Analysis of phenotypes altered by temperature stress and hipermutability in Drosophila willistoni

Drosophila willistoni (Sturtevant, 1916) is a species of the willistoni group of Drosophila having wide distribution from the South of USA (Florida) and Mexico to the North of Argentina. It has been subject of many evolutionary studies within the group, due to its considerable ability to successfully occupy a wide range of environments and also because of its great genetic variability expressed by different markers. The D. willistoni 17A2 strain was collected in 1991 in the state of Rio Grande do Sul, Brazil (30°05'S, 51°39'W), and has been maintained since then at the Drosophila laboratory of UFRGS. Different to the other D. willistoni strains maintained in the laboratory, the 17A2 strain spontaneously produced mutant males white-like (white eyes) and sepia-like (brown eyes) in stocks held at 17°C. In order to discover if this strain is potentially hypermutable, we submitted it to temperature stress tests. Eighteen isofemale strains were used in our tests and, after the first generation, all the individuals produced in each strain were maintained at 29°C. Different phenotype alterations were observed in subsequent generations, similar to mutations already well characterized in D. melanogaster (white, sepia, blistered and curly). In addition, an uncommon phenotype alteration with an apparent fusion of the antennae was observed, but only in the isofemale line nº 31. This last alteration has not been previously described as a mutation in the D. melanogaster species. Our results indicate that the D. willistoni 17A2 strain is a candidate for hypermutability, which presents considerable cryptic genetic variability. Different factors may be operating for the formation of this effect, such as the mobilization of transposable elements, effect of inbreeding and alteration of the heat-shock proteins functions.

Ectodysplasin A1 promotes placodal cell fate during early morphogenesis of ectodermal appendages.

Organs developing as appendages of the ectoderm are initiated from epithelial thickenings called placodes. Their formation is regulated by interactions between the ectoderm and underlying mesenchyme, and several signalling molecules have been implicated as activators or inhibitors of placode formation. Ectodysplasin (Eda) is a unique signalling molecule in the tumour necrosis factor family that, together with its receptor Edar, is necessary for normal development of ectodermal organs both in humans and mice. We have shown previously that overexpression of the Eda-A1 isoform in transgenic mice stimulates the formation of several ectodermal organs. In the present study, we have analysed the formation and morphology of placodes using in vivo and in vitro models in which both the timing and amount of Eda-A1 applied could be varied. The hair and tooth placodes of K14-Eda-A1 transgenic embryos were enlarged, and extra placodes developed from the dental lamina and mammary line. Exposure of embryonic skin to Eda-A1 recombinant protein in vitro stimulated the growth and fusion of placodes. However, it did not accelerate the initiation of the first wave of hair follicles giving rise to the guard hairs. Hence, the function of Eda-A1 appears to be downstream of the primary inductive signal required for placode initiation during skin patterning. Analysis of BrdU incorporation indicated that the formation of the epithelial thickening in early placodes does not involve increased cell proliferation and also that the positive effect of Eda-A1 on placode expansion is not a result of increased cell proliferation. Taken together, our results suggest that Eda-A1 signalling promotes placodal cell fate during early development of ectodermal organs.

Identification of a novel determinant for membrane association in hepatitis C virus nonstructural protein 4B.

Nonstructural protein 4B (NS4B) plays an essential role in the formation of the hepatitis C virus (HCV) replication complex. It is a relatively poorly characterized integral membrane protein predicted to comprise four transmembrane segments in its central portion. Here, we describe a novel determinant for membrane association represented by amino acids (aa) 40 to 69 in the N-terminal portion of NS4B. This segment was sufficient to target and tightly anchor the green fluorescent protein to cellular membranes, as assessed by fluorescence microscopy as well as membrane extraction and flotation analyses. Circular dichroism and nuclear magnetic resonance structural analyses showed that this segment comprises an amphipathic alpha-helix extending from aa 42 to 66. Attenuated total reflection infrared spectroscopy and glycosylation acceptor site tagging revealed that this amphipathic alpha-helix has the potential to traverse the phospholipid bilayer as a transmembrane segment, likely upon oligomerization. Alanine substitution of the fully conserved aromatic residues on the hydrophobic helix side abrogated membrane association of the segment comprising aa 40 to 69 and disrupted the formation of a functional replication complex. These results provide the first atomic resolution structure of an essential membrane-associated determinant of HCV NS4B.

HARNESSING iNKT CELLS WITH RECOMBINANT CD1d FUSION PROTEINS TO REDIRECT INNATE AND ADAPTIVE IMMUNITY TO THE TUMOR

Les thérapies du cancer, comme la radiothérapie et la chimiothérapie, sont couramment utilisées mais ont de nombreux effets secondaires. Ces thérapies invasives pour le patient nécessitent d'être améliorées et de nombreuses avancées ont été faites afin d'adapter et de personnaliser le traitement du cancer. L'immunothérapie a pour but de renforcer le système immunitaire du patient et de le rediriger de manière spécifique contre la tumeur. Dans notre projet, nous activons les lymphocytes Invariant Natural Killer T (iNKT) afin de mettre en place une immunothérapie innovatrice contre le cancer. Les cellules iNKT sont une unique sous-population de lymphocytes T qui ont la particularité de réunir les propriétés de l'immunité innée ainsi qu'adaptative. En effet, les cellules iNKT expriment à leur surface des molécules présentes aussi sur les cellules tueuses NK, caractéristique de l'immunité innée, ainsi qu'un récepteur de cellules T (TCR) qui représente l'immunité adaptative. Les cellules iNKT reconnaissent avec leur TCR des antigènes présentés par la molécule CD1d. Les antigènes sont des protéines, des polysaccharides ou des lipides reconnus par les cellules du système immunitaire ou les anticorps pour engendrer une réponse immunitaire. Dans le cas des cellules iNKT, l'alpha-galactosylceramide (αGC) est un antigène lipidique fréquemment utilisé dans les études cliniques comme puissant activateur. Après l'activation des cellules iNKT avec l'αGC, celles-ci produisent abondamment et rapidement des cytokines. Ces cytokines sont des molécules agissant comme des signaux activateurs d'autres cellules du système immunitaire telles que les cellules NK et les lymphocytes T. Cependant, les cellules iNKT deviennent anergiques après un seul traitement avec l'αGC c'est à dire qu'elles ne peuvent plus être réactivées, ce qui limite leur utilisation dans l'immunothérapie du cancer. Dans notre groupe, Stirnemann et al ont publié une molécule recombinante innovante, composée de la molécule CD1d soluble et chargée avec le ligand αGC (αGC/sCD1d). Cette protéine est capable d'activer les cellules iNKT tout en évitant l'anergie. Dans le système immunitaire, les anticorps sont indispensables pour combattre une infection bactérienne ou virale. En effet, les anticorps ont la capacité de reconnaître et lier spécifiquement un antigène et permettent l'élimination de la cellule qui exprime cet antigène. Dans le domaine de l'immunothérapie, les anticorps sont utilisés afin de cibler des antigènes présentés seulement par la tumeur. Ce procédé permet de réduire efficacement les effets secondaires lors du traitement du cancer. Nous avons donc fusionné la protéine recombinante αGC/CD1d à un fragment d'anticorps qui reconnaît un antigène spécifique des cellules tumorales. Dans une étude préclinique, nous avons démontré que la protéine αGC/sCD1d avec un fragment d'anticorps dirigé contre la tumeur engendre une meilleure activation des cellules iNKT et entraîne un effet anti-tumeur prolongé. Cet effet anti-tumeur est augmenté comparé à une protéine αGC/CD1d qui ne cible pas la tumeur. Nous avons aussi montré que l'activation des cellules iNKT avec la protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur améliore l'effet anti- tumoral d'un vaccin pour le cancer. Lors d'expériences in vitro, la protéine αGC/sCD1d-anti- tumeur permet aussi d'activer les cellules humaines iNKT et ainsi tuer spécifiquement les cellules tumorales humaines. La protéine αGC/sCD1d-anti-tumeur représente une alternative thérapeutique prometteuse dans l'immunothérapie du cancer. - Les cellules Invariant Natural Killer T (iNKT), dont les effets anti-tumoraux ont été démontrés, sont de puissants activateurs des cellules Natural Killer (NK), des cellules dendritiques (DC) et des lymphocytes T. Cependant, une seule injection du ligand de haute affinité alpha-galactosylceramide (αGC) n'induit une forte activation des cellules iNKT que durant une courte période. Celle-ci est alors suivie d'une longue phase d'anergie, limitant ainsi leur utilisation pour la thérapie. Comme alternative prometteuse, nous avons montré que des injections répétées d'αGC chargé sur une protéine recombinante de CD1d soluble (αGC/sCD1d) chez la souris entraînent une activation prolongée des cellules iNKT, associée à une production continue de cytokine. De plus, le maintien de la réactivité des cellules iNKT permet de prolonger l'activité anti-tumorale lorsque la protéine αGC/sCD1d est fusionnée à un fragment d'anticorps (scFv) dirigé contre la tumeur. L'inhibition de la croissance tumorale n'est optimale que lorsque les souris sont traitées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv ciblant la tumeur, la protéine αGC/sCD1d-scFv non-appropriée étant moins efficace. Dans le système humain, les protéines recombinantes αGC/sCD1d-anti-HER2 et anti-CEA sont capables d'activer et de faire proliférer des cellules iNKT à partir de PBMCs issues de donneurs sains. De plus, la protéine αGC/sCD1d-scFv a la capacité d'activer directement des clones iNKT humains en l'absence de cellules présentatrices d'antigènes (CPA), contrairement au ligand αGC libre. Mais surtout, la lyse des cellules tumorales par les iNKT humaines n'est obtenue que lorsqu'elles sont incubées avec la protéine αGC/sCD1d-scFv anti- tumeur. En outre, la redirection de la cytotoxicité des cellules iNKT vers la tumeur est supérieure à celle obtenue avec une stimulation par des CPA chargées avec l'αGC. Afin d'augmenter les effets anti-tumoraux, nous avons exploité la capacité des cellules iNKT à activer l'immunité adaptive. Pour ce faire, nous avons combiné l'immunothérapie NKT/CD1d avec un vaccin anti-tumoral composé d'un peptide OVA. Des effets synergiques ont été obtenus lorsque les traitements avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 étaient associés avec le CpG ODN comme adjuvant pour la vaccination avec le peptide OVA. Ces effets ont été observés à travers l'activation de nombreux lymphocytes T CD8+ spécifique de la tumeur, ainsi que par la forte expansion des cellules NK. Les réponses, innée et adaptive, élevées après le traitement avec la protéine αGC/sCD1d-anti-HER2 combinée au vaccin OVA/CpG ODN étaient associées à un fort ralentissement de la croissance des tumeurs B16- OVA-HER2. Cet effet anti-tumoral corrèle avec l'enrichissement des lymphocytes T CD8+ spécifiques observé à la tumeur. Afin d'étendre l'application des protéines αGC/sCD1d et d'améliorer leur efficacité, nous avons développé des fusions CD1d alternatives. Premièrement, une protéine αGC/sCD1d dimérique, qui permet d'augmenter l'avidité de la molécule CD1d pour les cellules iNKT. Dans un deuxième temps, nous avons fusionné la protéine αGC/sCD1d avec un scFv dirigé contre le récepteur 3 du facteur de croissance pour l'endothélium vasculaire (VEGFR-3), afin de cibler l'environnement de la tumeur. Dans l'ensemble, ces résultats démontrent que la thérapie médiée par la protéine recombinante αGC/sCD1d-scFv est une approche prometteuse pour rediriger l'immunité innée et adaptive vers le site tumoral. - Invariant Natural Killer T cells (iNKT) are potent activators of Natural Killer (NK), dendritic cells (DC) and T lymphocytes, and their anti-tumor activities have been well demonstrated. However, a single injection of the high affinity CD1d ligand alpha-galactosylceramide (αGC) leads to a strong but short-lived iNKT cell activation followed by a phase of long-term anergy, limiting the therapeutic use of this ligand. As a promising alternative, we have demonstrated that when αGC is loaded on recombinant soluble CD1d molecules (αGC/sCD1d), repeated injections in mice led to the sustained iNKT cell activation associated with continued cytokine secretion. Importantly, the retained reactivity of iNKT cell led to prolonged antitumor activity when the αGC/sCD1d was fused to an anti-tumor scFv fragments. Optimal inhibition of tumor growth was obtained only when mice were treated with the tumor-targeted αGC/CD1d-scFv fusion, whereas the irrelevant αGC/CD1d-scFv fusion was less efficient. When tested in a human system, the recombinant αGC/sCD1d-anti-HER2 and -anti-CEA fusion proteins were able to expand iNKT cells from PBMCs of healthy donors. Furthermore, the αGC/sCD1d-scFv fusion had the capacity to directly activate human iNKT cells clones without the presence of antigen-presenting cells (APCs), in contrast to the free αGC ligand. Most importantly, tumor cell killing by human iNKT cells was obtained only when co- incubated with the tumor targeted sCD1d-antitumor scFv, and their direct tumor cytotoxicity was superior to the bystander killing obtained with αGC-loaded APCs stimulation. To further enhance the anti-tumor effects, we exploited the ability of iNKT cells to transactivate the adaptive immunity, by combining the NKT/CD1d immunotherapy with a peptide cancer vaccine. Interestingly, synergistic effects were obtained when the αGC/sCD1d- anti-HER2 fusion treatment was combined with CpG ODN as adjuvant for the OVA peptide vaccine, as seen by higher numbers of activated antigen-specific CD8 T cells and NK cells, as compared to each regimen alone. The increased innate and adaptive immune responses upon combined tumor targeted sCD1d-scFv treatment and OVA/CpG vaccine were associated with a strong delay in B16-OVA-HER2 melanoma tumor growth, which correlated with an enrichment of antigen-specific CD8 cells at the tumor site. In order to extend the application of the CD1d fusion, we designed alternative CD1d fusion proteins. First, a dimeric αGC/sCD1d-Fc fusion, which permits to augment the avidity of the CD1d for iNKT cells and second, an αGC/sCD1d fused to an anti vascular endothelial growth factor receptor-3 (VEGFR-3) scFv, in order to target tumor stroma environment. Altogether, these results demonstrate that the iNKT-mediated immunotherapy via recombinant αGC/sCD1d-scFv fusion is a promising approach to redirect the innate and adaptive antitumor immune response to the tumor site.

Role of microRNAs in the pathogenesis of Ewing's sarcoma

SummaryEwing's sarcoma family tumors (ESFT) are the second most frequent cancer of bone in adolescents and young adults. ESFT are characterized by a chromosomal translocation that involves the 5' segment of the EWSR1 gene and the 3' segment of an ets transcription factor family member gene. In 85% of cases the chromosomal translocation generates the fusion protein EWSR1-FLI-1. Recent work from our laboratory identified mesenchymal stem cells (MSC) as the putative cell of origin of ESFT and characterized a CD133+ subpopulation of ESFT cells with tumor initating and self-renewal capacity, known as cancer stem cells (CSC). MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNA that regulate protein expression at the post-transcriptional level by either repressing translation or destabilizing mRNA. MiRNAs participate in several biological processes including cell proliferation and differentiation. We used miRNA expression profile comparison between MSC and ESFT cell lines and CD133+ ESFT cells and CD133" ESFT cells to investigate the role of miRNAs in ESFT pathogenesis. MiRNA expression profile comparison of MSC and ESFT cell lines identified 35 differentially expressed miRNAs. Among these was down-regulation of let-7a which results, in part, by the direct repression of let-7a-l promoter by EWSR1-FLI-1. Overexpression of let-7a in ESFT cells blocked ESFT tumorigenesis through an High-motility group AT-hook2 (HMGA2)-mediated mechanism.MiRNA profiling of CD133+ ESFT and CD 133" ESFT cells revealed a broad repression of miRNAs in CD133+ ESFT mediated by down-regulation of TARBP2, a central regulator of the miRNA maturation pathway. Down-regulation of TARBP2 in ESFT cell lines results in a miRNA expression profile reminescent of that observed in CD133+ ESFT and associated with increased tumorigenicity. Enhancement of TARBP2 activity using the antibiotic enoxacin or overexpression of miRNA-143 or miRNA-145, two targets of TARBP2, impaired ESFT CSC self-renewal and block ESFT tumorigenicity. Moreover in vivo administration of synthetic let- 7a, miRNA-143 or miRNA-145 blocks ESFT tumor growth.Thus, dysregulation of miRNA expression is a key feature in ESFT pathogenesis and restoration of their expressions might be used as a new therapeutic tool.RésuméLe sarcome d'Ewing est la deuxième tumeur osseuse la plus fréquente chez l'enfant et le jeune adolescent. Le sarcome d'Ewing est caractérisé par une translocation chromosomique qui produit une protéine de fusion EWSR1-FLI-1. Des récents travaux ont identifié les cellules mésenchymateuses souches (MSC) comme étant les cellules à l'origine du sarcome d'Ewing ainsi qu'une sous-population de cellules exprimant le marqueur CD 133, dans le sarcome d'Ewing connu comme les cellules cancéreuses souches (CSC). Ces cellules ont la capacité d'initier la croissance tumorale et possèdent des propriétés d'auto-renouvellement. Les microRNAs (miRNAs) sont de petits ARN qui ne codent pas pour des protéines et qui contrôlent l'expression des protéines en bloquant la traduction ou en dégradant l'ARNm. Les miRNAs participent à différents processus biologiques comme la prolifération et la différenciation cellulaires.Le but de ce travail est d'étudier le rôle des miRNAs dans le sarcome d'Ewing. Un profil d'expression de miRNAs entre les MSC et des lignées cellulaires de sarcome d'Ewing a mis en évidence 35 miRNAs différemment exprimés. Parmi ceux-ci, la répression de let-7a est liée à la répression directe du promoteur de let-7a-l par EWSR-FLI-1. La sur-expression de let-7a dans des lignées cellulaires de sarcome d'Ewing inhibe leur croissance tumorale. Cette inhibition de croissance tumorale est régulée par la protéine high-motility group AT-hook2 (HMGA2).Un profil d'expression de miRNAs entre les cellules du sarcome d'Ewing CD133+ et CD133" montre une sous-expression d'un grand nombre de miRNAs dans les cellules CD133+ par rapport aux cellules CD133". Cette différence d'expression de miRNAs est due à la répression du gène TARBP2 qui participe à la maturation des miRNAs. La suppression de TARBP2 dans des cellules d'Ewing induit un profil d'expression de miRNAs similaire aux cellules CD133+ du sarcome d'Ewing et augmente la tumorigenèse des lignées cellulaires. De plus l'utilisation d'enoxacin, une molécule qui augmente l'activité de TARBP2 ou la sur- expression des miRNA143 ou miRNA-145 dans les CSC du sarcome d'Ewing bloque l'auto- renouvellement des cellules et la croissance tumorale. Finalement, l'administration de let-7a, miRNA-143 ou miRNA-145, dans des souris bloque la croissance du sarcome d'Ewing. Ces résultats indiquent que la dysrégulation des miRNAs participe à la pathogenèse du sarcome d'Ewing et que les miRNAs peuvent être utilisés comme des agents thérapeutiques.

Contact metamorphism and emplacement of the western Adamello tonalite

The geodynamic forces acting in the Earth's interior manifest themselves in a variety of ways. Volcanoes are amongst the most impressive examples in this respect, but like with an iceberg, they only represent the tip of a more extensive system hidden underground. This system consists of a source region where melt forms and accumulates, feeder connections in which magma is transported towards the surface, and different reservoirs where it is stored before it eventually erupts to form a volcano. A magma represents a mixture of melt and crystals. The latter can be extracted from the source region, or form anywhere along the path towards their final crystallization place. They will retain information of the overall plumbing system. The host rocks of an intrusion, in contrast, provide information at the emplacement level. They record the effects of thermal and mechanical forces imposed by the magma. For a better understanding of the system, both parts - magmatic and metamorphic petrology - have to be integrated. I will demonstrate in my thesis that information from both is complementary. It is an iterative process, using constraints from one field to better constrain the other. Reading the history of the host rocks is not always straightforward. This is shown in chapter two, where a model for the formation of clustered garnets observed in the contact aureole is proposed. Fragments of garnets, older than the intrusive rocks are overgrown by garnet crystallizing due to the reheating during emplacement of the adjacent pluton. The formation of the clusters is therefore not a single event as generally assumed but the result of a two-stage process, namely the alteration of the old grains and the overgrowth and amalgamation of new garnet rims. This makes an important difference when applying petrological methods such as thermobarometry, geochronology or grain size distributions. The thermal conditions in the aureole are a strong function of the emplacement style of the pluton. therefore it is necessary to understand the pluton before drawing conclusions about its aureole. A study investigating the intrusive rocks by means of field, geochemical, geochronologi- cal and structural methods is presented in chapter three. This provided important information about the assembly of the intrusion, but also new insights on the nature of large, homogeneous plutons and the structure of the plumbing system in general. The incremental nature of the emplacement of the Western Adamello tonalité is documented, and the existence of an intermediate reservoir beneath homogeneous plutons is proposed. In chapter four it is demonstrated that information extracted from the host rock provides further constraints on the emplacement process of the intrusion. The temperatures obtain by combining field observations with phase petrology modeling are used together with thermal models to constrain the magmatic activity in the immediate intrusion. Instead of using the thermal models to control the petrology result, the inverse is done. The model parameters were changed until a match with the aureole temperatures was obtained. It is shown, that only a few combinations give a positive match and that temperature estimates from the aureole can constrain the frequency of ancient magmatic systems. In the fifth chapter, the Anisotropy of Magnetic Susceptibility of intrusive rocks is compared to 3D tomography. The obtained signal is a function of the shape and distribution of ferromagnetic grains, and is often used to infer flow directions of magma. It turns out that the signal is dominated by the shape of the magnetic crystals, and where they form tight clusters, also by their distribution. This is in good agreement with the predictions made in the theoretical and experimental literature. In the sixth chapter arguments for partial melting of host rock carbonates are presented. While at first very surprising, this is to be expected when considering the prior results from the intrusive study and experiments from the literature. Partial melting is documented by compelling microstructures, geochemical and structural data. The necessary conditions are far from extreme and this process might be more frequent than previously thought. The carbonate melt is highly mobile and can move along grain boundaries, infiltrating other rocks and ultimately alter the existing mineral assemblage. Finally, a mineralogical curiosity is presented in chapter seven. The mineral assemblage magne§site and calcite is in apparent equilibrium. It is well known that these two carbonates are not stable together in the system Ca0-Mg0-Fe0-C02. Indeed, magnesite and calcite should react to dolomite during metamorphism. The presented explanation for this '"forbidden" assemblage is, that a calcite melt infiltrated the magnesite bearing rock along grain boundaries and caused the peculiar microstructure. This is supported by isotopie disequilibrium between calcite and magnesite. A further implication of partially molten carbonates is, that the host rock drastically looses its strength so that its physical properties may be comparable to the ones of the intrusive rocks. This contrasting behavior of the host rock may ease the emplacement of the intrusion. We see that the circle closes and the iterative process of better constraining the emplacement could start again. - La Terre est en perpétuel mouvement et les forces tectoniques associées à ces mouvements se manifestent sous différentes formes. Les volcans en sont l'un des exemples les plus impressionnants, mais comme les icebergs, les laves émises en surfaces ne représentent que la pointe d'un vaste système caché dans les profondeurs. Ce système est constitué d'une région source, région où la roche source fond et produit le magma ; ce magma peut s'accumuler dans cette région source ou être transporté à travers différents conduits dans des réservoirs où le magma est stocké. Ce magma peut cristalliser in situ et produire des roches plutoniques ou alors être émis en surface. Un magma représente un mélange entre un liquide et des cristaux. Ces cristaux peuvent être extraits de la source ou se former tout au long du chemin jusqu'à l'endroit final de cristallisation. L'étude de ces cristaux peut ainsi donner des informations sur l'ensemble du système magmatique. Au contraire, les roches encaissantes fournissent des informations sur le niveau d'emplacement de l'intrusion. En effet ces roches enregistrent les effets thermiques et mécaniques imposés par le magma. Pour une meilleure compréhension du système, les deux parties, magmatique et métamorphique, doivent être intégrées. Cette thèse a pour but de montrer que les informations issues de l'étude des roches magmatiques et des roches encaissantes sont complémentaires. C'est un processus itératif qui utilise les contraintes d'un domaine pour améliorer la compréhension de l'autre. Comprendre l'histoire des roches encaissantes n'est pas toujours aisé. Ceci est démontré dans le chapitre deux, où un modèle de formation des grenats observés sous forme d'agrégats dans l'auréole de contact est proposé. Des fragments de grenats plus vieux que les roches intru- sives montrent une zone de surcroissance générée par l'apport thermique produit par la mise en place du pluton adjacent. La formation des agrégats de grenats n'est donc pas le résultat d'un seul événement, comme on le décrit habituellement, mais d'un processus en deux phases, soit l'altération de vieux grains engendrant une fracturation de ces grenats, puis la formation de zone de surcroissance autour de ces différents fragments expliquant la texture en agrégats observée. Cette interprétation en deux phases est importante, car elle engendre des différences notables lorsque l'on applique des méthodes pétrologiques comme la thermobarométrie, la géochronologie ou encore lorsque l'on étudie la distribution relative de la taille des grains. Les conditions thermales dans l'auréole de contact dépendent fortement du mode d'emplacement de l'intrusion et c'est pourquoi il est nécessaire de d'abord comprendre le pluton avant de faire des conclusions sur son auréole de contact. Une étude de terrain des roches intrusives ainsi qu'une étude géochimique, géochronologique et structurale est présente dans le troisième chapitre. Cette étude apporte des informations importantes sur la formation de l'intrusion mais également de nouvelles connaissances sur la nature de grands plutons homogènes et la structure de système magmatique en général. L'emplacement incrémental est mis en évidence et l'existence d'un réservoir intermédiaire en-dessous des plutons homogènes est proposé. Le quatrième chapitre de cette thèse illustre comment utiliser l'information extraite des roches encaissantes pour expliquer la mise en place de l'intrusion. Les températures obtenues par la combinaison des observations de terrain et l'assemblage métamorphique sont utilisées avec des modèles thermiques pour contraindre l'activité magmatique au contact directe de cette auréole. Au lieu d'utiliser le modèle thermique pour vérifier le résultat pétrologique, une approche inverse a été choisie. Les paramètres du modèle ont été changés jusqu'à ce qu'on obtienne une correspondance avec les températures observées dans l'auréole de contact. Ceci montre qu'il y a peu de combinaison qui peuvent expliquer les températures et qu'on peut contraindre la fréquence de l'activité magmatique d'un ancien système magmatique de cette manière. Dans le cinquième chapitre, les processus contrôlant l'anisotropie de la susceptibilité magnétique des roches intrusives sont expliqués à l'aide d'images de la distribution des minéraux dans les roches obtenues par tomographie 3D. Le signal associé à l'anisotropie de la susceptibilité magnétique est une fonction de la forme et de la distribution des grains ferromagnétiques. Ce signal est fréquemment utilisé pour déterminer la direction de mouvement d'un magma. En accord avec d'autres études de la littérature, les résultats montrent que le signal est dominé par la forme des cristaux magnétiques, ainsi que par la distribution des agglomérats de ces minéraux dans la roche. Dans le sixième chapitre, une étude associée à la fusion partielle de carbonates dans les roches encaissantes est présentée. Si la présence de liquides carbonatés dans les auréoles de contact a été proposée sur la base d'expériences de laboratoire, notre étude démontre clairement leur existence dans la nature. La fusion partielle est documentée par des microstructures caractéristiques pour la présence de liquides ainsi que par des données géochimiques et structurales. Les conditions nécessaires sont loin d'être extrêmes et ce processus pourrait être plus fréquent qu'attendu. Les liquides carbonatés sont très mobiles et peuvent circuler le long des limites de grain avant d'infiltrer d'autres roches en produisant une modification de leurs assemblages minéralogiques. Finalement, une curiosité minéralogique est présentée dans le chapitre sept. L'assemblage de minéraux de magnésite et de calcite en équilibre apparent est observé. Il est bien connu que ces deux carbonates ne sont pas stables ensemble dans le système CaO-MgO-FeO-CO.,. En effet, la magnésite et la calcite devraient réagir et produire de la dolomite pendant le métamorphisme. L'explication présentée pour cet assemblage à priori « interdit » est que un liquide carbonaté provenant des roches adjacentes infiltre cette roche et est responsable pour cette microstructure. Une autre implication associée à la présence de carbonates fondus est que la roche encaissante montre une diminution drastique de sa résistance et que les propriétés physiques de cette roche deviennent comparables à celles de la roche intrusive. Cette modification des propriétés rhéologiques des roches encaissantes peut faciliter la mise en place des roches intrusives. Ces différentes études démontrent bien le processus itératif utilisé et l'intérêt d'étudier aussi bien les roches intrusives que les roches encaissantes pour la compréhension des mécanismes de mise en place des magmas au sein de la croûte terrestre.

Importance of sequences adjacent to the terminal tripeptide in the import of a peroxisomal Candida tropicalis protein in plant peroxisomes.

The peroxisome targeting signal (PTS) required for import of the rat acyl-CoA oxidase (AOX; EC 1.3.3.6) and the Candida tropicalis multifunctional protein (MFP) in plant peroxisomes was assessed in transgenic Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. The native rat AOX accumulated in peroxisomes in A. thaliana cotyledons and targeting was dependent on the presence of the C-terminal tripeptide S-K-L. In contrast, the native C. tropicalis MFP, containing the consensus PTS sequence A-K-I was not targeted to plant peroxisomes. Modification of the carboxy terminus to the S-K-L tripeptide also failed to deliver the MFP to peroxisomes while addition of the last 34 amino acids of the Brassica napus isocitrate lyase, containing the terminal tripeptide S-R-M, enabled import of the fusion protein into peroxisomes. These results underline the influence of the amino acids adjacent to the terminal tripeptide of the C. tropicalis MFP on peroxisomal targeting, even in the context of a protein having a consensus PTS sequence S-K-L.

Oligomerization of the alpha 1a- and alpha 1b-adrenergic receptor subtypes. Potential implications in receptor internalization.

We combined biophysical, biochemical, and pharmacological approaches to investigate the ability of the alpha 1a- and alpha 1b-adrenergic receptor (AR) subtypes to form homo- and hetero-oligomers. Receptors tagged with different epitopes (hemagglutinin and Myc) or fluorescent proteins (cyan and green fluorescent proteins) were transiently expressed in HEK-293 cells either individually or in different combinations. Fluorescence resonance energy transfer measurements provided evidence that both the alpha 1a- and alpha 1b-AR can form homo-oligomers with similar transfer efficiency of approximately 0.10. Hetero-oligomers could also be observed between the alpha 1b- and the alpha 1a-AR subtypes but not between the alpha 1b-AR and the beta2-AR, the NK1 tachykinin, or the CCR5 chemokine receptors. Oligomerization of the alpha 1b-AR did not require the integrity of its C-tail, of two glycophorin motifs, or of the N-linked glycosylation sites at its N terminus. In contrast, helix I and, to a lesser extent, helix VII were found to play a role in the alpha 1b-AR homo-oligomerization. Receptor oligomerization was not influenced by the agonist epinephrine or by the inverse agonist prazosin. A constitutively active (A293E) as well as a signaling-deficient (R143E) mutant displayed oligomerization features similar to those of the wild type alpha 1b-AR. Confocal imaging revealed that oligomerization of the alpha1-AR subtypes correlated with their ability to co-internalize upon exposure to the agonist. The alpha 1a-selective agonist oxymetazoline induced the co-internalization of the alpha 1a- and alpha 1b-AR, whereas the alpha 1b-AR could not co-internalize with the NK1 tachykinin or CCR5 chemokine receptors. Oligomerization might therefore represent an additional mechanism regulating the physiological responses mediated by the alpha 1a- and alpha 1b-AR subtypes.

Development of advanced silicon radiation detectors for high energy physics and medical imaging

The 1st chapter of this work presents the different experiments and collaborations in which I am involved during my PhD studies of Physics. Following those descriptions, the 2nd chapter is dedicated to how the radiation affects the silicon sensors, as well as some experimental measurements carried out at CERN (Geneve, Schwitzerland) and IFIC (Valencia, Spain) laboratories. Besides the previous investigation results, this chapter includes the most recent scientific papers appeared in the latest RD50 (Research & Development #50) Status Report, published in January 2007, as well as some others published this year. The 3rd and 4th are dedicated to the simulation of the electrical behavior of solid state detectors. In chapter 3 are reported the results obtained for the illumination of edgeless detectors irradiated at different fluences, in the framework of the TOSTER Collaboration. The 4th chapter reports about simulation design, simulation and fabrication of a novel 3D detector developed at CNM for ions detection in the future ITER fusion reactor. This chapter will be extended with irradiation simulations and experimental measurements in my PhD Thesis.

Dynamin-SNARE interactions control trans-SNARE formation in intracellular membrane fusion.

The fundamental processes of membrane fission and fusion determine size and copy numbers of intracellular organelles. Although SNARE proteins and tethering complexes mediate intracellular membrane fusion, fission requires the presence of dynamin or dynamin-related proteins. Here we study these reactions in native yeast vacuoles and find that the yeast dynamin homologue Vps1 is not only an essential part of the fission machinery, but also controls membrane fusion by generating an active Qa SNARE-tethering complex pool, which is essential for trans-SNARE formation. Our findings provide new insight into the role of dynamins in membrane fusion by directly acting on SNARE proteins.

Solid-phase synthesis and NMR studies of modified oligonucleotides forming triplex helix and of oligonucleopeptides mimicking the topoisomerase I-DNA covalent complex

Report for the scientific sojourn carried out at the Institut de Biologia Molecular de Barcelona of the CSIC –state agency – from april until september 2007. Topoisomerase I is an essential nuclear enzyme that modulates the topological status of DNA, facilitating DNA helix unwinding during replication and transcription. We have prepared the oligonucleotide-peptide conjugate Ac-NLeu-Asn-Tyr(p-3’TTCAGAAGC5’)-LeuC-CONH-(CH2)6-OH as model compound for NMR studies of the Topoisomerase I- DNA complex. Special attention was made on the synthetic aspects for the preparation of this challenging compound especially solid supports and protecting groups. The desired peptide was obtained although we did not achieve the amount of the conjugate needed for NMR studies. Most probably the low yield is due to the intrinsic sensitive to hydrolysis of the phosphate bond between oligonucleotide and tyrosine. We have started the synthesis and the structural characterization of oligonucleotides carrying intercalating compounds. At the present state we have obtained model duplex and quadruplex sequences modified with acridine and NMR studies are underway. In addition to this project we have successfully resolved the structure of a fusion peptide derived from hepatitis C virus envelope synthesized by the group of Dr. Haro and we have synthesized and started the characterization of a modified G-quadruplex.

HCF-1 is cleaved in the active site of O-GlcNAc transferase.

Host cell factor-1 (HCF-1), a transcriptional co-regulator of human cell-cycle progression, undergoes proteolytic maturation in which any of six repeated sequences is cleaved by the nutrient-responsive glycosyltransferase, O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) transferase (OGT). We report that the tetratricopeptide-repeat domain of O-GlcNAc transferase binds the carboxyl-terminal portion of an HCF-1 proteolytic repeat such that the cleavage region lies in the glycosyltransferase active site above uridine diphosphate-GlcNAc. The conformation is similar to that of a glycosylation-competent peptide substrate. Cleavage occurs between cysteine and glutamate residues and results in a pyroglutamate product. Conversion of the cleavage site glutamate into serine converts an HCF-1 proteolytic repeat into a glycosylation substrate. Thus, protein glycosylation and HCF-1 cleavage occur in the same active site.

Reversal of the silencing of tetracycline-controlled genes requires the coordinate action of distinctly acting transcription factors.

BACKGROUND: Regulation of genes transferred to eukaryotic organisms is often limited by the lack of consistent expression levels in all transduced cells, which may result in part from epigenetic gene silencing effects. This reduces the efficacy of ligand-controlled gene switches designed for somatic gene transfers such as gene therapy. METHODS: A doxycycline-controlled transgene was stably introduced in human cells, and clones were screened for epigenetic silencing of the transgene. Various regulatory proteins were targeted to the silent transgene, to identify those that would mediate regulation by doxycycline. RESULTS: A doxycycline-controlled minimal promoter was found to be prone to gene silencing, which prevents activation by a fusion of the bacterial TetR DNA-binding domain with the VP16 activator. DNA modification studies indicated that the silenced transgene adopts a poorly accessible chromatin structure. Several cellular transcriptional activators were found to restore an accessible DNA structure when targeted to the silent transgene, and they cooperated with Tet-VP16 to mediate regulation by doxycycline. CONCLUSIONS: Reversal of the silencing of a tetracycline-regulated minimal promoter requires a chromatin-remodeling activity for subsequent promoter activation by the Tet-VP16 fusion protein. Thus, distinct regulatory elements may be combined to obtain long-term regulation and persistent expression of exogenous genes in eukaryotic cells.

Current status of biotechnology in China

There has been increasing interest over past decade in exploring the possibility of using new biotechinology to produce new products and to improve the old productive process. The researches and applications of genetic engineering, cell fusion, mutagenesis, cell and enzyme immobilization in enzyme, antibiotic, vitamine, steroid, amino acid, organic acid, solvent, food and brewage industries is reviewed.

Force-induced globule-coil transition in laminin binding protein and its role for viral-cell membrane fusion.

The specific interactions of the pairs laminin binding protein (LBP)-purified tick-borne encephalitis viral surface protein E and certain recombinant fragments of this protein, as well as West Nile viral surface protein E and certain recombinant fragments of that protein, are studied by combined methods of single-molecule dynamic force spectroscopy (SMDFS), enzyme immunoassay and optical surface waves-based biosensor measurements. The experiments were performed at neutral pH (7.4) and acid pH (5.3) conditions. The data obtained confirm the role of LBP as a cell receptor for two typical viral species of the Flavivirus genus. A comparison of these data with similar data obtained for another cell receptor of this family, namely human αVβ3 integrin, reveals that both these receptors are very important. Studying the specific interaction between the cell receptors in question and specially prepared monoclonal antibodies against them, we could show that both interaction sites involved in the process of virus-cell interaction remain intact at pH 5.3. At the same time, for these acid conditions characteristic for an endosome during flavivirus-cell membrane fusion, SMDFS data reveal the existence of a force-induced (effective already for forces as small as 30-70 pN) sharp globule-coil transition for LBP and LBP-fragments of protein E complexes. We argue that this conformational transformation, being an analog of abrupt first-order phase transition and having similarity with the famous Rayleigh hydrodynamic instability, might be indispensable for the flavivirus-cell membrane fusion process. Copyright © 2014 John Wiley & Sons, Ltd.