The Role of Membrane Lipid Composition on Skeletal Muscle Damage in the Rodent Model of Duchenne Muscular Dystrophy

Duchenne muscular dystrophy is a X-linked muscle disease, which leads to alterations in membrane phospholipid fatty acid (FA) composition and skeletal muscle damage. Increased membrane saturated FA in muscular dystrophy may suggest its association with increased susceptibility (as being the cause or consequence) to muscle damage. It was hypothesised that increased saturation is positively correlated to increased muscle damage. Correlations were hypothesized to be greater in extensor digitorum longus (EDL) at 20 weeks compared to soleus (SOL) at 10 weeks in dystrophin deficient (mdx) mice. Increased saturation was correlated to damage in EDL at both 10 and 20 weeks, with stronger correlations at 10 weeks. The results suggest that membrane PL FA composition may be associated with damage through two possible means. Increased saturation may be a cause or consequence of membrane damage. Association of membrane composition with eccentric induced damage has underscored the importance of saturated PL FA compositions in damage to dystrophic myofibres.

Second copy of the memorandum respecting differences between the approximate and final estimate but this one has “memorandum of extras of Brown and McDonall contract” written on the outer page

Second copy of the memorandum respecting differences between the approximate and final estimate but this one has “memorandum of extras of Brown and McDonall contract” written on the outer page (3 pages, handwritten), n.d.

The Ligand and Membrane-binding Behaviour of the Phosphatidylinositol Transfer Proteins (PITPa & PITPb)

Human Class I phosphatidylinositol transfer proteins (PITPs) exists in two forms: PITPα and PITPβ. PITPs are believed to be lipid transfer proteins based on their capacity to transfer either phosphatidylinositol (PI) or phosphatidylcholine (PC) between membrane compartments in vitro. In Drosophila, the PITP domain is found to be part of a multi-domain protein named retinal degeneration B (RdgBα). The PITP domain of RdgBα shares 40 % sequence identity with PITPα and has been shown to possess PI and PC binding and transfer activity. The detailed molecular mechanism of ligand transfer by the human PITPs and the Drosophila PITP domain remains to be fully established. Here, we investigated the membrane interactions of these proteins using dual polarization interferometry (DPI). DPI is a technique that measures protein binding affinity to a flat immobilized lipid bilayer. In addition, we also measured how quickly these proteins transfer their ligands to lipid vesicles using a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based assay. DPI investigations suggest that PITPβ had a two-fold higher affinity for membranes compared to PITPα. This was reflected by a four-fold faster ligand transfer rate for PITPβ in comparison to PITPα as determined by the FRET assay. Interestingly, DPI analysis also demonstrated that PI-bound human PITPs have lower membrane affinity compared to PC-bound PITPs. In addition, the FRET studies demonstrated the significance of membrane curvature in the ligand transfer rate of PITPs. The ligand transfer rate was higher when the accepting vesicles were highly curved. Furthermore, when the accepting vesicles contained phosphatidic acid (PA) which have smaller head groups, the transfer rate increased. In contrast, when the accepting vesicles contained phosphoinositides which have larger head groups, the transfer rate was diminished. However, PI, the favorite ligand of PITPs, or the presence of anionic lipids did not appear to influence the ligand transfer rate of PITPs. Both DPI and FRET examinations revealed that the PITP domain of RdgBα was able to bind to membranes. However, the RdgBα PITP domain appears to be a poor binder and transporter of PC.

Role of Phosphorylation of the Oxysterol Binding Protein (OSBP) in (PI(4)P) and Sterol-Containing Membrane Recognition and Binding

Studies have demonstrated that the oxysterol binding protein (OSBP) acts as a phosphatidylinositol phosphate (PIP)-sterol exchanger at membrane contact sites (MCS) of the endoplasmic reticulum (ER) and Golgi. OSBP is known to pick up phosphatidylinositol-4-phosphate (PI(4)P) from the ER, transfer it to the trans-Golgi in exchange for a cholesterol molecule that is then transferred from the trans-Golgi to the ER. Upon further examination of this pathway by Ridgway et al. (1), it appeared that phosphorylation of OSBP played a role in the localization of OSBP. The dephosphorylation state of OSBP was linked to Golgi localization and the depletion of cholesterol at the ER. To mimic the phosphorylated state of OSBP, the mutant OSBP-S5E was designed by Ridgway et al. (1). The lipid and sterol recognition by wt-OSBP and its phosphomimic mutant OSBP-S5E were investigated using immobilized lipid bilayers and dual polarization interferometry (DPI). DPI is a technique in which the protein binding affinity to immobilized lipid bilayers is measured and the binding behavior is examined through real time. Lipid bilayers containing 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and varying concentrations of PI(4)Ps or sterols (cholesterol or 25-hydroxycholesterol) were immobilized on a silicon nitride chip. It was determined that wt-OSBP binds differently to PI(4)P-containing bilayers compared to OSBP-S5E. The binding behavior suggested that wt-OSBP extracts PI(4)P and the change in the binding behavior, in the case of OSBP-S5E, suggested that the phosphorylation of OSBP may prevent the recognition and/or extraction of PI(4)P. In the presence of sterols, the overall binding behavior of OSBP, regardless of phosphorylation state, was fairly similar. The maximum specific bound mass of OSBP to sterols did not differ as the concentration of sterols increased. However, comparing the maximum specific bound mass of OSBP to cholesterol with oxysterol (25-hydroxycholesterol), OSBP displayed nearly a 2-fold increase in bound mass. With the absence of the wt-OSBP-PI(4)P binding behavior, it can be speculated that the sterols were not extracted. In addition, the binding behavior of OSBP was further tested using a fluorescence based binding assay. Using 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3β-ol (22-NBD cholesterol), wt-OSBP a one site binding dissociation constant Kd, of 15 ± 1.4 nM was determined. OSBP-S5E did not bind to 22-NBD cholesterol and Kd value was not obtained.

Rôle de l’extrémité C-terminale dans l’expression du canal calcique Cav1.2 à la membrane plasmique

Le canal calcique de type L, Cav1.2, joue un rôle clé dans le couplage excitation-contraction des myocytes ventriculaires. Il a été montré que la sous-unité Cavα1 était sujette à l’épissage alternatif et que ce phénomène pouvait mener à une protéine tronquée en C-terminal au niveau de l’exon 45 (Liao, Yong et al. 2005). D’autres groupes ont étudié différentes délétions au niveau de l’extrémité C-terminale (De Jongh, Warner et al. 1991; Gao, Cuadra et al. 2001). Les courants mesurés dans la configuration cellule entière, était significativement plus grands que le canal « pleine longueur ». Nous avons décidé de tester certaines de ces délétions (ΔC2030, ΔC1935, ΔC1856, ΔC1733, ΔC1700) en présence ou en absence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, susceptible d’interagir avec l’extrémité C-terminale de la sous-unité Cavα1 par l’intermédiaire de son domaine SH3 (Lao, Kobrinsky et al. 2008). Les résultats obtenus dans les ovocytes de Xénope ont mis en évidence que les sous-unités Cavα1.2 tronquées montraient des courants globaux plus élevés que le canal « pleine longueur » en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3 et que les sous-unités Cavα1.2 tronquées donnaient des courants en absence de la sous-unité Cavβ3 contrairement à la sous-unité Cavα1.2 « pleine longueur ». Afin de vérifier si l’augmentation des courants macroscopiques était le résultat d’une augmentation du nombre de sous-unités Cavα1.2 à la membrane, nous avons choisi de quantifier la fluorescence spécifiquement due à cette sous-unité en utilisant la méthode de cytométrie de flux (FACS : « Fluorescence Activated Cell Sorting »). L’épitope HA a été inséré dans une région extracellulaire de la sous-unité Cavα1 du canal calcique Cav1.2 et un anticorps anti-HA couplé au FITC (« Fluorescein IsoThioCyanate ») a été utilisé pour observer la fluorescence. Nos résultats confirment que la sous-unité Cavα1-HA du canal calcique Cav1.2, s’exprime à la membrane plasmique en présence de la sous-unité auxiliaire Cavβ3, et qu’en absence de celle-ci, ne s’exprime que peu ou pas à la membrane. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les trois délétions testées dans les mêmes conditions soit Cavα1.2-HA ΔC1935, Cavα1.2-HA ΔC1856 et Cavα1.2-HA ΔC1733. Ensemble, ces résultats suggèrent que l’augmentation des courants macroscopiques observés après une délétion partielle du C-terminal n’est pas causée par une augmentation du nombre de protéines Cavα1.2 à la membrane.

La méthode IIM pour une membrane immergée dans un fluide incompressible

La méthode IIM (Immersed Interface Method) permet d'étendre certaines méthodes numériques à des problèmes présentant des discontinuités. Elle est utilisée ici pour étudier un fluide incompressible régi par les équations de Navier-Stokes, dans lequel est immergée une membrane exerçant une force singulière. Nous utilisons une méthode de projection dans une grille de différences finies de type MAC. Une dérivation très complète des conditions de saut dans le cas où la viscosité est continue est présentée en annexe. Deux exemples numériques sont présentés : l'un sans membrane, et l'un où la membrane est immobile. Le cas général d'une membrane mobile est aussi étudié en profondeur.

Développement d'une méthode d'isolation des noyaux adaptée aux macrophages pour une caractérisation protéomique d'une nouvelle structure autophagique induite par le virus HSV-1

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.

Identification de nouveaux partenaires protéiques des récepteurs couplés aux protéines G contrôlant leur transport du reticulum endoplasmique à la membrane plasmique

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire.

Phosphorylcholine based amphiphilic polymers for the solubilization of integral membrane proteins

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Étude du transport ionique membranaire par la mesure de concentration dans le microenvironnement externe de la membrane : mise au point de la technique du "piège ionique"

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Étude des mécanismes moléculaires de formation des pores des toxines formeuses de pores par la spectroscopie de fluorescence

Les toxines formeuses de pore (PFTs) sont des protéines exogènes responsables d’un grand nombre de maladies infectieuses qui perméabilisent les membranes cellulaires de leur hôte. La formation des pores ou l’introduction d’une enzyme dans le cytoplasme peut entrainer l’apparition de symptômes de maladies connues (l’anthrax, le botulisme) et, dans le pire des cas, la mort. Les mécanismes d’infection et de destruction des cellules infectées sont bien caractérisés. Toutefois, l’aspect dynamique des changements de conformation durant le processus de perméabilisation reste à découvrir pour la majorité des toxines formeuses de pore. Le but de cette thèse est d’étudier les mécanismes d’oligomérisation des PFTs, ainsi que la formation des pores à la membrane lipidique grâce à la spectroscopie de fluorescence. Nous avons choisi la toxine Cry1Aa, un bio pesticide produit par le bacille de Thuringe et qui a été rigoureusement caractérisé, en tant que modèle d’étude. La topologie de la Cry1Aa à l’état actif et inactif a pu être résolue grâce à l’utilisation d’une technique de spectroscopie de fluorescence, le FRET ou transfert d’énergie par résonance entre un fluorophore greffé au domaine formeur de pore (D1) et un accepteur non fluorescent (le DPA ou dipicrylamine) localisé dans la membrane et qui bouge selon le potentiel membranaire. Le courant électrique, ainsi que la fluorescence provenant de la bicouche lipidique membranaire horizontale ont été enregistrés simultanément. De cette manière, nous avons pu localiser toutes les boucles reliant les hélices de D1 avant et après la formation des pores. Dans la forme inactive de la toxine, toutes ces boucles se trouvent du côté interne de la bicouche lipidique, mais dans sa forme active l’épingle α3-α4 traverse du côté externe, alors que toutes les autres hélices demeurent du côté interne. Ces résultats suggèrent que α3-α4 forment le pore. Nous avons découvert que la toxine change significativement de conformation une fois qu’elle se trouve dans la bicouche lipidique, et que la Cry1Aa attaque la membrane lipidique de l’extérieur, mais en formant le pore de l’intérieur. Dans le but de caractériser la distribution de toxines à chaque extrémité de la bicouche, nous avons utilisé une technique de double FRET avec deux accepteurs ayant des vitesses de translocation différentes (le DPA et l’oxonol) dans la membrane lipidique. De cette manière, nous avons déterminé que la toxine était présente des deux côtés de la bicouche lipidique durant le processus de perméabilisation. La dynamique d’oligomérisation de la toxine dans une bicouche lipidique sans récepteurs a été étudiée avec une technique permettant le compte des sauts de fluorescence après le photoblanchiment des fluorophore liés aux sous unités composant un oligomère présent dans la bicouche lipidique supportée. Nous avons confirmé de cette manière que la protéine formait ultimement des tétramères, et que cet état résultait de la diffusion des monomères de toxine dans la bicouche et de leur assemblage subséquent. Enfin nous avons voulu étudier le « gating » de la colicine Ia, provenant de la bactérie E.Coli, dans le but d’observer les mouvements que font deux positions supposées traverser la bicouche lipidique selon le voltage imposé aux bornes de la bicouche. Nos résultats préliminaires nous permettent d’observer un mouvement partiel (et non total) de ces positions, tel que le suggèrent les études de conductances du canal.

Amino acid substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins are selected during mammalian reovirus adaptation to Vero cells

Establishment of viral persistence in cell culture has previously led to the selection of mammalian reovirus mutants, although very few of those have been characterized in details. In the present study, reovirus was adapted to Vero cells that, in contrast to classically-used L929 cells, are inefficient in supporting the early steps of reovirus uncoating and are also unable to produce interferon as an antiviral response once infection occurs. The Vero cell-adapted reovirus exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 proteins. This contrasts with uncoating mutants from persistently-infected L929 cells, and various other cell types, that generally harbor amino acids substitutions in the σ3 outer capsid protein. The Vero cell-adapted virus remained sensitive to an inhibitor of lysosomal proteases; furthermore, in the absence of selective pressure for its maintenance, t he virus has partially lost its ability to resist interferon. The positions of the amino acids substitutions on the known protein structures suggest an effect on binding of the viral σ1 protein to the cell surface and on μ1 disassembly from the outer capsid.

Addition of exogenous polypeptides on the mammalian reovirus outer capsid using reverse genetics

Addition of exogenous peptide sequences on viral capsids is a powerful approach to study the process of viral infection or to retarget viruses toward defined cell types. Until recently, it was not possible to manipulate the genome of mammalian reovirus and this was an obstacle to the addition of exogenous sequence tags onto the capsid of a replicating virus. This obstacle has now been overcome by the advent of the plasmid-based reverse genetics system. In the present study, reverse genetics was used to introduce different exogenous peptides, up to 40 amino acids long, at the carboxyl-terminal end of the σ1 outer capsid protein. The tagged viruses obtained were infectious, produce plaques of similar size, and could be easily propagated at hight titers. However, attempts to introduce a 750 nucleotides-long sequence failed, even when it was added after the stop codon, suggesting a possible size limitation at the nucleic acid level.

Amino acids substitutions in σ1 and μ1 outer capsid proteins of a Vero cell-adapted mammalian orthoreovirus are required for optimal virus binding and disassembly

In a recent study, the serotype 3 Dearing strain of mammalian orthoreovirus was adapted to Vero cells; cells that exhibit a limited ability to support the early steps of reovirus uncoating and are unable to produce interferon as an antiviral response upon infection. The Vero cell-adapted virus (VeroAV) exhibits amino acids substitutions in both the σ1 and μ1 outer capsid proteins but no changes in the σ3 protein. Accordingly, the virus was shown not to behave as a classical uncoating mutant. In the present study, an increased ability of the virus to bind at the Vero cell surface was observed and is likely associated with an increased ability to bind onto cell-surface sialic acid residues. In addition, the kinetics of μ1 disassembly from the virions appears to be altered. The plasmid-based reverse genetics approach confirmed the importance of σ1 amino acids substitutions in VeroAV's ability to efficiently infect Vero cells, although μ1 co-adaptation appears necessary to optimize viral infection. This approach of combining in vitro selection of reoviruses with reverse genetics to identify pertinent amino acids substitutions appears promising in the context of eventual reovirus modification to increase its potential as an oncolytic virus.

Le rôle de l’Oxygénation Extracorporelle par Membrane (ECMO) dans la réanimation cardio-pulmonaire

Rapport de stage présenté à la Faculté de médecine en vue de l'obtention du grade de Maître ès sciences appliquées (M.Sc.A.) en génie biomédical, option génie clinique.