Directed evolution of human dihydrofolate reductase: towards a better understanding of binding at the active site

La dihydrofolate réductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle à la prolifération cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de différents cancers. À cet effet, plusieurs inhibiteurs spécifiques de la DHFRh, les antifolates, ont été mis au point : le méthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgré l’efficacité clinique certaine de ces antifolates, le développement de nouveaux traitements s’avère nécessaire afin de réduire les effets secondaires liés à leur utilisation. Enfin, dans l’optique d’orienter la synthèse de nouveaux composés inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. À l’aide de l’évolution dirigée, il a été possible d’identifier des mutants de la DHFRh pour lesquels l’affinité envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifiée. La mutagenèse dite ¬¬de saturation a été utilisée afin de générer des banques de mutants présentant une diversité génétique au niveau des résidus du site actif de l’enzyme d’intérêt. De plus, une nouvelle méthode de criblage a été mise au point, laquelle s’est avérée efficace pour départager les mutations ayant entrainé une résistance aux antifolates et/ou un maintient de l’activité enzymatique envers son substrat natif, soient les phénotypes d’activité. La méthode de criblage consiste dans un premier temps en une sélection bactérienne à haut débit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant d’identifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, résistants aux antifolates, ont ainsi pu être identifiés et caractérisés lors d’études de cinétique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces résultats cinétiques, de la modélisation moléculaire et des données structurales de la littérature, une étude structure-activité a été effectuée. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commencé à construire un carte moléculaire des contacts impliqués dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplémentaires sur les propriétés spécifiques de liaison ont put être acquises en variant l’inhibiteur testé, permettant ainsi une meilleure compréhension du phénomène de discrimination du ligand.

Participation as capacity-building for active citizenship

Within the framework of the “capability approach” to human rights, this paper argues that adults who facilitate participatory planning and design with children and youth have an ethical obligation to foster young people’s capacities for active democratic citizenship. Practitioners often worry, justifiably, that if young people fail to see their ideas realized, they may become disillusioned and alienated from political life. Based on the experience of the Growing Up in Cities program of UNESCO, four rules of good practice are distilled which can help promote young people’s belief in the value of collective action, regardless of the challenges that the full implementation of their ideas may face.

Etude des propriétés physicochimiques des vecteurs nanoparticulaires

Cette thèse rapporte l’étude des propriétés physicochimiques des nanoparticles polymériques et leur impact sur l’interaction avec les cellules vivantes. Nous nous sommes tout spécialement attachés à étudier l’effet des propriétés adhésives et mécaniques des nanoparticules sur leur capacité de pénétration de la membrane cellulaire. Pour ce faire, nous avons tout d’abord utilisé des nanoparticules d’acide polylactique (PLA) fonctionnalisées en surface avec un ligand des sélectines E et P. Le greffage du ligand sur la particule s’est fait par une nouvelle méthode expérimentale garantissant la présence du ligand à la surface de la particule durant toute sa durée de vie. Cette méthode consiste à mélanger un polymère fonctionnalisé avec le ligand avec un autre polymère non fonctionnalisé. La présence du ligand à la surface des nanoparticules formées à partir de ce mélange de polymères a été confirmée par analyse ToF SIMS. Nous avons pu prouver que les particules possédant le ligand greffé à leur surface démontraient une capacité adhésive supérieure à leurs homologues non fonctionnalisés sur des cellules endothéliales HUVEC activées par différentes drogues. De plus, le captage des particules par les cellules HUVEC est modulé par le niveau d’expression des récepteurs selectine E et P et aussi par la quantité de ligand libre. Ces résultats montrent clairement que le greffage du ligand confère aux particules des propriétés adhésives accrues et spécifiques ce qui permet leur usage postérieure comme vecteur pharmaceutique capable de cibler un récepteur particulier à la surface d’une cellule. Nous avons aussi démontré que l’interaction entre les nanoparticules et la membrane cellulaire peut aussi être contrôlée aussi bien par les propriétés mécaniques de la cellule que de la nanoparticule. Dans une première étape, nous avons mesuré à l’aide de l’appareil de forces de surface l’élasticité de cellules macrophagiques déposées sur différents substrats. En contrôlant l’interaction entre la cellule et le substrat sur lequel elle repose nous avons montré qu’il était possible de modifier à ii volonté les propriétés mécaniques cellulaire. Une augmentation de l’élasticité cellulaire s’accompagne d’une augmentation systématique de l’internalisation de nanoparticules de PLA non fonctionnalisées. Ceci suggère un rôle prépondérant des propriétés mécaniques du cortex cellulaire dans le captage des nanoparticules de PLA. Dans une seconde étape, nous avons étudié l’effet des propriétés mécaniques des nanoparticules sur leur capacité de pénétration cellulaire. Pour ce faire, nous avons synthétisé des particules d’hydrogel dont l’élasticité était contrôlée par le degré d’agent réticulant inclus dans leur formulation. Le contrôle des propriétés mécaniques des nanoparticules a été confirmé par la mesure du module de Young des particules par microscopie de force atomique. L’impact des propriétés mécaniques de ces particules sur leur capacité de pénétration dans les cellules vivantes a été étudié sur des cellules macrophagiques de souris. Les résultats ont montré que la cinétique d’internalisation, la quantité de particules internalisées et le mécanisme d’internalisation dépendent tous du module de Young des nanoparticules. Aucune différence dans le trajet intracellulaire des particules n’a pu être observée malgré le fait que différentes voies d’internalisation aient été observées. Ce dernier résultat peut s’expliquer par le fait que les nanoparticules sont internalisées par plusieurs voie simultanément ce qui facilite leur accumulation dans les organelles digestives intracellulaires. Un modèle simple permettant d’expliquer ces résultats a été proposé et discuté.

Active nuclear import and cytoplasmic retention of activation-induced deaminase

The enzyme activation-induced deaminase (AID) triggers antibody diversification in B cells by catalyzing deamination and consequently mutation of immunoglobulin genes. To minimize off-target deamination, AID is restrained by several regulatory mechanisms including nuclear exclusion, thought to be mediated exclusively by active nuclear export. Here we identify two other mechanisms involved in controlling AID subcellular localization. AID is unable to passively diffuse into the nucleus, despite its small size, and its nuclear entry requires active import mediated by a conformational nuclear localization signal. We also identify in its C terminus a determinant for AID cytoplasmic retention, which hampers diffusion to the nucleus, competes with nuclear import and is crucial for maintaining the predominantly cytoplasmic localization of AID in steady-state conditions. Blocking nuclear import alters the balance between these processes in favor of cytoplasmic retention, resulting in reduced isotype class switching.

Synthèse stéréosélective de motifs polypropionates via la chimie des radicaux : application à l'élaboration de l'hémisphère ouest de la narasine

Cet ouvrage traite principalement de la synthèse de motifs polypropionates de type stéréopentade ainsi qu’une application à la synthèse d’une molécule naturelle possèdant des propriétés biologiques. La stratégie envisagée pour l’élaboration de ces motifs récurrents dans plusieurs structures d’origine naturelle fait appel à la chimie des radicaux. Cette thèse se divise en différents chapitres dans lesquels la versatilité de la méthodologie développée sera démontrée. En premier lieu, il sera question de présenter l’importance de la synthèse de motifs polypropionates. Le domaine couvert par la chimie de ces molécules complexes hautement fonctionnalisées a contribué énormément à l’avancement de nos connaissances en synthèse organique, particulièrement dans le contexte des réactions impliquant des molécules acyliques. Une brève description des méthodes connues est présentée afin de saisir l’étendue des défis restants pour construire efficacement tous les isomères possibles des polypropionates de type stéréopentade. La stratégie proposée est basée sur une approche contrôlée entièrement par le substrat. Ce contrôle s’appuie sur le choix judicieux de l’acide de Lewis activant les deux réactions impliquées, soit la réaction de Mukaiyama et le transfert d’hydrogène. La seconde section de cette thèse concerne principalement le développement d’une réaction de Mukaiyama impliquant un éther d’énol silylé portant un lien pouvant être homolytiquement brisé dans la réaction suivante et un aldéhyde de type propionate. Le contrôle de l’aldolisation provient de la nature de l’acide de Lewis. Une espèce monodentate (BF3·OEt2) génère une relation 3,4-syn selon le modèle dit Felkin-Anh tandis que les acides de Lewis bidentates mènent à la relation 3,4-anti via un état de transition définit comme Cram-chélate. Une optimisation des conditions réactionnelles en variant l’acidité et la stoechiométrie de l’acide de Lewis de titane a permis de construire diastéréosélectivement le produit de Mukaiyama ayant une relation 3,4-anti. En outre, la nature des complexes impliqués dans ces réactions a été élucidée par des études RMN 13C à basse température. Une fois les précurseurs radicalaires synthétisés, notre méthodologie de réduction par transfert d’hydrogène contrôlée également par les acides de Lewis s’avère très efficace. Les acides de Lewis dérivés d’aluminium mènent sélectivement à la relation 2,3-syn selon un contrôle endocyclique tandis que les acides de Lewis de bore permettent la création des relations 2,3-anti en se basant sur une stabilisation par les divers facteurs de contrôle de molécules acycliques. Cette stratégie novatrice nous a ainsi permis de construire efficacement les 16 diastéréoisomères possibles. Le chapitre suivant concerne l’application de cette méthodologie à la synthèse de l’hémisphère ouest de la salinomycine et de la narasine. Plusieurs défis synthétiques ont été relevés à cette occasion par la présence de nombreux centres stéréogènes contigus. Nous avons réalisé que la relation stéréochimique 2,3-anti de la salinomycine n’est pas accessible sélectivement par la chimie des radicaux via l’effet exocyclique. Des études ont été entreprises afin de comprendre cette perte de sélectivité. Les conclusions suggèrent que les substituants sur le cycle imposent un biais conformationnel conduisant à des faibles sélectivités. Une alternative utilisant un réactif de crotylsilane chiral a été développée pour arriver à la molécule cible. Cette situation est différente dans le cas de la narasine où la présence du méthyle sur le carbone en position β du radical bloque efficacement l’approche d’une des faces d’attaque par l’hydrure. Des sélectivités impressionnantes nous ont permis de construire le fragment C1-C9 de la narasine de manière expéditive et efficace. Finalement, l’élongation sélective utilisant à nouveau la séquence d’aldolisation de Mukaiyama/réduction radicalaire suivie d’un couplage de type aldol stéréosélectif conduit au fragment C1-C17 de la narasine (hémisphère ouest)en 19 étapes avec un rendement global de l’ordre de 7 %. En dernier lieu, nous nous sommes penchés sur la réactivité des α-bromo-β- alkoxycétones lors de transfert d’hydrogène. Nous avons découvert que la chimie de ces derniers pourrait s’avérer utile dans le contexte de la synthèse de motifs complexes polypropionates. La présence d’un centre stéréogène de l’autre coté de la cétone semble avoir un impact sur la sélectivité.

Sélection des substrats lors de l’exercice prolongé avec ingestion de glucides : études par traçage au 13C

Les principaux substrats oxydés à l’exercice, soit les glucides, les lipides et les pro- téines ne contribuent pas tous au même niveau à la fourniture d’énergie lors de l’effort prolongé. De plus, le glucose peut provenir de différentes sources endogènes (muscle, foie) et exogènes. Plusieurs facteurs peuvent influencer leur contribution respective incluant : la masse musculaire impliquée et l’entraînement préalable, le sexe, l’état nutritionnel et les conditions environnementales. L’utilisation d’isotopes stables, tels que le carbone 13 (13C), combinée à la calorimétrie indirecte respiratoire corrigée pour l’excrétion d’urée dans l’urine et la sueur, permet de différencier les substrats endogènes et exogènes et d’évaluer la contribution de leur oxydation à la fourniture d’énergie. Ces méthodes d’investigation permettant d’apprécier la sélection des substrats lors de l’exercice prolongé avec ingestion de glucose ont permis d’effectuer les comparaisons qui ont fait l’objet des trois études de cette thèse. Dans la première étude, la sélection des substrats au cours d’un effort prolongé effectué avec les membres inférieurs ou les membres supérieurs a été comparée avec et sans ingestion de glucose. Une différence modeste fut observée entre la sélection des substrats selon le mode d’exercice avec l’ingestion d’eau, celle-ci favorisant légèrement l’oxydation des glucides lors de l’effort avec les membres supérieurs. La quantité de glucose exogène oxydée était plus faible lors de l’exercice avec les membres supérieurs qu’avec les membres supérieurs, mais sa contribution plus importante, conséquence d’une dépense énergétique plus faible. Dans la deuxième étude, on a comparé la sélection des substrats chez des sujets mas- culins et féminins et les effets d’une alimentation enrichie en glucides ou de l’ingestion de glucose, au cours d’un exercice prolongé d’une durée de deux heures. On reconnaît généralement que, pour une même puissance relative, les femmes utilisent moins de glucides et davantage de lipides que les hommes. Les effets séparés d’une alimentation riche en glucides ou de l’ingestion de glucose pendant l’exercice sur la sélection des substrats furent pourtant similaires chez les deux sexes. L’effet combiné des deux procédures de supplémentation est toutefois plus important chez la femme que chez l’homme, soutenant l’hypothèse qu’un léger déficit en glucides soit présent chez les femmes. Dans la troisième étude, l’oxydation des substrats et particulièrement celle d’amidon exogène au cours d’une marche prolongée à une faible puissance de travail a été décrite. Les individus qui pratiquent des activités physiques prolongées à des intensités faibles (< 40 %VO2max) sont encouragés à ingérer des glucides et de l’eau pendant l’effort, mais la contribution de leur oxydation à la fourniture d’énergie est relativement peu connue. Nous avons montré que, contrairement aux observations précédemment effectuées à jeun sans ingestion de glucides pendant l’effort, les glucides (incluant de source exogène) peuvent fournir une très grande partie de l’énergie lorsqu’ils sont ingérés à des intervalles réguliers au cours de l’exercice prolongé. Dans l’ensemble, les résultats des études expérimentales présentées dans cette thèse montrent que les glucides ingérés peuvent fournir une grande proportion de l’énergie pendant l’exercice prolongé. Toutefois, le mode d’exercice, le sexe et la puissance de travail mènent à des variations qui sont en grande partie liées à une dépense énergétique variable selon les conditions et les groupes d’individus ayant des caractéristiques différentes.

Étude structurale de la fructoselysine 6-kinase d’Escherichia coli : reconnaissance de substrats et mécanisme enzymatique

Quelques enzymes sont connus pour déglyquer les kétoamines résultants de la réaction de Maillard entre des sucres et des amines primaires. Il a été démontré qu’Escherichia coli possède un opéron afin de métaboliser la fructoselysine. La fructoselysine 6-kinase, de la famille des PfkB, initie le processus de déglycation permettant l’utilisation ultérieure du glucose-6-P par la bactérie. La résolution de la structure de la FL6K par cristallographie et diffraction des rayons X a permis d’identifier son site actif en présence d’ATP, d’ADP et d’AMP-PNP. La modélisation de la fructoselysine au site actif de la kinase a permis d’identifier des résidus pouvant être importants pour sa liaison et son mécanisme enzymatique. De plus, les résultats de cinétique suggèrent que le mécanisme utilisé par la FL6K semble passer par un état ternaire de type SN2. Des modifications structurales à la FL6K pourraient permettre d’augmenter la taille des substrats afin de permettre ultimement la déglycation de protéines.

Marquage fluorescent des protéines pour étudier les enzymes protéolytiques solubles et immobilisées par la cartographie peptidique électrophorétique

La cartographie peptidique est une méthode qui permet entre autre d’identifier les modifications post-traductionnelles des protéines. Elle comprend trois étapes : 1) la protéolyse enzymatique, 2) la séparation par électrophorèse capillaire (CE) ou chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC) des fragments peptidiques et 3) l’identification de ces derniers. Cette dernière étape peut se faire par des méthodes photométriques ou par spectrométrie de masse (MS). Au cours de la dernière décennie, les enzymes protéolytiques immobilisées ont acquis une grande popularité parce qu’elles peuvent être réutilisées et permettent une digestion rapide des protéines due à un rapport élevé d’enzyme/substrat. Pour étudier les nouvelles techniques d’immobilisation qui ont été développées dans le laboratoire du Professeur Waldron, la cartographie peptidique par CE est souvent utilisée pour déterminer le nombre total de peptides détectés et leurs abondances. La CE nous permet d’avoir des séparations très efficaces et lorsque couplée à la fluorescence induite par laser (LIF), elle donne des limites de détection qui sont 1000 fois plus basses que celles obtenues avec l’absorbance UV-Vis. Dans la méthode typique, les peptides venant de l’étape 1) sont marqués avec un fluorophore avant l’analyse par CE-LIF. Bien que la sensibilité de détection LIF puisse approcher 10-12 M pour un fluorophore, la réaction de marquage nécessite un analyte dont la concentration est d’au moins 10-7 M, ce qui représente son principal désavantage. Donc, il n’est pas facile d’étudier les enzymes des peptides dérivés après la protéolyse en utilisant la technique CE-LIF si la concentration du substrat protéique initial est inférieure à 10-7 M. Ceci est attribué à la dilution supplémentaire lors de la protéolyse. Alors, afin d’utiliser le CE-LIF pour évaluer l’efficacité de la digestion par enzyme immobilisée à faible concentration de substrat,nous proposons d’utiliser des substrats protéiques marqués de fluorophores pouvant être purifiés et dilués. Trois méthodes de marquage fluorescent de protéine sont décrites dans ce mémoire pour étudier les enzymes solubles et immobilisées. Les fluorophores étudiés pour le marquage de protéine standard incluent le naphtalène-2,3-dicarboxaldéhyde (NDA), la fluorescéine-5-isothiocyanate (FITC) et l’ester de 6-carboxyfluorescéine N-succinimidyl (FAMSE). Le FAMSE est un excellent réactif puisqu’il se conjugue rapidement avec les amines primaires des peptides. Aussi, le substrat marqué est stable dans le temps. Les protéines étudiées étaient l’-lactalbumine (LACT), l’anhydrase carbonique (CA) et l’insuline chaîne B (INB). Les protéines sont digérées à l’aide de la trypsine (T), la chymotrypsine (CT) ou la pepsine (PEP) dans leurs formes solubles ou insolubles. La forme soluble est plus active que celle immobilisée. Cela nous a permis de vérifier que les protéines marquées sont encore reconnues par chaque enzyme. Nous avons comparé les digestions des protéines par différentes enzymes telles la chymotrypsine libre (i.e., soluble), la chymotrypsine immobilisée (i.e., insoluble) par réticulation avec le glutaraldéhyde (GACT) et la chymotrypsine immobilisée sur billes d’agarose en gel (GELCT). Cette dernière était disponible sur le marché. Selon la chymotrypsine utilisée, nos études ont démontré que les cartes peptidiques avaient des différences significatives selon le nombre de pics et leurs intensités correspondantes. De plus, ces études nous ont permis de constater que les digestions effectuées avec l’enzyme immobilisée avaient une bonne reproductibilité. Plusieurs paramètres quantitatifs ont été étudiés afin d’évaluer l’efficacité des méthodes développées. La limite de détection par CE-LIF obtenue était de 3,010-10 M (S/N = 2,7) pour la CA-FAM digérée par GACT et de 2,010-10 M (S/N = 4,3) pour la CA-FAM digérée par la chymotrypsine libre. Nos études ont aussi démontrées que la courbe d’étalonnage était linéaire dans la région de travail (1,0×10-9-1,0×10-6 M) avec un coefficient de corrélation (R2) de 0,9991.

Investigating active transportation to and from school : identification of predictors and health benefits

Funding support for this doctoral thesis has been provided by the Canadian Institutes of Health Research-Public Health Agency of Canada, QICSS matching grant, and la Faculté des études supérieures et postdoctorales-Université de Montréal.

Mécanismes de déformation de nanoparticules d’Au par irradiation ionique

Résumé Dans la présente thèse, nous avons étudié la déformation anisotrope par bombardement ionique de nanoparticules d'or intégrées dans une matrice de silice amorphe ou d'arséniure d’aluminium cristallin. On s’est intéressé à la compréhension du mécanisme responsable de cette déformation pour lever toute ambigüité quant à l’explication de ce phénomène et pour avoir une interprétation consistante et unique. Un procédé hybride combinant la pulvérisation et le dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma a été utilisé pour la fabrication de couches nanocomposites Au/SiO2 sur des substrats de silice fondue. Des structures à couches simples et multiples ont été obtenues. Le chauffage pendant ou après le dépôt active l’agglomération des atomes d’Au et par conséquent favorise la croissance des nanoparticules. Les nanocomposites Au/AlAs ont été obtenus par implantation ionique de couches d’AlAs suivie de recuit thermique rapide. Les échantillons des deux nanocomposites refroidis avec de l’azote liquide ont été irradiés avec des faisceaux de Cu, de Si, d’Au ou d’In d’énergie allant de 2 à 40 MeV, aux fluences s'étendant de 1×1013 à 4×1015 ions/cm2, en utilisant le Tandem ou le Tandetron. Les propriétés structurales et morphologiques du nanocomposite Au/SiO2 sont extraites en utilisant des techniques optiques car la fréquence et la largeur de la résonance plasmon de surface dépendent de la forme et de la taille des nanoparticules, de leur concentration et de la distance qui les séparent ainsi que des propriétés diélectriques du matériau dans lequel les particules sont intégrées. La cristallinité de l’arséniure d’aluminium est étudiée par deux techniques: spectroscopie Raman et spectrométrie de rétrodiffusion Rutherford en mode canalisation (RBS/canalisation). La quantité d’Au dans les couches nanocomposites est déduite des résultats RBS. La distribution de taille et l’étude de la transformation de forme des nanoparticules métalliques dans les deux nanocomposites sont déterminées par microscopie électronique en transmission. Les résultats obtenus dans le cadre de ce travail ont fait l’objet de trois articles de revue. La première publication montre la possibilité de manipuler la position spectrale et la largeur de la bande d’absorption des nanoparticules d’or dans les nanocomposites Au/SiO2 en modifiant leur structure (forme, taille et distance entre particules). Les nanoparticules d’Au obtenues sont presque sphériques. La bande d’absorption plasmon de surface (PS) correspondante aux particules distantes est située à 520 nm. Lorsque la distance entre les particules est réduite, l’interaction dipolaire augmente ce qui élargit la bande de PS et la déplace vers le rouge (602 nm). Après irradiation ionique, les nanoparticules sphériques se transforment en ellipsoïdes alignés suivant la direction du faisceau. La bande d’absorption se divise en deux bandes : transversale et longitudinale. La bande correspondante au petit axe (transversale) est décalée vers le bleu et celle correspondante au grand axe (longitudinale) est décalée vers le rouge indiquant l’élongation des particules d’Au dans la direction du faisceau. Le deuxième article est consacré au rôle crucial de la déformation plastique de la matrice et à l’importance de la mobilité des atomes métalliques dans la déformation anisotrope des nanoparticules d’Au dans les nanocomposites Au/SiO2. Nos mesures montrent qu'une valeur seuil de 2 keV/nm (dans le pouvoir d'arrêt électronique) est nécessaire pour la déformation des nanoparticules d'or. Cette valeur est proche de celle requise pour la déformation de la silice. La mobilité des atomes d’Au lors du passage d’ions est confirmée par le calcul de la température dans les traces ioniques. Le troisième papier traite la tentative de formation et de déformation des nanoparticules d’Au dans une matrice d’arséniure d’aluminium cristallin connue pour sa haute résistance à l’amorphisation et à la déformation sous bombardement ionique. Le résultat principal de ce dernier article confirme le rôle essentiel de la matrice. Il s'avère que la déformation anisotrope du matériau environnant est indispensable pour la déformation des nanoparticules d’or. Les résultats expérimentaux mentionnés ci-haut et les calculs de températures dans les traces ioniques nous ont permis de proposer le scénario de déformation anisotrope des nanoparticules d’Au dans le nanocomposite Au/SiO2 suivant: - Chaque ion traversant la silice fait fondre brièvement un cylindre étroit autour de sa trajectoire formant ainsi une trace latente. Ceci a été confirmé par la valeur seuil du pouvoir d’arrêt électronique. - L’effet cumulatif des impacts de plusieurs ions conduit à la croissance anisotrope de la silice qui se contracte dans la direction du faisceau et s’allonge dans la direction perpendiculaire. Le modèle de chevauchement des traces ioniques (overlap en anglais) a été utilisé pour valider ce phénomène. - La déformation de la silice génère des contraintes qui agissent sur les nanoparticules dans les plans perpendiculaires à la trajectoire de l’ion. Afin d’accommoder ces contraintes les nanoparticules d’Au se déforment dans la direction du faisceau. - La déformation de l’or se produit lorsqu’il est traversé par un ion induisant la fusion d’un cylindre autour de sa trajectoire. La mobilité des atomes d’or a été confirmée par le calcul de la température équivalente à l’énergie déposée dans le matériau par les ions incidents. Le scénario ci-haut est compatible avec nos données expérimentales obtenues dans le cas du nanocomposite Au/SiO2. Il est appuyé par le fait que les nanoparticules d’Au ne se déforment pas lorsqu’elles sont intégrées dans l’AlAs résistant à la déformation.

The role of Caulobacter crescentus XerC and XerD recombinases in site-specific recombination

XerC et XerD, deux recombinases impliquées dans la recombinaison site spécifique, résolvent les multimères d’ADN en monomères. Cette réaction se produit au niveau du site dif du chromosome, et nécessite le domaine C-terminale de la protéine de division cellulaire FtsK. Caulobacter crescentus est une bactérie aquatique de type Gram-négative qui se retrouve dans plusieurs environnements. Elle présente un cycle cellulaire asymétrique avec deux types de cellules distinctes. Cette propriété peut être utilisée pour synchroniser la croissance d’une population bactérienne pour permettre l’étude de l’expression de gènes à travers le temps et les liens entre le cycle cellulaire et le développement de la bactérie. La liaison à l’ADN et la capacité de former des complexes covalents (phosphotyrosyl) avec le site dif de C. crescentus (ccdif) ont été testé pour les recombinases de C. crescentus (ccXerC et ccXerD). Les deux recombinases ont eu une meilleure liaison au demi-site gauche de ccdif et sont incapable d’effectuer une liaison coopérative, contrairement à ce qui se produit au niveau du site dif de E. coli. La formation de complexes covalents a été testé en utilisant des «substrats suicides avec bris» marqués à la fluorescence ainsi que des protéines de fusion (marquées ou non à la fluorescence). Des complexes ADN-protéines résistants à la chaleur et au SDS ont été observé lors de la réaction de ccXerC et ccXerD de type sauvage avec ccdif, mais pas lors de la réaction de mutants avec le même ADN. Des complexes covalents phosphotyrosine sont formés de façon plus efficace sur les substrats suicides avec un bris au niveau du brin supérieur que ceux ayant un bris au niveau du brin inférieur. Dans les deux cas, c’est ccXerC qui est resté lié de façon covalente à l’ADN de ccdif.

Étude structure-fonction des fructose-1,6-bisphosphate aldolases métallo-dépendantes : mécanisme catalytique et développement d’antimicrobiens

Les fructose-1,6-bisphosphate aldolases (FBPA) sont des enzymes glycolytiques (EC 4.1.2.13) qui catalysent la transformation réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en deux trioses-phosphates, le glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) et le dihydroxyacétone phosphate (DHAP). Il existe deux classes de FBPA qui diffèrent au niveau de leur mécanisme catalytique. Les classes I passent par la formation d’un intermédiaire covalent de type iminium alors que les classes II, métallodépendantes, utilisent généralement un zinc catalytique. Contrairement au mécanisme des classes I qui a été très étudié, de nombreuses interrogations subsistent au sujet de celui des classes II. Nous avons donc entrepris une analyse détaillée de leur mécanisme réactionnel en nous basant principalement sur la résolution de structures cristallographiques. De nombreux complexes à haute résolution furent obtenus et ont permis de détailler le rôle de plusieurs résidus du site actif de l’enzyme. Nous avons ainsi corrigé l’identification du résidu responsable de l’abstraction du proton de l’O4 du FBP, une étape cruciale du mécanisme. Ce rôle, faussement attribué à l’Asp82 (chez Helicobacter pylori), est en fait rempli par l’His180, un des résidus coordonant le zinc. L’Asp82 n’en demeure pas moins essentiel car il oriente, active et stabilise les substrats. Enfin, notre étude met en évidence le caractère dynamique de notre enzyme dont la catalyse nécessite la relocalisation du zinc et de nombreux résidus. La dynamique de la protéine ne permet pas d’étudier tous les aspects du mécanisme uniquement par l’approche cristallographique. En particulier, le résidu effectuant le transfert stéréospécifique du proton pro(S) sur le carbone 3 (C3) du DHAP est situé sur une boucle qui n’est visible dans aucune de nos structures. Nous avons donc développé un protocole de dynamique moléculaire afin d’étudier sa dynamique. Validé par l’étude d’inhibiteurs de la classe I, l’application de notre protocole aux FBPA de classe II a confirmé l’identification du résidu responsable de cette abstraction chez Escherichia coli (Glu182) mais pointe vers un résidu diffèrent chez H. pylori (Glu149 au lieu de Glu142). Nos validations expérimentales confirment ces observations et seront consolidées dans le futur. Les FBPA de classe II sont absentes du protéome humain mais sont retrouvées chez de nombreux pathogènes, pouvant même s'y révéler essentielles. Elles apparaissent donc comme étant une cible idéale pour le développement de nouveaux agents anti-microbiens. L’obtention de nouveaux analogues des substrats pour ces enzymes a donc un double intérêt, obtenir de nouveaux outils d’étude du mécanisme mais aussi développer des molécules à visée pharmacologique. En collaboration avec un groupe de chimistes, nous avons optimisé le seul inhibiteur connu des FBPA de classe II. Les composés obtenus, à la fois plus spécifiques et plus puissants, permettent d’envisager une utilisation pharmacologique. En somme, c’est par l’utilisation de techniques complémentaires que de nouveaux détails moléculaires de la catalyse des FBPA de classe II ont pu être étudiés. Ces techniques permettront d’approfondir la compréhension fine du mécanisme catalytique de l’enzyme et offrent aussi de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Direct functionalization of heterocyclic and non-heterocyclic arenes

L’application des métaux de transition à la fonctionnalisation directe a ouvert la voie à une nouvelle classe de réactions pour la formation de liens carbone-carbone. De par l'omniprésence des liaisons C–H, l’introduction de nouvelles fonctionnalités chimiques par voie directe et pré-activation minimale s’impose comme une stratégie de synthèse très attrayante. Ainsi, il est envisageable de préparer de manière rapide et efficace des supports complexes menant à des molécules complexes, qui pourraient être utiles dans divers domaines de la chimie. L'objectif principal de la présente thèse vise la fonctionnalisation directe des arènes hétérocycliques et non hétérocycliques et, plus précisément, les techniques d’arylation. Dans un premier temps, nous allons aborder le thème de l’arylation directe tout en mettant l’accent sur les pyridines (Chapitre 1). Ces molécules sont à la base d'une multitude de composés biologiquement actifs et jouent un rôle important dans le domaine des sciences des matériaux, de l’agrochimie et de la synthèse des produits naturels. Dans un deuxième temps, nous discuterons de nos travaux sur l’arylation directe catalysé par un complex de palladium sur des ylures de N-iminopyridinium en soulignant la dérivatisation du sel de pyridinium après une phénylation sp2 (Chapitre 2). L’étude de ce procédé nous a permis de mettre en lumière plusieurs découvertes importantes, que nous expliquerons en détails une à une : l’arylation benzylique directe lorsque des ylures N-iminopyridinium substituées avec un groupement alkyl à la position 2 sont utilisés comme partenaires dans la réaction; les allylations Tsuji-Trost catalysée par un complex de palladium; et l’alkylation directe et sans métal via une catalyse par transfert de phase. Plusieurs défis restent à relever pour le développement de procédés directs utilisant des métaux de transition peu coûteux, d’autant plus que la synthèse par transformation directe des pyridines 2-alcényles, lesquelles sont pertinentes sur le plan pharmacologique, n’a pas encore été rapportée à ce jour. Avec cette problématique en tête, nous avons réussi à mettre au point une alcénylation directe catalysé par un complex de cuivre sur des ylures de N-iminopyridinium. Nous discuterons également d’une nouvelle méthode pour la préparation des iodures de vinyle utilisés dans les couplages. Ces réactions sont non seulement remarquablement chimiosélectives, mais sont aussi applicables à plusieurs substrats (Chapitre 3). En optimisant ce procédé direct, nous avons découvert une façon unique de synthétiser les pyrazolo[1,5-a]pyridines 2-substituées (Chapitre 4). Le mécanisme global met en jeu une séquence tandem de fonctionnalisation-cyclisation directe et un procédé direct en cascade, qui n’avais jamais été rapporté. Cela simplifie ansi la synthèse autrement compliquée de ces substrats en y apportant une solution à un problème de longue date. Dans les deux derniers chapitres, nous examinerons en détail les techniques d’arylation directe qui n'impliquent pas les partenaires de couplage hétérocycliques. Entre autres, au Chapitre 5, nous soulignerons notre découverte d’un umpolung dirigé et catalysé par un complexe de palladium du benzène et de quelques autres dérivés arènes. Il s’agit là du premier cas de fonctionnalisation directe dans laquelle le groupe directeur se trouve sur le partenaire halogène et il s’ajoute à la courte liste d’exemples connus dans la littérature rapportant une arylation directe du benzène. Finalement, au Chapitre 6, nous passerons en revue une nouvelle arylation directe catalysée au fer, qui se veut un procédé peu coûteux, durable et présentant une économie d’atomes. Nous discutons des substrats possibles ainsi des études mécanistiques réalisés.

Études des interactions détergents/lipides dans les systèmes membranaires

Les liposomes sont des structures sphériques formés par l'auto-assemblage de molécules amphiphiles sous forme d'une bicouche. Cette bicouche sépare le volume intérieur du liposome du milieu extérieur, de la même manière que les membranes cellulaires. Les liposomes sont donc des modèles de membranes cellulaires et sont formulés pour étudier les processus biologiques qui font intervenir la membrane (transport de molécules à travers la membrane, effets des charges en surface, interactions entre la matrice lipidique et d'autres molécules, etc.). Parce qu'ils peuvent encapsuler une solution aqueuse en leur volume intérieur, ils sont aussi utilisés aujourd'hui comme nanovecteurs de principes actifs. Nous avons formulé des liposomes non-phospholipidiques riches en stérol que nous avons appelés stérosomes. Ces stérosomes sont composés d'environ 30 % d'amphiphiles monoalkylés et d'environ 70 % de stérols (cholestérol, Chol, et/ou sulfate de cholestérol, Schol). Quand certaines conditions sont respectées, ces mélanges sont capables de former une phase liquide ordonnée (Lo) pour donner, par extrusion, des vésicules unilamellaires. Certaines de ces nouvelles formulations ont été fonctionnalisées de manière à libérer leur contenu en réponse à un stimulus externe. En incorporant des acides gras dérivés de l’acide palmitique possédant différents pKa, nous avons pu contrôler le pH auquel la libération débute. Un modèle mathématique a été proposé afin de cerner les paramètres régissant leur comportement de libération. En incorporant un amphiphile sensible à la lumière (un dérivé de l’azobenzène), les liposomes formés semblent répondre à une radiation lumineuse. Pour ce système, il serait probablement nécessaire de tracer le diagramme de phase du mélange afin de contrôler la photo-libération de l’agent encapsulé. Nous avons aussi formulé des liposomes contenant un amphiphile cationique (le chlorure de cétylpyridinium). En tant que nanovecteurs, ces stérosomes montrent un potentiel intéressant pour la libération passive ou contrôlée de principes actifs. Pour ces systèmes, nous avons développé un modèle pour déterminer l’orientation des différentes molécules dans la bicouche. La formation de ces nouveaux systèmes a aussi apporté de nouvelles connaissances dans le domaine des interactions détergents-lipides. Aux nombreux effets du cholestérol (Chol) sur les systèmes biologiques, il faut ajouter maintenant que les stérols sont aussi capables de forcer les amphiphiles monoalkylés à former des bicouches. Cette nouvelle propriété peut avoir des répercussions sur notre compréhension du fonctionnement des systèmes biologiques. Enfin, les amphiphiles monoalkylés peuvent interagir avec la membrane et avoir des répercussions importantes sur son fonctionnement. Par exemple, l'effet antibactérien de détergents est supposé être dû à leur insertion dans la membrane. Cette insertion est régie par l'affinité existant entre le détergent et cette dernière. Dans ce cadre, nous avons voulu développer une nouvelle méthode permettant d'étudier ces affinités. Nous avons choisi la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) pour sa sensibilité. Les hypothèses permettant de déterminer cette constante d’affinité se basent sur l’incapacité du détergent à exalter le signal SERS lorsque le détergent est inséré dans la membrane. Les résultats ont été comparés à ceux obtenus par titration calorimétrique isotherme (ITC). Les résultats ont montré des différences. Ces différences ont été discutées.

Effect of mindfulness meditation on the neural substrates of emotion processing and resting state in experienced and beginner meditators

La méditation par le ‘mindfulness’ favorise la stabilité émotionelle, mais les mécanismes neuroneux qui sous-tendent ces effets sont peu connus. Ce projet investiga l’effet du ‘mindfulness’ sur les réponses cérébrales et subjectives à des images négatives, positives et neutres chez des méditants expérimentés et des débutants au moyen de l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf). Le ‘mindfulness’ atténua l’intensité émotionelle via différents mécanismes cérébraux pour chaque groupe. Comparés aux méditants, les débutants manifestèrent une déactivation de l’amygdale en réponse aux stimuli émotifs durant le ‘mindfulness’. Comparés aux débutants, les méditants exhibèrent une déactivation de régions du réseau du mode par défaut (RMD) pendant le ‘mindfulness’ pour tous stimuli (cortex médian préfrontal [CMP], cortex cingulaire postérieur [CCP]). Le RMD est constitué de régions fonctionnellement connectées, activées au repos et déactivées lors de tâches explicites. Cependant, nous ne connaissons pas les impacts de l’entraînement par la méditation sur la connectivité entre régions du RMD et si ces effets persistent au-delà d’un état méditatif. La connectivité fonctionnelle entre régions du RMD chez les méditants et débutants au repos fut investiguée au moyen de l’IRMf. Comparés aux débutants, les méditants montrèrent une connectivité affaiblie entre subdivisions du CMP, et une connectivité accrue entre le lobule pariétal inférieur et trois regions du RMD. Ces résultats reflètent que les bienfaits immédiats du ‘mindfulness’ sur la psychopathologie pourraient être dûs à une déactivation de régions limbiques impliquées dans la réactivité émotionelle. De plus, les bienfaits à long-terme de la méditation sur la stabilité émotionelle pourrait être dûs à une déactivation de régions corticales et cingulaires impliquées dans l’évaluation de la signification émotive et une connectivité altérée entre régions du RMD à l’état de repos.