金环蛇蛇毒对S180, EAC 腹水癌细胞的细胞毒性作用

　目的　探讨金环蛇毒对S180, EAC 腹水癌细胞的细胞毒性作用。　方法　采用小白鼠腹腔和皮下 接种S180, EAC 腹水癌细胞造成小白鼠腹水模型后腹腔注射金环蛇毒。　结果　腹腔注射金环蛇毒, 能 抑制肿瘤细胞的生长, 降低接种率。但不能完全控制腹水和癌细胞的生长。体外试验表明有明显的细胞毒 作用。台酚蓝染色镜检可见死细胞显著增加, 腹水图片检查给药后细胞膜破裂, 纤维化坏死明显。　结论 　能延长小白鼠存活时间。

尖吻蝮蛇毒出血毒素DaHT-3 的红外光谱测定

　目的　观察蛇毒出血毒素结构的变化对功能的影响。　方法　利用傅利叶变换红外光谱仪对尖吻 蝮蛇毒出血毒素(DaHT23) 在溶液中酰胺I 带吸收光谱的研究, 探测了此出血毒素在溶液中的自然构象 和加入EDTA 螯合剂除去金属离子后构象的变化。　结果　此出血毒素在水溶液中的自然构象分别是: A2 螺旋为3118%、B2折叠为5611%、转角为1211%; 而在去除金属离子情况下A2螺旋和B2折叠减少, 转角 和无规卷曲增加, 即加入螯合剂后其A2螺旋、B2折叠、转角和无规卷曲分别变为11%、2614%、4612% 和 1615%。由于结构的变化, 它的出血活性和蛋白水解酶活性均被丧失。　结论　金属离子, 特别是锌离子 在维系蛇毒出血蛋白酶分子中的二级结构中起着很重要的作用。

尖吻蝮蛇蛇毒出血毒素的纯化与部分性质

目的　被尖吻蝮蛇(D ienag k istrod on acu tus) 咬伤会引起严重的出血, 对蛇毒出血毒素的研究有利 于治疗蛇伤出血药物筛选。方法　采用Sephadex G275, DEA E2Sephadex A 250, Sephadex G2200 和两次 PBE 聚焦层析纯化。SDS2PA GE 电泳和等电聚焦电泳测定纯化样品的纯度和等电点。氨基酸组成用自动氨 基酸分析仪测定。以小鼠背部皮下注射部位出血斑的面积来确定最小出血剂量和常规的方法测定酶活性。 结果　从尖吻蝮蛇毒中纯化到一个相对分子量为56 000 的出血毒素(DaHT23) , 经氨基酸组成测定计算, 它由487 个氨基酸残基组成。此成分在SDS2PA GE 上显示出一条均一的蛋白染色带, 其p I 为5150。该出 血成分的最小出血剂量是216Lg, 具有蛋白水解酶活力, 其活力为3168, 但没有精氨酯酶和磷脂酶A 2 活 力。当加入EDTA 螯合剂去除金属离子后, 它们的出血活力和蛋白水解酶活力均丧失。结论　这是从大 陆尖吻蝮蛇毒中获得的一个新的出血金属蛋白酶(DaHT 23)。

Characterization of a new bradykinin-potentiating peptide (TmF) from Trimeresurus mucrosquamatus

A novel bradykinin-potentiating peptide (BPP), designated as TmF, has been purified to homogeneity from the venom of Trimeresurus mucrosquamatus by 70% cold methanol extraction, Sephadex G-15 gel filtration and reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC). The amino acid sequence of TmF was determined to be pGlu-Gly-Arg-Pro-Leu-Gly-Pro-Pro-Ile-Pro-Pro (pGlu denotes pyroglutamic acid), which shared high homology with other BPPs. The molecular mass of TmF was 1.1107 kD as determinated by electrospray ionization-mass spectrometry (ESI-MS), which was in accordance with the calculated value of 1.1106 kD. The potentiating "unit" of TmF to bradykinin-induced (BK-induced) contraction on the guinea-pig ileum in vitro was (1.13 +/- 0.3) unit (mg/L), and TmF (5.0 x 10(-4) mg/kg) increased the pressure-lowering-effect of bradykinin (5.0 x 10(-5) mg/kg) with approximate descent value of (14 +/- 2) mmHg. In addition, TmF inhibited the conversion of angiotensin I to angiotensin 11, 2 x 10(-3) mg of TmF caused 50% inhibition (IC50) of angiotensin-converting enzyme (ACE) hydrolyzing activity to bradykinin.

Improved suppression of circulating complement does not block acute vascular rejection of pig-to-rhesus monkey cardiac transplants

At present, acute vascular rejection (AVR) remains a primary obstacle inhibiting long-term graft survival in the pig-to-non-human primate transplant model. The present study was undertaken to determine whether repetitive injection of low dose Yunnan-cobra venom factor (Y-CVF), a potent complement inhibitor derived from the venom of Naja kaouthia can completely abrogate hemolytic complement activity and subsequently improve the results in a pig-to-rhesus monkey heterotopic heart transplant model. Nine adult rhesus monkeys received a heterotopic heart transplant from wild-type pigs and the recipients were allocated into two groups: group 1 (n = 4) received repetitive injection of low dose Y-CVF until the end of the study and group 2 (n = 5) did not receive Y-CVF. All recipients were treated with cyclosporine A (CsA), cyclophosphamide (CyP) and steroids. Repetitive Y-CVF treatment led to very dramatic fall in CH50 and serum C3 levels (CH50 < 3 units/C3 remained undetectable throughout the experiment) and successfully prevented hyperacute rejection (HAR), while three of five animals in group 2 underwent HAR. However, the continuous suppression of circulating complement did not prevent AVR and the grafts in group 1 survived from 8 to 13 days. Despite undetectable C3 in circulating blood, C3 deposition was present in these grafts. The venular thrombosis was the predominant histopathologic feature of AVR. We conclude that repetitive injection of low dose Y-CVF can be used to continuously suppress circulating complement in a very potent manner and successfully prevent HAR. However, this therapy did not inhibit complement deposition in the graft and failed to prevent AVR. These data suggest that using alternative pig donors [i.e. human decay accelerating factor (hDAF)-transgenic] in combination with the systemic use of complement inhibitors may be necessary to further control complement activation and improve survival in pig-to-non-human primate xenotransplant model.

TMVA, a novel GPIb-binding protein, significantly prevents platelet microthrombi formation and prolongs discordant cardiac xenograft survival

In xenotransplantation, donor endothelium is the first target of immunological attack. Activation of the endothelial cell by preformed natural antibodies leads to platelet binding via the interaction of the glycoprotein (GP) Ib and von Willebrand factor (vWF). TMVA is a novel GPIb-binding protein purified from the venom of Trimeresurus mucrosquamatus. In this study, the inhibitory effect of TMVA on platelet aggregation in rats and the effect on discordant guinea pig-to-rat cardiac xenograft survival were investigated. Three doses (8, 20 or 40 mug/kg) of TMVA were infused intravenously to 30 rats respectively. Platelet aggregation rate was assayed 0.5, 12, and 24 h after TMVA administration. Wister rats underwent guinea pig cardiac cervical heterotopic transplantation using single dosing of TMVA (20 mug/kg, i.v., 0.5 h before reperfusion). Additionally, levels of TXB2 and 6-keto-PGF(1alpha) within rejected graft tissues were determined by radioimmunoassay. Treatment with TMVA at a dose of 20 or 40 mug/kg resulted in complete inhibition of platelet aggregation 0.5 h after TMVA administration. Rats receiving guinea pig cardiac xenografts after TMVA therapy had significantly prolonged xenograft survival. Histologic and immunopathologic analysis of cardiac xenografts in TMVA treatment group showed no intragraft platelet microthrombi formation and fibrin deposition. Additionally, the ratio of 6-keto-PGF(1alpha) to TXB2 in TMVA treatment group was significantly higher than those in control group. We conclude that the use of this novel GPIb-binding protein was very effective in preventing platelet microthrombi formation and fibrin deposition in a guinea pig-to-rat model and resulted in prolongation of xenograft survival. The increased ratio of PGI(2)/TXA(2) in TMVA treatment group may protect xenografts from the endothelial cell activation and contribute to the prolongation of xenograft survival.

Design and testing of an ortho-planar micro-valve

This paper presents the production and testing of an ortho-planar one-way micro-valve. The main advantages of such valves are that they are very compact and can be made from a single flat piece of material. A previous paper presents and discusses a micro-valve assembly based on a spider spring. The present paper focuses on the valve assembly process and the valve performance.. Several prototypes with a bore of 0.2 mm have been built using two manufacturing techniques (μEDM and stereo-lithography) and tested for pressures up to 7 bars. © 2008 International Federation for Information Processing.

蛇毒血管内皮生长因子及丝氨酸蛋白酶类似物的研究

蝰科蛇毒中含有丰富的具有血管通透增强活性的蛋白组分，本论文结合生物化学与分子生物学手段对几种毒蛇的蛇毒血管内皮生长因子进行了研究。其中，从云南产菜花烙铁头（Trimeresurus jerdonii）蛇毒中分离得到一个血管内皮生长因子，TjsvVEGF，并研究了其活性与受体结合特性的关系。同时，对圆斑蝰蛇、蝮蛇、山烙铁头和竹叶青等几种蛇的svVEGFs进行了分子生物学研究。此外，我们还分离到了一个蛇毒丝氨酸蛋白酶类似物,TjsvSPH,还对该蛋白的理化性质进行了初步研究。 TjsvVEGF是一个表观分子量为29 kDa的二聚体蛋白，由两个相同大小的亚基组成。活性实验表明，它在10ng的剂量下即可明显提高血管通透性，活性强度与VEGF165相当。虽然TjsvVEGF的氨基酸序列与TfsvVEGF和Pm-VEGF具有较高的相似性，但是它们的受体结合特性却有很大差异。TjsvVEGF与VEGFR-1的结合能力很弱，而对VEGR-2有很高的亲和力。这说明，TjsvVEGF的活性主要是VEGFR-2介导的。最后，我们对导致TjsvVEGF对VEGFR-1低亲和力的原因进行了探讨。 利用PCR方法，我们从圆斑蝰蛇毒腺中得到了三种svVEGFs蛋白编码区长短不一的cDNA序列，其差异是由cDNA链中一段富含AG（3’拼接接受位点）的区段发生了核苷酸缺失产生的。蛋白编码区核苷酸的缺失导致其编码的三种svVEGF蛋白N末端的氨基酸序列和长短均产生较大差异。因此我们推测，蝰属svVEGFs蛋白N末端普遍较短可能是编码它们的mRNA前体对3’拼接点的不同选择产生的。同时，通过对cDNAs推导的氨基酸序列分析发现，蝮蛇svVEGF和山烙铁头svVEGF在与受体结合相关的多个重要位点上发生了氨基酸替换，提示它们是研究svVEGFs与VEGFR结合机制的良好材料。 通过分子筛、离子交换和亲和层析等方法，我们还从菜花烙铁头蛇毒中得到了一个不具有酶活性的丝氨酸蛋白酶类似物，命名为：TjsvSPH。内肽序列测定结果表明，TjsvSPH三联体结构中的组氨酸已突变为精氨酸，这很可能是导致其失去蛋白水解酶活性的主要原因。活性检测验表明，与许多已发现的蛇毒活性组分不同，TjsvSPH不具有蛋白水解酶活性，不能引起血小板聚集，也不抑制ADP和凝血酶诱导的血小板聚集。它对人血浆的复钙时间也没有影响。TjsvSPH的氨基酸序列与典型蛇毒丝氨酸蛋白酶Halystase和Calobin有约77％的一致性。它与同科属来源的蛇毒丝氨酸蛋白酶类似物氨基酸序列相似性高达92％以上，与不同科属的也有约74％以上的相似性。通过对Genbank中六种毒蛇所有丝氨酸蛋白酶及其类似物进化分析，我们推测，蛇毒丝氨酸蛋白酶类似物很可能是由蛇毒丝氨酸蛋白酶进化而来，并在进化过程中形成了一类独特的蛋白质。

竹叶青蛇毒金属蛋白酶结构与功能的研究

出血性的蝰科蛇毒中含有丰富的蛇毒金属蛋白酶，本论文就竹叶青（Trimeresurus stejnegeri）蛇毒中的蛇毒金属蛋白酶的结构与功能进行研究。我们用生物化学手段从竹叶青（T.stejnegeri）的粗毒中分离纯化得到一个二聚体的P-IIIb亚型蛇毒金属蛋白酶，命名为TSV-DM。同时，用分子生物学方法从竹叶青（T.stejnegeri）的毒腺cDNA文库中克隆得到3个P-III型的蛇毒金属蛋白酶的cDNAs序列， 其中一个编码TSV-DM蛋白前体，另两个编码P-IIIc亚型的出血性蛇毒金属蛋白酶前体，分别命名为stejnihagin-A 和 stejnihagin-B。 经过阴离子层析和肝素亲和层析两步层析方法，我们从竹叶青（T. stejnegeri）蛇毒中分离纯化得到TSV-DM蛋白质，非还原条件下SDS-PAGE电泳表观分子量约110 kDa，还原条件下约为55 kDa。活性检测表明，TSV-DM降解牛纤维蛋白原Aα链快于Bβ链，且呈剂量依赖关系。但不降解明胶，不诱导出血，不具有促凝或者抗凝活性，以及不诱导或者抑制血小板聚集。蛋白质N-末端测序表明TSV-DM的成熟蛋白N-末端封闭。利用肽指纹图谱确证了TSV-DM的编码cDNA。TSV-DM的cDNA序列编码622个氨基酸残基的蛋白前体，包括信号肽、前肽、金属蛋白酶区域、间隔区、去整合素样区域和富含半胱氨酸区域。TSV-DM与其他P-III型蛇毒金属蛋白酶的一级结构序列比对发现TSV-DM和诱导血管内皮细胞凋亡的P-IIIb亚型蛇毒金属蛋白酶具有高度的同源性。但是用人脐带静脉血管内皮细胞系ECV304细胞作为靶细胞检测TSV-DM的诱导血管内皮细胞凋亡活性发现，TSV-DM只能抑制ECV304细胞的增殖和诱导细胞形态从多角形的内皮细胞向成纤维细胞样的梭形状改变。电泳检测抽提的片断化DNA以及流式细胞仪检测TSV-DM处理的ECV304细胞的DNA含量变化均表明TSV-DM不能诱导ECV304细胞的凋亡。 Stejnihagin-A 和stejnihagin-B是用PCR方法从竹叶青（T.stejnegeri）毒腺cDNA文库中克隆得到的两个P-III型蛇毒金属蛋白酶前体的cDNAs。这两个cDNA序列均编码600个氨基酸残基的蛋白前体，包括信号肽、前肽、金属蛋白酶区域、间隔区、去整合素样区域和富含半胱氨酸区域。推导成熟肽的氨基酸序列分析结果表明，stejnihagin-A 和stejnihagin-B不仅在一级结构序列上和来源于黄绿烙铁头（Trimeresurus flavoviridis）的HR1b具有高度同源性，高达79%， 而且在他们的金属蛋白酶区域的第100个氨基酸残基位置上均有一保守的半胱氨酸残基。结合序列比对和进化树的分析，我们推测stejnihagin-A、stejnihagin-B和HR1b有可能组成一个新的P-III型蛇毒金属蛋白酶亚型，命名为P-IIIc亚型。

眼镜王蛇毒第X因子激活剂结构和功能研究

通过G-75（超细）凝胶过渡，快速蛋白液相色谱（FPLC）阴离子柱两步离子交换从眼镜王蛇毒中分离得到了一个特异的血液凝固第X因子激活剂。在碱性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中均呈一条均一的带。纯化的眼镜王蛇毒第X因子激活剂不能作用于纤维蛋白原、凝血酶原、蛋白C、纤溶酶原，对6种人工合成小肽发色底物及BAEE的水解实验表明它不能水解大多数小肽底物，不具备水解BAEE的酯酶活性，表明了它对大分子及小分子底物作用专一性较高，同时表明了对FX的作用是较为专一的。抑制剂研究结果表明它对FX的激活活性被丝氨酸蛋白酶的抑制剂PMSF、TPCK等抑制，而金属离子螯合剂EDTA则无影响，表明眼镜王蛇毒血液凝固第X因子激活剂是一个丝氨酸蛋白酶。

金环蛇蛇毒丝氨酸蛋白酶抑制剂和三种胡蜂蜂毒的研究

蛇毒和蜂毒是提供药理学活性分子的丰富来源，它们富含肽和蛋白，包括一 些酶类和毒素。 丝氨酸蛋白酶抑制剂广泛存在于动物、植物和微生物体内，参与许多重要的 生理过程，如血液凝集、纤维蛋白溶解、细胞凋亡、发育以及炎症反应和补体活 化等（van Gent D. et al., 2003）。通过凝胶过滤、离子交换和反向高压液相色谱， 我们从金环蛇毒液中纯化得到一种天然的丝氨酸蛋白酶抑制剂，命名为 bungaruskunin。并且从该蛇的毒腺cDNA 文库中克隆到了它的核苷酸序列。 bungaruskunin 预测的前体由83 个氨基酸组成，包括含有24 个氨基酸的信号肽 和含有59 个氨基酸的成熟肽。它与一种由红腹伊澳蛇（Pseudechis porphyriacus） 的cDNA 预测到的丝氨酸蛋白酶抑制剂blackelin 具有最大相似性，达64％。 Bungaruskunin 是一种Kunitz 型的蛋白酶抑制剂，具有一个保守的Kunitz 结构域， 能够抑制胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。通过对金环蛇毒腺cDNA 文库 的筛选，我们还得到了另外两条β-bungarotoxin B 链，Bungaruskunin 的整体结 构与β-bungarotoxin B 链相似，特别是它们都具有高度保守的信号肽序列。这些 发现强烈地表明蛇毒Kunitz/BPTI 蛋白酶抑制剂与神经毒性的类似物可能起源于 共同的祖先。 肥大细胞脱粒肽是从膜翅目昆虫的毒液中鉴别出的一个小肽家族，是一种具 有潜在的药物治疗作用的诱导活性分子（Xueqing Xu et al., 2006）。来源于蜂类的 缓激肽样的类似物vespakinin 家族是一种具有调节和激素功能的活性成分，与哺 乳动物和两栖动物的缓激肽类似（Nakajima T., 1984）。本研究对三种胡蜂的 毒液进行了一系列的活性检测，发现黑尾胡蜂的蜂毒对白色念珠菌Candida albicans 和金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 有抑制作用。凹纹胡蜂和黑尾 胡蜂的蜂毒具有微弱的磷酯酶A2 活性。通过凝胶过滤和反向高压液相色谱，没 有得到相关的活性组分。通过对三种胡蜂毒腺cDNA 文库的筛选，我们得到了2 条来源于黑尾胡蜂的核苷酸序列，Blast 分析表明，其中一条编码类似肥大细胞 脱粒肽，但未克隆到全长，序列比对结果显示其与来源于大胡蜂（Vespa magnifica） 的Mastoparan-like peptide 12c precursor（GenBank accession A0SPI0）的核苷酸序 列相似性达98％（Xueqing Xu et al., 2006）；另一条编码缓激肽类似物，命名为 Hw-bradykinin，序列比对结果显示其与来源于大胡蜂（Vespa magnifica）的 vespakinin-M precursor（GenBank accessionABG75944）的核苷酸相似率达96% (Zouhong Zhou et al., 2006)。

菜花烙铁头蛇毒金属蛋白酶的研究

本论文结合生物化学与分子生物学手段对云南产菜花烙铁头蛇毒（几互刃eresrs户厂由刀打）的金属蛋白酶进行了系统深入的研究。从中分离纯化到两个新的蛇毒金属蛋白酶：二型蛇毒金属蛋白酶Jerdonit认和三型蛇毒金属蛋白酶jerdohagin。采用又卫PCR的方法得到了两个cDNA。通过蛋白质胰蛋白酶水解的内肚测序分析，其中一条为编码Jerdo址tin的，cDNA。序列分析发现，另外一条是一个含有RTS短链去整合素cDNA序列，命名为jerdos七atin，并对其进行了表达和活性鉴定。，Jerdonitin是一个表观分子量为为kDa的单链蛋白。它的c砚认全长1578bP，由金属蛋白酶、间隔区和去整合素区组成，说明它是二型蛇毒金属蛋白酶。但是与其它二型蛇毒金属蛋白酶不同的是，Jerdonitin的成熟蛋白由金属蛋白酶和去整合素结构域组成。与其它二型相比，Jerdonitin"多了两个半肤氨酸的（CysZ19andCys238）分别位于间隔区和去整合素区，Cys219可能和后面去整合素区的自由半眺氨酸残基Cys238形成一对二硫键，这对二硫键可能阻止了在后翻译加工过程中去整合素区的释放。通过Jerdonitin和其它二型蛇毒金属蛋白酶氨基酸序列比较和进化分析，结合天然蛋白结构数据，说明Jerdonitin是二型蛇毒金属蛋白酶的一个新亚型。和其它蛇毒金属蛋白酶一样，Jerdon九in是a一纤溶酶，并且它的活性都能被金属鳌合剂EDTA完全抑制，而不受丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF影响。像其独特的结构一样，Jerdonitin不仅具有纤维蛋白原降解的蛇毒金属蛋白酶活性，而且也有抑制ADP诱导的血小板聚集的非酶活性。Jerdohagin是一个表观分子量为96kDa单链蛋白。测定其内肤发现它有金属蛋白酶、去整合素样和富含半耽氨酸区组成，说明jerdohagig是三型蛇毒金属蛋白酶。像其它典型的蛇毒金属蛋白酶一样，jerdohagin的出血活性能完全被EDTA抑制，而不受R涯SF的影响。Jerdohagin是仪纤溶酶专一酶切人纤维蛋白原的。链。用氧化的胰岛素B链作底物，它可以水解仰r16一Leu17肤键。有趣的是，jerdohagin不激活人凝血酶原，但是它酶切人凝血酶原和凝血酶原激活后产生的激活片段F1。Jerdostotin的cDNA全长邹3bp，由信号肚、前肤和去整合素三个区组成，其与。btustotin和vieris七atin有较高的相似性（80％）。jerdostatin的序列是第一个报道的短链去整合素的cD以序列，它的产生机制和aCostatin一a有相似之处。值得注意的是，jerdostatin和obtus七atin八ipris，tatin不同的氨基酸残基（8／9）主要分布在含有整合素识别区的C末端。采用硫氧还蛋·白作为融合蛋白表达jerdostatin：，表达纯化后发现有两个j．erdostatin表达，，命名为：jerdo就。tin一1和'rjerdostotin一2。质谱分析显示它们的八个半肤氨酸都参与形成了四对二硫键，它俩可能是分别含有天然和非天然二硫键结构的多肚。但是jerdostatin一1的活性比rjerdostat还一2高两个数量级。和含有KTS的去整合素一样，重组jerdos七atin的异构体都选择性抑制整合素。lpl结合胶原IV，rjerdost就in一1的抑制活性分别是。b加stotin和viperistotill的1／1时和1／2500。氨基酸残基的组成不同尽管没有影响jerdost就in对整合素alpl的抑制选择性，但是它造成的化学环境不同可能导致抑制活性的差异。

圆斑蝰蛇毒磷脂酶A_2蛋白活性表现和分子进化探讨及菜花烙铁头、烙铁头蛇毒中Jerdonase、TmF的研究

磷脂酶AZ（PLA2）是蛇毒中含量较为丰富的一类作用于梭酷键的酶。迄今为止，己有多种形式的PLA2从不同地域、不同种属的蛇毒中得以纯化并进行了较为系统的研究。其中，以VipoXin为代表的异二聚体形式PLA2较为引人注目，原因在于这种形式不同于此类蛋白家族中的诸多其它个体。目前，己经有许多关于此异二聚体PL凡生物学特性的报道，包括对此类形式存在原因、活性变化、结构表现、系统进化等方面的讨论。然而至今，这种以异二聚体形式存在的PLA2仅发现于几种蛙亚科（ViperinaeSubfamily）蛇种的蛇毒中，其中就包括我国台湾岛的圆斑蜂蛇台湾亚种（Doboiarusselliiformosensis），而蝮亚科（CrotaiinaeSubfamil）蛇种的蛇毒至今却没有此类报道。我国大陆西南端接壤东南亚，存在于云南、福建一带的圆斑蛙蛇隶属圆斑蛙蛇泰国亚种（Daboiarusselliisiamensis），那么这种蛇毒中是否也含有异二聚体形式的PLA2呢？本工作就此疑问对云南产圆斑蛙蛇泰国亚种（D.r.siamensis）蛇毒中的PLA2进行了研究，结果得到三个新的PLAZ，分别命名为DRS-PLA2-I、DRS-PLA2-II和DRS-PLA2-III。其中，DRS-PLA2-I的分子量为13864.06Da，理论pI为4.56，PLA2活性为12.35μmol/mg/min；DRS-PLA2-II的分子量为13635.99Da，理论pI为8.74，PLA2活性为8.76μmol／mg/min；DRS-PLA2-III的分子量为13619.80Da，理论厂为4.61，无PLA2活性。这三个蛋白酶N端的30个氨基酸残基恰好和三个阳性克隆的cDNA序列推导的蛋白序列吻合，结合已经报道的PLA2蛋白家族蛋白序列的保守性表现，我们可以断定它们之间存在对应关系。分子系统学分析表明DRS-PLA2-II和DRS-PLA2-III在进化关系上和蛙亚科的异二聚体PLA2关系较近，并且二者酶活性分别与异二聚体PLA2的Normalchain和Inhibitorchain相一致，只是没有发现类似Vipoxin形式的异二聚体结合蛋白。这些分析表明DRS-PLA2-nORS-PLA2-III类似圆斑蛙蛇台湾亚种（D.r.forlnos翻s沽）中的PV-4/RV-7，是PLA2异二聚体的一种特殊形式，在进化上滞后于VinOXin。另夕卜本工作还相继从云南产菜花烙铁头（Trimeresrusjerdonii）蛇毒和湖南产烙铁头（Trimeresurusmucrosquamatus）蛇毒中分离得到Jerdonase和TmF。前者为一个丝氨酸蛋白酶性质的、具有纤维蛋白原水解作用和激肤释放酶原水解作用双重活性表现的、高分子量的份五brinogenase，其活性表现可以被PMSF彻底抑制，而EDTA对此却没有影响。其它的几种抑制剂如大豆胰蛋白酶抑制剂、l-cysteine、DTT对Jerdonase的活性表现也有不同程度的影响。在Jerdonase的这些生化特性上中，分子量的大小和对纤维蛋白酶水解的特性这两方面有别于蛇毒中诸多其它来源的同类蛋白；后者T淤为一个舒缓激肚增强肤（BradykninPQtentiatingPePtide，BPP），电离质谱分析表明其分子量为1110.7Da。此小肚氨基酸序列为促进舒缓激肚（Bradki垃n，BK）诱导的豚鼠回肠纵行肌收缩的活力单位为（1.13±0.3）（m留L），T妊抑制血管紧张素转化酶（ACE）对BK水解的半数抑制剂量IC50为2μg。比较已报道的从Agkistrodon属和Bothrops属中纯化得到的BPP氨基酸序列发现：BPP的N端都是特征性的pGlu，C端为IIe-Pro-Pro，有高度的保守性。另外，TmF是Trimeresurus属中此类小肤的首次纯化。总之，本研究对国产的几种常见蛇毒中的几种常见蛋白多肤进行了一定程度的探讨和分析，和相同类别的其它蛋白、多肤比较可以看到，有许多相同的地方，也有许多不同的表现，研究结果为相应领域的深入研究提供资料和思路。

菜花烙铁头蛇毒去整合素的纯化、克隆及活性研究

蛇毒去整合素蛋白（disintegrin）家族一般具有分子量低、富含半胧氨酸和含有RGD三肽等结构特点，因其能与配基竞争结合细胞表面的整合素受体，干扰整合素的正常功能而呈现出多方面的生物学活性，如抑制血小板聚集、抑制肿瘤转移和诱导细胞凋亡等。本论文用凝胶过滤、反向高压液相等层析技术从我国云南产菜花烙铁头（Trimeresurusjerdonii）蛇毒中分离纯化到两个新的去整合素蛋白，分别命名为jerdonin和Jerdonatin。MALDI-TOF-MS测定jerdonin分子量为7483Da，jerdonatin分子量为80llDa，二者均属第二类去整合素。分别测定了其N末端25个氨基酸序列，发现与其它蛇毒来源的去整合素具有很高的相似性。提取菜花烙铁头毒腺总mRNA，通过反转录PCR（RT-PCR）扩增到两个去整合素cDNA序列，分别命名为TJDIS-1和TJDIS-2。TJDIS-1全长1528bp，TJDIS-2全长16O3bp，二者均包含编码信号肚区、前肤区、金属蛋白酶区、间隔肤区和去整合素区一属于P一H型金属蛋白酶家族。经推导的氨基酸序列和MALDI一TOF一MS分析，可确定TJDIS-1去整合素区编码jerdonin，TJDIS-2去整合素区编码jerdonotin。jerdonin全长71个氨基酸，jerdonatin全长72个氨基酸，二者均含12个半眺氨酸，且在C末端附近均含有去整合素家族的典型特征三肤序列一RGD。氨基酸序列比较分析显示，jerdon加与来源于侏响尾蛇（Sistrurusm.tergeminus）的去整合素tergeminin序列相似性最高，为82.2％。而jertionatin与来源于黄绿烙铁头（Trimeresurusflavoviridis）的去整合素CTF-I序列相似性最高，为97.2％，仅在RGD附近有两个氨基酸不同。jerdonin与jerdonatin序列相似性为67.6％。本论文还研究了jedonin和jerdonatin的生物学活性。二者均能强烈抑制ADP、胶原、凝血酶诱导的人血小板的聚集，IC50为100-300nM。jerdonin和jerdonatin还能够抑制B16肿瘤细胞增生，研究表明，jerdonin不仅能显著抑制肿块的生长，还能延长荷瘤小鼠的寿命。平均肿块体积由对照的5260．33枷，降低至2086.65mm3，小鼠平均寿命由对照的24.8天延长至30.5天，提高了22.98％。本论文也研究了jerdonin和jedonatin对小鼠精卵受精过程的影响，结果表明jordonotin能够呈剂量关系抑制精卵结合，但对精卵融合无影响。当jerdonatin用量为10.0μg／毗时，单个卵子的精子结合数由对照的95.31降为21.83。菜花烙铁头蛇毒去整合素蛋白的结构和活性鉴定，为去整合素家族的生物多样性研究提供了丰富的素材，同时也为血栓、肿瘤、生殖等生理或病理过程的研究提供了一个有力的工具。