Mutations within subdomain II of the extracellular region of epidermal growth factor receptor selectively alter TGF alpha binding

The interactions of epidermal growth factor (EGF) and transforming growth factor alpha (TGF alpha) with the epidermal growth factor receptor (EGFR) were examined by insertion mutagenesis of the receptor. Seventeen insertions were made throughout a construct containing only the extracellular domain. This truncated receptor (sEGFR) was secreted and had a dissociation constant similar to that of the full-length solubilized receptor. Receptors with insertions within subdomain III were not secreted. Two receptors with insertions at positions 291 and 474, which border subdomain III, have significantly decreased binding to both EGF and TGF alpha relative to wild type. This confirms previous work demonstrating that subdomain III forms the primary binding site for EGF and TGF alpha. Four of the mutants within subdomain II had a decreased binding to TGF alpha relative to wild type, but had wild type binding to EGF. These results suggest that a region within subdomain II may selectively regulate the binding of TGF alpha. Two receptors which contained insertions within subdomains II and IV, approximately equidistant from the center of subdomain III, bound twofold more ligand molecules than wild type receptor, with an affinity similar to that of wild type receptor. These findings suggest that insertion at these positions allows the access of more than one ligand molecule to the binding site.

Sex hormone binding globulin and insulin resistance

Sex hormone binding globulin (SHBG) is a glycoprotein composed of two 373-amino-acid subunits. The SHBG gene and a promotor region have been identified. The SHBG receptor has yet to be cloned but is known to act through a G-protein-linked second-messenger system following plasma membrane binding. The principal function of SHBG has traditionally been considered to be that of a transport protein for sex steroids, regulating circulating concentrations of free (unbound) hormones and their transport to target tissues. Recent research suggests that SHBG has functions in addition to the binding and transport of sex steroids. Observational studies have associated a low SHBG concentration with an increased incidence of type 2 diabetes mellitus (DM) independent of sex hormone levels in men and women. Genetic studies using Mendelian randomization analysis linking three single nucleotide polymorphisms of the SHBG gene to risk of developing type 2 DM suggest SHBG may have a role in the pathogenesis of type 2 DM. The correlation between SHBG and insulin resistance that is evident in a number of cross-sectional studies is in keeping with the suggestion that the association between SHBG and incidence of type 2 DM is explained by insulin resistance. Several potential mechanisms may account for this association, including the identification of dietary factors that influence SHBG gene transcription. Further research to characterize the SHBG-receptor and the SHBG second messenger system is required. An interventional study examining the effects on insulin resistance of altering SHBG concentrations may help in determining whether this association is causal.

Clathrin adaptor epsinR is required for retrograde sorting on early endosomal membranes

Retrograde transport links early/recycling endosomes to the trans-Golgi network (TGN), thereby connecting the endocytic and the biosynthetic/secretory pathways. To determine how internalized molecules are targeted to the retrograde route, we have interfered with the function of clathrin and that of two proteins that interact with it, AP1 and epsinR. We found that the glycosphingolipid binding bacterial Shiga toxin entered cells efficiently when clathrin expression was inhibited. However, retrograde transport of Shiga toxin to the TGN was strongly inhibited. This allowed us to show that for Shiga toxin, retrograde sorting on early/recycling endosomes depends on clathrin and epsinR, but not AP1. EpsinR was also involved in retrograde transport of two endogenous proteins, TGN38/46 and mannose 6-phosphate receptor. In conclusion, our work reveals the existence of clathrin-independent and -dependent transport steps in the retrograde route, and establishes a function for clathrin and epsinR at the endosome-TGN interface.

Immunocytochemical Localization of Substance P Receptors (NK-1 Receptors) in Human Gingival Tissue

Substance P (SP) is a member of the structurally related family of neuropeptides known as the tachykinins. In addition to neurotransmitter roles, the tachykinins are also known to modulate local inflammation which depends on signalling between the neuropeptide molecules and target cells and tissues. SP mediates its effects through a specific receptor, known as the substance P receptor or the neurokinin 1 (NK-1) receptor. The NK-1 receptor is a G-protein associated integral membrane protein and although it has been studied in a wide range of tissues, to date there has been no published data on the localisation of the NK-1 receptor in human gingival tissue. Objective: The aim of this study was to examine the distribution of the NK-1 receptor in human gingival tissue using immunocytochemistry. Method: Gingival tissue was obtained from patients undergoing periodontal surgery. Tissue was fixed in paraformaldehyde and embedded in wax for sectioning. Sections were dewaxed in xylene and then rehydrated in alcohols and phosphate buffered saline. Rehydrated sections were probed with rabbit polyclonal antibody to human NK-1 receptor which was subsequently detected using anti-rabbit horseradish peroxidase conjugate and diaminobenzidine as substrate. Results: Immunocytochemistry revealed that the NK-1 receptor was distributed along nerve fibres and blood vessel endothelial cells, suggesting these areas are main targets for the actions of SP via the NK-1 receptor. Conclusion: This is the first immunocytochemical report of NK-1 receptors in human gingival tissue and provides evidence for possible NK-1 mediated biological effects of SP in human gingival tissue from periodontitis patients.

Five gonadotrophin-releasing hormone receptors in a teleost fish: isolation, tissue distribution and phylogenetic relationships

Gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) is the main neurohormone controlling gonadotrophin release in all vertebrates, and in teleost fish also of growth hormone and possibly of other adenohypophyseal hormones. Over 20 GnRHs have been identified in vertebrates and protochoordates and shown to bind cognate G-protein couple receptors (GnRHR). We have searched the puffer fish, Fugu rubripes, genome sequencing database, identified five GnRHR genes and proceeded to isolate the corresponding complementary DNAs in European sea bass, Dicentrachus labrax. Phylogenetic analysis clusters the European sea bass, puffer fish and all other vertebrate receptors into two main lineages corresponding to the mammalian type I and II receptors. The fish receptors could be subdivided in two GnRHR1 (A and B) and three GnRHR2 (A, B and C) subtypes. Amino acid sequence identity within receptor subtypes varies between 70 and 90% but only 50–55% among the two main lineages in fish. All European sea bass receptor mRNAs are expressed in the anterior and mid brain, and all but one are expressed in the pituitary gland. There is differential expression of the receptors in peripheral tissues related to reproduction (gonads), chemical senses (eye and olfactory epithelium) and osmoregulation (kidney and gill). This is the first report showing five GnRH receptors in a vertebrate species and the gene expression patterns support the concept that GnRH and GnRHRs play highly diverse functional roles in the regulation of cellular functions, besides the ‘‘classical’’ role of pituitary function regulation.

Resting metabolic rate and protein turnover in apparently healthy elderly Gambian men.

Body composition, resting energy expenditure (REE), and whole body protein metabolism were studied in 26 young and 28 elderly Gambian men matched for body mass index during the dry season in a rural village in The Gambia. REE was measured by indirect calorimetry (hood system) in the fasting state and after five successive meals. Rates of whole body nitrogen flux, protein synthesis, and protein breakdown were determined in the fed state from the level of isotopic enrichment of urinary ammonia over a period of 12 h after a single oral dose of [15N]glycine. Expressed in absolute value, REE was significantly lower in the elderly compared with the young group (3.21 +/- 0.07 vs. 4.04 +/- 0.07 kJ/min, P < 0.001) and when adjusted to body weight (3.29 +/- 0.05 vs. 3.96 +/- 0.05 kJ/min, P < 0.0001) and fat-free mass (FFM; 3.38 +/- 0.01 vs. 3.87 +/- 0.01 kJ/min, P < 0.0001). The rate of protein synthesis averaged 207 +/- 13 g protein/day in the elderly and 230 +/- 13 g protein/day in the young group, whereas protein breakdown averaged 184 +/- 13 g protein/day in the elderly and 203 +/- 13 g protein/day in the young group (nonsignificant). When values were adjusted for body weight or FFM, they did not reveal any difference between the two groups. It is concluded that the reduced REE adjusted for body composition observed in elderly Gambian men is not explained by a decrease in protein turnover.

A-kinase anchoring protein-Lbc promotes pro-fibrotic signaling in cardiac fibroblasts

In response to stress or injury the heart undergoes an adverse remodeling process associated with cardiomyocyte hypertrophy and fibrosis. Transformation of cardiac fibroblasts to myofibroblasts is a crucial event initiating the fibrotic process. Cardiac myofibroblasts invade the myocardium and secrete excess amounts of extracellular matrix proteins, which cause myocardial stiffening, cardiac dysfunctions and progression to heart failure. While several studies indicate that the small GTPase RhoA can promote profibrotic responses, the exchange factors that modulate its activity in cardiac fibroblasts are yet to be identified. In the present study, we show that AKAP-Lbc, an A-kinase anchoring protein (AKAP) with an intrinsic Rho-specific guanine nucleotide exchange factor (GEF) activity, is critical for activating RhoA and transducing profibrotic signals downstream of type I angiotensin II receptors (AT1Rs) in cardiac fibroblasts. In particular, our results indicate that suppression of AKAP-Lbc expression by infecting adult rat ventricular fibroblasts with lentiviruses encoding AKAP-Lbc specific short hairpin (sh) RNAs strongly reduces the ability of angiotensin II to promote RhoA activation, differentiation of cardiac fibroblasts to myofibroblasts, collagen deposition as well as myofibroblast migration. Interestingly, AT1Rs promote AKAP-Lbc activation via a pathway that requires the α subunit of the heterotrimeric G protein G12. These findings identify AKAP-Lbc as a key Rho-guanine nucleotide exchange factor modulating profibrotic responses in cardiac fibroblasts.

Stoichiometry of Heteromeric BAFF and APRIL Cytokines Dictates Their Receptor Binding and Signaling Properties.

The closely related TNF family ligands B cell activation factor (BAFF) and a proliferation-inducing ligand (APRIL) serve in the generation and maintenance of mature B-lymphocytes. Both BAFF and APRIL assemble as homotrimers that bind and activate several receptors that they partially share. However, heteromers of BAFF and APRIL that occur in patients with autoimmune diseases are incompletely characterized. The N and C termini of adjacent BAFF or APRIL monomers are spatially close and can be linked to create single-chain homo- or hetero-ligands of defined stoichiometry. Similar to APRIL, heteromers consisting of one BAFF and two APRILs (BAA) bind to the receptors B cell maturation antigen (BCMA), transmembrane activator and CAML interactor (TACI) but not to the BAFF receptor (BAFFR). Heteromers consisting of one APRIL and two BAFF (ABB) bind to TACI and BCMA and weakly to BAFFR in accordance with the analysis of the receptor interaction sites in the crystallographic structure of ABB. Receptor binding correlated with activity in reporter cell line assays specific for BAFFR, TACI, or BCMA. Single-chain BAFF (BBB) and to a lesser extent single-chain ABB, but not APRIL or single-chain BAA, rescued BAFFR-dependent B cell maturation in BAFF-deficient mice. In conclusion, BAFF-APRIL heteromers of different stoichiometries have distinct receptor-binding properties and activities. Based on the observation that heteromers are less active than BAFF, we speculate that their physiological role might be to down-regulate BAFF activity.

Optimisation de la domiciliation des cellules CD34+ de sang de cordon ombilical: élucider les mécanismes en cause dépendant du CXCR4.

Le sang provenant d’un cordon ombilical (SCO) représente une bonne source de cellules souches hématopoïétiques (CSH) pour des transplantations. Cependant, le nombre de cellules souches contenues dans ce sang est souvent insuffisant pour greffer un adulte. Le mécanisme intervenant dans la domiciliation de ces cellules au sein de la moelle osseuse (MO) est encore mal compris. On sait que l’interaction entre la chimiokine SDF-1 et le récepteur CXCR4, présent sur les cellules CD34+ de SCO, mène à la migration de ces cellules en direction de la MO. Nous pensons que l’augmentation de la proportion de cellules qui réussit à se greffer pourra pallier au problème du nombre. Les produits de dégradation, C3a et le C3desarg,, issus du système du complément, sont connus pour favoriser la réponse de cellules exprimant CXCR4 vers SDF-1. Nous avons analysé l’effet du C3adesarg, molécule non anaphylatoxique, sur la migration cellulaire vers SDF-1, de même que sur la prise de greffe des cellules CD34+ issues de SCO suite à une transplantation sur des souris NOD/SCIDyC-. Nos expériences ont démontré que le C3a ainsi que le C3adesarg augmentaient tous les deux la réponse des cellules CD34+ vers SDF-1. Toutefois, nous n’avons pas pu démontrer que ces molécules liaient directement le récepteur CXCR4. Par contre, le composé C3adesarg favorise la prise de greffe des cellules CD34+ de SCO. Il serait donc un bon candidat pour poursuivre une optimisation de ses propriétés. Nous avons également constaté que suite à une transplantation chez la souris, les cellules CD34+ de SCO subissent une hausse d’expression transitoire de leur CXCR4 environ quatre jours après la greffe. Cette hausse d’expression coïncide avec la multiplication des cellules CD34+ dans la MO. Nous avons également confirmé qu’une cellule CD34+ avec une forte expression de CXCR4 était dans un état prolifératif. Nos données suggèrent que l’interaction directe avec les cellules stromales soit responsable de cette hausse d’expression de CXCR4.

Rôle du dimère Gbetagamma dans l’organisation des systèmes de signalisation cellulaire

Selon le modèle classique, le signal reçu par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) se propage suite à des interactions transitoires et aléatoires entre les RCPGs, les protéines G et leurs effecteurs. Par les techniques de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), de complémentation bimoléculaire de protéines fluorescentes (BiFC) et de co-immunoprécipitation, nous avons observé que les récepteurs, les protéines G et les effecteurs forment un complexe stable, avant et après l’activation des récepteurs. L’interaction entre l’effecteur Kir3 et le dimère Gbetagamma se produit initialement au réticulum endoplasmique et est sensible à un agoniste liposoluble des récepteurs beta2-adrénergiques. Bien que peu de spécificité pour les nombreux isoformes des sous-unités Gbetagamma ait été observée pour l’activation du canal Kir3, les interactions précoces au RE sont plus sensibles aux différentes combinaisons de Gbetagamma présentes. En plus de son rôle dans la régulation des effecteurs, le dimère Gbetagamma peut interagir avec de nombreuses protéines possédant des localisations cellulaires autres que la membrane plasmique. Nous avons identifié une nouvelle classe de protéines interagissant avec la sous-unité Gbeta, autant en système de surexpression que dans des extraits de cerveaux de rats, soit les protéines FosB et cFos, qui forment le complexe de transcription AP-1, suite à leur dimérisation avec les protéines de la famille des Jun. La coexpression du dimère Gbetagamma réduit l’activité transcriptionnelle du complexe AP-1 induit par le phorbol 12-,myristate 13-acetate (PMA), sans toutefois interférer avec la formation du complexe Fos/Jun ou son interaction avec l’ADN. Toutefois, le dimère Gbetagamma colocalise au noyau avec le complexe AP-1 et recrute les protéines histones déacétylases (HDAC) afin d’inhiber l’activité transcriptionnelle du complexe AP-1.

Couplage du récepteur à sept domaines transmembranaires GABA-B1 aux voies intracellulaires de signalisation en absence de GABA-B2

Le GABA est le principal neurotransmetteur inhibiteur du SNC et est impliqué dans le développement du cerveau, la plasticité synaptique et la pathogénèse de maladies telles que l’épilepsie, les troubles de l’anxiété et la douleur chronique. Le modèle actuel de fonctionnement du récepteur GABA-B implique l’hétérodimérisation GABA-B1/B2, laquelle est requise au ciblage à la surface membranaire et au couplage des effecteurs. Il y est cependant des régions du cerveau, des types cellulaires et des périodes du développement cérébral où la sous-unité GABA-B1 est exprimée en plus grande quantité que GABA-B2, ce qui suggère qu’elle puisse être fonctionnelle seule ou en association avec des partenaires inconnus, à la surface cellulaire ou sur la membrane réticulaire. Dans le cadre de cette thèse, nous montrons la capacité des récepteurs GABA-B1 endogènes à activer la voie MAPK-ERK1/2 dans la lignée dérivée de la glie DI-TNC1, qui n’exprime pas GABA-B2. Les mécanismes qui sous-tendent ce couplage demeurent mal définis mais dépendent de Gi/o et PKC. L’immunohistochimie de récepteurs endogènes montre par ailleurs que des anticorps GABA-B1 dirigés contre la partie N-terminale reconnaissent des protéines localisées au RE tandis des anticorps C-terminaux (CT) marquent une protéine intranucléaire. Ces données suggèrent que le domaine CT de GABA-B1 pourrait être relâché par protéolyse. L’intensité des fragments potentiels est affectée par le traitement agoniste tant en immunohistochimie qu’en immunobuvardage de type western. Nous avons ensuite examiné la régulation du clivage par le protéasome en traitant les cellules avec l’inhibiteur epoxomicine pendant 12 h. Cela a résulté en l’augmentation du marquage intranucléaire de GABA-B1-CT et d’un interacteur connu, le facteur de transcription pro-survie ATF-4. Dans des cellules surexprimant GABA-B1-CT, l’induction et la translocation nucléaire d’ATF-4, qui suit le traitement epoxomicine, a complètement été abolie. Cette observation est associée à une forte diminution du décompte cellulaire. Étant donné que les trois derniers résidus de GABA-B1-CT (LYK) codent un ligand pseudo-PDZ et que les protéines à domaines PDZ sont impliquées dans la régulation du ciblage nucléaire et de la stabilité de protéines, en complément de leur rôle d’échaffaud à la surface cellulaire, nous avons muté les trois derniers résidus de GABA-B1-CT en alanines. Cette mutation a complètement annulé les effets de GABA-B1-CT sur l’induction d’ATF-4 et le décompte cellulaire. Cette deuxième série d’expériences suggère l’existence possible de fragments GABA-B1 intranucléaires régulés par le traitement agoniste et le protéasome dans les cellules DI-TNC1. Cette régulation d’ATF-4 dépend des résidus LYK de GABA-B1-CT, qui modulent la stabilité de GABA-B1-CT et favorisent peut-être la formation d’un complexe multiprotéique incluant GABA-B1-CT, ATF-4, de même qu’une protéine d’échaffaudage inconnue. En somme, nous démontrons que les sous-unités GABA-B1 localisées au RE, lorsque non-hétérodimérisées avec GABA-B2, demeurent capables de moduler les voies de signalisation de la prolifération, la différentiation et de la survie cellulaire, via le couplage de protéines G et possiblement la protéolyse régulée. Les mécanismes de signalisation proposés pourraient servir de nouvelle plate-forme dans la compréhension des actions retardées résultant de l’activation des récepteurs 7-TMs.

Étude de la relation entre les conformations et la signalisation des 7TMRs

L’interaction d’un ligand avec un récepteur à sept domaines transmembranaires (7TMR) couplé aux protéines G, mène à l’adoption de différentes conformations par le récepteur. Ces diverses conformations pourraient expliquer l’activation différentielle des voies de signalisation. Or, le lien entre la conformation et l’activité du récepteur n’est pas tout à fait claire. Selon les modèles classiques pharmacologiques, comme le modèle du complexe ternaire, il n’existe qu’un nombre limité de conformations qu’un récepteur peut adopter. Afin d’établir un lien entre la structure et la fonction des récepteurs, nous avons choisi dans un premier temps, le récepteur de chimiokine CXCR4 comme récepteur modèle. Ce dernier, est une cible thérapeutique prometteuse, impliqué dans l’entrée du VIH-1 dans les cellules cibles et dans la dissémination de métastases cancéreuses. Grâce au transfert d’énergie par résonance de bioluminescence (BRET) nous pouvons détecter les changements conformationnels des homodimères constitutifs de CXCR4 dans les cellules vivantes. En conséquence, nous avons mesuré les conformations de mutants de CXCR4 dont les mutations affecteraient sa fonction. Nous montrons que la capacité des mutants à activer la protéine Galphai est altérée suite au traitement avec l’agoniste SDF-1. Notamment, ces mutations altèrent la conformation du récepteur à l’état basal ainsi que la réponse conformationnelle induite suite au traitement avec l’agoniste SDF-1, l’agoniste partiel AMD3100 ou l’agoniste inverse TC14012. Ainsi, différentes conformations de CXCR4 peuvent donner lieu à une activation similaire de la protéine G, ce qui implique une flexibilité des récepteurs actifs qui ne peut pas être expliquée par le modèle du complexe ternaire (Berchiche et al. 2007). Également, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CCR2, exprimé à la surface des cellules immunitaires. Il joue un rôle important dans l’inflammation et dans des pathologies inflammatoires telles que l’asthme. CCR2 forme des homodimères constitutifs et possède différents ligands naturels dont la redondance fonctionnelle a été suggérée. Nous avons étudié le lien entre les conformations et les activations d’effecteurs (fonctions) de CCR2. Notre hypothèse est que les différents ligands naturels induisent différentes conformations du récepteur menant à différentes fonctions. Nous montrons que les réponses de CCR2 aux différents ligands ne sont pas redondantes au niveau pharmacologique et que les chimiokines CCL8, CCL7 et CCL13 (MCP-2 à MCP-4) sont des agonistes partiels de CCR2, du moins dans les systèmes que nous avons étudiés. Ainsi, l’absence de redondance fonctionnelle parmi les chimiokines liant le même récepteur, ne résulterait pas de mécanismes complexes de régulation in vivo, mais ferait partie de leurs propriétés pharmacologiques intrinsèques (Berchiche et al. 2011). Enfin, nous nous sommes intéressés au récepteur de chimiokine CXCR7. Récemment identifié, CXCR7 est le deuxième récepteur cible de la chimiokine SDF-1. Cette chimiokine a été considérée comme étant capable d’interagir uniquement avec le récepteur CXCR4. Notamment, CXCR4 et CXCR7 possèdent un patron d’expression semblable dans les tissus. Nous avons évalué l’effet de l’AMD3100, ligand synthétique de CXCR4, sur la conformation et la signalisation de CXCR7. Nos résultats montrent qu’AMD3100, tout comme SDF-1, lie CXCR7 et augmente la liaison de SDF-1 à CXCR7. Grâce au BRET, nous montrons aussi qu’AMD3100 seul est un agoniste de CXCR7 et qu’il est un modulateur allostérique positif de la liaison de SDF-1 à CXCR7. Aussi, nous montrons pour la première fois le recrutement de la beta-arrestine 2 à CXCR7 en réponse à un agoniste. L’AMD3100 est un ligand de CXCR4 et de CXCR7 avec des effets opposés, ce qui appelle à la prudence lors de l’utilisation de cette molécule pour l’étude des voies de signalisation impliquant SDF-1 (Kalatskaya et al. 2009). En conclusion, nos travaux amènent des évidences qu’il existe plusieurs conformations actives des récepteurs et appuient les modèles de structure-activité des récepteurs qui prennent en considération leur flexibilité conformationnelle.

Profilage Moléculaire de la Scoliose Idiopathique de l’Adolescent

La scoliose idiopathique de l’adolescent (SIA) est la déformation la plus fréquente en orthopédie pédiatrique. C'est une maladie qui génère des déformations complexes du rachis, du thorax et du bassin affectant plus sévèrement et majoritairement les filles à la puberté. Malgré de nombreuses années de recherches approfondies dans le domaine de la SIA, la cause n'a toujours pas été résolue. OBJECTIFS : Il a été démontré qu’il existe une dysfonction de la signalisation de la mélatonine par les protéines G inhibitrices (Gi) dans les ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA. Ceci a conduit à une stratification des patients en trois groupes fonctionnels. Le but de ce projet de maîtrise est d’établir les profils d’expression moléculaire correspondant à chacun des groupes fonctionnels. Les objectifs spécifiques sont d’identifier les gènes responsables de l’initiation de la SIA et du défaut différentiel observé dans la signalisation des récepteurs couplés aux protéines Gi. MÉTHODES : Des ARNs ont été préparés à partir d’ostéoblastes isolés de patients atteints de SIA sélectionnés pour chaque groupe fonctionnel et comparés aux ARNs obtenus d’ostéoblastes de sujets sains. En plus, des cellules sanguines (PBMCs) isolées d’une paire de jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose ont été étudiées pour comparer leur profil d’expression génétique. Nous avons utilisé des biopuces à ADN contenant un ensemble de 54,000 sondes permettant l’analyse du niveau d’expression de plus de 47,000 transcrits représentant 30,000 gènes humains bien caractérisés (Affymetrix, GeneChip® Human gene 1.0 ST array). Les gènes retenus ont par la suite été validés par qPCR sur un plus grand nombre de patients afin de tester la spécificité des profils d’expression pour chaque groupe de patients à partir des cellules osseuses dérivées lors de la chirurgie. RÉSULTATS: Le profilage moléculaire proposé permettra d’établir les fondements moléculaires de la SIA selon le test fonctionnel développé par le Dr Moreau et son équipe et d’identifier de nouveaux gènes associés à la SIA. Ce projet a permis de mettre en évidence des gènes possiblement impliqués dans le défaut de signalisation associé aux protéines Gi communs aux trois groupes, ainsi que des gènes spécifiques à certains groupes, pouvant contribuer au développement de certaines co-morbidités et/ou au risque d’aggravation des déformations rachidiennes. L’étude préliminaire des jumelles monozygotes discordantes pour la scoliose a mis en évidence un nombre limité de gènes possiblement associés au défaut de signalisation observé chez la jumelle scoliotique, gènes dont l’expression pourrait être influencée par des modifications d’ordre épigénétique liées à l’environnement. CONCLUSION: Les données obtenues par des approches de transcriptomiques dans le cadre de ce projet soutiennent notre méthode de stratification fonctionnelle des patients SIA et ont conduit à l’identification de nouveaux gènes associés à la SIA. Ces résultats jettent un éclairage nouveau sur la SIA et contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes et facteurs impliqués dans l’étiologie de la SIA. À cet égard, nos résultats permettront éventuellement d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles et des traitements personnalisés compte tenu des profils moléculaires distincts observés pour chaque groupe de patients.

Electrophysiological analysis of the olfactory signal transduction cascade in the hawkmoth Manduca sexta

Neben der Verbreitung von gefährlichen Krankheiten sind Insekten für enorme agrarwirtschaftliche Schäden verantwortlich. Ein Großteil der Verhaltensweisen bei Insekten wird über den Geruchssinn gesteuert, der somit einen möglichen Angriffspunkt zur Bekämpfung von Schadinsekten darstellt. Hierzu ist es allerdings nötig, die Mechanismen der olfaktorischen Signalübertragung im Detail zu verstehen. Neben den duftstoffbindenden olfaktorischen Rezeptoren spielt hier auch ein konservierter Korezeptor (Orco) eine entscheidende Rolle. Inwieweit bei diesen Proteinen ionotrope bzw. metabotrope Prozesse involviert sind ist bislang nicht vollständig aufgeklärt. Um weitere Einzelheiten aufzuklären wurden daher Einzelsensillenableitungen am Tabakschwärmer Manduca sexta durchgeführt. Orco-Agonisten und Antagonisten wurden eingesetzt, um die Funktion des Korezeptors besser zu verstehen. Bei dem Einsatz des Orco-Agonisten VUAA1 konnte keine Verstärkung der Pheromonantworten bzw. eine Sensitivierung beobachtet werden, wie im Falle einer ionotropen Signalweiterleitung zu erwarten gewesen wäre. Ein ionotroper Signalweg über den OR/Orco-Komplex in M. sexta ist daher unwahrscheinlich. Der Orco-Antagonist OLC15 beeinflusste die gleichen Parameter wie VUAA1 und konnte die von VUAA1 generierte Spontanaktivität blocken. Daher ist es wahrscheinlich, dass dieser einen spezifischen Orco-Blocker darstellt. Sowohl VUAA1 als auch OLC15 hatten großen Effekt auf die langanhaltende Pheromonantwort, welches die Vermutung nahelegt, dass Orco modulierend auf die Sensitivität der Nervenzelle einwirkt. Von OLC15 abweichende Effekte durch die getesteten Amiloride HMA und MIA auf die Pheromonantwort lassen nicht auf eine spezifische Wirkung dieser Agenzien auf Orco schließen und zusätzliche Wirkorte sind anzunehmen. Um die These eines metabotropen Signalwegs zu überprüfen wurde ebenfalls der G-Protein-Blocker GDP-β-S eingesetzt. Alle Parameter der Pheromonantwort die innerhalb der ersten Millisekunden analysiert wurden wiesen eine Reduktion der Sensitivität auf. Im Gegensatz dazu hatte GDP-β-S keinen Effekt auf die langanhaltende Pheromonantwort. Somit scheint ausschließlich die schnelle Pheromonantwort über einen Ligand-bindenden G-Protein-gesteuerten Rezeptor gesteuert zu werden.

Convergencia de vías de señalización en un modelo de apoptosis

La sepsis es un evento inflamatorio generalizado del organismo inducido por un daño causado generalmente por un agente infeccioso. El patógeno más frecuentemente asociado con esta entidad es el Staphylococcus aureus, responsable de la inducción de apoptosis en células endoteliales debida a la producción de ceramida. Se ha descrito el efecto protector de la proteína C activada (PCA) en sepsis y su relación con la disminución de la apoptosis de las células endoteliales. En este trabajo se analizó la activación de las quinasas AKT, ASK1, SAPK/JNK y p38 en un modelo de apoptosis endotelial usando las técnicas de Western Blotting y ELISA. Las células endoteliales (EA.hy926), se trataron con C2-ceramida (130μM) en presencia de inhibidores químicos de cada una de estas quinasas y PCA. La supervivencia de las células en presencia de inhibidores químicos y PCA fue evaluada por medio de ensayos de activación de las caspasas 3, 7 y 9, que verificaban la muerte celular por apoptosis. Los resultados evidencian que la ceramida reduce la activación de AKT y aumenta la activación de las quinasas ASK, SAPK/JNK y p38, en tanto que PCA ejerce el efecto contrario. Adicionalmente se encontró que la tiorredoxina incrementa la activación/fosforilación de AKT, mientras que la quinasa p38 induce la defosforilación de AKT.