芦苇Phragmites communis Trin. 耐盐变异体的生物学鉴定和快速繁殖以及在海水生态养殖中的应用示范

本文以芦苇野生亲本和耐盐变异体为材料，比较了两者在形态、生理生化以及分子生物学特性上的差异，对耐盐变异体抗盐能力提高的机理作了初步的探讨。为了适应推广芦苇耐盐变异体的需要，进行了耐盐变异体快速繁殖的研究，建立了两种诱导丛生芽的技术系统。对耐盐变异体芦苇在滩涂上的利用作了有益的尝试。结果总结如下： 1．通过对芦苇野生亲本和耐盐变异体的基因组DNA用随机引物扩增分析，发现两者的基因组DNA在序列上存在着一定的差异，并克隆测序了几个对变异体而言是特异的标记序列。 2．生化分析发现，在盐胁迫下，两者在可溶性蛋白上存在着差异，芦苇耐盐变异体在胁迫下分别在20～30 kD和43～66．2 kD之间各有一条特异的蛋白带表达。而且变异体盐胁迫下在同工酶的表达上也与野生亲本有着显著的区别。 3．生理测定发现，芦苇耐盐变异体在200 mmol/L NaCl盐胁迫下光合作用要比野生亲本强，叶绿素测定的结果与此相吻合，在此浓度的胁迫下，变异体叶绿素含量受影响较小，而野生亲本的叶绿素含量明显降低。对两者胁迫前后的离子含量测定发现，虽然K+含量最多，但是植株内离子含量变化最大且增加最多的离子是Na+，而且变异体内Na~+增加的量比野生亲本高得多。另一个变化较大的是游离脯氨酸的含量，其变化情况类似于Na~+，在胁迫后脯氨酸含量增加明显，而且变异体内的增加量比野生亲本高。对变异体进一步的胁迫反应证实了Na+和脯氨酸含量变化与胁迫反应的密切联系。推测它们的这些变化与变异体抗盐能力提高密切相关。 4．将芦苇耐盐变异体的种子苗切去种壳和种子根，以此作为外植体，通过筛选大量的激素组合，最终建立了两种快繁技术系统（MP－A和MP－B）进行丛生芽诱导。两个系统都包含预处理和诱导两个主要步骤，其中预处理培养基激素组合是相同的（NAA 2～5 mg/L + 2,4-D 0.05 ～ 0.1 mg + BA 1mg/L）,而诱导处理的培养基激素组合不同，分别为：MP－A的诱导处理的激素组合是将预处理的激素组合中的2，4－D去除即可;MP－B诱导处理的激素组合为1mg/L NAA + 0.05 ～0.1mg/L 2,4-D + 2～5mg/L BA. 两个系统都获得显著的丛生芽诱导效果。 5．在滩涂水产养殖中引入芦苇种植、发现耐盐芦苇能有效地降低水体污染和病害，实验了两种模式的种养殖方式：围隔模式和混合模式，初步结果表明混合模式效果较好。这一初中初步验证了芦苇对海水养殖的价值，对开发滩涂具有很大的意义，具有创新性。

羊草繁殖生物学特性的研究

羊草(Leymus chinensis (Trin.) Tzvel. )又称碱草，隶属禾本科，赖草属，因其营养价值高，富含蛋白质，适口性好，抗旱，耐盐碱，耐贫瘠，抗逆性强，适应性广等优点，对我国发展草原畜牧业和退化草地、荒漠化治理方面具有举足轻重的作用。近年来，由于自然环境变劣，荒漠化加剧，以及过度放牧等不利影响，加之羊草本身固有的“三低”问题（即结实率低、出苗率低、产草量低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁，严重限制了我国人工草地建设和天然草地的改良和沙化治理的步伐。加强羊草生物学研究，开展羊草种质生物多样性保护，成为当前研究的紧迫课题。经对国内外相关文献的查新发现：国外发表的文献匮乏，国内的报导大多集中在草原生态等宏观领域，在羊草繁殖生物学方面缺乏系统的研究。本文以本课题组从国内外收集的羊草资源为材料，从以下几个方面进行了初步探索： 一、羊草繁殖性状与遗传多样性分子标记指标的相关分析。利用分子标记与形态标记对随机抽取的17份羊草种质进行了种质评估的比较研究。结果表明：两种方法均在17份供试材料中鉴别出9份羊草种质,说明分子标记方法用于羊草种质资源鉴定是可行的，并具有快速、准确、不受环境条件限制等优点。在40个10 Mer的随机引物当中筛选出21个有效引物，以之对9份羊草材料进行RAPD 分析，共扩增出115条带，其中95条带表现出多态性，多态比率82.61%，并筛选出S1213-900，S1213-1700，S1215-5500， S1396-1370，S1384-900，S1202-5180，S1220-2200，S1381-1580，S1211-1300，S1211-800为羊草种质所具有的10个特异性标记，据此可将羊草种质与披肩草、赖草加以区分。同时在羊草种内亦发现13条可区分供试羊草种质的特有标记。形态标记与分子标记相关性分析结果显示：羊草种质的小穗数，种子千粒重，叶色，有性繁殖量和结实率5个形态学指标与遗传多样性指标---特有带百分率及遗传距离之间，存在一定相关性。同时对羊草种质资源在收集和评价过程中存在的问题进行了探讨。 二、羊草不同基因型无性繁殖特性比较研究。以本课题组从吉林、内蒙古等省份收集的10个基因型羊草为供试材料，在相同的生态因子作用下，以吉生1号羊草为对照，对10个基因型羊草的叶数增量、芽数增量、芽高度、芽间距、芽重量、根量六个无性系形态性状指标进行测评。结果表明：基因型的差异也是影响羊草无性系生长发育的重要影响因子。因此，在今后的羊草无性繁殖生物学研究中，应综合考虑环境因子和基因型因子对羊草无性繁殖生长发育的影响。在所测评的10个基因型中，各基因型的形态性状指标差异很大，栽3基因型较其他基因型优于对照吉生1号，此结论可为今后培育羊草新种提供重要资料。 三、羊草幼穗离体培养方法的建立。其方法是取羊草幼穗为外植体，经0.1%升汞溶液表面消毒后，接种到含2mg/L的2,4-D的MS培养基上，置于恒温25℃条件下诱导愈伤组织。在加有1mg/L2,4-D的MS培养基上继代2次后，转移到含1mg/L KT和0.5mg/LNAA的MS培养基上分化培养得到再生芽。在除去激素后的基本培养基上获得了生根的试管苗。试管苗移栽到温室后生长正常。羊草试管苗的分化因基因型和外源激素条件的不同而异。 四、羊草有性生殖特性的研究。在自然条件下进行了羊草自交、异交结实性实验，采用FDA染色法检测羊草小孢子活性，并观测羊草雌蕊、雄蕊发育的时空特点。结果表明：在大田中羊草异交结实率远大于其自交结实率;成熟花药中有活性的花粉达到92.2%以上;同时，在发育时间顺序和空间结构上，羊草的雌蕊、雄蕊并不妨碍自体授粉。因此，初步结论认为羊草具自交不和性。

玉米的单倍体育种及基因转化的研究

玉米的单倍体育种，是利用花药培养或孤雌生殖产生单倍体后，进行人工或自然加倍，迅速获得稳定的新品种的育种方法。单倍体育种可以缩短育种时间，单倍体培养体系如果作为转基因的受体，可保证外源基因在后代中稳定遗传，而不发生分离。因此，玉米单倍体育种无论在实践中还是在理论研究方面都具有重大的意义。 本文针对玉米花药培养中长期以来未能解决的诱导频率低、基因型之间差异大、小苗移栽不容易成活等问题，重点探讨了各种因素对玉米花药培养的影响。结果表明：不同基因型之间的诱导频率差异明显，杂交种的诱导频率比纯系高，并选择出诱导频率高达20%的材料“中0198”;接种时花药中的花粉处于单核中期时，其诱导频率最高;采用液体培养基比采用固体培养基诱导频率提高一倍;培养基中加入0.5%的活性炭，可使诱导频率由5.25%提高到9.35%;15%的蔗糖浓度对玉米的花药培养是最适宜的，培养2周后，将培养基的蔗糖浓度从15%调整为10%，将明显提高诱导频率;培养基中高浓度的KT和低浓度的BA有利于诱导体细胞胚的发生，而低浓度的KT和高浓度的BA有利于诱导芽的发生;接种前将花药在4℃条件下进行低温预处理，可将诱导频率从3.13%提高到11.71%;培养基中添加2 mg/l的多效唑，可有效地促进小苗的生根;再生植株于冬季拿到海南种植，可明显提高移栽的成活率。 在玉米孤雌生殖的实验中，将未受粉的玉米雌穗接种在成份为N6 + 2,4-D 1mg/L + NAA 1mg/L + BA 1mg/L + CH 200mg/L + colchicine 2 mg/L + sucrose 5% + agar 0.7% 的培养基上。第一轮实验共接种了三个材料的26个雌穗（约3900个未受精的子房）。每种材料均有单性结实，诱导频率由高到低分别3.06%，2.29%，1.90%。直接获得了5株再生植株，通过染色体检查，发现其中3株为单倍体（n=10），另外2株为二倍体。移栽到土壤中后，有4株成活，其中一株二倍体植株能够正常开花、结实。得到的种子播种于实验田中，表现整齐一致，有纯系的特征，而且出现了2株白化苗。通过石蜡切片初步观察了孤雌生殖的胚胎发生过程，发现胚胎发生是从胚囊里的单倍体细胞起源的。第二、三轮实验又接种了10个基因型的玉米材料，证实了上述结果。 外源基因转导是利用生物技术进行玉米育种的一个有效途径。本文首次尝试了用离体子房注射法对玉米进行基因转化。首先构建了含有开花促进因子基因FPF1及植物选择标记抗除草剂基因pat的植物表达载体pFBR，采用离体注射培养法，取授粉24小时后的玉米雌穗，剥去苞叶，在超净工作台进行微量注射，然后切成小块接种在培养基上，在光照培养箱内培养，3-4周可直接获得种子或小植株。种子萌发后进行植株抗性筛选和分子检测，共注射了3个品种的47个雌穗（约16450个子房）得到再生植株109株，其中经PPT筛选有抗性的植株为23株，占再生植株的21.1%。经PCR检测，13株植株有阳性反应。但Southern杂交检测有杂带出现。出现杂带的原因、RNA水平的分子检测、转基因后代T1代的分子检测和早开花农艺性状的观察，由于时间关系没有完成，还需要进一步的实验。实验初步证明了离体子房注射法对玉米进行基因转化的可行性，而且与田间注射法相比，此方法具有省力省时，容易控制污染，转化效率提高的优点, 克服了玉米培养再生植株受基因型限制的困境, 将为玉米分子育种的基因工程提供更易行的手段。 同时，也为子房较大的其它植物的基因转化提供了方法。

水稻小G蛋白Arf GTPase激活蛋白OsAGAP功能研究

　　锌指蛋白在植物生长发育中具有重要功能，它们可以识别并结合特定的DNA序列进行转录调控，还能够参与蛋白之间相互作用的调节。我们根据锌指蛋白等转录因子特征结构域的序列特点，从来自10 K水稻芯片的EST数据库中筛选出编码58个EST序列。通过对器官表达特异性的比较分析，从中选出七个只在单一器官表达的基因，并对这七个基因的功能进行研究。对其转基因水稻的表型分析发现，C1基因调节水稻的株高和穗的发育;LIM 家族的F9影响小花的形态，主要体现在雌蕊与雄蕊的发育;锌指蛋白S34调控叶倾角的变化;F14基因编码一个核定位的TFIIIA类锌指蛋白，具体功能尚不清楚;锌指蛋白F35转基因水稻主根缩短，侧根数目显著减少。它编码一个推测的ArfGAP (Arf GTPase activating protein)，据此我们将其命名为OsAGAP，并对其进行深入研究。 　　OsAGAP的cDNA全长为1328bp，编码的蛋白由320个氨基酸组成，含有两个保守结构域：锌指结构域和C2 结构域。其中锌指结构域属于CX2CX16CX2C类，即ArfGAP domain的特征结构。GTP酶活性测定试验表明，OsAGAP蛋白能够激活水稻Arf的GTP酶活性，另外，OsAGAP还能够恢复酵母ArfGAP缺失突变体的表型。说明OsAGAP编码的蛋白是水稻中的一个ArfGAP。 　　OsAGAP在水稻各器官中均有表达，但强弱有所不同。RNA原位杂交结果显示，它在茎尖分生组织与侧生原基及侧根部位表达强烈;它在根尖主要分布于中央维管组织、分生区、皮层细胞，最有趣的是恰好与生长素在根尖极性运输路径相吻合。在亚细胞水平，OsAGAP广泛分布于细胞膜、细胞质、细胞核。 　　OsAGAP超表达水稻主根、不定根长度缩短，侧根数目显著减少表现出类似于生长素极性运输突变体的表型。其主根伸长对TIBA的抑制作用不敏感，这暗示OsAGAP超表达水稻的生长素极性运输被破坏;另外，其对各种生长素的作用敏感性也发生变化，对IAA、2,4-D的不敏感，而对NAA的反应与野生型一致，根据各类生长素进出细胞机制不同，可以推测超表达水稻的输入能力存在缺陷。极性运输实验结果表明，超表达水稻极性运输能力被破坏;对生长素输入能力的测定进一步表明，超表达水稻根载体的介导的生长素输入能力显著下降。另外，NAA处理能够恢复超表达水稻中侧根发育受抑的表型缺陷。由此可见，OsAGAP在水稻中超表达破坏了生长素极性运输的输入能力。 　　FM1-43是一类特异标记囊泡运输的荧光染料。经其染色标记后，OsAGAP超表达水稻细胞内囊泡成片聚集，形成“BFA区间”，表现出囊泡运输被破坏的典型特征。透射电镜观察发现，超表达水稻细胞内有大量的小液泡，其中积累了电子密度很高的颗粒物质。由此推测，可能由于细胞的囊泡运输被破坏，导致胞内的代谢物质不能被正常运送或分泌，而在液泡中暂时贮存以维持细胞环境的稳定。 　　在酵母和动物细胞中的研究表明， ArfGAP是调控囊泡运输的一个重要因子，然而目前还没有关于ArfGAP在植物细胞中生理作用的报道。我们的结果说明，OsAGAP作为的一个ArfGAP，它通过调控水稻中的囊泡运输，而影响了生长素的极性运输，具体表现在对生长素输入能力的调控。由此，我们推测ArfGAP可能在生长素的极性运输中也起着重要的调控作用。 　　但OsAGAP在拟南芥中却通过调控植株生长素的水平，而影响了转基因拟南芥根的发育。每种生物都有多个ArfGAP，它们之间的分工存在联系，但各不相同。OsAGAP是拟南芥的外源基因，它在拟南芥中可能以不同于水稻的机制起作用。

羊草细胞差异表达基因分析与遗传转化方法研究

羊草（Leymus chinensis (Trin.) Tzvel），隶属禾本科赖草属，是欧亚大陆草原区东部重要建群种之一。羊草是牧草之王，是我国比较有优势的战略性生物资源，对我国北方畜牧业的发展以及生态环境的保育均具有重要意义。近年来，由于缺乏科学管理、过度放牧等不利影响，加之羊草本身固有的“三低”问题（即抽穗率低、结实率低、发芽率低）已对羊草生物多样性维持构成了严重的威胁，限制了我国人工草地建设和天然草地的改良及沙化治理的步伐。因此，如何通过细胞、分子生物学以及生物技术手段改良羊草、快速评价和创造新的种质;如何加快育种进程便成为当前亟待解决的问题。本文围绕这些问题开展了系统的研究并取得如下结果： 1. 建立了羊草离体培养再生体系，并研究了影响愈伤组织诱导和植株再生的因素，影响植株再生的主要因素为激素配比和基因型。将3～5mm的幼穗接种到含有2,4-D 0～5.0mg/L的N6基本培养基上，随着2,4-D浓度的变化，愈伤组织诱导率不同，最高诱导率为93.21%（基因型C6）、最低为33.35%（吉生1号）;愈伤组织在N6(大)＋B5(微)＋KT1.0mg/L+BA1.0mg/L的培养基上可以分化出芽，并在1/2MS培养基上生根。羊草基因型W4不同幼穗诱导的愈伤组织在继代培养过程中其生长、褐化死亡等方面存在着差异;在分化培养过程中，不同幼穗的愈伤组织最高分化率为9.24%，最低分化率为5.26%。 2. 对来自同一基因型不同幼穗的愈伤组织中差异表达的基因进行了研究。采用DDRT-PCR技术对其差异表达的基因进行了分离，通过银染技术显示差异片段。将得到的差异片段进行回收、克隆测序，得到两个差异片段序列，经过序列分析表明，其中一个片段是与水稻翻译延伸因子eEF-1基因高度同源;另一差异片段与水稻谷胱甘肽转移酶GST基因高度同源。 3. 建立了羊草遗传转化方法。在获得羊草离体培养再生体系的基础上，采用基因枪法对羊草两个基因型进行转抗除草剂基因（PAT）的研究。对分别来自基因型W4和C3的愈伤组织各1430和1850块进行转化。在附加1.0mg/L PPT的培养基上进行一系列的筛选培养，共获得了23株再生苗，经过生根筛选培养，得到5株抗性苗，3株来自基因型W4，2株来自基因型C3。对5株植株进行PCR和Southern 检测，得到2株阳性苗，均来自基因型W4，对阳性植株经过无性繁殖得到的无性系进行PCR检测及Basta耐受性鉴定，外源基因可以在其无性系稳定遗传并表达，无性系除对Basta具有抗性外，其表型特征与对照无明显区别。

药蒲公英(Taraxacum officinale Weber)体外再生体系的建立、耐盐愈伤组织筛选和抗盐基因转化

药蒲公英(Taraxacum officinale Weber)是菊科蒲公英属的模式种，主要分布于欧洲和北美，在我国新疆也有少量分布。与Taraxacum mongolicum Hand-Mazz(我国中药市场的主流种和主要自然分布种)相比，药蒲公英的生物量更大，作为营养保健蔬菜具有更大的市场价值。药蒲公英的组织培养工作是开展基础研究的有力工具，本工作中，药蒲公英叶片外植体在含0.2mg/L IAA和1.0mg/L TDZ的MS培养基中培养2周后便产生大量的丛生芽，在含有0.5mg/L 2,4-D和2mg/L6-BA的MS培养基中培养30天后，形成明显的愈伤组织，愈伤组织块在含1.0mg/L 6-BA的MS培养基中成功再生。 体细胞无性系变异是植物愈伤组织培养中的普遍现象，我们将继代6次的愈伤组织接种于含盐培养基，得到了能够耐受1.0%NaCl的细胞系。耐盐细胞系在含盐培养基中的相对生长率和细胞活力明显高于对照（非耐盐细胞系接种于含盐培养基），由耐盐细胞系在含盐培养基中获得再生植株的工作正在进行。 直接不定芽再生途径对遗传物质具有高度保真性，是遗传转化的理想体系。我们利用此再生系统，将来源于耐盐植物山菠菜(Atriplex hortensis L.)BADH基因通过农杆菌介导的叶盘转化法导入药蒲公英，获得了PCR检测成阳性的转基因植株5株，从而建立了药蒲公英的转化体系。转基因植株的其他分子检测和耐盐性鉴定工作正在进行。

盐角草（Salicornia europaea L.）体外再生体系及floral-dip转化系统的初步研究

盐角草（Salicornia europaea L.）属藜科盐角草属（Salicornia），是迄今已报道过的最为耐盐的真盐生植物之一。跟与其同属的海蓬子（Salicornia bigelovvi Torr.）相比, 它的分布更为广泛。它的种子含油丰富，因此具有发展为油料作物的潜力。此外，它也可以作为蔬菜和饲料。盐角草的组织培养工作为未来的转化研究和胁迫相关基因功能分析提供了有力的工具。本工作中，通过器官发生途径，建立了盐角草的体外再生体系。以完整的成熟种子为起始培养材料，在添TDZ 0.1 mg/L与NAA 1 mg/L的MS培养基上，暗培养三周后在下胚轴处形成愈伤组织，形成愈伤的平均频率为99％。愈伤组织在含TDZ 0.1 mg/L与NAA 1 mg/L的培养基上培养3－4周后分化出芽，分化频率约26.7%。采用2,4-D短时处理法结合添加NaCl，经过6－8周的培养获得了丛生芽，提高了再生频率。分化芽3周后转入含IBA 0.5 mg/L、KN 0.1 mg/L与0.05％活性炭的1/2 MS培养基，3周后生根形成完整植株。同时，本研究也进行了从直接不定芽途径建立盐角草再生体系的试验，但未获成功。 此外，本工作借鉴拟南芥的floral-dip转化法，对建立盐角草floral-dip转化系统进行了尝试。

复苏植物牛耳草干旱诱导的ACC氧化酶及乙烯调控的引导蛋白基因的克隆、表达与功能分析

本文以耐旱的牛耳草(Boea hygrometirica)为材料，研究了乙烯合成关键酶之一——ACC氧化酶编码基因（BhACO1）在干旱复苏过程中的诱导表达及其编码蛋白的酶活，分析了乙烯在干旱复苏过程中的积累及其对叶片复苏能力的影响和对干旱诱导基因的调控，探讨了一个受乙烯调控的干旱诱导的引导蛋白编码基因（BhDIR1）的表达及其功能。 利用cDNA微阵列技术从牛耳草干旱2h的叶片中得到一个ACC氧化酶基因片段，经5’-RACE得到全长cDNA，命名为BhACO1。BhACO1包含317个氨基酸，与其它植物中的ACC氧化酶具有80%左右的序列相似性。BhACO1基因受乙烯和干旱诱导、但ACC氧化酶抑制剂氯化钴可抑制其干旱诱导表达。BhACO1基因受ABA、2,4-D、SA、H2O2、CaCl2、EGTA及热害和盐害的诱导，但不受冷害诱导。原核表达的GST-BhACO1融合蛋白在体内体外均表现出ACC氧化酶的活性，而过量表达BhACO1的转基因植物的蛋白提取物也表现出较野生型更强的ACC氧化酶活性。 乙烯在牛耳草叶片干旱复水过程中随着时间延长而逐步积累。外源乙烯可诱导叶片黄化，但不影响叶片在复水后的复苏能力;氯化钴处理可部分地抑制乙烯合成而降低牛耳草叶片在干旱过程中乙烯的释放量，同时导致叶片失去复苏能力。与对照相比，氯化钴处理的叶片在干旱时仍可维持较低的离子渗漏水平，但复水后发生大量离子外渗，表明细胞膜完整性也遭到破坏;光系统ІІ活性下降程度在干旱时与对照相似，但复水后完全丧失。 乙烯诱导牛耳草干旱响应基因BhDohb561，BhLEA2和BhDIR1的表达，但不影响牛耳草干旱响应基因BhCML1，BhGRP1，BhSGP和BhLEA1的表达。除BhLEA1外，上述基因在干旱过程中的诱导表达均可被氯化钴预处理所抑制，尤其是BhSGP最明显。 BhDIR1在牛耳草干旱复水过程中mRNA明显地积累，乙烯、ABA、CaCl2、EGTA、H2O2、SA和热害、冷害、盐害都可诱导其表达。BhDIR1编码一个199个氨基酸的小分子量蛋白质，与松柏等植物中发现的可能参与木质素合成的引导蛋白具有约20-30%的序列相似性。与其它引导蛋白相同，BhDIR1在N’端包含一个外泌的信号肽，GFP定位分析表明BhDIR1定位于细胞膜和壁上。 上述结果表明，乙烯在牛耳草叶片耐脱水复苏反应中有不可或缺的作用，而ACC氧化酶所催化的反应是干旱诱导的乙烯合成中的关键步骤。氯化钴预处理通过抑制干旱过程中的乙烯合成，影响一系列基因的干旱诱导表达导致叶片在生理水平和细胞水平上造成了损伤，或是使牛耳草失去了在复水过程中原有的修复能力而无法恢复生命力。BhDIR1作为乙烯调控的下游靶基因之一，可能通过调控木质素的单体间的连接方式而改变木质素的物理性质来影响细胞壁的机械强度和柔韧性，减少干旱对细胞造成的机械伤害。

显花植物器官形成激素调控的分子机理研究

本论文以显花植物水稻和拟南芥为对象，研究植物器官形成激素调控的分子机理。发现拟南芥干细胞决定基因WUS和ABA信号关键调节因子ABI3间存在相互调节关系，它们对质体和根毛发育等具有调控作用；运用细胞学手段对OsAGAP和OsRMC调控根发育的机理进行了研究。这些结果为了解ABA、生长素和JA等激素对分生组织或根等器官的形成的调控机理提供了新资料。 拟南芥WUS基因是一个重要的干细胞决定基因。在茎尖分生组织和花分生组织的动态平衡调节中各存在一个反馈调节环：WUS促进CLV3的表达，而CLV3 反馈抑制WUS表达，它们共同决定干细胞的数目；在WUS+LFY 和AG之间也存在一个类似的反馈环，负责花器官的正常启动和终止。本工作发现在外源ABA 存在下，拟南芥WUS功能获得突变体sef (stem ectopic flowers)子叶黄化过程受到抑制，即sef突变体对ABA 的敏感性降低，而且在sef突变体中ABI3转录水平下调，说明WUS 抑制ABI3的表达。另一方面，在abi3突变体中WUS转录水平下降，启动子分析发现WUS是ABI3所在的B3结构域家族基因的靶基因，酵母单杂交实验表明B3家族蛋白FUS3可以与WUS调控区结合；外源ABA 处理pWUS::GUS植株发现ABA可使WUS异位表达，暗示受ABA信号诱导的B3类转录因子可与WUS调控区结合，从而促进WUS的表达。这些结果支持ABI3/WUS间的反馈调节机理，该调节环可能参与调控拟南芥质体和根毛发育等过程。 双子叶和单子叶植物的发育和器官形成高度依赖生长素极性运输（PAT）， 生长素输入和输出载体的准确定位对于极性运输的正常进行是必要的。在双子叶模式植物拟南芥中，生长素输出载体PIN1的转运和定位受小G蛋白ARF鸟苷酸转换因子GNOM介导。本实验室克隆到一个水稻ARF GAPase激活蛋白OsAGAP， 其超表达引起PAT改变且干扰主根和侧根的发生及发育。前期生理实验显示超表达植株侧根的表型可被膜渗透性生长素NAA恢复，但不能被载体依赖型生长素IAA和2, 4-D恢复。为了解释OsAGAP过表达引起根系发育受到抑制的表型，本工作主要从细胞学角度继续深入分析OsAGAP介导生长素运输的机理。实验发现，OsAGAP超表达植株中AUX1在细胞中分布改变；生长素输出载体PIN1和PIN2的定位不受影响；该基因的超表达使囊泡聚集，形成类似囊泡运输抑制剂BFA处理后的结构；OsAGAP与细胞转运系统中的高尔基体存在部分共定位。以上结果表明OsAGAP调节小G蛋白Arf的活性，参与调控生长素极性运输过程，进而调控根系发育。通过对JA诱导的OsRMC蛋白的膜定位分析及转基因植株根中JA合成水平的测定，为研究此蛋白参与JA信号、调控根系发育提供了直接证据。 此外，论文还对拟南芥STAR2基因的功能进行了一定的初探。

五助百里香植物愈伤组织培养及挥发油成份的生物合成研究

高等植物具有合成各种化合物的特殊功能。早在本世纪二十年代初期，许多有机化学家对这些复杂的天然次生代谢物提出了各种生源假说，阐述这些化合物的结构关系及其可能的生源途径。 目前，对于次生代谢产物生物合成研究主要有二个途径，整体方法和离体方法，其中离体方法包括非细胞系以及植物组织和细胞培养。 经过近一个世纪的努力，植物组织和细胞培养成了今天研究次生代谢产物生物合成的一个重要工具。目前这方面研究主要包括三个方面;﹤一﹥通过植物组织和细胞培养获得有价值的天然次生代谢产物;﹤二﹥研究次生代谢产物的生物合成途径;﹤三﹥生物合成新的有特殊价值的天然产物。 近二十年来，这一领域发展迅速，尤其是在寻找用植物细胞，像微生物那样，工业生产有价值的天然产物方面，为许多科学家所瞩目。 为了从植物组织和细胞培养中获得原植物特有的次生代谢产物，目前，主要包括四个方面的研究。﹤一﹥营养调节;﹤二﹥激素调节;﹤三﹥一级代谢对二级代谢的调节;﹤四﹥一些物理因子的调节。这些工作均在不同程度上取得一定的进展。 目前，在本领域中存在的主要问题是：﹤1﹥在植物组织培养中，许多植物特有的次生产物只能在在具有一定程度分化的细胞中才能产生;﹤2﹥在植物组织或细胞培养中，合成的次生产物含量较低;﹤3﹥许多植物组织或细胞培养不能合成原植物特有的次生代谢产物。 在我国，应用植物组织或细胞培养研究次生代谢产物合成的工作开展不多，尤其是有关精油的生物合成研究，目前才刚刚开始。 本实验应用两种化学型（芳樟醇型和香芹酚型）五肋百里香（Thymus guinguecostatus celak)植物的叶、茎、子房、花粉等诱导愈伤组织，以期探讨萜类及有关成份在愈伤组织中合成的规律;比较不同愈伤组织合成萜类及有关成份的差异;探讨不同化学型的遗传信息在愈伤组织中合成的作用。 在本实验中，我们的结果如下： 1.愈伤组织诱导 不同培养基对愈伤组织诱导不同，其中以添加6ppm 2,4-D和0.5ppm激动素的staba培养基的诱导率最高，接种17天后，诱导率达70%。老茎和老叶均不易产生愈伤组织。光照下培养也不易产生愈伤组织，诱导愈伤组织是在暗处进行的。 2.愈伤组织培养 愈伤组织在含有0.2ppm NAA和1ppm激动素的 staba 和 Ms 培养基中生长较好，五周后可长成约1克重。在光照下培养，茎的愈伤组织是绿色的，叶的愈伤组织为白色，无叶绿素，子房和花药愈伤组织含有少量叶绿素。光照下培养比暗处生长较快。在这两种培养基中添加200毫克/升亮氨酸时，茎的愈伤组织出现分化的不定芽，叶的愈伤组织不发生分化，但生长加快。 3.原植物精油成份 移栽于本所北京植物园的五肋百里香精油成份，经气-质联用鉴定,与原产地的精油成份相似。从山东烟台地区移栽的芳樟醇型，经气-质联用鉴定有13个化合物，除前已坚定的五个原产地精油成份，如芳樟醇，龙脑，莰烯，蒎烯和β-红波药烯外，本实验鉴定的成份。 从山东泰安地区移栽的为香芹酚型经气-质联用鉴定的精油成份有12个，除前已鉴定的香芹酚，百里香酚等9个成份外，本实验鉴定的成份有桧烯，α-侧柏烯和新异侧柏醇等。 4.愈伤组织中萜类和有关成份及其生源 芳樟醇型叶愈伤组织，经提取分离，气-质联合检出4个化合物：异戌酰胺，苯甲酸乙酯，橙花叔醇和香兰素。主要成份是异戌酰胺和苯甲酸乙酯。 在香芹酚型愈伤组织中，鉴定了一个化合物，异戌酰胺，它是该愈伤组织的主要成份。 在本实验中，没有检出单萜成份，但检出一个倍半萜，橙花叔醇。因此，我们认为单萜和倍半萜的生物合成部位可能是相互分离的。倍半萜可能是在细胞质中合成的。 在本实验中，我们认为主要成份异戌酰胺可能是由亮氨酸转化的;香兰素和苯甲酸乙酯可能是从肉桂酸途径衍生的。

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的导入以及转基因马铃薯植株的大田攻毒

应用四种不同的马铃薯试管微型薯诱导体系生产试管微型薯，通过比较建立了—种有效的试管微型薯诱导系统。这种诱导系统使用液体培养基，具有试管微型薯发生频率高、薯块体积大和微型薯形成早的特点。同时，此系统使用的培养基成分成本低、方法简便以及所用设备简单，适用于容器内大批量生产马铃薯试管微型薯以及马铃薯种质资源的保存。 对银离子在马铃薯叶片组织培养过程中对愈伤组织诱导或芽分化和再生的影响作了研究。结果表明银离子通过抑制叶片组织培养过程中形成的乙烯与其受体的结合从而促进芽再生，但是其对叶片愈伤组织的诱导无显著效果。银离子的这些作用在通过同时应用2，4-D而明显表现出来。2，4-D通过促进乙烯的生物合成而降低银离子的促进作用，两者则通过对乙烯的调节而影响马铃薯叶片的愈伤组织诱导和芽分化再生。 将马铃薯Y病毒外壳蛋白基因通过根癌农杆菌双元载体系统导入马铃薯品种Desiree、K4和Favorita，获得了若干转基因株系。除了K4品种中—转化株系具有非正常生长形态外，其余转基因植株都生长发育正常。由此表明以根癌农杆菌介导的马铃薯转化中，构建于双元载体上的外源目的基因是随机进入并整合到受体细胞的染色体上。具有畸形生长性状的转基因植株的产生说明了PVY CP基因的整合可能干扰了控制正常生长发育、尤其是形态建成的基因表达。 在转化试验中，应用了试管微型薯薄片、茎切段和叶片三种外植体作为转化材料。对转化过程中农杆菌对外植体的侵染时间、共培养时间、外植体的类型以基因型对转化频率的影响作了比较研究。发现以试管微型薯薄片和茎切段作为受体的最佳侵染时间是十分钟，而叶片则为五分钟，三种外植体的最佳共培养时间皆为四天。在各种处理的最佳条件下，Desiree比K4具有相对较高的转化频率，表明马铃薯Desiree比K4在转化反应上更温和或顺从。 通过比较几种由不同统计得出的农杆菌介导的转化频率，认为使用“净转换频率”(Net Transformation Frequency)能更精确地表达马铃薯的转化效率。而在以前的报导中还没有—种统一的、并且能被广泛接受和使用的表达转化效率的参数或指标。． 以叶片作为起始材料的转化具有较高的转化频率。在转化外植体的植株再生过程中应用了2，4-D和AgN03两种乙烯调节剂分别于愈伤组织诱导和芽分化再生阶段，使其产生高频的植株再生。尤其是它的净化频率明显高于其它外植体的转化频率，并且无显著品种之间的差异，具有高效马铃薯转化系统的特征。 以聚合酶链式反应(PCR)检测转化再生植株得到的结果与DNA杂交(Southern blot analysis)的鉴定结果比较，结论是相同的。由此表明在以农杆菌介导的马铃薯转化试验中，PCR可被用于证实外源目的DNA的导入，它以简便、迅速的特点帮助节省时间以及提供及时的转化证据。 对三个马铃薯品种的一系列转基因株系在大田条件下进行了攻毒试验．最后从Favorita 品种中筛选出了两个抗性较强的无性系，它们具有明显较低的病毒侵染发生频率以及正常的生长发育性状，具有很大潜力成为生产上推广应用的抗病新品种。

太行花属（Taihangia Yu et Li）种质资源的研究

本文报道了太行花属（Taihangia Yu et Li）的种群分布、生物学特性和离体培养的初步结果。 太行花种群由于环境和生物等方面的原因仅在太行山区有狭小分布。来源于不同地区种群的太行花其形态特征具有丰富的表型，在引种条件下更为显著。而酯酶同工酶和过氧化物酶同工酶分析进一步证实了其遗传的稳定性和同源性。 实验表明，太行花在北纬39°58'，最低温度-11℃的北京北京植物园，露地越冬正常。温度提高至40℃时生长发育受抑制而迟滞，以25℃最为适宜，增殖率最高。太行花对土壤的适应范围较广，在泥炭培养土上移殖的幼苗成活率达97.20%，主根须根发达，叶生长良好。不同强度光照处理12000Lux效果最好。 太行花生育期为230多天，生长积温为3763℃左右。物候期受环境条件和当年气候的影响，不同种群和个体之间有一定的差异。花的性别、花期和开花量等与纬度、海拔主要与温湿度相关。 太行花的茎尖、花芽、花梗、萼片、花瓣和叶子等外植体均能在MS附加不同种类和浓度植物激素的培养基中分化，其分化途径和分化效果因附加成分、外植体类别而异。在含有0.1mg/L IAA和0.5mg/L 6-BA的培养基中，不但能启动花芽正常生长、开花、形成合子胚，而且也能诱导花芽、花梗、茎尖产生花芽和营养芽。在芽的继代培养中，细胞分裂素能大量诱导芽的分化，最好的配比是0.5mg/L 6-BA、0.1mg/L ZJ;只含生长素时可以诱导生根或脱分化，其中生根最好的是0.5mg/L IAA;2.4-D单独使用时，能较好地使花芽、叶等脱分化，其最佳浓度为1.0mg/L。

黄河口滨岸潮滩湿地系统氮生物循环特征与循环模式研究

潮滩湿地处于海陆相互作用地带，是响应全球变化和人类活动较为敏感的生态系统 之一。潮滩湿地是海岸带一个非常重要的生态类型，作为陆地和海洋过渡区的重要组成 部分，承接来自陆地人类活动带来的大量含氮物质。潮滩湿地氮的生物循环特征不但影 响湿地系统自身的调节机制，而且其在环境介质中的特殊动力学过程也与一系列全球环 境问题息息相关。为了更深入的理解潮滩湿地氮的生物循环特征及其关键机制，论文以 黄河口滨岸潮滩翅碱蓬湿地为研究对象，通过野外样品采集、原位实验、微区试验，研 究了湿地土壤氮的时空分布与化学转化特征，探讨了湿地植物生物量与氮累积季节变化 特征以及湿地植物残体分解及分解过程氮动态特征，建立了湿地植物-土壤系统氮循环 分室模式，主要结论如下：（1）潮滩湿地土壤氮含量具有明显的水平变异和空间结构， TN、NO3 --N 和C/N 具有明显空间分布格局，其空间变异性均以向低潮滩延伸且受潮汐 涨落影响较大的方向最大；微地貌特征和潮汐微域物理扰动是导致空间异质性的两个重 要随机因素，水盐条件、土壤类型和潮汐物理扰动是三个重要结构因素；（2）潮滩湿地 土壤氮含量在不同时期的垂直分布均存在较高变异性，主要与有机质分布、潮汐影响、 水分条件以及陆源影响程度有关；潮滩湿地土壤的氮含量具有明显季节变化特征，主要 与水分状况及受潮汐影响的程度有关；（3）潮滩湿地土壤氮的净矿化/硝化速率均呈波动 变化，并受生物固持、反硝化、温度、水分、C/N 和pH 等因素影响；潮滩湿地0~15cm 土壤的净矿化量和净硝化量分别介于0.33~27.81kg·hm-2 和1.19~15.99kg·hm-2，高潮滩湿 地维持无机氮的能力明显强于中潮滩和低潮滩湿地；（4）两种表现型翅碱蓬的生物量 均具有明显季节变化和空间结构分形特征，二者的地上生物量具有自相似性，分别遵从 D=2.012 和2.366 的分形生长过程；（5）沉积强度显著影响翅碱蓬种子的出苗和幼苗存 活，适度沉积可刺激幼苗生长，重度沉积对幼苗生长则具有抑制作用；沉积可促使幼苗 被埋部分发育为根系，反映了其对潮滩较强沉积环境的特殊适应对策；（6）两种表现 型翅碱蓬根、茎和枯落物的TN 含量均呈递减变化，符合指数衰减模型，叶是二者重要 氮储库，分配比高达46.91±16.97%和55.21±9.79%；中潮滩植被的N/P 为9.87±3.47＜14， 其生长受N 限制，低潮滩植被的N/P 为15.73±5.00＜16，其生长同时受N、P 限制，但 更受P 限制；（7）潮滩湿地植物残体在水盐含量较高或沉积较强条件下的失重率和分解 速率一般较高，反之则较低；温度、水分、盐分和pH 是影响残体相对分解速率的重要 摘 要 II 因素；（8）当分解环境的养分状况不发生较大改变时，残体相对分解速率在很大程度上 取决于基质质量，当养分状况因潮汐养分交换、潮汐物理扰动、沉积物矿化等发生较大 改变时，残体相对分解速率在很大程度上取决于分解环境养分供给状况；（9）潮滩湿地 植物残体在不同水盐梯度和沉积强度下的氮含量、C/N 的变化模式整体较为一致，水盐 条件和沉积强度对残体氮绝对量的变化具有重要影响，C/N 对分解过程中氮养分的调控 作用更为重要；（

农杆菌介导的单子叶植物早熟禾的转化(英文)

利用种子和胚分别在两种培养基K3和K5诱导产生了早熟禾(Poa pratensis L.)一个品种Mado的胚性愈伤组织。K3培养基含有10.0μmol/L的二氯苯氧乙酸(2,4-D)、0.5μmol/L的苄氨基嘌呤(BAP)。K5培养基是K3另加0.5μmol/L的硫酸铜。光照条件为20～30μmol·m~(-2)·s~(-1)、16h光照、8h黑暗。温度保持在24℃。用携有bar基因和gus基因的pDM805质粒转化的农杆菌AGL1对胚性愈伤组织进行转化。共得到4个转基因株系。影响转基因效率的主要因素

Agrobacterium-mediated transformation of Kentucky bluegrass

Embryogenic calli of Kentucky bluegrass, named Md, were induced from mature seeds and embryos, and proliferated on medium K3 containing 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D, 10.0 mumol/L), 6-benzylaminopurine (BAR, 0.5 mumol/L) and K5 which was the K3 medium supplemented with cupric sulfa (0.5 mumol/L) under dim-light condition (20-30 mumol.m(-2).s-1, 16 h light) at 24 degreesC. Embryogenic calli were transformed with plasmids pDM805 Carring bar and gus genes, Which was mediated by an Agrobacterium strain AGL1, four transgenic lines were obtained. The important factors that affect the transformation efficiency and obtain desirable number of transgenic plants included: (1) the quality of embryogenic calli; (2) light condition and time of co-cultivation; (3) concentration of antibiotics used for suppressing the overgrowth of Agrobacterium in the course of transformed plant regeneration; (4) selection pressure, etc. The micro nutrient of cupric had significant influence on the quality of embryogenic calli. This presentation is the first successful protocol of Kentucky bluegrass transformation mediated by Agrobacterium.