Polyketide Quinones Are Alternate Intermediate Electron Carriers during Mycobacterial Respiration in Oxygen-Deficient Niches

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) adaptation to hypoxia is considered crucial to its prolonged latent persistence in humans. Mtb lesions are known to contain physiologically heterogeneous microenvironments that bring about differential responses from bacteria. Here we exploit metabolic variability within biofilm cells to identify alternate respiratory polyketide quinones (PkQs) from both Mycobacterium smegmatis (Msmeg) and Mtb. PkQs are specifically expressed in biofilms and other oxygen-deficient niches to maintain cellular bioenergetics. Under such conditions, these metabolites function as mobile electron carriers in the respiratory electron transport chain. In the absence of PkQs, mycobacteria escape from the hypoxic core of biofilms and prefer oxygenrich conditions. Unlike the ubiquitous isoprenoid pathway for the biosynthesis of respiratory quinones, PkQs are produced by type III polyketide synthases using fatty acyl-CoA precursors. The biosynthetic pathway is conserved in several other bacterial genomes, and our study reveals a redox-balancing chemicocellular process in microbial physiology.

The mycobacterial iron-dependent regulator IdeR induces ferritin (bfrB) by alleviating Lsr2 repression

Emerging evidence indicates that precise regulation of iron (Fe) metabolism and maintenance of Fe homeostasis in Mycobacterium tuberculosis (Mtb) are essential for its survival and proliferation in the host. IdeR is a central transcriptional regulator of Mtb genes involved in Fe metabolism. While it is well understood how IdeR functions as a repressor, how it induces transcription of a subset of its targets is still unclear. We investigated the molecular mechanism of IdeR-mediated positive regulation of bfrB, the gene encoding the major Fe-storage protein of Mtb. We found that bfrB induction by Fe required direct interaction of IdeR with a DNA sequence containing four tandem IdeR-binding boxes located upstream of the bfrB promoter. Results of in vivo and in vitro transcription assays identified a direct repressor of bfrB, the histone-like protein Lsr2. IdeR counteracted Lsr2-mediated repression in vitro, suggesting that IdeR induces bfrB transcription by antagonizing the repressor activity of Lsr2. Together, these results elucidate the main mechanism of bfrB positive regulation by IdeR and identify Lsr2 as a new factor contributing to Fe homeostasis in mycobacteria.

Autoregulation of topoisomerase I expression by supercoiling sensitive transcription

The opposing catalytic activities of topoisomerase I (TopoI/relaxase) and DNA gyrase (supercoiling enzyme) ensure homeostatic maintenance of bacterial chromosome supercoiling. Earlier studies in Es-cherichia coli suggested that the alteration in DNA supercoiling affects the DNA gyrase and TopoI expression. Although, the role of DNA elements around the promoters were proposed in regulation of gyrase, the molecular mechanism of supercoiling mediated control of TopoI expression is not yet understood. Here, we describe the regulation of TopoI expression from Mycobacterium tuberculosis and Mycobac-terium smegmatis by a mechanism termed Supercoiling Sensitive Transcription (SST). In both the organisms, topoI promoter(s) exhibited reduced activity in response to chromosome relaxation suggesting that SST is intrinsic to topoI promoter(s). We elucidate the role of promoter architecture and high transcriptional activity of upstream genes in topoI regulation. Analysis of the promoter(s) revealed the presence of suboptimal spacing between the -35 and -10 elements, rendering them supercoiling sensitive. Accordingly, upon chromosome relaxation, RNA polymerase occupancy was decreased on the topoI promoter region implicating the role of DNA topology in SST of topoI. We propose that negative supercoiling induced DNA twisting/writhing align the -35 and -10 elements to facilitate the optimal transcription of topoI.

Mycobacteria-responsive sonic hedgehog signaling mediates programmed death-ligand 1-and prostaglandin E-2-induced regulatory T cell expansion

CD4(+)CD25(+)FoxP3(+) regulatory T cells (Tregs) are exploited by mycobacteria to subvert the protective host immune responses. The Treg expansion in the periphery requires signaling by professional antigen presenting cells and in particularly dendritic cells (DC). However, precise molecular mechanisms by which mycobacteria instruct Treg expansion via DCs are not established. Here we demonstrate that mycobacteria-responsive sonic hedgehog (SHH) signaling in human DCs leads to programmed death ligand-1 (PD-L1) expression and cyclooxygenase (COX)-2-catalyzed prostaglandin E-2 (PGE(2)) that orchestrate mycobacterial infection-induced expansion of Tregs. While SHH-responsive transcription factor GLI1 directly arbitrated COX-2 transcription, specific microRNAs, miR-324-5p and miR-338-5p, which target PD-L1 were downregulated by SHH signaling. Further, counter-regulatory roles of SHH and NOTCH1 signaling during mycobacterial-infection of human DCs was also evident. Together, our results establish that Mycobacterium directs a fine-balance of host signaling pathways and molecular regulators in human DCs to expand Tregs that favour immune evasion of the pathogen.

Hanseníase neural, aspectos diagnósticos da forma neural pura e mecanismos imunopatogênicos da lesão do nervo na doença. Participação de quimiocinas CCL2 e CXCL10 e metaloproteinases 2 e 9

O diagnóstico da hanseníase neural pura baseia-se em dados clínicos e laboratoriais do paciente, incluindo a histopatologia de espécimes de biópsia de nervo e detecção de DNA de Mycobacterium leprae (M. leprae) pelo PCR. Como o exame histopatológico e a técnica PCR podem não ser suficientes para confirmar o diagnóstico, a imunomarcação de lipoarabinomanana (LAM) e/ou Glicolipídio fenólico 1 (PGL1) - componentes de parede celular de M. leprae foi utilizada na primeira etapa deste estudo, na tentativa de detectar qualquer presença vestigial do M. leprae em amostras de nervo sem bacilos. Além disso, sabe-se que a lesão do nervo na hanseníase pode diretamente ser induzida pelo M. leprae nos estágios iniciais da infecção, no entanto, os mecanismos imunomediados adicionam severidade ao comprometimento da função neural em períodos sintomáticos da doença. Este estudo investigou também a expressão imuno-histoquímica de marcadores envolvidos nos mecanismos de patogenicidade do dano ao nervo na hanseníase. Os imunomarcadores selecionados foram: quimiocinas CXCL10, CCL2, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, e metaloproteinases 2 e 9. O estudo foi desenvolvido em espécimes de biópsias congeladas de nervo coletados de pacientes com HNP (n=23 / 6 BAAR+ e 17 BAAR - PCR +) e pacientes diagnosticados com outras neuropatias (n=5) utilizados como controle. Todas as amostras foram criosseccionadas e submetidas à imunoperoxidase. Os resultados iniciais demonstraram que as 6 amostras de nervos BAAR+ são LAM+/PGL1+. Já entre as 17 amostras de nervos BAAR-, 8 são LAM+ e/ou PGL1+. Nas 17 amostras de nervos BAAR-PCR+, apenas 7 tiveram resultados LAM+ e/ou PGL1+. A detecção de imunorreatividade para LAM e PGL1 nas amostras de nervo do grupo HNP contribuiu para a maior eficiência diagnóstica na ausência recursos a diagnósticos moleculares. Os resultados da segunda parte deste estudo mostraram que foram encontradas imunoreatividade para CXCL10, CCL2, MMP2 e MMP9 nos nervos da hanseníase, mas não em amostras de nervos com outras neuropatias. Além disso, essa imunomarcação foi encontrada predominantemente em células de Schwann e em macrófagos da população celular inflamatória nos nervos HNP. Os outros marcadores de ativação imunológica foram encontrados em leucócitos (linfócitos T e macrófagos) do infiltrado inflamatório encontrados nos nervos. A expressão de todos os marcadores, exceto CXCL10, apresentou associação com a fibrose, no entanto, apenas a CCL2, independentemente dos outros imunomarcadores, estava associada a esse excessivo depósito de matriz extracelular. Nenhuma diferença na frequência da imunomarcação foi detectada entre os subgrupos BAAR+ e BAAR-, exceção feita apenas às células CD68+ e HLA-DR+, que apresentaram discreta diferença entre os grupos BAAR + e BAAR- com granuloma epitelioide. A expressão de MMP9 associada com fibrose é consistente com os resultados anteriores do grupo de pesquisa. Estes resultados indicam que as quimiocinas CCL2 e CXCL10 não são determinantes para o estabelecimento das lesões com ou sem bacilos nos em nervo em estágios avançados da doença, entretanto, a CCL2 está associada com o recrutamento de macrófagos e com o desenvolvimento da fibrose do nervo na lesão neural da hanseníase.

Propriedades adesivas a substratos abióticos e bióticos, invasão e indução de apoptose celular de Corynebacterium pseudodiphtheriticum

A ocorrência de fenótipos multirresistentes de Corynebacterium pseudodiphtheriticum e sua associação a infecções graves, com elevada mortalidade em pacientes imunocomprometidos, aliados ao escasso conhecimento da virulência e patogenia destas infecções, motivou esta pesquisa, que teve como objetivo investigar mecanismos de virulência e resistência microbiana deste agente entre pacientes de um hospital universitário brasileiro. Um total de 113 amostras de C. pseudodiphtheriticum identificadas por métodos bioquímicos convencionais e sistema API-Coryne isoladas de pacientes de diferentes grupos etários. Os micro-organismos eram, em sua maioria, relacionados a infecções no trato respiratório (27,45%), urinário (29,20%) e sitios intravenosos (18,60%) e cerca de 32,70% das amostras foram provenientes de pacientes com pelo menos uma das condições predisponentes: insuficiência renal; transplante renal, tuberculose em paciente HIV+, câncer, cirrose hepática, hemodiálise e uso de cateter. As amostras testadas revelaram-se multirresistentes sendo a maioria resistente à oxacilina, eritromicina e clindamicina. A adesão das cepas ao poliestireno e ao poliuretano indicou o envolvimento de hidrofobicidade da superfície celular na fase inicial da formação de biofilmes. O crescimento subsequente conduziu à formação de microcolônias, agregados bacterianos densos incorporados na matriz exopolimérica rodeada por espaços vazios, típica de biofilmes maduros. Adicionalmente, a interação do micro-organismo com fibrinogênio e fibronectina humana indica o envolvimento destes componentes séricos na formação de biofilme, sugerindo a participação de diferentes adesinas neste processo e a capacidade deste agente formar biofilme in vivo. A afinidade por esses componentes e a formação de biofilme podem contribuir para o estabelecimento e disseminação da infecção no hospedeiro. Adicionalmente, as cepas de C. pseudodiphtheriticum isoladas de pacientes com infecções localizadas (ATCC10700/Pharyngitis) e sistêmicas (HHC1507/Bacteremia) exibiram um padrão de aderência agregativa-like a células HEp-2, caracterizado por aglomerados de bactérias com aparência de um "empilhado de tijolos". Através do teste FAS e ensaios de interação na presença de inibidores de citoesqueleto, demonstramos o envolvimento da polimerização de actina na internalização das cepas testadas. A internalização bacteriana e rearranjo do citoesqueleto pareceu ser parcialmente desencadeado pela ativação da tirosina-quinase. Finalmente, C. pseudodiphtheriticum foi capaz de sobreviver no ambiente intracelular e embora não tenha demonstrado capacidade de replicar intracelularmente, células HEp-2 foram incapazes de eliminar o patógeno completamente no ambiente extracelular no período de 24 horas. Todas as cepas estudadas foram capazes de induzir apoptose em células epiteliais 24 horas pós-infecção evidenciada pelo aumento significativo no número de células mortas e pela ocorrência de alterações nucleares reveladas através dos métodos de coloração pelo azul Trypan, pelo DAPI e microscopia electrônica de transmissão. Alterações morfológicas incluindo a vacuolização, a fragmentação nuclear e a formação de corpos apoptóticos foram observadas neste período. A citometria de fluxo demonstrou ainda uma diminuição significativa no tamanho das células infectadas e a utilização de dupla marcação (iodeto de propídio / anexina V) permitiu a detecção da ocorrência de necrose e apoptose tardia. Em conclusão, o conhecimento de tais características contribuiu para a compreensão de mecanismos envolvidos no aumento da frequência de infecções graves com elevada mortalidade em pacientes no ambiente hospitalar, por C. pseudodiphtheriticum, um patógeno rotineiramente subestimado em países em desenvolvimento.

Avaliação de marcadores biológicos com potencial para detecção da evolução para doença em tuberculose

A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa obtida a partir da inalação de aerossóis contendo seu agente etiológico, o Mycobacterium tuberculosis. A TB acomete principalmente os pulmões e é a patologia bacteriana líder em causar mortes no mundo. No Brasil, por ano, são notificados 69 mil casos de tuberculose, dos quais 4,6 mil evoluem para o óbito. Durante a infecção pelo M. tuberculosis, 90% dos indivíduos permanece na forma latente assintomática, e aproximadamente 10% evolui para doença. Este trabalho estudou parâmetros de resposta imune e inflamatória, em indivíduos de ambos os sexos, com idades de 18 a 65 anos, com diferentes graus de exposição ao M. tuberculosis (indivíduos não-expostos ao M. tuberculosis, TST < 5 mm, n= 30; indivíduos com tuberculose latente, TST ≥ 5 mm, n=29; pacientes com tuberculose pulmonar n= 22). Nossos resultados mostraram que o TST isoladamente falhou em detectar todos os indivíduos expostos ao M. tuberculosis, e em 1/3 dos TST positivos não foi observada resposta in vitro a antígenos específicos de M. tuberculosis, avaliada com os biomarcadores IFN-γ e CXCL10. Houve uma alta correlação entre os biomarcadores IFN-γ e CXCL10 em culturas de sangue não fracionado estimuladas com antígenos específicos de M. tuberculosis. A utilização combinada destes 2 biomarcadores mostrou positividade para M. tuberculosis em 94,4% dos pacientes. Foram observadas diferenças marcantes de nível de expressão de RNA mensageiro específicos para CD64, GTPase associada a Ras, lactoferrina, PDL-1 e CXCL10, mas não para OASL em leucócitos sanguíneos, quando os pacientes com tuberculose pulmonar foram comparados com os dois outros grupos de voluntários. Da mesma forma, os níveis de expressão dos receptores CD64 e CD163 foram significativamente mais elevados em neutrófilos dos pacientes quando comparados com os grupos-controle. Tomadas em conjunto, nossas observações sugerem que o uso de mais de um biomarcador aumenta a sensibilidade e especificidade dos métodos para detecção de infecção latente por M. tuberculosis e tuberculose.

Síntese, caracterização e estudo da ação antituberculose e citotóxica de hidrazonas derivadas de isoniazida e de seus complexos de cobre(II) e gálio(III)

No presente trabalho é descrita a obtenção de hidrazonas derivadas de isoniazida e de seus complexos de cobre(II) e gálio(III) candidatos a protótipos de fármacos antituberculose e antitumoral. Para investigar o efeito da modificação química sobre as bioatividades do fármaco isoniazida, foram preparados cinco derivados hidrazônicos: 2-piridinocarboxaldeído isonicotinoil hidrazona (HPCIH, 1), 2-acetilpiridina isonicotinoil hidrazona (HAPIH, 2), 2-benzoilpiridina isonicotinoil hidrazona (HBPIH, 3), 2-piridinoformamida isonicotinoil hidrazona (HPAmIH, 4) e 2-pirazinoformamida isonicotinoil hidrazona (HPzAmIH, 5), sendo o composto HPAmIH (4) inédito. Análises de ponto de fusão, espectroscopia de infravermelho (IV), espectrometria de massas, ressonância magnética nuclear (RMN), análise elementar e termogravimetria confirmaram a obtenção e pureza das hidrazonas. Foi determinada ainda a estrutura de HPCIH (1) por difração de raios X de monocristal. Essas moléculas foram efetivas em inibir o crescimento de cepas de micobactérias Mycobacterium tuberculosis H37Rv (ATCC 27294) nas concentrações testadas, com exceção de HPzAmIH (5). As hidrazonas HAPIH (2) e HBPIH (3) foram os compostos orgânicos mais ativos (concentração inibitória mínima, CIM = 0,625 g/mL), apresentando atividade antimicobacteriana apenas duas vezes inferior à do fármaco isoniazida.Quanto à ação contra células tumorais, as hidrazonas HAPIH (2) e HBPIH (3) foram as mais potentes contra as linhagens OVCAR-8 (tumor de ovário - humano), HCT-116 (tumor de cólon - humano) e SF-295 (glioblastoma humano), com inibições de 34,98 a 98,63% do crescimento celular, na concentração de 5 g/mL, enquanto que a isoniazida não foi efetiva contra as linhagens estudadas. Para avaliar o efeito da coordenação a metais sobre a atividade farmacológica das hidrazonas, foram sintetizados os complexos de cobre(II) e gálio(III), sendo todos inéditos: [Cu(HPCIH)Cl2]∙H2O (6), [Cu(HAPIH)Cl2]∙H2O (7), [Cu2(HBPIH)2Cl2]Cl2∙4H2O(8), [Cu(HPAmIH)Cl2]∙H2O (9), [Cu(HPzAmIH)Cl2]∙H2O (10), [Ga(HPCIH)2](NO3)32H2O (11), [Ga(HAPIH)(APIH)](NO3)22H2O (12), [Ga(HPAmIH)(PAmIH)](NO3)22H2O(13) e [Ga(HPzAmIH)(PzAmIH)](NO3)2H2O (14). Os complexos foram caracterizados por espectroscopia de IV, análise elementar, condutivimetria, RMN e espectroscopia eletrônica. Em geral, os complexos também demonstraram ação contra M. tuberculosis, sendo que apenas para 6, 9, 10 e 14 foi verificada melhor atividade em relação às hidrazonas livres. Os complexos metálicos foram tanto quanto ou mais ativos contra as células tumorais OVCAR-8, HCT-116 e SF-295 do que as hidrazonas livres. Merecem destaque os complexos 79 e 12, que apresentaram inibição de crescimento celular de 72,2100%, na concentração de 5 g/mL. Os resultados demonstram portanto que em geral os compostos 114 são menos ativos do que a isoniazida contra M. tuberculosis, enquanto que a modificação química do fármaco, formando-se hidrazonas com posterior complexação cobre(II) e gálio(III) constituíram uma estratégia interessante na obtenção de compostos mais potentes contra células tumorais

Custo-efetividade da prova tuberculínica versus QuantiFERON-TB Gold-In-Tube no diagnóstico e tratamento da infecção latente tuberculosa em profissionais de saúde da Atenção Básica no Brasil.

Os profissionais da área da saúde formam um dos grupos mais vulneráveis à infecção pelo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Segundo estimativas da Organização Mundial de Saúde (OMS), 8,8 milhões de pessoas estavam infectadas pelo Mtb e ocorreram 1,4 milhão de óbitos por tuberculose (TB) em 2010. A identificação de pessoas com Infecção Latente Tuberculosa (ILTB) é considerada pela OMS como uma prioridade no controle da doença, especialmente em países em desenvolvimento em que a incidência da doença ativa tem apresentado redução. O objetivo do presente trabalho foi avaliar, no Brasil, o custo-efetividade dos testes Prova Tuberculínica (PT) e Quantiferon TB Gold-In-Tube (QTF-GIT) no diagnóstico e tratamento da ILTB em profissionais de saúde atuantes na atenção básica, sob a perspectiva do Sistema Único de Saúde (SUS), comparando cinco estratégias que incluem o QTF-GIT, distintos pontos de corte para a PT e uso sequencial dos dois testes; e analisar o impacto do tabagismo sobre o risco de ILTB entre os profissionais de saúde, destacando-se a categoria da Enfermagem. Foi realizada uma avaliação econômica completa do tipo custo-efetividade, conduzida considerando uma coorte hipotética de 10.000 profissionais de saúde atuantes na atenção básica, com horizonte temporal restrito a um ano. Um modelo analítico de decisão, caracterizado por uma árvore de probabilidades de eventos, foi desenvolvido utilizando o software TreeAge ProTM 2013 para simular os resultados clínicos e impactos econômicos em saúde da nova tecnologia diagnóstica (QTF-GIT) versus a PT tradicional. Esse modelo simulou cinco estratégias diagnósticas para detecção e tratamento da ILTB: (a) PT, usando ponto de corte de 5mm; (b) PT, usando ponto de corte de 10 mm; (c) teste QTF-GIT; (d) PT, com ponto de corte de 5mm, seguida de teste QTF-GIT quando PT positiva; (e) PT, com ponto de corte de 10mm, seguida de teste QTF-GIT quando PT positiva. Foi realizada análise de sensibilidade determinística univariada. Na determinação dos fatores associados à ILTB, foi elaborado um modelo de regressão logística múltipla com seleção hierarquizada, utilizando o software Stata. A estratégia mais custo-efetiva foi a PT no ponto de corte ≥10mm, considerando como medida de desfecho tanto o número de indivíduos corretamente classificados pelos testes assim como o número de casos de TB evitados. A utilização isolada do QTF-GIT revelou-se a estratégia de menor eficiência, com RCEI= R$ 343,24 por profissional corretamente classificado pelo teste. Encontrou-se risco à ILTB significantemente maior para sexo masculino [OR=1,89; IC 95%:1,11-3,20], idade ≥ 41 anos [OR=1,56; IC 95%: 1.09-2,22], contato próximo com familiar com TB [OR=1,55; IC 95%: 1.02-2,36], status do tabagismo fumante [OR=1,75; IC 95%: 1.03-2,98] e categoria profissional da Enfermagem [OR=1,44; IC 95%: 1.02-2,03]. Concluiu-se que a PT no ponto de corte de 10mm é a estratégia diagnóstica mais custo-efetiva para ILTB entre os profissionais de saúde na atenção básica e que a ILTB está associada ao hábito do tabagismo e à categoria profissional de Enfermagem.

Estudo in vitro de derivados sintéticos da Isoniazida e da Pirazinamida sobre Leishmania (Viannia) braziliensis

As leishmanioses são um grupo de doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania spp que afetam 98 países. No Brasil, no ano de 2013, foram relatados 3.253 casos de leishmaniose visceral e 18.226 casos de Leishmaniose Tegumentar Americana. O tratamento de primeira escolha continua sendo realizado com antimoniais pentavalentes, e em casos de insucessos os fármacos de segunda escolha são a pentamidina e a anfotericina B. Tais medicamentos causam intensos efeitos adversos e ultimamente têm surgido cepas resistentes aos mesmos. Em áreas endêmicas têm sido cada vez mais comum o surgimento da co-infecção Leishmania com Mycobacterium tuberculosis. O tratamento para a tuberculose com pirazinamida (PZA) e isoniazida (INZ), controla a leishmaniose. Esses dados sugerem atividade anti-leishmania da PZA e da INZ. O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade in vitro da INZ e da PZA e seus compostos derivados (série G e série R, respectivamente) sobre Leishmania (Viannia) braziliensis. As moléculas foram testadas em monocamadas de macrófagos peritoneais de camunongos infectados com L. (V) braziliensis durante 48h. Todas as moléculas testadas inibiram o índice de infecção de forma dose dependente em comparação aos controles. As moléculas da série R foram mais ativas do que a PZA, porém o resultado foi significativo somente para a R02 (p < 0,005). Apenas a molécula R05 (76,64M) foi relativamente tóxica para macrófagos. Os compostos mais ativos foram R02, G01 e G02, cujos índices de seletividade foram 14,31, 19 e 30, respectivamente. A dosagem de nitrito foi feita em sobrenadantes de monocamadas de macrófagos peritoniais infectados e tratados com as substâncias nas concentrações 10 e 100M. A G01 e a G02 estimularam a produção de NO2 nas duas concentrações, entretanto o resultado foi estatisticamente significativo para a G02 em 100M (p < 0,0001), a G05 só estimulou óxido nítrico na maior concentração. Todos os compostos da série R estimularam NO2, contudo, o resultado foi estatisticamente significativo para a R03 e R05 a 100M (p < 0,001). Adicionalmente, foi realizado uma análise preditiva in sílico de parâmetros farmacocinéticos das moléculas mais ativas in vitro, utilizando o software admetSAR. Os dados obtidos mostraram que de forma semelhante às suas moléculas originais a G01, G02 e R02 apresentaram alta capacidade de serem absorvidas pelo trato gastrointestinal, baixo potencial hepatotoxico e carcinogênico. Juntos, esses dados demonstram que essas moléculas são seletivamente tóxicas para o parasito com potencial para serem testadas pela via oral em estudos em modelo experimental de infecção.

Alterações da expressão da proteína PHEX na Hanseníase

A hanseníase é uma doença infecciosa causada pelo Mycobacteruim leprae, um bacilo intracelular obrigatório, que prolifera principalmente na pele e nos nervos periféricos no interior de células como macrófagos e células de Schwann. A transmissão ocorre por meio das mucosas das vias respiratórias, provavelmente por aerossóis expelidos por indivíduos infectados. O homem é o seu hospedeiro natural sendo a multiplicação do bacilo muito lenta, com um período de geração estimado de 14 dias. Apesar da mínima variação no genoma do M. leprae, a doença é caracterizada por um espectro de formas clínicas bem definido, decorrente da capacidade de resposta imune do hospedeiro. Em pacientes classificados como multibacilares (MB) a doença é disseminada, com inúmeras lesões de pele e proliferação bacilar considerável. Nesses indivíduos ocorre hiporresponsividade celular ao M. leprae. Nas formas paucibacilares (PB), os pacientes apresentam uma ou poucas lesões, a carga bacilar é pequena e, às vezes não observada por meio da baciloscopia tradicional e ocorre resposta imune patógeno-específica. As incapacidades físicas nos pacientes decorrem da neuropatia e osteopatia e podem ser irreversíveis. Essas deformidades podem avançar mesmo após a diminuição da carga bacilar com o final do tratamento poliquimioterápico. A presente tese teve por objetivo estudar as implicações da proteína PHEX nas alterações fisiopatológicas da hanseníase, em especial as alterações ósseas. A proteína PHEX (Phosphate-regulating gene with Homologies to Endopeptidase on the X chromosome) é expressa em várias células humanas e, no primeiro artigo que compõe essa tese, demonstramos que o M.leprae leva à diminuição da expressão de PHEX em linhagens de células de Schwann e osteoblastos humanos. Este efeito foi igualmente causado por outras espécies de micobactérias. No segundo manuscrito ora submetido, observamos que em leucócitos sanguíneos de pacientes hansenianos também ocorreu modulação negativa de PHEX. Este efeito não se relacionou com a capacidade de produção de citocinas inflamatórias frente ao M. leprae in vitro ou com alterações bioquímicas. O efeito inibidor da mineralização ocasionado pela modulação negativa de PHEX talvez contribua para a doença óssea da hanseníase, auxiliando a explicar a capacidade do M. leprae de penetrar e sobreviver no osso.

7 种蛇毒小肽对临床分离耐(多) 药结核分枝杆菌的体外活性研究

目的　检测7 种从蛇毒分离的小肽是否对临床分离的耐药性结核分枝杆菌菌株具有活性。方法　放射性方法检测蛇毒 小肽对结核分枝杆菌的最小抑制浓度,细菌存活计数确证放射性方法的结果。结果　7 种蛇毒小肽对耐药性结核分枝杆菌菌 株都有活性。其MIC 值分别为(μg·mL - 1) : Opiophagus hannah 5. 4 , Naja at ra 8. 6 , B ungarus f asciatus 6. 4 , Trimeresurus ste2 jnegri 12. 6 , Protobothrops mucrosquamatus 11. 8 , Protobothrops jerdonii 7 , A gksist rodon halys 4. 2 。结论　这些结果是首次报 道,为进一步设计和开发新来源的抗结核病新药提供了依据。

Oligonucleotide ligation assay-based DNA chip for multiplex detection of single nucleotide polymorphism

An oligonucleotide ligation assay-based DNA chip has been developed to detect single nucleotide polymorphism. Synthesized nonamers, complementary to the flanking sequences of the mutation sites in target DNA, were immobilized onto glass slides through disulfide bonds on their 5' terminus. Allele-specific pentamers annealed adjacent to the nonamers on the complementary target DNA, containing 5'-phosphate groups and biotin labeled 3'-ends, were mixed with the target DNA in tube. Ligation reactions between nonamers and pentamers were carried out on chips in the presence of T4 DNA ligase. Ligation products were directly visualized on chips through enzyme-linked assay. The effect of G:T mismatch at different positions of pentamers on the ligation were evaluated. The results showed that any mismatch between pentamer and the target DNA could lead to the decrease of ligation, which can be detected easily. The established approach was further used for multiplex detection of mutations in rpoB gene of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis clinical isolates. (C) 2003 Elsevier B.V. All rights reserved.

结核分枝杆菌尼克酰胺酶/吡嗪酰胺酶的研究

本研究通过一系列生物学手段系统阐述了结核分枝杆菌尼克酰胺酶/吡嗪酰胺酶（PncA酶）的生物化学特征，并鉴定了酶当中的关键氨基酸。结果表明体外表达的结核分枝杆菌PncA酶是一个分子量为22.4 KDa的单体酶，其最适pH值和温度分别为6.6 ~ 7.4和35 ~ 45 °C。电感耦合等离子原子发射光谱结果表明PncA酶是一种含有Mn2+和Fe2+的蛋白，二者的比率为1:1。通过运用高效液相色谱和耦联氨酶试验的方法对纯化的PncA酶进行了动力学分析，结果表明PncA酶拥有相同的吡嗪酰胺酶和尼克酰胺酶活性。通过定点突变得到了9个突变，圆二色谱数据证明突变并没有引起PncA酶的二级结构的改变。对这9个突变的酶活性和金属离子含量分析的结果表明，D8、K96和C138是PncA酶结合和催化底物的关键氨基酸残基，D49、H51、H57和H71是金属离子结合的关键氨基酸，而Y103和S104则有可能与底物的结合稳定有关。我们的结果也表明，尽管与Pyrococcus horikoshii PncA酶的序列同源性很高，但二者在对金属离子的结合方式上存在明显差异, 并有可能导致两者在催化机制上的差异, 值得进一步研究。 通过筛选抗吡嗪酰胺药物的临床分离结核分枝杆菌19株，并对其pncA基因序列进行测序分析。结果再一次表明结核分枝杆菌PncA酶的突变与吡嗪酰胺耐药性密切相关，检测的准确性为78.9 %，并发现了一个在16位的甘氨酸突变为丝氨酸的新突变。

结核分枝杆菌基因组学及特异检测技术研究

结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见。结核病至今仍为重要的传染病。估计世界人口中1/3感染结核分枝杆菌。据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。我国建国前死亡率达200-300人/10万，居各种疾病死亡原因之首，建国后，随着人民生活水平提高，卫生状态改善，特别是开展了群防群治，儿童普遍接种卡介苗，结核病的发病率和死亡率大为降低。由于耐药结核的出现已及HIV共感染等因素影响，目前发病率又有上升趋势。对于结核病的防治而言，其首要问题是结核病的诊断，而结核病的实验室检查已成为临床医生诊断结核病、判断疗效和评估预后不可缺少的手段。结核病的临床诊断主要根据病史、痰培养、涂片抗酸染色、胸片等结果，其中痰结核检查是诊断肺结核的重要依据之一，检测方法常规采用细菌学检查。痰中细菌学检查主要采用痰涂片和培养方法，涂片虽简单易行，但阳性率低，培养虽为金标准，但周期太长，均难以满足临床需要。细菌对部分患者可造成误诊或漏诊。近年来随着现代科学技术的不断进展，分子生物学技术在结核病诊断方面取得了显著的成绩，实时动态荧光定量(FQ—PCR)技术又是在原有的PCR技术上一次质的飞跃。 尽管许多文献已经报道了结核耐药的分子机理，但耐药的分子机理并没有充分了解。本研究利用全基因组鸟枪法测序和高通量测序技术，测定了两株结核分枝杆菌菌株TFJA和TFJB全基因组序列，分别为药物敏感株和耐多药株。在序列初步拼接后，获得了由189个DNA contigs（DNA序列连接群）组成的基因组框架图。借助10kb左右插入片段克隆的正反向末端序列信息以及PCR扩增技术，确定了全部DNA contigs在基因组上的物理位置，最后补上了所有“间隙(gap)” ，得到了全基因组序列。三种限制性酶切物理图谱证明了序列拼接的正确性。两株结核菌基因组大小为4.4Mbp左右，GC含量都在65.6%左右，其中TFJB株比TFJA株大7kbp，分别具有3591、3648个基因，83.7%的基因位于先导链上。我们比较了两株细菌的949SNPs位点，发现94个在TFJB中不同nsSNPs，这些SNPs位点的碱基在其它的结核分枝杆菌基因组中是相同的。我们去掉了那些代谢途径与毒力代谢无关的基因，最后选择了6个基因的18个SNP，检测这些SNP在277株耐药或者药物敏感结核分枝杆菌中的保守性以及其耐药相关性。用PCR扩增含有SNP的序列，用统计学检验这些SNP是否耐药相关，结果发现，TFJB0109_CDS04405基因的407位点SNP（g->a）和TFJB0109_CDS00149基因上的SNP（720a->c，722插入t，727t->g，729g->t，以及735g->t）可能与SM耐药相关，其P-value分别是0.04128、0.02160和0.01394（见表3）。 结核是一种慢性传染病，其病原体为TB。在全基因组序列分析研究的同时，我们筛选到一套灵敏度较高、特异性较好的REAL TIME-PCR检测引物，并用它对105份不同发病时间的病人标本进行了检测。初步结果表明，应用本方法，样本检出率为98%，这一结果比涂片及分离培养更灵敏。