Quantum dot-dye hybrid systems for energy transfer applications

In this thesis, we focus on the preparation of energy transfer-based quantum dot (QD)-dye hybrid systems. Two kinds of QD-dye hybrid systems have been successfully synthesized: QD-silica-dye and QD-dye hybrid systems.rn rnIn the QD-silica-dye hybrid system, multishell CdSe/CdS/ZnS QDs were adsorbed onto monodisperse Stöber silica particles with an outer silica shell of thickness 2 - 24 nm containing organic dye molecules (Texas Red). The thickness of this dye layer has a strong effect on the total sensitized acceptor emission, which is explained by the increase in the number of dye molecules homogeneously distributed within the silica shell, in combination with an enhanced surface adsorption of QDs with increasing dye amount. Our conclusions were underlined by comparison of the experimental results with Monte-Carlo simulations, and by control experiments confirming attractive interactions between QDs and Texas Red freely dissolved in solution. rnrnNew QD-dye hybrid system consisting of multishell QDs and organic perylene dyes have been synthesized. We developed a versatile approach to assemble extraordinarily stable QD-dye hybrids, which uses dicarboxylate anchors to bind rylene dyes to QD. This system yields a good basis to study the energy transfer between QD and dye because of its simple and compact design: there is no third kind of molecule linking QD and dye; no spacer; and the affinity of the functional group to the QD surface is strong. The FRET signal was measured for these complexes as a function of both dye to QD ratio and center-to-center distance between QD and dye by controlling number of covered ZnS layers. Data showed that fluorescence resonance energy transfer (FRET) was the dominant mechanism of the energy transfer in our QD-dye hybrid system. FRET efficiency can be controlled by not only adjusting the number of dyes on the QD surface or the QD to dye distance, but also properly choosing different dye and QD components. Due to the strong stability, our QD-dye complexes can also be easily transferred into water. Our approach can apply to not only dye molecules but also other organic molecules. As an example, the QDs have been complexed with calixarene molecules and the QD-calixarene complexes also have potential for QD-based energy transfer study. rn

Riorganizzazione di un distribution center mediante le tecniche di lean production: il caso Gambro Dasco spa

La Lean Production è un tema di estrema attualità per tutte le aziende che abbiano compreso l’importanza di produrre di più, con le risorse che si hanno a disposizione, eliminando sistematicamente tutte le attività che non creano valore aggiunto. La Produzione Snella è diventato un metodo per incrementare la competitività, riducendo l’incertezza e aumentando il servizio fornito al cliente. Nella realtà attuale vi è ancora una scarsa diffusione dei concetti Lean. Le cause di questo problema sono imputabili soprattutto alla cultura del management aziendale, alla mancanza di efficaci strumenti tecnologici a supporto, e in alcuni casi, la scarsa disponibilità delle imprese ad abbracciare la filosofica “snella”. La presente tesi, dopo una panoramica introduttiva su l’origine e l’evoluzione del Pensiero Snello e l’analisi di tutti i tools disponibili per combattere lo spreco; si propone di analizzare l’applicazione degli stessi in Gambro Dasco, multinazionale biomedicale leader nella vendita delle sue apparecchiature per dialisi.

Realizzazione e caratterizzazione chimico-fisica di una sorgente di plasma di non equilibrio operante a pressione atmosferica per la modifica superficale di materiali polimerici in ambiente controllato

Il plasma, quarto stato della materia, rappresenta un gas ionizzato in cui ioni ed elettroni si muovono a diverse energie sotto l’azione di un campo elettro-magnetico applicato dall’esterno. I plasmi si dividono in plasmi di equilibrio e di non equilibrio termodinamico, quest’ultimi sono caratterizzati da un’alta temperatura elettronica (oltre 10000 K) e da una bassa temperatura traslazionale degli ioni e delle specie neutre (300-1000 K). I plasmi di non equilibrio trovano largo impiego nella microelettronica, nei processi di polimerizzazione, nell’industria biomedicale e del packaging, consentendo di effettuare trattamenti di sterilizzazione e attivazione superficiale. Il lavoro di tesi è incentrato sui processi di funzionalizzazione e polimerizzazione superficiale con l’obbiettivo di realizzare e caratterizzare sorgenti di plasma di non equilibrio a pressione atmosferica operanti in ambiente controllato. È stata realizzata una sorgente plasma operante a pressione atmosferica e in ambiente controllato per realizzare trattamenti di modifica superficiale e di polimerizzazione su substrati polimerici. L’efficacia e l’omogeneità dei trattamenti eseguiti sono stati valutati tramite misura dell’angolo di contatto. La caratterizzazione elettrica ha consentito di determinare i valori di densità di energia superficiale trasferita sui substrati al variare delle condizioni operative. Lo strato depositato durante il processo di polimerizzazione è stato analizzato qualitativamente tramite l’analisi chimica in spettroscopia infrarossa. L’analisi delle prove di funzionalizzazione dimostra l’uniformità dei processi plasma eseguiti; inoltre i valori dell’angolo di contatto misurati in seguito ai trattamenti risultano confrontabili con la letteratura esistente. Lo studio dei substrati trattati in atmosfera satura d’azoto ha rivelato una concentrazione superficiale di azoto pari al 3% attribuibile alla presenza di ammine, ammine protonate e gruppi ammidici; ciò conferma la bontà della soluzione realizzata e dei protocolli operativi adottati per la funzionalizzazione delle superfici. L’analisi spettroscopica dei trattamenti di polimerizzazione, ha fornito spettri IR confrontabili con la letteratura esistente indicando una buona qualità del polimero depositato (PEG). I valori misurati durante la caratterizzazione elettrica della sorgente realizzata risulteranno fondamentali in futuro per l’ottimizzazione del dispositivo. I dati raccolti infatti, determineranno le linee guida per il tailoring dei trattamenti plasma e per lo sviluppo della sorgente. Il presente lavoro di tesi, pur prendendo in esame una piccola parte delle applicazioni industriali dei plasmi non termici, conferma quanto queste siano pervasive nei comuni processi industriali evidenziandone le potenzialità e i numerosi campi d’applicazione. La tecnologia plasma è destinata ad essere imprescindibile per la ricerca di soluzioni innovative ai limiti dei processi tradizionali.

Functional hydrogels

Hydrogels are used in a variety of applications in daily life, such as super absorbers, contact lenses and in drug delivery. Functional hydrogels that allow the incorporation of additional functionalities have enormous potential for future development. The properties of such hydrogels can be diversified by introducing responsiveness to external stimuli. These crosslinked polymers are known to respond to changes in temperature, pH and pressure, as well as chemical and electrical stimuli, magnetic fields and irradiation. From this responsive behavior possible applications arise in many fields like drug delivery, tissue engineering, purification and implementation as actuators, biosensors or for medical coatings. However, their interaction with biomaterial and way of functioning are yet not fully understood. Therefore, thorough investigations regarding their optical, mechanical and chemical nature have to be conducted. A UV-crosslinkable polymer, consisting of N-isopropylacrylamide, methacrylic acid and the UV-crosslinker 4-benzoylphenyl methacrylate was synthesized. Its composition, determined by a comprehensive NMR study, is equivalent to the composition of the monomer mixture. The chemical characteristics were preserved during the subsequently formation of hydrogel films by photo-crosslinking as proved by XPS. For the optical characterization, e.g. the degree of swelling of very thin films, the spectroscopy of coupled long range surface plasmons is introduced. Thicker films, able to guide light waves were analyzed with combined surface plasmon and optical waveguide mode spectroscopy (SPR/OWS). The evaluation of the data was facilitated by the reverse Wentzel-Kramers-Brillouin (WKB) approximation. The meshsize and proper motion of the surface anchored hydrogels were investigated by fluorescence correlation spectroscopy (FCS), micro photon correlation spectroscopy (µPCS) and SPR/OWS. The studied gels exhibit a meshsize that allowed for the diffusion of small biomolecules inside their network. For future enhancement of probing diffusants, a dye that enables FRET in FCS was immobilized in the gel and the diffusion of gold-nanoparticles embedded in the polymer solution was studied by PCS. These properties can be conveniently tuned by the crosslinking density, which depends on the irradiation dose. Additionally, protocols and components for polymer analogous reactions based on active ester chemistry of the hydrogel were developed. Based on these syntheses and investigations, the hydrogel films are applied in the fields of medical coatings as well as in biosensing as matrix and biomimetic cushion. Their non-adhesive properties were proved in cell experiments, SPR/OWS and ToF-SIMS studies. The functionality and non-fouling property of the prepared hydrogels allowed for adaption to the needs of the respective application.

Studio approfondito di processi post-polimerizzazione del poli(glicidil metacrilato)

The reactivty of poly(glycidyl methacrylate), obtained by RAFT controlled radical polymerization, has been investigated with a nucelophilic agent, such as morpholine, in various aprotic polar solvents in order to optimize the reaction (time and nucleophile excess). A strong interaction between polymer and solvent, gained by hydrogen bonds, during the process has proved to be essential in order to lower the reaction time and the nucelophilic agent excess. Dissimilar behaviors have been detected by GPC analysis due to the reactivity of the sulfhydryl formed during the RAFT's aminolysis. The various solvents lead to conditions in which different inter and intra-chain associations occur; the result is the formation of dimers, trimers and tetramers (to a less extent) in the first case, and cyclical structures in the second one. The reactivity of the hydroxy group, formed during the ring opening reaction, has been further investigated in order to link isothiocyanate-functionalized fluorescent marker along the polymeric chain.

Sintesi e caratterizzazione di oligo e politiofeni per applicazioni in elettronica e biodiagnostica

Negli ultimi anni sono stati sintetizzati numerosi oligomeri e polimeri del tiofene che, grazie alle loro proprietà di semiconduttori, hanno trovano largo impiego in molti campi di interesse tecnologico come, ad esempio, transistor ad effetto di campo, diodi elettroluminescenti, dispositivi ottici non lineari e celle fotovoltaiche. Più recentemente, oligomeri tiofenici ossidati allo zolfo hanno trovato applicazione sia in campo elettronico, come materiali accettori in blenda con il poli(3-esiltiofene) (P3HT) usato come materiale donatore, in celle solari di tipo Bulk Hetero Junction (BHJ), ma anche in campo biologico come marcatori fluorescenti di proteine e oligonucleotidi. Tuttavia la sintesi di queste specie richiede condizioni di reazione spinte e al contempo rischiose dovute all’utilizzo in largo eccesso di agenti ossidanti molto forti. Uno degli obiettivi di questa tesi è stato lo sviluppo di metodi più versatili per la mono e di-ossidazione selettiva allo zolfo del tiofene di building-blocks dibromurati di diversa natura. Successivamente i building-blocks S-monossido e S,S-diossido derivati sono stati impiegati per la sintesi di oligomeri e polimeri tramite reazioni di cross-coupling Palladio catalizzate. I composti finali sono stati caratterizzati sia dal punto di vista spettroscopico UV-Vis che elettrochimico, mettendo in evidenza le relazioni che esistono fra gli andamenti dei dati sperimentali ottenuti con il diverso stato di ossidazione dei composti tiofenici diversamente sostituiti. Infine i composti finali sono stati testati sia in campo fotovoltaico che biologico.

From amphiphilic block copolymers to ferrocenyl-functionalized polymers for biosensoric applications

The present thesis can be divided in three main parts. In all parts new polymer architecturesrnwere synthesized and characterized concerning their special features.rnThe first part will emphasize the advantage of a polystyrene-block-(hyperbranchedrnpolyglycerol) copolymer in comparison to an analogue polystyrene-block-(linear polyglycerol)rncopolymer. Therefore a synthethic route to prepare linear block copolymersrnhas been developed. Two strategies were examined. One strategy was based on thernclassic, sequential anionic polymerization; the second strategy was based on arn“Click-Chemistry” coupling reaction. In a following step glycidol was hypergraftedrnfrom these block copolymers by applying a hypergrafting reaction with glycidol. Thernbehavior of the amphiphilic block copolymers synthesized was studied in differentrnsolvents. Furthermore the polarity of the solvent was changed to form the correspondingrninverse micelles. DLS, SLS, SEC-MALLS-VISCO, AFM and Cyro TEMrnmeasurements were performed to obtain a visual image from the appearance of thernaggregates. It was found that a linear-hyperbranched architecture is necessary, ifrnwell defined, monodisperse aggregates are required, e.g. for the preparation of orderedrnnanoarrays. Linear-linear block copolymers formed only polydisperse aggregates.rnAdditionally it was found that size distribution could be improved dramaticallyrnby passing the aggregates through a SEC column with large pores. The SEC columnsrnacted like a template in which the aggregates adopt a more stable conformation.rnIn the second part anionic polymerization was employed to synthesize silaneendfunctionalizedrnmacromonomers with different molecular weights based on polybutadienernand polyisoprene. These were polymerized by a hydrosilylation reaction inrnbulk to obtain branched polymers, using Karstedt’s catalyst. Surprisingly the additionrnof monofunctional silanes during the polymerization had only a minimal effect concerningrnthe degree of polymerization. It was possible to introduce silanes without increasingrnthe overall number of reaction steps by a very convenient “pseudo-copolymerization”rnmethod. All branched polymers were analyzed by SEC, SEC-MALLS,rnSEC-viscometry, 1H-NMR-spectroscopy and DSC concerning their branching ratio.rnThe branching parameters for the branched polymers exhibited similar characteristicsrnas hyperbranched polymers based on AB2 monomers. Detailed kinetic study showedrnthat the polymerization occurred very rapidly in comparison to the hydrosilylation polymerizationrnof classical AB2 type carbosilanes monomers.rnThe last part will deal with ferrocenyl-functionalized polymers. On the one hand,rnferrocenyl-functionalized polyglycerols (PG) were studied. Esterification of PGs withrndifferent molecular weight using ferrocenemonocarboxylic acid gave the ferrocenylrnfuntionalized polymers in high yields. On the other hand three different block copolymersrnwere prepared with different ratios of styrene to butadiene units (10:1, 4:1, 2:1).rnThe double bonds of the 1,2-PB block were hydrosilylated using silanes bearing onern(HSiMe2Fc) or two (HSiMeFc2) ferrocene units. High degrees of functionalizationrnwere obtained (up to 83 %). In this manner, six different ferrocenyl-rich block copolymersrnwith different fractions of ferrocene were prepared and analyzed, employingrnNMR-spectroscopy, SEC, SEC/MALLS/viscometry, DLS and cyclic voltammetry. Thernredox properties of the studied polymers varied primarily with the nature of the silanernunit attached. Additionally, the redox properties in solution of the studied polymersrnwere influenced by the block length ratio of the block copolymers. Unexpectedly, withrnincreasing block length of the ferrocenyl block the fraction of active ferrocenes decreased.rnNevertheless, in case of thin monolayer films this behaviour was not observed.rnAll polymers (PG and PS-b-PB based) exhibited good electrochemical propertiesrnin a wide range of solvents, which rendered them very interesting for biosensoricrnapplications.

Messung dynamischer Prozesse in der Nähe von Grenzflächen mit Hilfe neu entwickelter Lichtstreumethoden

Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung und Erprobung zweier neuer dynamischer Lichtstreumethoden: Die Resonanz verstärkte Lichtstreuung (REDLS: resonance enhanced dynamic light scattering) und die Wellenleiter verstärkte Lichtstreuung (WEDLS: waveguide enhanced dynamic light scattering). Beide Methoden verwenden eine Kombination aus evaneszenten Wellen und dynamischer Lichtstreuung: Bei der REDLS-Technik wird das evaneszentes Feld eines Oberflächenplasmons verwendet, bei der WEDLS-Technik handelt es sich um das evaneszente Feld von Metallfilm verstärkten Leckwellenleitermoden. Die neuen Methoden liefern Informationen über die Dynamik an Grenzflächen über ein breites Zeitfenster (einige Nanosekunden bis hin zu mehreren Sekunden) mit einer räumlichen Auflösung im sub-Mikrometerbereich. Sie erweitern somit das Gebiet der dynamischen Lichtstreuung in evaneszenter Geometrie, bei dem bislang nur die evanescent wave dynamic light scattering (EWDLS) - Technik zur Verfügung stand. Bei der EWDLS-Technik wird das evaneszente Feld der Totalreflexion als kohärenter Lichtstrahl für die dynamische Lichtstreuung verwendet. Ein Vergleich mit der EWDLS-Technik zeigt ein stark erhöhtes Signal/Rausch-Verhältnis bei den neu entwickelten Techniken aufgrund der resonanten Anregung. Zusätzlich ist es sowohl bei der REDLS- als auch bei der WEDLS-Technik möglich Grenzflächenmodifikationen und damit z.B. Adsorptionsprozesse zu detektieren. Der Einfluss einer Grenzfläche auf die Diffusion von PS-Latex-Partikeln wurde untersucht. Die Grenzfläche bestand im Fall der REDLS-Technik aus Gold, bei der WEDLS-Technik aus PMMA. Die Funktionsweise und die Gültigkeit der neu entwickelten Techniken wurde mit Hilfe von PS-Latex-Partikeln mit hydrodynamischen Radien von R =11nm bis hin zu R=204nm demonstriert.

Untersuchungen über ADAMTS13 in Gerinnungsfaktorpräparaten

Zusammenfassung rnIn der vorliegenden Arbeit wurden sechs VWF/FVIII Gerinnungsfaktorkonzentrate unterschiedlicher Chargen auf ihre ADAMTS13 Aktivität, Antigen und VWF Multimere untersucht. Grund dafür ist die Annahme, dass bei der Aufkonzentrierung des VWFs möglicherweise auch erhöhte Mengen an ADAMTS13 vorhanden sind. Wäre dies nachweisbar, könnten die entsprechenden Konzentrate auch Anwendung bei TTP Patienten finden. Neben den Gerinnungsfaktorkonzentraten wurden ebenfalls die zur Plasmapherese verwendeten Therapeutika FFP und s/d Plasma analysiert. Es soll getestet werden, ob Unterschiede hinsichtlich der Qualität zwischen den Präparaten bestehen und inwiefern die Blutgruppen eine Auswirkung auf die ADAMTS13 Aktivität/Antigen haben. Überdies wurde die Bedeutung von ADAMTS13 als wichtiges diagnostisches Merkmal im Rahmen der Gegenüberstellung von Patienten mit thrombotischen Mikroangiopathien erörtert. Alle angewandten Methoden wurden zudem kritisch miteinander verglichen und auf ihre Eignung für die klinische Diagnostik getestet. Zur Untersuchung der ADAMTS13 Aktivität kamen drei unterschiedliche Methoden zur Anwendung, die BCS-Methode nach Böhm und zwei FRET Kits (Technozym®ADAMTS13/ActifluorTMADAMTS13). Für die Bestimmung des ADAMTS13 Antigen wurde das Technozym®ADAMTS13 Kit verwendete als auch der Imubind®ELISA angewendet. Mittels der SDS-Gelelektrophorese konnten die VWF Multimere dargestellt werden. Die Untersuchungen konnten zeigen, dass nur in Haemate®P, deutlich höhere ADAMTS13 Aktivitäten (12,3% bzw. 470ng/ml) sowie ein physiologische Antigenwerte vorlagen. Die anderen Faktorkonzentrate wiesen entweder nur sehr geringe bzw. keine Aktivitäten auf. Das Antigen lag bei allen Konzentraten im nachweisbaren Bereich. Folglich ist ein Einsatz von Haemate®P bei der Therapie der TTP, insbesondere bei hereditären Formen sowie bei Kindern, die durch eine Plasmapherese stark belastet werden, und bei Schwangeren, könnten, in Erwägung zu ziehen und innerhalb der Klinik zu testen. Die Plasmapräparate FFP und Octaplas® wiesen in allen Untersuchungen ADAMTS13 Aktivitäten und Antigen im mittleren bis hohen physiologischen Bereich auf. Insbesondere bei Blutgruppe 0 ließ sich beiden Präparaten eine höhere ADAMTS13 Aktivität und Antigen gegenüber den drei anderen Blutgruppen darstellen. Insgesamt waren die interindividuellen Schwankungen bei FFP deutlich höher als bei Octaplas®, was sich in der unterschiedlichen Herstellung der Präparate begründen lässt. Octaplas® ist also genauso geeignet zur Plasmapherese bei der TTP wie FFP, kann jedoch aufgrund seiner intensiveren Virusinaktivierung eine größere Sicherheit aufweisen und stellt sich auch in der Klinik als nebenwirkungsärmer dar. Bei der Gegenüberstellung der thrombotischen Mikroangiopathien konnte gezeigt werden, dass eine verminderte ADAMTS13 Aktivität ein wichtiges Unterscheidungsmerkmal ist und auch während der Remission schon diagnostizierbar werden kann. Auf der Grundlage der labordiagnostischen Werte und dem klinischen Erscheinungsbild im akuten Schub und in der Remission konnte ein diagnostischer Algorithmus für den klinischen Alltag erstellt werden. In der Methodenvalidierung erwies sich der ActifluorTMADAMTS13 Kit als der beste Kit, da er innerhalb kürzester Zeit zuverlässige Werte in Standardeinheiten liefert. Nach neuesten Erkenntnissen, bei der eine Unterscheidung von ADAMTS13 Aktivitäten über und unter 5 % von großer prognostischer Bedeutung sind, ist die BCS-Methode nach Böhm mit einer unteren Nachweisgrenze von 6,2% zu ungenau und auch hinsichtlich ihres Zeitaufwandes eher ungünstig.rn

Silica-Supported Gold Nanoparticles: Synthesis, Characterization and Reactivity

The main aim of this work was the synthesis and applications of functionalized-silica-supported gold nanoparticles. The silica-anchored functionalities employed, e.g. amine, alkynyl carbamate and sulfide moieties, possess a notable affinity with gold, so that they could be able to capture the gold precursor, to spontaneously reduce it (possibly at room temperature), and to stabilize the resulting gold nanoparticles. These new materials, potentially suitable for heterogeneous catalysis applications, could represent a breakthrough among the “green” synthesis of supported gold nanoparticles, since they would circumvent the addition of extra reducing agent and stabilizers, also allowing concomitant absorption of the active catalyst particles on the support immediately after spontaneous formation of gold nanoparticles. In chapter 4 of this thesis is also presented the work developed during a seven-months Marco Polo fellowship stay at the University of Lille (France), regarding nanoparticles nucleation and growth inside a microfluidic system and the study of the corresponding mechanism by in situ XANES spectroscopy. Finally, studies regarding the reparation and reactivity of gold decorated nanodiamonds are also described. Various methods of characterization have been used, such as ultraviolet-visible spectroscopy (UV-Vis), Transmission Electron Microscopy (TEM), Dynamic Light Scattering (DLS), X-ray Fluorescence (XRF), Field Emission Gun Scanning Electron Microscopy (SEM-FEG), X-ray Photoionization (XPS), X ray Absorption Spectroscopy (XAS).

Polymer-nanoparticle composites: from orientation phenomena to optoelectronic applications

Polymer-nanoparticle hybrids show synergistic effects, demonstrating both, the unique properties of nanosized structures and the good processability and functionalities of polymeric materials. This work shows the synthesis and application of block copolymers containing a soluble, functional block and a short anchor block, which efficiently binds to the surface of nanocrystals. We functionalized anisotropic, semiconducting nanoparticles, which can be dissolved in organic and polymeric matrices upon modification. The modified nanorods have the ability to form liquid crystalline phases, which behave similar to low molecular liquid crystals with a reversible clearing behaviour. These liquid crystalline phases could also be obtained in hole conducting matrices. For a macroscopic orientation of the nanorods, electric fields were applied and a switching (in analogy to known liquid crystals) to a homeotropic orientation was observed.rnBy introduction of dye molecules in the anchor block of a hole conducting block copolymer, all essential components of a solar cell can be combined in a single particle. Light absorption of the dye induces the injection of electrons into the particles, followed by a charging, that was monitored by a special AFM technique.rnLight emitting nanocrystals were functionalized analogously with a hole transporting polymer. The stability of the particles could be enhanced by the sterically stabilizing polymer corona and the particles showed improved properties in terms of processing. We applied these hybrid materials in light emitting devices, which showed better characteristics due to an improved hole injection and well dispersed emitting particles in the active device layer.rnThe work shows the broad spectrum of properties and applications based on the synergistic effects in hybrid and composite materials.

Sviluppo di metodologie per l'analisi di composti organici prodotti dalla fermentazione di frazioni pirolitiche della biomassa

I processi microbiologici rivestono una grande importanza nello sviluppo di combustibili e sostanze chimiche da fonti rinnovabili (biomassa), quali: il biometano e le bioplastiche, come i poli(idrossialcanoati), PHA. I PHA sono poliesteri ottenuti per condensazione di 3-idrossiacidi, il più comune dei quali è il poli(3-idrossibutirrato, PHB). Gli alti costi di produzione del PHA da colture microbiche singole ha portato a valutare nuove strategie, tra cui l’utilizzo di colture microbiche miste (MMC) e substrati di scarto. Il bio-olio ottenuto dalla pirolisi di biomassa potrebbe essere un substrato interessante per la produzione di biogas e PHA. Gli acidi a catena corta (acidi grassi volatili, VFA), infatti, sono i prodotti intermedi nella produzione sia di biogas che di PHA. L’analisi di questi ultimi viene normalmente effettuata tramite GC-FID o GC-MS. La degradazione termica (pirolisi, Py) di PHA produce acidi alchenoici caratteristici, come l’acido crotonico. Il metodo tradizionale per la determinazione del PHA è la metanolisi seguita da un’analisi GC-MS, una procedura laboriosa con uso di solventi clorurati e sostanze corrosive. Lo scopo principale di questa tesi è stato quello di sviluppare un nuovo metodo di analisi dei PHA. Il metodo studiato si basa sulla pirolisi diretta della biomassa e determinazione degli acidi alchenoici prodotti dalla degradazione del PHA in GC-FID. La pirolisi analitica è stata studiata tramite analisi di polimeri puri (per la calibrazione) e poi è stata applicata a campioni batterici derivanti da MMC e a ceppi selezionati. Il confronto con il metodo convenzionale ha dimostrato che la Py/GC-FID è un metodo valido per l’identificazione dei PHA e per la loro quantificazione nelle matrici batteriche. Il pre-trattamento del campione è minimo e non richiede l’uso di solventi e reagenti chimici. Inoltre, è stata applicata una tecnica di analisi dei VFA nei test di biometanazione basata sull’estrazione con una microquantità di dimetilcarbonato.

Untersuchung multimerer Proteinkomplexe mit oberflächenanalytischen und röntgenspektroskopischen Methoden

Zusammenfassung rnrnIn dieser Arbeit wurden Untersuchungen an zwei verschiedenen multimeren Proteinkomplexen durchgeführt: Zum einen am Hämocyanin aus Homarus americanus mittels Röntgen-L-Kantenspektroskopie und zum anderen am α-Toxin aus Staphylococcus aureus, hinsichtlich der Interaktion an speziellen Raft-artigen Membranabschnitten, mittels AFM.rnFür das Hämocyanin aus Homarus americanus konnte ein neuer Aspekt bezüglich der Bindung von Sauerstoff aufgezeigt werden. Ein zuvor nicht in Betracht gezogener und diskutierter Einfluss von Wassermolekülen auf diesen Vorgang konnte mittels der Methode der Röntgen-L-Kantenspektroskopie dargestellt werden. Erstmals war es möglich die beiden verschiedenen Beladungszustände (Oxy-, Deoxy-Zustand) des Hämocyanin mittels dieser Methode in physiologisch ähnlicher Umgebung zu untersuchen. Vergleiche der erhaltenen L-Kanten-Spektren mit denen anorganischer Vergleichslösungen ließen auf eine Interaktion von Wassermolekülen mit den beiden Kupferatomen des aktiven Zentrums schließen. Dadurch wurde erstmals ein möglicher Einfluss des Wassers auf den Oxygenierungsprozess des Hämocyanins auf elektronischer Ebene aufgezeigt. Vergleichende Betrachtungen von Röntgenkristallstrukturen verschiedener Typ-3-Kupferproteine bestätigten, dass auch hier ein Einfluss von Wassermolekülen auf die aktiven Zentren möglich ist. Vorgeschlagen wird dabei, dass an Stelle der Überlappung der 3d-Orbitale des Kupfers mit den 2p-Orbitalen des Sauerstoffs, wie sie im sauerstoffbeladenen Zustand auftritt, im sauerstoffunbeladenen Zustand eine Wechselwirkung der 3d-Orbitale des Kupfers mit den LUMOS der Wassermoleküle möglich wird, und ein Elektronen- bzw. Ladungstransfer von den Kupfern auf die Wassermoleküle erfolgen kann. rnAFM-Untersuchungen hinsichtlich der Interaktion des α-Toxins aus Staphylococcus aureus mit oberflächenunterstützten Modellmembranen wiesen darauf hin, dass eine bevorzugte Anbindung und zumindest teilweise Integration der α-Toxine in Raft-artige Membranbereiche stattfindet. Für verschiedene ternäre Lipidsysteme konnten phasenseparierte Modellmembranen abgebildet und die unterschiedlichen Domänenformen zugeordnet werden. Der Anbindungsprozess der Toxine an diese oberflächenunterstützte Modellmembranen erfolgte dann wahrscheinlich vornehmlich an den speziellen Raft-artigen Domänen, wohingegen die Insertion der Poren vorrangig an den Grenzbereichen zwischen den Domänen auftrat. Mögliche Ursache dafür sind die räumlichen Besonderheiten dieser Grenzflächen. Membranen weisen an den Schnittstellen zwischen zwei Domänenformen eine erhöhte Unordnung auf, was sich u.a. in einer geringeren Packungsdichte der Phospholipide und dem erhöhten Freiheitsgrad ihrer Kopfgruppen bemerkbar macht. Außerdem kommt es auf Grund der Interaktion der beteiligten Membranbestandteile Sphingomyelin und Cholesterol untereinander zu einer speziellen Ausrichtung der Phosphocholin-Kopfgruppen und innerhalb der Raft-artigen Domänen zu einer erhöhten Packungsdichte der Phospholipide. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse unterstützten demnach die in der Literatur postulierte Vermutung der bevorzugten Interaktion und Integration der Toxin-Moleküle mit Raft-artigen Membrandomänen. Die Insertion der Pore erfolgt aber wahrscheinlich bevorzugt an den Grenzbereichen zwischen den auftretenden Domänen.rn

Molecular interaction of the human metalloprotease meprin beta with the amyloid precursor protein, ADAM10, and ADAM17 based on proteomics

Die Zinkendopeptidasen Meprin α und β sind Schlüsselkomponenten in patho(physiologischen) Prozessen wie Entzündung, Kollagenassemblierung und Angiogenese. Nach ihrer Entdeckung in murinen Bürstensaummembranen und humanen Darmepithelien, wurden weitere Expressionsorte identifiziert, z.B. Leukozyten, Krebszellen und die humane Haut. Tiermodelle, Zellkulturen und biochemische Analysen weisen auf Funktionen der Meprine in der Epithelialdifferenzierung, Zellmigration, Matrixmodellierung, Angiogenese, Bindegewebsausbildung und immunologische Prozesse hin. Dennoch sind ihre physiologischen Substrate weitgehend noch unbekannt. Massenspektrometrisch basierte Proteomics-Analysen enthüllten eine einzigartige Spaltspezifität für saure Aminosäurereste in der P1´ Position und identifizierten neue biologische Substratkandidaten. Unter den 269 extrazellulären Proteinen, die in einem Substratscreen identifiziert wurden, stellten sich das amyloid precursor protein (APP) and ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease 10) als sehr vielversprechende Kandidaten heraus. Mehrere Schnittstellen innerhalb des APP Proteins, hervorgerufen durch verschiedenen Proteasen, haben unterschiedlichen Auswirkungen zur Folge. Die β-Sekretase BACE (β-site APP cleaving enzyme) prozessiert APP an einer Schnittstelle, welche als initialer Schritt in der Entwicklung der Alzheimer Erkrankung gilt. Toxische Aβ (Amyloid β)-Peptide werden in den extrazellulären Raum freigesetzt und aggregieren dort zu senilen Plaques. Membran verankertes Meprin β hat eine β-Sekretase Aktivität, die in einem Zellkultur-basierten System bestätigt werden konnte. Die proteolytische Effizienz von Meprin β wurde in FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer)-Analysen bestimmt und war um den Faktor 104 höher als die von BACE1. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass Meprin β die ersten zwei Aminosäuren prozessiert und somit aminoterminal einen Glutamatrest freisetzt, welcher nachfolgend durch die Glutaminylzyklase in ein Pyroglutamat zykliert werden kann. Trunkierte Aβ-Peptide werden nur in Alzheimer Patienten generiert. Aufgrund einer erhöhten Hydrophobie weisen diese Peptide eine höhere Tendenz zur Aggregation auf und somit eine erhöhte Toxizität. Bis heute wurde keine Protease identifiziert, welche diese Schnittstelle prozessiert. Die Bildung der Meprin vermittelten N-terminalen APP Fragmenten wurde in vitro und in vivo detektiert. Diese N-APP Peptide hatten keine cytotoxischen Auswirkungen auf murine und humane Gehirnzellen, obwohl zuvor N-APP als Ligand für den death receptor (DR) 6 identifiziert wurde, der für axonale Degenerationsprozesse verantwortlich ist. rnIm nicht-amyloidogenen Weg prozessiert ADAM10 APP und entlässt die Ektodomäne von der Zellmembran. Wir konnten das ADAM10 Propeptid als Substrat von Meprin β identifizieren und in FRET Analysen, in vitro und in vivo zeigen, dass die Meprin vermittelte Prozessierung zu einer erhöhten ADAM10 Aktivität führt. Darüber hinaus wurde ADAM10 als Sheddase für Meprin β identifiziert. Shedding konnte durch Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) oder durch das Ionophor A23187 hervorgerufen werden, sowie durch ADAM10 Inhibitoren blockiert werden. rnDiese Arbeit konnte somit ein komplexes proteolytisches Netwerk innerhalb der Neurophysiologie aufdecken, welches für die Entwicklung der Alzheimer Demenz wichtig sein kann.rn

Synthese von selektiv Protease-spaltbaren Nanopartikeln

Diese Arbeit legt, im Rahmen eines interdisziplinären BMBF Projekts, die Grundlage für eine neue, potentielle Früherkennungsmethode für Prostatakrebs. Ausgehend von der Idee, einen sensitiv detektierbaren Farbstoff in selektiv, Hepsin-spaltbare Kapseln einzubringen, wurde ein Modellsystem erarbeitet. Als Zielsubstrat für das Enzym Hepsin wurde die Sequenz RQLRVVGG identifiziert. Basierend auf dem hier entwickelten Modell, könnte in Zukunft eine Detektion von Hepsin und damit von Prostatakrebs im Frühstadium in vivo erfolgen. rnUm das Konzept der Enzymspaltbarkeit zu zeigen,wurden, basierend auf einem Modell,enzymatisch-spaltbare, polymere Nanopartikeldargestellt. In dieser Arbeit konnte die Synthese von vier Generationen spezifisch Protease-spaltbarer, hydrophober Nanopartikel gezeigt werden. Die Enzyme Pepsin und Trypsin, die selektiv die Peptidsequenz GFF spalten, wurden als Modellenzyme für das im Prostatakarzinom überexprimierte Hepsin eingesetzt. rnrnAls Ausgangspolymer diente Poly(styrol-co-acrylsäure), das in freier, radikalischer Polymerisation hergestellt und mit Molekulargewichten zwischen 8500 und 49400 g/mol erhalten wurde. Der Funktionalisierungsgrad wurde zwischen 5 und 16%-Gew. variiert. Die Charakterisierung erfolgte mittels GPC und NMR-Spektroskopie. In einer polymeranalogen Reaktion wurden die Säurefunktionen zu Aminogruppen umgesetzt. Die resultierendenPolymere wurden unter Einsatz der über Jahrzehnte entwickelten, effektiven Peptidkupplungschemie mit enzymspaltbarenPeptiden gekuppelt, um dadurch definierte Peptid-Polymer-Konjugate zu erhalten.Als enzymatisch spaltbarer Teil des Konjugats, wurden mithilfe der Festphasenpeptidsynthese (SPPS),FRET(Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer)-markiertePeptide synthetisiert, die auf der Trypsin-spaltbaren Sequenz GFF basierten. Zum Nachweis der Vernetzung der späteren Nanopartikel, wurde zusätzlich einern15N-markierte Aminosäure (Fmoc-(15N)-Glycin) am N-Terminus der Peptide eingebaut, um die Reaktion des Amins zu einem Amid verfolgen zu können.Die Charakterisierung der Peptide erfolgte mittels1H-, 13C-NMR-Spektroskopie, MALDI TOF-MS und HPLC. Aus den Polymeren und dem Peptid wurden Peptid-Polymer-Konjugate hergestellt und die erfolgreiche Anbindung mittels DOSY-NMR-Spektroskopie und HPLC nachgewiesen. Aus den Konjugaten konnten im nächsten Schritt, durch Anwendung des inversen Miniemulsionsprozesses, Nanopartikel formuliertund diese in wässriges Milieu überführt werden. Die Dispersionen konnten mittels PCCS, REM und Zetapotentialmessungen charakterisiert werden, wobei Partikeldurchmesser um 230 nm resultierten. Der Nachweis der Vernetzung des Polymers in den Partikeln konnte durch die Reaktion desrn15N-Amins zu einem 15N-Amid mittels 15N-Festkörper-NMR-Spektroskopie nachverfolgt werden. Abschließend konnten die Partikel durch Trypsin gespalten werden, was durch das eingebaute FRET-Paar über eine in situ Detektion der relativen Fluoreszenz erfolgte. rnIn dieser Arbeit konnten Peptid-vernetzte, Polystyrol basierte Nanopartikel hergestellt und in Heterophase von Trypsin gespalten werden.rn