In planta proteomics and proteogenomics of the biotrophic barley fungal pathogen blumeria graminis f. sp hordei

To further our understanding of powdery mildew biology during infection, we undertook a systematic shotgun proteomics analysis of the obligate biotroph Blumeria graminis f. sp. hordei at different stages of development in the host. Moreover we used a proteogenomics approach to feed information into the annotation of the newly sequenced genome. We analyzed and compared the proteomes from three stages of development representing different functions during the plant-dependent vegetative life cycle of this fungus. We identified 441 proteins in ungerminated spores, 775 proteins in epiphytic sporulating hyphae, and 47 proteins from haustoria inside barley leaf epidermal cells and used the data to aid annotation of the B. graminis f. sp. hordei genome. We also compared the differences in the protein complement of these key stages. Although confirming some of the previously reported findings and models derived from the analysis of transcriptome dynamics, our results also suggest that the intracellular haustoria are subject to stress possibly as a result of the plant defense strategy, including the production of reactive oxygen species. In addition, a number of small haustorial proteins with a predicted N-terminal signal peptide for secretion were identified in infected tissues: these represent candidate effector proteins that may play a role in controlling host metabolism and immunity. Molecular & Cellular Proteomics 8: 2368-2381, 2009.

In planta proteomics and proteogenomics of the biotrophic barley fungal pathogen blumeria f.sp. hordei

Whilst there is increasing evidence tht the outcome of the interation between a pathogen and a host is dependent on protein-protein interactions, very little information is available on in planta proteomics of biotrophic plant pathogens. Here a proteogenomic approach has been employed to supplement the annotation of the recently sequenced genome and to cast light on the biology of the infection process of the economically important barley powdery mildew pathogen, Blumeria graminis f.sp hordei

In planta conditions induce genomic changes in Pseudomonas syringae pv. phaseolicola

The co-evolution of bacterial plant pathogens and their hosts is a complex and dynamic process. Plant resistance can impose stress on invading pathogens that can lead to, and select for, beneficial changes in the bacterial genome. The Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Pph) genomic island PPHGI-1 carries an effector gene, avrPphB (hopAR1), which triggers the hypersensitive reaction in bean plants carrying the R3 resistance gene. Interaction between avrPphB and R3 generates an antimicrobial environment within the plant, resulting in the excision of PPHGI-1 and its loss from the genome. The loss of PPHGI-1 leads to the generation of a Pph strain able to cause disease in the plant. In this study, we observed that lower bacterial densities inoculated into resistant bean (Phaseolus vulgaris) plants resulted in quicker PPHGI-1 loss from the population, and that loss of the island was strongly influenced by the type of plant resistance encountered by the bacteria. In addition, we found that a number of changes occurred in the bacterial genome during growth in the plant, whether or not PPHGI-1 was lost. We also present evidence that the circular PPHGI-1 episome is able to replicate autonomously when excised from the genome. These results shed more light onto the plasticity of the bacterial genome as it is influenced by in planta conditions.

Avaliação das quimiocinas e da expressão de seus receptores em células mononucleares de pacientes portadores da doença de Chagas submetidas à infecção in vitro com Trypanosoma cruzi e tratamento com benzonidazol

Atualmente o Brasil apresenta 3 milhões de indivíduos portadores da cardiomiopatia chagásica. Porém, tratamento etiológico com o fármaco Benzonidazol (BZ) na fase crônica da doença ainda não está elucidado. Acredita-se que a recomendação do BZ nessa fase, pode prevenir ou retardar a evolução clínica da cardiomiopatia na Doença Chagas (DC). Assim o objetivo do estudo é avaliar a produção de quimiocinas e expressão de seus receptores em Células mononucleares do sangue periférico - PBMC (de portadores crônicos da doença de Chagas) submetidas in vitro ao tratamento com BZ, após a infecção com T.cruzi. Foram selecionados 11 pacientes na fase crônica da doença. Amostras de sangue desses pacientes foram coletadas para obtenção de PBMC, em que foram cultivadas em placas de cultivo na concentração de 106 células/ml por poço. Após a adesão das células aderentes (principalmente macrófagos), as células não aderentes (principalmente linfócitos) foram removidas e as formas tripomastigotas foram adicionadas ao cultivo para infecção das células aderentes. Subsequente a incubação, as células não aderentes foram adicionadas novamente ao cultivo juntamente com o fármaco Bz (1µg/mL), ficando um co-cultivo de células aderentes infectadas com T.cruzi, células não aderentes e o BZ (C+T+BZ). As placas de cultura foram incubadas por períodos de 24h e 5 dias. Para uma análise fidedigna da ação do BZ nas células aderentes e não aderentes foi necessário a criação dos controles: células (C), células e tripomastigotas (C+T) e células e o BZ (C+BZ). Após o cultivo, foram coletados os sobrenadantes das culturas, para avaliação da produção de quimiocinas (CCL2, CXL9, CXL10, CCL5 e CXCL8) por CBA (Cytometric Bead Array). Posteriormente foi realizada a imunofenotipagem, avaliando a expressão dos receptores CCR3, CCR4, CXCR3, CXCR5, CCR1, CXCR4, CXCR2 e CCR5, em linfócitos T CD3+ e monócitos CD14+. Os resultados obtidos na avaliação dos linfócitos mostraram que o receptor CXCR5 esteve aumentado na condição C+T+BZ; e os receptores CCR4 e CCR1 estavam diminuídos nessa mesma condição. Nos monócitos observamos uma diminuição de CCR4 e um aumento do CCR5 nas mesmas condições. Com relação a dosagem de quimiocinas no sobrenadante, foi evidenciado que CCL2 e CXCL8 apresentaram uma diminuição na condição C+T+BZ. Assim podemos concluir que devido ao caráter inflamatório modulado, que o BZ conduziu, podemos afirmar que o fármaco demonstrou benefícios relevantes na expressão de receptores e na produção de quimiocinas

Dengue: desenvolvimento de ferramentas moleculares e caracterização de cepas virais quanto a inibição da sinalização do Interferon do tipo I (IFN-I)

A infecção pelo vírus da dengue é um problema de saúde pública global que põe em risco cerca de 2,5 bilhões de pessoas no mundo, com uma incidência de 50-100 milhões de casos resultando em cerca de 24.000 mortes por ano. Os mecanismos envolvidos na resposta imune inata atuam imediatamente após o contato do hospedeiro com os antígenos virais, levando à secreção de interferon do tipo I (IFN-I), a principal citocina envolvida na resposta antiviral. Entender como o sistema IFN-I é inibido em células infectadas pelo vírus dengue pode fornecer valiosas informações sobre a patogênese da doença. Propomos neste estudo analisar a inibição da via de sinalização do IFN-I por diferentes cepas isoladas no estado de Pernambuco, assim como o desenvolvimento de um vírus recombinante da dengue expressando a proteína Gaussia luciferase, para estudos futuros de replicação e imunopatogênese. A fim de estudar a via de sinalização do IFN-I, foram selecionadas cepas dos quatro sorotipos de dengue para crescimento, concentração e titulação viral. Foi utilizada a linhagem celular BHK-21-ISRE-Luc-Hygro que expressa o gene firefly luciferase fusionado a um promotor induzido pelo IFN-I (ISRE - Interferon Stimulated Response Element). Observamos que todos os sorotipos em estudo foram capazes de inibir, em diferentes proporções, a resposta ou sinalização do IFN-I. Com o intuito de auxiliar as pesquisas em dengue, desenvolvemos um vírus repórter de dengue expressando o gene repórter da Gaussia luciferase. Células transfectadas com o transcrito in vitro de um dos clones resultou em imunofluorescência positiva, porém não houve recuperação de partículas infectivas. Outros clones deverão ser testados para recuperação de vírus recombinante repórter. Juntos, os dados da caracterização das cepas em estudo e a recuperação de partículas infectivas da construção realizada neste trabalho deverão contribuir para as pesquisas em imunopatogênese, replicação viral e desenvolvimento de antivirais contra o dengue

Caracterização da resposta imunológica de Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus à infecção pelo sorotipo 1 do Dengue vírus

Os insetos podem atuar como pragas agrícolas e vetores de patógenos causadores de doenças ao homem e outros animais. Investigações a respeito do sistema imunológico de Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus poderão contribuir para o desenvolvimento de métodos de controle das doenças veiculadas por estes insetos, principalmente a dengue, enfermidade causadora de sério problema de saúde pública no mundo. Apesar de Ae. aegypti ser a única espécie vetora confirmada na transmissão do vírus Dengue no Brasil, considera-se também importante um melhor entendimento dos mecanismos imunológicos de Cx. quinquefasciatus tido como refratário ao vírus. Neste estudo foram utilizadas linhagens de Ae. aegypti e Cx. quinquefasciatus mantidas no Insetário do Departamento de Entomologia do CPqAM/FIOCRUZ. Três grupos experimentais de fêmeas com 10 dias de idade foram formados para cada espécie. Grupo I, composto por fêmeas alimentadas com solução sacarose (10 por cento); grupo II, fêmeas alimentadas com sangue limpo e grupo III, fêmeas alimentadas com sangue infectado com o sorotipo DENV-1. De cada grupo foram obtidos hemolinfa, glândula salivar, intestino médio e corpo gorduroso para avaliação da expressão dos antimicrobianos defensina e transferrina. Essa avaliação foi realizada através de PCR em Tempo Real utilizando o kit QuantiFast SYBR Green - One-Step qRT-PCR. A avaliação da hemodinâmica foi realizada utilizando 10 microlitros de hemolinfa de cada grupo, através da contagem das células em câmara de Neubauer. Nossos resultados demonstraram que o Cx. quinquefasciatus tem um maior aumento da expressão de defensina e um maior número total de hemócitos quando infectados com DENV-1 em relação ao Ae. aegypti e a transferrina teve sua expressão alterada somente no Ae. aegypti. Em ambas as espécies estudadas, apenas a alimentação sanguínea não interfere na produção de hemócitos ou quanto na indução de defensina e transferrina. Esses dados sugerem que fêmeas de Cx. quinquefasciatus parecem apresentar uma resposta imune celular e humoral mais intensa do que Ae. aegypti quando infectados com DENV-1

Avaliação do efeito do benzonidazol sobre linfócitos, de portadores crônicos da doença de Chagas, submetidos experimentalmente à exposição ao Trypanosoma cruzi

O único medicamento disponível para o tratamento da doença de Chagas (DC) no Brasil é o benzonidazol (Bz). O beneficio da medicação aos portadores crônicos da doença ainda demonstra controvérsias, mas seu uso nessa fase pode ter a finalidade de prevenir/retardar a evolução da DC para formas mais graves. Os fenômenos imunológicos que ocorrem após a terapia com o Bz ainda não estão elucidados. Assim, este estudo propôs avaliar o efeito do Bz sobre o perfil imunológico de linfócitos T e a produção de citocinas por células da resposta imune expostas in vitro ao T. cruzi. Amostras de sangue de portadores crônicos da DC foram coletadas para obtenção de células mononucleares de sangue periférico com posterior infecção com tripomastigotas de T. cruzi, seguida de adição do Bz às culturas. Após o tempo de cultivo, os sobrenadantes foram estocados para posterior análise das citocinas IFN-gama, TNF, IL-10, IL-6, IL-4 e IL-2 por CBA e as células foram avaliadas por citometria de fluxo, quanto à expressão das moléculas CD28+ e CTLA-4+ e a produção de citocinas (IL-10 e IFN-gama) em linfócitos T CD4+ e CD8+. Nossos resultados mostraram que o tratamento com o Bz aumentou a expressão da molécula CTLA-4+ em linfócitos T CD8+, indicando que o Bz pode induzir uma modulação da resposta imune e, consequentemente, diminuir a ativação exacerbada dessas células. Além disso, verificamos uma diminuição da produção da citocina IL-10 por linfócitos T CD4+ na presença do Bz. Com relação à produção global de citocinas por células aderentes e não aderentes, observamos que o Bz causou uma diminuição da citocina pró-inflamatória TNF e da citocina anti-inflamatória IL-10, enquanto que as outras citocinas (IFN-gama, IL-6, IL4 e IL-2) permaneceram com níveis elevados de produção na presença desse fármaco. Nossos resultados sugerem que o Bz induz uma regulação da ativação de linfócitos T CD8+ e a produção de citocinas do perfil Th1 modulado por citocinas do perfil Th2, em células de portadores crônicos da DC. Assim, acreditamos que a administração do Bz aos portadores de formas clínicas brandas da DC pode ser benéfica a esses pacientes, visto que o Bz não promoveu um perfil inflamatório exacerbado

Condições orais em Minas Gerais: estudo da Carga Global de Doença e o papel dos serviços de saúde

Introdução: Os agravos orais são um problema de saúde pública devido à suaprevalência na população e as complicações físicas e psicológicas advindas de suas ocorrências. Objetivou-se estimar a carga de doença para as condições orais em Minas Gerais, no período 2004 - 2006, e identificar fatores contextuais e de serviços de saúdeassociados. Métodos: Estudo da Carga de Doença para cárie, edentulismo e doençaperiodontal, por sexo e faixa etária. O indicador usado foi o DALY, que medesimultaneamente o impacto da mortalidade e dos problemas de saúde que afetam a qualidade de vida. A Carga de Doença para condições orais foi analisada em números absolutos e taxas / 1.000 habitantes. Os procedimentos ambulatoriais odontológicos foram organizados em série histórica e examinados por meio de análise descritiva. A associação de fatores contextuais com agravos orais foi analisada com modelagem hierárquica. Resultados: Estimou-se 45.514 YLD para agravos orais, com taxa de 2,4/1.000 habitantes. Estimou-se 18.142 YLD para homens e 27.372 YLD para mulheres (1,9/1.000 e 2,8/1.000, respectivamente). O número de YLD para cárie foi de 8.332, com taxas de 0,4/1.000 para ambos os sexos. Estimou-se 33.888 YLD para edentulismo, com taxa de 2,2/1.000 nas mulheres. Na doença periodontal estimou-se 3.217 YLD, resultando em uma taxa de 0,2/1.000 para ambos os sexos. Observou-se aumento da oferta de alguns procedimentos odontológicos ambulatoriais nas Macrorregionais de Saúde menos favorecidas economicamente. As característicassocioeconômicas associaram-se à incidência de cárie dentária e à prevalência de edentulismo.

Estudo da influência dos alelos do HLA classe I e II e do polimorfismo dos genes de citocinas na infecção pelo HTLV-1

INTRODUÇÃO: O vírus linfotrópico para células T humanas (HTLV-1) é o principal agente causador da Paraparesia Espástica Tropical / Mielopatia associada ao HTLV-1 (PET/MAH) e da Leucemia da célula T do Adulto (LTA). A maioria dos indivíduos infectados permanece assintomática, somente 2 a 5% irão desenvolver uma das duas doenças. Fatores da interação HTLV-1/ hospedeiro estão envolvidos no risco de desenvolver doença. A lesão neurológica na PET/MAH parece ser consequência de uma reação inflamatória, desencadeada pelo reconhecimento de células infectadas por linfócitos T citotóxicos, com consequente liberação de citocinas e lesão medular. OBJETIVO: Identificar marcadores genéticos, que possam ajudar no prognóstico e tratamento dos pacientes portadores do HTLV-1. MÉTODOS: Nas amostras de 117 portadores do HTLV-1 assintomáticos e 171 pacientes com acometimento neurológico em acompanhamento na cidade do Rio de Janeiro, foram realizadas as tipificações dos genes do HLA Classe I e II, dos polimorfismos dos genes das citocinas -308TNF-\03B1,-174IL-6, +874IFN-\03B3, códon 10 e 25TGF-\03B21 e -1082 - 819-592IL-10, e a quantificação da carga proviral. Os dados foram organizados em um banco de dados no programa SPSS. As frequências alélicas e genotípicas foram obtidas por contagem direta. O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi avaliado para os polimorfismos das citocinas no sitio http://bioinfo.iconcologia.net/ubbweb/SNPStats_web, em relação ao HLA foram utilizadas as ferramentas disponíveis no sítio \201CLos Alamos HIV database tools\201D. As comparações entre os grupos foram realizadas através de tabelas de contingência 2x2 (quiquadrado, exato de Fisher e odds ratios), valores de p\22640,05 foram considerados significantes RESULTADOS E CONCLUSÕES: O alelo A*02 não influencia a condição clínica nem os níveis da carga proviral. Os alelos A*29 e B*44 foram mais frequentes entre os indivíduos assintomáticos e a sua presença influenciou os níveis da carga proviral sugerindo proteção ao desenvolvimento de doença neurológica. O alelo A*68 foi mais frequente entre os pacientes com doença neurológica, porém sua presença não influenciou nos níveis da carga proviral. O alelo C*04 foi mais frequente entre os portadores assintomáticos e não influenciou os níveis de carga proviral, já o alelo DRB1*03 predominou entre os pacientes com doença neurológica e a sua presença entre os indivíduos assintomáticos acarretou níveis mais elevados de carga proviral, sugerindo ser um possível fator de risco para o desenvolvimento de doença neurológica. Na análise do polimorfismo genético das citocinas, o polimorfismo de IL-10, com perfil fenotípico de baixo produtor da citocina foi mais frequente no grupo dos assintomáticos, enquanto que o fenótipo de produtor intermediário predominou entre os sintomáticos. O perfil fenotípico da população estudada foi caracterizado como: baixo produtor da citocina -308TNF-\03B1, intermediário a alto produtor para códon 10 e códon 25 TGF-\03B2, baixo a intermediário produtor para -1082,-819,- 592 IL-10, alto produtor para -174 IL-6 e baixo a intermediário produtor para +874IFN-\03B3

Estudo clínico-molecular na Leishmaniose mucocutânea diagnóstico e rastreamento de subpopulações de Leishmania (Viannia) braziliensis nos níveis inter e intrapacientes

O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a diversidade genética de Leishmania (Viannia) braziliensis nos níveis inter e intrapacientes, diretamente em lesões cutâneas e mucosas de indivíduos com leishmanioses mucocutânea (LMC), disseminada (LD) e mucosa (LM), incluindo indivíduos coinfectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Um total de 61 amostras procedentes de 38 pacientes foi analisado pelas técnicas da reação em cadeia da polimerase (PCR), da reação em cadeia da polimerase com primer único em condições de baixa estringência (LSSP-PCR) e da análise fenética, tendo como alvo molecular a região variável do minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA). Neste estudo, predominaram indivíduos do sexo masculino e com acometimento mucoso nasal. A presença de DNA do parasita foi evidenciada pela banda diagnóstica de 750 pb, em todas as amostras analisadas, possibilitando o diagnóstico específico. Na investigação do perfil genotípico de subpopulações de L. (V.) braziliensis, através da LSSP-PCR, foi revelado o polimorfismo genético intrafragmento traduzido como uma assinatura do kDNA do parasito para cada amostra. Assinaturas de kDNAs similares em amostras de paciente coletadas ao mesmo tempo (mucosa oral e nasal), e a divergência nos perfis genéticos em amostras coletadas em tempos diferentes na mesma localização (mucosa nasal) sugerem a clonalidade do inóculo inicial, como consequência da estrutura populacional clonal de Leishmania No estudo da variabilidade genética de L. (V.) braziliensis nos níveis inter e intrapacientes foram evidenciadas similaridades genotípicas entre as amostras de lesões cutânea e mucosa intrapacientes. As análises fenética e estatística possibilitaram afirmar que a diversidade genética no nível intrapacientes é menor do que a observada entre os pacientes. Nenhuma associação pode ser observada entre os perfis genéticos de L. (V.) braziliensis e as formas clínicas da doença (LM, LMC, LD), e nem em relação à localização da lesão cutânea ou mucosa (nasal ou oral). O polimorfismo genético de L. (V.) braziliensis também foi evidenciado nos pacientes coinfectados pelo HIV, cuja análise fenética reuniu os perfis genéticos em dois grupos distintos, os quais discriminaram entre as amostras obtidas de pacientes com coinfecção Leishmania/ HIV daquelas obtidas de pacientes não coinfectados. A discriminação de perfis genéticos diferenciados de L. (V.) braziliensis em pacientes coinfectados pelo HIV sugere que a imunossupressão tem impacto na estrutura populacional do parasita. Os nossos resultados corroboram a complexidade genética existente nos parasitos do gênero Leishmania, reforçando a diversidade na dinâmica populacional e na plasticidade genética de L. (V.) braziliensis

Seed development and maturation in early spring-flowering Galanthus nivalis and Narcissus pseudonarcissus continues post-shedding with little evidence of maturation in planta

Background and Aims: Seeds of the moist temperate woodland species Galanthus nivalis and Narcissus pseudonarcissus, dispersed during spring or early summer, germinated poorly in laboratory tests. Seed development and maturation were studied to better understand the progression from developmental to germinable mode in order to improve seed collection and germination practices in these and similar species. Methods: Phenology, seed mass, moisture content, and ability to germinate and tolerate desiccation were monitored during seed development until shedding. Embryo elongation within seeds was investigated during seed development and at several temperature regimes after shedding. Key Results: Seeds were shed at high moisture content (> 59%) with little evidence that dry mass accumulation or embryo elongation were complete. Ability to germinate developed prior to the ability of some seeds to tolerate enforced desiccation. Germination was sporadic and slow. Embryo elongation occurred post-shedding in moist environments, most rapidly at 20C in G. nivalis and 15C in N. pseudonarcissus. The greatest germination also occurred in these regimes, 78 and 48%, respectively, after 700 d. Conclusions: Seeds of G. nivalis and N. pseudonarcissus seeds were comparatively immature at shedding and substantial embryo elongation occurred post-shedding. Seeds showed limited desiccation tolerance at dispersal.

Estabilidades provisòrias no direito do trabalho

A proposta da presente monografia é analisar algumas das modalidades de estabilidades provisorias no direito do trabalho, as quais buscam um equilíbrio social, que é a causa e o fim do direito do trabalho.A estabilidade é conceituada como o direito do trabalhador permanecer no emprego, mesmo contra a vontade do empregador, enquanto inexistir uma causa relevante e expressa em lei que permita sua dispensa.As principais estabilidades previstas no nosso ordenamento jurídico que vedam a dispensa do empregado e que serão abordadas no presente estudo são:estabilidades do dirigente sindical(a partir do registro da candidatura até um ano após o final do mandato);estabilidade do membro da CIPA(desde o registro de sua candidatura até um ano após o final de seu mandato);estabilidade do membro da comissão de conciliação prévia(até um ano após o final do mandato); estabilidade do empregado acidentado(mínimo de 12 meses,após a cessação do auxílio-doença acidentário)estabilidade da empregada gestante(desde a confirmação da gravidez até cinco meses após o parto);estabilidade do empregada vítima de prática discriminatória;estabilidade do trabalhador portador do vírus HIV e estabilidade para empregados acidentados e portadores de doenças profissionais.Portanto, verifica-se que o trabalhador obteve essas conquistas ao longo dos anos e, com a correta aplicação das leis trabalhistas e da própria Constituição Federal pelo Poder Judiciário, o mesmo tem conseguido assegurar esse direito.

Estabilidades provisòrias no direito do trabalho

A proposta da presente monografia é analisar algumas das modalidade de "Estabilidades Provisórias no Direito do Trabalho", as quais buscam um equilíbrio social, que é a causa e o fim do Direito do Trabalho.A estabilidade é conceituada como o diretor do trabalhador permanecer no emprego, mesmo contra a vontade do empregador, enquanto inexistir uma causa relevante e expressa em lei que permita sua dispensa.As principais estabilidades previstas no nosso ordenamento jurídico que vedam a dispensa do empregado e que serão abordados no presente estudo são:Estabilidade do dirigente sindical(a partir do registro da candidatura até um ano após o final do mandato);Estabilidade do Membro da CIPA(desde o registro de sua candidatura até um ano após o final de seu mandato);Estabilidade do Membro da Comissão de Conciliação Prévia(até um ano após o final do mandato);Estabilidade do empregado acidentado(mínimo de 12 meses,após a cessação do auxílio-doença acidentário);Estabilidade da empregada gestante(desde a confirmação da gravidez até cinco meses após o parto); Estabilidade do empregada vítima de prática discriminatória;Estabilidade do Trabalhador Portador do Vírus HIV e Estabilidade para empregados acidentados e portadores de doenças profissionais.Portanto, verifica-se que o trabalhador obteve essas conquistas ao longo dos anos e, com a correta aplicação das leis trabalhistas e da própria Constituição Federal pelo Poder Judiciário, o mesmo tem conseguido assegurar esse direito.