialmente relevantes as relacionadas com os eventos iniciais de transformação em LDGCB. A segunda, baseou-se em várias hipóteses centradas no microambiente do LF, rico em vários tipos de células nãomalignas. Os estudos imunoarquitectural de macrófagos, células T regulatórias e densidade de microvasos efectuado em biopsias de diagnóstico de doentes com LF tratados uniformemente correlacionaram-se significativamente, e independentemente dos critérios clínicos, com a evolução clínica e, mais importante, com o risco de transformação em LDGCB. Nesta tese, foram preferencialmente utilizadas (e optimizadas) técnicas que permitam o uso de amostras fixadas em parafina e formalina (FFPET). Estas são facilmente acessíveis a partir das biopsias de diagnóstico de rotina presentes nos arquivos de todos os departamentos de patologia, facilitando uma transição rápida dos novos marcadores para a prática clínica. Embora o FL fosse o tema principal da tese, os novos achados permitiram estender facilmente hipóteses semelhantes a outros subtipos de linfoma. Assim, são propostos e validados vários biomarcadores promissores e relacionados com o microambiente não tumoral, sobretudo dependentes das células do sistema imunológico, como contribuintes importantes para a biologia dos linfomas. Estes sugerem novas opções para a abordagem clínica destas doenças e, eventualmente, novos alvos terapêuticos.------------- ABSTRACT: Cancer biomarkers provide an opportunity to identify those patients most at risk for disease recurrence, predict which tumours will respond to different therapeutic approaches and ultimately define candidate biomarkers that may serve as targets for personalized therapy. New biomarkers are especially needed in the management of lymphoid cancers. At present, these tumours are diagnosed using a combination of morphologic, phenotypic and molecular features but prognosis and overall survival are mostly dependent on clinical characteristics. In most lymphoma types, these imprecisely assess a significant proportion of patients, in particular, those with very poor outcomes. Follicular lymphoma (FL) is the second most common lymphoma subtype worldwide. It is typically an indolent disease with current median survivals in the range of 8-12 years, but is usually fatal when it transforms into an aggressive high-grade lymphoma, characteristically Diffuse Large B Cell Lymphoma (DLBCL). Morphologically and functionally it recapitulates the normal cells of the germinal center with its survival dependency on non-malignant immune and immunerelated cells. Informative markers of transformation related to the intrinsic biology of FL progression are needed. Within this thesis two separate approaches to biomarker discovery were employed. The first was to study the global expression of genes (‘genomics’) obtained using high-throughput, wholegenome-wide approaches that offered the possibility for discovery of new genetic abnormalities that might represent the important biological mechanisms of transformation. Gene signatures associated with early events of transformation were found. Another approach relied on hypothesis-driven concepts focusing upon the microenvironment, rich in several non-malignant cell types. The immunoarchitectural studies of macrophages, regulatory T cells and microvessel density on diagnostic biopsies of uniformly treated FL patients significantly predicted clinical outcome and, importantly, also informed on the risk of transformation. Techniques that enabled the use of routine formalin fixed paraffin embedded diagnostic specimens from the pathology department archives were preferentially used in this thesis with the goal of fulfilling a rapid bench-to-beside” translation for these new findings. Although FL was the main subject of the thesis the new findings and hypotheses allowed easy transition into other lymphoma types. Several promising biomarkers were proposed and validated including the implication of several non-neoplastic immune cells as important contributors to lymphoma biology, opening new options for better treatment planning and eventually new therapeutic targets and candidate therapeutics.

Impact of Taraxerol in combination with extract of Euphorbia tirucalli plant on biological parameters of Lymnaea acuminata

The present work was carried out to evaluate the molluscicidal activity of active ingredient Taraxerol with the acetone extract of Euphorbia tirucalli against Lymnaea acuminata snail. The (fecundity, hatchability and survivability) of snail L. acuminata exposed to this extract was studied. The effects of the tested extracts on life-history traits of harmful snail L. acuminata have also been evaluated, and this study also expounds the inhibitory effects of these extracts singly as well as in binary combination (1:1 ratio). It concluded that these herbal products act as a potential source of molluscicides, and that they would also have the advantage of easy availability, low cost, biodegradability and greater acceptance amongst users than synthetic pesticide.

Full-scale biological phosphorus removal: quantification of storage polymers, microbial performance and metabolic modelling

Dissertação para obtenção do Grau de Doutor em Engenharia Química e Bioquímica

Software development for estimation of optical clearing agent’s diffusion coefficients in biological tissues

The study of chemical diffusion in biological tissues is a research field of high importance and with application in many clinical, research and industrial areas. The evaluation of diffusion and viscosity properties of chemicals in tissues is necessary to characterize treatments or inclusion of preservatives in tissues or organs for low temperature conservation. Recently, we have demonstrated experimentally that the diffusion properties and dynamic viscosity of sugars and alcohols can be evaluated from optical measurements. Our studies were performed in skeletal muscle, but our results have revealed that the same methodology can be used with other tissues and different chemicals. Considering the significant number of studies that can be made with this method, it becomes necessary to turn data processing and calculation easier. With this objective, we have developed a software application that integrates all processing and calculations, turning the researcher work easier and faster. Using the same experimental data that previously was used to estimate the diffusion and viscosity of glucose in skeletal muscle, we have repeated the calculations with the new application. Comparing between the results obtained with the new application and with previous independent routines we have demonstrated great similarity and consequently validated the application. This new tool is now available to be used in similar research to obtain the diffusion properties of other chemicals in different tissues or organs.