1000 resultados para signalisation cellulaire
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Les anticorps anti-phospholipides (aPL), tels que les anticoagulants lupiques (LAC), sont associs au dveloppement rcurrent de thromboses chez les patients atteints du lupus rythmateux dissmin (LED). Il a t observ que des titres levs dauto-anticorps antilamine B1 (anti-LB1), chez des patients porteurs de LAC, diminuent le risque de ces manifestations thrombotiques. Toutefois, la relation existant entre la lamine B1 (LB1), les anti-LB1 et la thromboprotection nest toujours pas explique. Dans cette tude, nous avons donc cherch comprendre comment la LB1 et les anti-LB1 induisent cette thromboprotection. Nous avons test les effets d'anti-LB1 purifis et de LB1 recombinante sur l'activation des cellules endothliales et des plaquettes. Nous avons t en mesure de dterminer que la LB1, contrairement aux anti-LB1, possde une activit anti-plaquettaire. En effet, la LB1 rduit lactivation et lagrgation plaquettaires in vitro et in vivo. Cette activit est due une liaison directe de la LB1 aux plaquettes, suivie par une internalisation rapide dans des vsicules de clathrine. Par co-immunoprcipitation, nous avons dcouvert que la LB1 interagit avec le rcepteur de linsuline situ sur la membrane plaquettaire. La liaison de la LB1 ce rcepteur entrane vraisemblablement son internalisation et l'inhibition d'une des cascades de signalisation normalement induite par le rcepteur de linsuline, menant ventuellement linhibition des fonctions plaquettaires. Lajout danti-LB1 purifis dans nos expriences a permis d'augmenter de faon significative la persistance de la LB1 dans les plaquettes, une observation confirme par la dtection de LB1 uniquement dans les lysats de plaquettes prleves chez des patients anti-LB1 positifs. iv Nos rsultats suggrent que la LB1 prend part aux mcanismes rgulateurs des processus dhmostase chez des sujets sains et que la prsence danti-LB1, chez les patients lupiques, prolonge la persistance de cet auto-antigne dans les plaquettes, les empchant ainsi de sactiver. Ce mcanisme expliquerait la diminution du risque de thrombose chez les patients LAC positifs porteurs danti-LB1 circulants.
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Le testicule assure la production des spermatozodes et la scrtion de la testostrone. Chaque fonction est assume par un compartiment cellulaire distinct: lpithlium sminifre et le tissu interstitiel. Le cholestrol, prsent dans les deux compartiments, est un compos indispensable aux membranes cellulaires et un prcurseur essentiel de la testostrone. Dans le compartiment interstitiel, environ 40 % du cholestrol utilis pour la production hormonale est import du sang partir des lipoprotines HDL et/ou LDL. Dans lpithlium sminifre, la cellule de Sertoli assure le contrle et le maintien de la spermatogense. Elle a la capacit de synthtiser du cholestrol partir de lactate in vitro, nanmoins, il ny a pas dvidence quelle le fait in vivo. De plus il existe, au niveau des tubules sminifres, une barrire hmato-testiculaire qui empche le libre passage de plusieurs composs sanguins, y compris le cholestrol. Nous avons test lhypothse quil existe des moyens dimportation du cholestrol sanguin, mais aussi lexportation du cholestrol intra-tissulaire, qui contourneraient cette barrire et qui contribueraient au maintien du taux intratubulaire du cholestrol compatible avec le bon droulement de la spermatogense. Nous avons compar les taux de variation de lexpression de lARNm et de la protine des transporteurs slectifs de cholestrol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 aux taux de variation du cholestrol libre et estrifi au cours de la spermatogense chez les souris normales durant le dveloppement postnatal. Afin de mieux apprcier le niveau dimplication de chacun de ces rcepteurs, nous avons examin comment la suppression du gne dune enzyme comme la lypase hormono-sensible (HSL) ou de celui dun transporteur de cholestrol comme SR-BI, CD36 ou NPC1 tait compense et comment cette suppression affectait le taux de cholestrol libre et estrifi dans chacun des deux compartiments cellulaires du testicule. Nous avons dans un premier temps mis au point une nouvelle technique disolation des testicules en fraction enrichie en tissu interstitiel (ITf) et en tubules sminifres (STf) qui a lavantage de mieux prserver lintgrit des formes phosphoryles et glycosyles des protines compare aux techniques prexistantes. Les rsultats de nos analyses ont montr que lexpression de SR-BI et CD36 taient maximales dans les ITf au moment o les souris ont complt leur maturit sexuelle et o le niveau de synthse de la testostrone tait maximal. Dans les tubules sminifres, lexpression maximale de SR-BI et le taux le plus lev de cholestrol estrifi taient mesurs de faon concomitante 35 jours aprs la naissance, au moment o la premire vague de lactivit spermatogntique tait complte. Lexpression de lABCA1 tait maximale au moment o le taux de cholestrol tait lev et minimale au moment o le taux de cholestrol tait le plus bas, alors que le niveau dexpression de CD36 tait maximal chez ladulte au moment o le taux de spermiation tait le plus lev. Lexpression de SR-BII variait peu dans les deux compartiments cellulaires durant le dveloppement. La suppression gntique de la HSL et de NPC1, qui cause une infertilit chez les souris mles, tait accompagne dune accumulation de cholestrol libre et estrifi dans les tubules sminifres. Par contre, la suppression gntique de SR-BI et CD36, qui ne causent pas dinfertilit chez les souris mles tait sans impact significatif sur le taux de cholestrol intratubulaire. Nous avons montr que linvalidation gntique dun transporteur slectif ou dune enzyme du mtabolisme du cholestrol tait accompagne dun ensemble de mcanismes de compensation visant maintenir le taux de cholestrol libre aux niveaux semblables ceux mesurs dans les fractions tissulaires de souris normales. Ensemble, nos rsultats ont montr que lexpression des transporteurs slectifs de cholestrol SR-BI, SR-BII, CD36 et ABCA1 variait en fonction de la spermatogense et du taux intratesticulaire du cholestrol suggrant leur contribution au maintien de lhomostasie du cholestrol intratesticulaire.
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Le transport et la traduction localise des ARN messagers sont observs chez plusieurs organismes et sont requis pour de multiples phnomnes tels la mmoire, la division cellulaire asymtrique et ltablissement des axes durant le dveloppement. Staufen, une protine liant lARN double-brin, a t identifi dans un premier temps chez la mouche fruits Drosophila melanogaster. Il a t montr, chez cet organisme, que Staufen est requis pour la localisation des messagers bicoid et oskar aux ples antrieur et postrieur de lovocyte, respectivement. galement, Staufen est requis afin que la rpression traductionnelle du messager oskar soit leve une fois quil est bien localis. Chez les mammifres, Stau1 est une protine ubiquiste qui est prsente dans des complexes prenant la forme de granules dans les dendrites des neurones. galement, Stau1 peut interagir de faon indpendante de lARN avec le ribosome et cofractionner tant avec la sous-unit 40S quavec la sous-unit 60S du ribosome dans un gradient de saccharose. Limplication de Stau1 dans un mcanisme permettant la drpression traductionnelle de certains ARNm chez les mammifres tait donc une voie dinvestigation intressante. Nous avons donc dcid de vrifier si Stau1 mammifre avait la capacit de stimuler la traduction dun ARNm cellulaire via un mcanisme rgul. Au moment o cette thse a t entreprise, aucun ARNm cellulaire li par Stau1 navait t identifi chez les mammifres. Des structures dARN double-brin ont donc t employes afin de rprimer la traduction dun ARNm rapporteur. Cest ainsi que nous avons montr que Stau1 peut stimuler la traduction dun ARNm lorsquil lie celui-ci dans sa rgion 5 non-traduite. Par la suite, en employant des micropuces dADN, nous avons identifi des messagers cellulaires dont la distribution dans les polysomes lourds est modifie par Stau1. En effet, un groupe de messagers est enrichi dans les polysomes lourds suite une surexpression de Stau1, ce qui suggre que Stau1 stimule la traduction de cette population dARNm. Afin didentifier un mcanisme potentiel de rgulation de lactivit traductionnelle de Stau1, nous nous sommes intresss la capacit dauto-association de cette protine. Nous avons montr que Stau1, tout comme plusieurs protines liant lARN double-brin, est en mesure de sassocier lui-mme, et ce, dune faon indpendante de lARN. Nous avons identifi les dterminants impliqus mettant ainsi au jour un nouveau mcanisme pouvant influencer les activits cellulaires de Stau1. Les rsultats prsents dans cette thse suggrent donc que Stau1 est en mesure de stimuler la traduction dune sous-population prcise dARN messagers au sein de la cellule permettant ainsi de jeter un regard nouveau sur limplication de cette protine dans divers phnomnes au sein de lorganisme.
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Rsum: La Scoliose Idiopathique de lAdolescent (SIA) est une condition dbilitante qui peut avoir comme rsultat une douleur importante, une altration du fonctionnement quotidien et une dtrioration de la qualit de vie. Pour les patients qui ne rpondent pas au traitement conservateur, la fusion vertbrale, en utilisant des greffes osseuses, est devenue un traitement de choix pour stabiliser la colonne. Des connaissances plus pointues propos des facteurs impliqus dans lostognse et la formation de los peuvent raccourcir le processus de gurison et permettre aux patients de rintgrer leurs activits dans un laps de temps plus court. Les plaquettes peuvent jouer un rle important dans la premire tape de la gurison des fractures car elles sont une source autologue de plusieurs facteurs de croissance qui soutiennent la prolifration et la diffrenciation des ostoblastes in vivo et in vitro. Au cours des dernires annes, plusieurs tentatives ont t ralises afin de trouver des traitements additionnels pour : 1) Raccourcir le temps de gurison des fractures relativement long ; 2) Obtenir une plus courte priode de convalescence pour les patients qui ont besoin de prothses ; 3) Corriger plus facilement plusieurs maladies congnitales; 4) Amliorer le processus de fusion vertbrale et 5) Dvelopper de nouvelles approches thrapeutiques, notamment au niveau des processus rgularisant le remodelage osseux et la rgnration des tissus osseux. Dans le cadre de la prsente tude, jai tudi la contribution possible du facteur de croissance de linsuline (IGF) et du facteur vasculaire endothlial de croissance (VEGF) sur la maturation de lostoblaste scoliotique dans des cultures cellulaires in vitro et jai compar les rsultats avec celles obtenues dans les mmes conditions mais en stimulant les ostoblastes avec de la mlatonine. Cette tude prliminaire a t ralise sur des chantillons dos rcolts de quatre patients atteints par la Scoliose Idiopathique de lAdolescent (SIA), ainsi que sur des chantillons dos issus de quatre sujets tmoins (cas traumatiques). Les rsultats montrent que lIGFs et le VEGFs possdent une action dinhibition sur la prolifration dostoblastes scoliotiques et non scoliotiques, et que cette action est proportionnelle la concentration de ces facteurs. Les ostoblastes scoliotiques tendent avoir une prolifration cellulaire plus rapide et plus leve que les tmoins non scoliotiques. De faon gnrale les ostoblastes provenant de patients scoliotiques ont une ostognse in vitro plus acclre que le sujet non scoliotique. De plus, il semble que la mlatonine joue un rle physiologique dans la diffrenciation de lostoblaste scoliotique et elle semble aider avoir une diffrenciation plus prcoce que chez les non traits. Les ostoblastes scoliotiques expriment un dfaut dexpression de lIGF 1 et dIGF 1R en prsence de la mlatonine. En conclusion, le VEGF A et lIGF 1 peuvent galement promouvoir la diffrenciation et la prolifration des ostoblastes humains scoliotiques en culture primaire.
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Le complexe actomyosine, form de lassociation de la myosine II avec les filaments dactine, stabilise le cytosquelette dactine et gnre la contraction cellulaire ncessaire plusieurs processus comme la motilit et lapoptose dans les cellules non-musculaires. La myosine II est un hexamre form dune paire de chanes lourdes (MHCs) et de deux paires de chanes lgres MLC20 et MLC17. La rgulation de lactivit de la myosine II, c'est--dire son interaction avec les filaments dactine, est directement lie ltat de phosphorylation des MLC20, mais il reste beaucoup dcouvrir sur limplication des MHCs. Il existe trois isoformes de MHCs de myosine II, MHCIIA, MHCIIB et MHCIIC qui possdent des fonctions la fois communes et distinctes. Notre but est de mettre en vidence les diffrences de fonction entre les isoformes de myosine II, au niveau structurale, dans la stabilisation du cytosquelette dactine, et au niveau de leur activit contractile, dans la gnration des forces de tension. Nous nous sommes intresss au rle des isoformes des MHCs dans lactivit du complexe actomyosine qui est sollicit durant le processus de contraction cellulaire de lapoptose. Dans quatre lignes cellulaires diffrentes, le traitement conjoint au TNF et la cycloheximide causait la contraction et le rtrcissement des cellules suivi de leur dtachement du support de culture. Par Western blot, nous avons confirm que la phosphorylation des MLC20 est augmente suite au clivage de ROCK1 par la caspase-3, permettant ainsi linteraction entre la myosine II et les filaments dactine et par consquent, la contraction des cellules apoptotiques. Cette contraction est bloque par linhibition des caspases et de ROCK1. MHCIIA est dgrade suite lactivation de la caspase-3 alors que MHCIIB nest pas affecte. En utilisant une ligne cellulaire dficiente en MHCIIB, ou MHCIIB (-/-), nous avons observ que la contraction et le dtachement cellulaires durant linduction de lapoptose se produisaient moins rapidement que dans la ligne de type sauvage (Wt) ce qui suggre que lisoforme B est implique dans la contraction des cellules apoptotiques. Paralllement, la kinase atypique PKC, qui phosphoryle MHCIIB et non MHCIIA, est active durant lapoptose. PKC joue un rle important puisque son inhibition bloque la contraction des cellules apoptotiques. Par la suite, nous nous sommes intresss la modulation de la morphologie cellulaire par la myosine II. Les fibroblastes MHCIIB (-/-), prsentent un large lamellipode dont la formation semble d uniquement labsence de lisoforme MHCIIB, alors que les fibroblastes Wt ont une morphologie cellulaire toile. La formation du lamellipode dans les fibroblastes MHCIIB (-/-) est caractrise par lassociation de la cortactine avec la membrane plasmique. Lobservation en microscopie confocale nous indique que MHCIIA interagit avec la cortactine dans les fibroblastes Wt mais trs peu dans les fibroblastes MHCIIB (-/-). Le bFGF active la voie des MAP kinases dans les fibroblastes Wt et MHCIIB (-/-) et induit des extensions cellulaires aberrantes dans les fibroblastes MHCIIB (-/-). Nos rsultats montrent que limplication de lisoforme B de la myosine II dans la modulation de la morphologie cellulaire. Lensemble de nos rsultats participe distinguer la fonction structurale et contractile de chacune des isoformes de myosine II dans la physiologie cellulaire.
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Le cancer du sein (CS) est la deuxime cause de dcs lis au cancer parmi les femmes dans la plupart des pays industrialiss. Les personnes qui ont le CS peuvent ne pas hriter des mutations causant le cancer de leurs parents. Ainsi, certaines cellules subissent des mutations qui mnent au cancer. Dans le cas de cancer hrditaire, les cellules tumorales contiennent gnralement des mutations qui ne sont pas trouves ailleurs dans l'organisme, mais peuvent maintenir des mutations qui vont rpartir dans toutes les cellules. La gense du CS est le rsultat des mutations de gnes qui assurent la rgulation de la prolifration cellulaire et la rparation de lADN. Deux gnes semblent particulirement concerns par les mutations. Les gnes Breast Cancer 1 (BRCA1) et Breast Cancer 2 (BRCA2), sont impliqus dans la prdisposition gntique de CS. On estime que 5-10% des cas de cancer du sein sont attribuables une prdisposition gntique. La plupart de ces cancers sont lis une anomalie du gne BRCA1 ou BRCA2. Plusieurs tudes ont t menes chez les femmes atteintes de CS sporadique et quelques tudes se sont concentres sur celles qui sont porteuses de mutations de BRCA. Alors, notre recherche a t entreprise afin de vrifier lhypothse dune association entre le CS, le mode vie et les habitudes alimentaires chez les Canadiennes-franaises non porteuses des 6 mutations de BRCA les plus frquentes parmi cette population. Nous avons men une tude cas-tmoins dans cette population. Quelque 280 femmes atteintes du cancer du sein et non-porteuses de mutations de BRCA, ont t recrutes en tant que cas. Les tmoins taient recruts parmi les membres de la famille des cas (n=15) ou partir d'autres familles atteintes de CS (n=265). Les participantes taient de tous ges, recrutes partir dune tude de cohorte qui est actuellement en cours, mene par une quipe de chercheurs au Centre Hospitalier Universitaire de Montral (CHUM) Htel-Dieu Montral. Les apports alimentaires ont t recueillis par un questionnaire de frquence semi-quantitatif valid et administr par une nutritionniste, qui portait sur la priode avant les deux ans prcdant le premier diagnostic de CS pour les cas et la priode avant les deux ans prcdant lentrevue tlphonique pour les tmoins. Un questionnaire de base tait administr par linfirmire de recherche aux participantes afin de colliger des renseignements sociodmographiques et sur les facteurs de risque du CS. Une association positive et significative a t dtecte entre lge (plus de 50 ans) auquel les sujets avaient atteint leur Indice de Masse Corporel (IMC) le plus lev et le CS rapport de cotes (OR) =2,83; intervalle de confiance 95% (IC95%) (2,34-2,91). De plus, une association positive a t dtecte entre un gain de poids de >34 lbs comparativement un gain de poids de 15 lbs, ds lge de 20 ans OR=1,68; IC95% (1,10-2,58). Un gain de poids de >24 lbs comparativement un gain de poids de 9 lbs, ds lge de 30 ans a aussi montr une augmentation de risque de CS OR=1,96; IC95% (1,46-3,06). Une association positive a aussi t dtect entre, un gain de poids de >12 lbs comparativement un gain de poids de 1 lb, ds lge de 40 ans OR=1,91; IC95% (1,53-2,66). Concernant le tabagisme, nous avons observ une association positive et significative relie la consommation de plus de 9 paquets-annes OR = 1,59; IC95% (1,57-2,87). Il fut suggr que lactivit physique modr confre une protection contre le CS: une pratique de > 24,8 (metabolic equivalent) MET-hrs par semaine par rapport 10,7 MET-hrs par semaine, diminue le risque du CS de 52% OR = 0,48 ; IC95% (0,31-0,74). Lactivit physique totale (entre 16,2 et 33,2 MET-hrs par semaine), a aussi montr une rduction de risque de CS de 43% OR = 0,57 ; IC95% (0,37-0,87). Toutefois, il n'y avait aucune association entre une activit physique vigoureuse et le risque de CS. Lanalyse portant sur les macro- et micro-nutriments et les groupes alimentaires a montr quun apport en nergie totale de plus de 2057 Kcal par jour augmentait le risque de CS de 2,5 fois OR = 2,54; IC95% (1,67-3,84). En ce qui concerne la consommation de caf, les participantes qui buvaient plus de 8 tasses de caf par jour avaient un risque de CS augment de 40% OR = 1,40; IC95% (1,09-2,24). Les sujets ayant une consommation dpassant 9 g dalcool (thanol) par jour avaient galement un risque lev de 55% OR = 1,55; IC95% (1,02-2,37). De plus, une association positive et significative a t dtecte entre le CS et la consommation de plus de deux bouteilles de bire par semaine OR = 1,34; IC95% (1,28-2,11), 10 onces de vin par semaine OR = 1,16; IC95% (1,08-2,58) ou 6 onces de spiritueux par semaine OR = 1,09; IC95% (1,02-2,08), respectivement. En rsum, les rsultats de cette recherche supportent lhypothse selon laquelle le mode de vie et les habitudes alimentaires jouent un rle important dans ltiologie de CS chez les Canadiennes-franaises non porteuses de mutations de BRCA. Les rsultats nous permettent de constater que le gain de poids et le tabagisme sont lis des risques levs de CS, tandis que l'activit physique modre aide rduire ce risque. De plus, nos rsultats suggrent quun apport nergtique total relativement lev et une consommation leve de caf et d'alcool peuvent accrotre le risque de ce cancer. Ce travail a permis de mettre laccent sur une nouvelle direction de recherche, jusqu' prsent non investigue. Les rsultats de ce travail de recherche pourraient contribuer recueillir de nouvelles informations et des conseils pouvant influencer et aider la population modifier son mode de vie et ses habitudes alimentaires afin de diminuer le risque de cancer du sein.
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Nos tudes ont dmontres que la formation de la cicatrice et la gurison sont associes avec lapparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) dans la rgion pri-infarcie. Prsentement, ltude examine le mcanisme, tel que lhypoxie ou les hormones neuronales, possiblement impliqu dans leur recrutement et de dvoiler leur origine cellulaire. La prsence de ces cellules a t dtecte dans les coeurs infarcies dune semaine et maintenue aprs neuf mois suite une sujtion coronaire complte. Aussi, ces cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) ont t observes dans le coeur infarci humain. Lhypoxie reprsente un vnement prdominant suite un infarctus de myocarde, mais lexposition des rats normaux un environnement hypoxique na pas pu promouvoir lapparition de ces cellules. Autrement, linfusion de lagoniste -adrnergique non-slectif isoprotrnol (ISO) dans les rats adultes Sprague-Dawley a augment la protine nestine dans le ventricule gauche et a t associ avec la rapparition de cellules de type myocytes cardiaques nestine(+). Cela reprsente possiblement un effet secondaire suite la ncrose des myocytes cardiaques par ladministration disoprotrnol. Dernirement, on a identifi une sous-population de cellules nestine(+) dans le coeur normal du rat qui co-exprime les marqueurs de cellules cardiaques prognitrices Nkx-2.5 et GATA-4. Cette sous-population de cellules nestine/Nkx-2.5/GATA-4 pourrait reprsenter des substrats cellulaires qui puissent se diffrentier en cellules de type myocytes cardiaques nestine(+) suite une ischmie. Mots cls: nestine, isoprotrnol, ncrose, cellule souche, cellule prognitrice, myocyte cardiaque
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La dihydrofolate rductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle la prolifration cellulaire, ce qui en fait une cible de choix pour le traitement de diffrents cancers. cet effet, plusieurs inhibiteurs spcifiques de la DHFRh, les antifolates, ont t mis au point : le mthotrexate (MTX) et le pemetrexed (PMTX) en sont de bons exemples. Malgr lefficacit clinique certaine de ces antifolates, le dveloppement de nouveaux traitements savre ncessaire afin de rduire les effets secondaires lis leur utilisation. Enfin, dans loptique dorienter la synthse de nouveaux composs inhibiteurs des DHFRh, une meilleure connaissance des interactions entre les antifolates et leur enzyme cible est primordiale. laide de lvolution dirige, il a t possible didentifier des mutants de la DHFRh pour lesquels laffinit envers des antifolates cliniquement actifs se voyait modifie. La mutagense dite de saturation a t utilise afin de gnrer des banques de mutants prsentant une diversit gntique au niveau des rsidus du site actif de lenzyme dintrt. De plus, une nouvelle mthode de criblage a t mise au point, laquelle sest avre efficace pour dpartager les mutations ayant entrain une rsistance aux antifolates et/ou un maintient de lactivit enzymatique envers son substrat natif, soient les phnotypes dactivit. La mthode de criblage consiste dans un premier temps en une slection bactrienne haut dbit, puis dans un second temps en un criblage sur plaques permettant didentifier les meilleurs candidats. Plusieurs mutants actifs de la DHFRh, rsistants aux antifolates, ont ainsi pu tre identifis et caractriss lors dtudes de cintique enzymatique (kcat et IC50). Sur la base de ces rsultats cintiques, de la modlisation molculaire et des donnes structurales de la littrature, une tude structure-activit a t effectue. En regardant quelles mutations ont les effets les plus significatif sur la liaison, nous avons commenc construire un carte molculaire des contacts impliqus dans la liaison des ligands. Enfin, des connaissances supplmentaires sur les proprits spcifiques de liaison ont put tre acquises en variant linhibiteur test, permettant ainsi une meilleure comprhension du phnomne de discrimination du ligand.
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Lapoptose des cellules endothliales (CE) reprsente un vnement initial dans le dveloppement de plusieurs pathologies fibrotiques telles que le rejet chronique dallogreffe et la sclrose systmique. Nous avons dmontr que les mdiateurs issus des CE apoptotiques entrane la diffrenciation myofibroblastique et la rsistance lapoptose, deux mcanismes centraux la fibrognse. Lactivation de PI3K (phospatidylinositol-3 kinase) caractrise ces deux mcanismes. Un fragment C-terminal du perlcan (LG3) produit par les CE apoptotiques inhibe lapoptose des fibroblastes. Les objectifs de ce travail taient de : 1. dfinir les rcepteurs et la signalisation impliqus dans la rponse anti-apoptotique et 2. caractriser les mdiateurs fibrogniques responsables de la diffrenciation myofibroblastique. En ce qui a trait la rponse anti-apoptotique, linhibition des intgrines 21 ou des kinases de la famille Src (SFK) chez les fibroblastes prvient la rsistance lapoptose et la phosphorylation dAkt normalement induites par le milieu conditionn par des CE apoptotiques (SSC) ou le LG3. Ces rsultats suggrent que le LG3 produit par les CE apoptotiques initie un tat de rsistance lapoptose chez les fibroblastes par des voies 21integrines/SFK/PI3K dpendantes. Le LG3 ninduit cependant pas la diffrenciation myofibroblastique. Nous avons donc caractris le milieu SSC de faon identifier les mdiateurs responsables de la diffrenciation myofibroblastique. Les milieux conditionns par des CE apoptotiques et non-apoptotiques (respectivement SSC et SSC-ZVAD) ont t analyss comparativement par chromatographie liquide bi-dimensionnelle, immunobuvardage et spectromtrie de masse. Le connective tissue growth factor (CTGF) est le seul facteur fibrognique connu augment dans le milieu SSC. Linhibition de la caspase-3 chez les CE prvient la relche de CTGF. Au niveau du fibroblaste, linhibition de SFK ou de Pyk2 (proline-rich tyrosine kinase-2) prvient la diffrenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF in vitro. Lanticorps neutralisant contre le TGF- (Transforming growth factor beta) nest pas en mesure de bloquer la diffrenciation myofibroblastique induite par le SSC ou le CTGF. Des injections quotidiennes sous-cutanes de SSC chez la souris C3H pour 3 semaines entrane une augmentation de lpaisseur de la peau et des niveaux protiques dSMA, de vimentine et de collagne I. Cette rponse fibrognique est rduite chez les souris qui ont reu le SSC-ZVAD ou le SSC immunodplt de son CTGF. Ces rsultats apportent de nouvelles issues mcanistiques au niveau de la rponse fibrognique active par la mort des CE. Lactivation des caspases chez les CE apoptotiques entrane la production de LG3 et de CTGF qui, leur tour, activent des voies de signalisation pro-fibrotiques SFK/PI3K dpendantes chez les fibroblastes, et ce indpendamment du TGF-.
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La dihydrofolate rductase humaine (DHFRh) est une enzyme essentielle la prolifration cellulaire. Elle rduit le dihydrofolate en ttrahydrofolate, un co-facteur impliqu dans la biosynthse des purines et du thymidylate. La DHFRh est une cible de choix pour des agents de chimiothrapie comme le mthotrexate (MTX), inhibant spcifiquement lenzyme ce qui mne un arrt de la prolifration et ultimement la mort cellulaire. Le MTX est utilis pour le traitement de plusieurs maladies prolifratives, incluant le cancer. La grande utilisation du MTX dans le milieu clinique a men au dveloppement de mcanismes de rsistance, qui rduisent lefficacit de traitement. La prsente tude se penche sur lun des mcanismes de rsistance, soit des mutations dans la DHFRh qui rduisent son affinit pour le MTX, dans le but de mieux comprendre les lments molculaires requis pour la reconnaissance de linhibiteur au site actif de lenzyme. En parallle, nous visons identifier des variantes plus rsistantes au MTX pour leur utilisation en tant que marqueurs de slection en culture cellulaire pour des systmes particuliers, tel que la culture de cellules hmatopotiques souches (CHS), qui offrent des possibilits intressantes dans le domaine de la thrapie cellulaire. Pour tudier le rle des diffrentes rgions du site actif, et pour vrifier la prsence dune corrlation entre des mutations ces rgions et une augmentation de la rsistance au MTX, une stratgie combinatoire a t dvelope pour la cration de plusieurs banques de variantes des rsidus du site actif proximit du MTX li. Les banques ont t slectionnes in vivo dans un systme bactrien en utilisant des milieux de croissance contenant des hautes concentrations de MTX. La banque DHFRh 31/34/35 gnra un nombre considrable de variantes combinatoires de la DHFRh hautement rsistantes au MTX. Les variantes les plus intressantes ont t testes pour leur potentiel en tant que marqueur de slection dans plusieurs lignes cellulaires, dont les cellules hmatopotiques transduites. Une protection complte contre les effets cytotoxiques du MTX a t observe chez ces cellules suite leur infection avec les variantes combinatoires. Pour mieux comprendre les causes molculaires relies la rsistance au MTX, des tudes de structure tridimensionnelle de variantes lies au MTX ont t entreprises. La rsolution de la structure de la double variante F31R/Q35E li au MTX a rvl que le phnotype de rsistance tait attribuable dimportantes diffrences entre le site actif de la double variante et de lenzyme native, possiblement d un phnomme dynamique. Une comprhension plus gnrale de la reconnaissance et la rsistance aux antifolates a t ralise en comparant des squences et des structures de variantes de la DHFR rsistants aux antifolates et provenant de diffrentes espces. En somme, ces travaux apportent de nouveaux lments pour la comprehension des intractions importantes entre une enzyme et un ligand, pouvant aider au dveloppement de nouveaux antifolates plus efficaces pour le traitement de diverses maladies. De plus, ces travaux ont gnr de nouveaux gnes de rsistance pouvant tre utiliss en tant que marqueurs de slection en biologie cellulaire.
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La transcription, la maturation dARN, et le remodelage de la chromatine sont tous des processus centraux dans l'interprtation de l'information contenue dans lADN. Bien que beaucoup de complexes de protines formant la machinerie cellulaire de transcription aient t tudis, plusieurs restent encore identifier et caractriser. En utilisant une approche protomique, notre laboratoire a purifi plusieurs composantes de la machinerie de transcription de lARNPII humaine par double chromatographie daffinit "TAP". Cette procdure permet l'isolement de complexes protiques comme ils existent vraisemblablement in vivo dans les cellules mammifres, et l'identification de partenaires d'interactions par spectromtrie de masse. Les interactions protiques qui sont valides bioinformatiquement, sont choisies et utilises pour cartographier un rseau connectant plusieurs composantes de la machinerie transcriptionnelle. En appliquant cette procdure, notre laboratoire a identifi, pour la premire fois, un groupe de protines, qui interagit physiquement et fonctionnellement avec lARNPII humaine. Les proprits de ces protines suggrent un rle dans l'assemblage de complexes plusieurs sous-units, comme les protines d'chafaudage et chaperonnes. L'objectif de mon projet tait de continuer la caractrisation du rseau de complexes protiques impliquant les facteurs de transcription. Huit nouveaux partenaires de lARNPII (PIH1D1, GPN3, WDR92, PFDN2, KIAA0406, PDRG1, CCT4 et CCT5) ont t purifis par la mthode TAP, et la spectromtrie de masse a permis didentifier de nouvelles interactions. Au cours des annes, lanalyse par notre laboratoire des mcanismes de la transcription a contribu apporter de nouvelles connaissances et mieux comprendre son fonctionnement. Cette connaissance est essentielle au dveloppement de mdicaments qui cibleront les mcanismes de la transcription.
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Les gnes suppresseurs de tumeurs (TSGs) contrlent la prolifration cellulaire et leur inactivation joue un rle important dans la leucmognse. Deux mcanismes pigntiques majeurs sont impliqus dans la rpression des TSGs: 1- la mthylation de lADN et 2- la dactylation des histones des chromosomes. On les dit pigntiques car ils naffectent pas la squence de lADN. Ces phnomnes sont rversibles, faisant donc deux des cibles thrapeutiques de choix. Dans le cadre de cette thse, nous avons valu le potentiel chimiothrapeutique de diffrents agents qui visent ces mcanismes pigntiques et nous les avons administrs seuls et en combinaison dans le but damliorer leur efficacit. La 5-aza-2-dsoxycytidine (5-Aza-CdR) est un inhibiteur de la mthylation de lADN qui permet la r-expression des TSGs. Cet agent sest avr efficace contre certaines maladies hmatologiques et est dailleurs approuv aux tats-Unis dans le traitement du syndrome mylodysplasique depuis 2006. Cependant, le protocole dadministration optimal de cet agent, en termes de doses et de dure, nest toujours pas tabli. Nos recherches suggrent que le celui-ci devrait tre plus intensif que ce que rapporte la littrature. Les inhibiteurs des dactylases des histones (HDACi) ont galement montr une activit antinoplasique intressante. De rcentes recherches ont montr que la combinaison dagents ciblant la fois la mthylation de lADN et la dactylation des histones produit une ractivation synergique des TSGs, ce quoi nous nous sommes intress. Nous avons observ que la co-administration dun HDACi avec la 5-Aza-CdR potentialise son action anti-leucmique. Il est aussi possible daugmenter lactivit de la 5-Aza-CdR en inhibant sa dgradation par lenzyme cytidine (CR) dsaminase. Nous avons observ que la co-administration du zebularine, un inhibiteur de la CR dsaminase, avec la 5-Aza-CdR accrot son efficacit. Le zebularine est aussi un inhibiteur de la mthylation de lADN, ce qui pourrait contribuer la potentialisation de la rponse anti-leucmique observe lors de la co-administration de ces deux agents. En rsum, il est possible daugmenter lefficacit anti-leucmique de la 5-Aza-CdR en : 1- intensifiant son protocole dadministration, en termes de doses et de dure, 2- la combinant avec un HDACi, et 3- diminuant sa dgradation par la CR dsaminase. Lutilisation de ces rsultats prcliniques dans llaboration de protocoles cliniques pourrait tre bnfique beaucoup de patients.
Resumo:
La susceptibilit ou la rsistance aux cancers peuvent impliquer plusieurs mcanismes, incluant lapoptose, la croissance cellulaire et la diffrenciation, la rplication et la rparation de lADN. Mon projet porte plus particulirement sur lapoptose. Une drgulation dans les voies dactivation de lapoptose entrane une accumulation de cellules drgles, crant ainsi un environnement propice linstabilit gntique et au dveloppement du cancer. Comme lapoptose est une voie biologique hautement rgule, nous proposons lhypothse que des polymorphismes fonctionnels dans les rgions de rgulations des gnes (rSNPs) perturberaient cette voie cause de taux variables de transcrits et des protines correspondantes d la modification des sites de reconnaissances des facteurs de transcription. Les principaux objectifs de mon projet sont : (i) identifier les SNPs prsents dans la rgion promotrice des gnes dapoptose; (ii) dterminer les haplotypes de promoteurs les plus frquents prsents dans la population gnrale; (rHaps) (iii) vrifier leurs impacts fonctionnels sur lexpression gnique par des essais in vitro (gne rapporteur et retard sur gel). Cette tude permettra didentifier des rSNPs et rHaps ayant un impact sur le niveau dexpression des gnes dapoptose, au moins dans un contexte in vitro. Ces diffrences allliques au niveau de lexpression de ces gnes dapoptose pourraient contribuer la susceptibilit interindividuelle de dvelopper un cancer.
Resumo:
Le bleuet dmontre un potentiel thrapeutique dans le traitement du cancer et des maladies cardiovasculaires et neurodgnratives. Ces effets bnfiques sont attribuables aux composs phnoliques abondants dans le bleuet, tels que les anthocyanines et les flavonodes. La biotransformation du jus de bleuet avec les bactries Serratia vaccinii augmente sa teneur en composs phnoliques et son activit anti-oxydante, et modifie ses activits physiologiques. Lobjectif de la prsente tude est dvaluer lactivit neuroprotectrice et le potentiel antidiabtique du jus de bleuet biostranform (BJ). Le BJ est tudi dans diffrents tests dont : 1) La protection des neurones (N2a) contre le stress oxydatif (SO) induit par le peroxyde dhydrogne; 2) La stimulation de la prise de glucose par les cellules musculaires (C2C12) et adipeuses (3T3-L1); 3) Lactivit anti-hyperglycmique chez les souris obses diabtiques KKAy. En effet, tandis que le jus de bleuet normal na aucun effet, le BJ augmente lactivit des enzymes anti-oxydantes, comme la catalase et la SOD (Superoxide Dimutase) et protge les neurones contre les changements de la signalisation des MAPKs et contre la toxicit induite par le peroxyde dhydrogne. Le BJ augmente aussi la prise de glucose de 48% dans les cellules C2C12 et de 142% dans les cellules 3T3-L1. Cette augmentation nest pas explique par une augmentation du calcium cytosolique mais plutt par une stimulation de la phosphorylation de lAMPK. De plus, le BJ inhibe ladipogense chez les 3T3-L1. Le BJ diminue galement lhyperglycmie chez les souris obses diabtiques KKAy et protge les jeunes souris pr-diabtiques contre le dveloppement de lobsit et du diabte. Lactivit anti-hyperglycmique du BJ pourrait impliquer les adipokines puisque le BJ augmente le niveau dadiponectine chez les souris diabtiques. Le BJ reprsente ainsi une approche prometteuse pour le traitement du diabte et les maladies neurodgnratives et une source de nouveaux agents thrapeutiques contre ces maladies.
Resumo:
Nous avons tudi les relations anatomiques entre les systmes de neurotransmission substance P (SP) et srotonine (5-hydroxytryptamine, 5-HT) dans le noyau du raph dorsal (NRD) du rongeur, afin de mieux comprendre les interactions entre ces systmes durant la rgulation de lhumeur. Le NRD reoit une innervation SP provenant de lhabenula, et le blocage pharmacologique des rcepteurs neurokinine-1 (rNK1) de la SP aurait des effets antidpresseurs. Chez le rongeur, le traitement par les antagonistes des rNK1 saccompagne dune dsensibilisation des autorcepteurs 5-HT1A de la 5-HT et dune hausse de lactivit des neurones 5-HT dans le NRD, suggrant des interactions locales entre ces deux systmes. Dans un premier temps, nous avons dmontr par doubles marquages immunocytochimiques en microscopies optique, confocale et lectronique, la prsence du rNK1 dans une sous-population de neurones 5-HT du NRD caudal. Lors de lanalyse en microscopie lectronique, nous avons pu constater que les rNK1 taient principalement cytoplasmiques dans les neurones 5-HT et membranaires sur les neurones non 5-HT du noyau. Grce dautres doubles marquages, nous avons aussi pu identifier les neurones non-5-HT porteurs de rNK1 comme tant GABAergiques. Nous avons ensuite combin limmunomarquage de la SP avec celui du rNK1, dans le but dexaminer les relations entre les terminaisons (varicosits *) axonales SP et les neurones 5-HT (pourvus de rNK1 cytoplasmiques du NRD caudal. En simple marquage de la SP, nous avons pu estimer 41% la frquence avec laquelle les terminaisons SP font synapse. Dans le matriel doublement marqu pour la SP et son rcepteur, les terminaisons SP ont t frquemment retrouves en contact direct ou proximit des dendrites munies de rNK1 cytoplasmiques, mais toujours loignes des dendrites rNK1 membranaires. Pour tester lhypothse dune internalisation soutenue des rNK1 par la SP dans les neurones 5-HT, nous avons ensuite examin la localisation subcellulaire du rcepteur chez le rat trait avec un antagoniste du rNK1, le RP67580. La densit du marquage des rNK1 a t mesure dans le cytoplasme et sur la membrane des deux types de dendrites (5-HT: rNK1 cytoplasmiques; non 5-HT: rNK1 membranaires). Une heure aprs une injection unique de lantagoniste, la distribution du rNK1 est apparue inchange dans les deux types de neurones (5-HT et non 5-HT). Par contre, aprs un traitement quotidien de 7 ou 21 jours avec lantagoniste, nous avons mesur une augmentation significative des densits cytoplasmique et membranaire du rNK1 dans les neurones 5-HT, sans aucun changement dans les neurones non 5-HT. Ces traitements ont aussi augment lexpression du gne rNK1 dans le NRD. Enfin, nous avons mesur une hausse de la densit membranaire du rNK1 dans les neurones 5-HT, sans hausse de densit cytoplasmique, par suite dune lsion bilatrale de lhabenula. Ces rsultats confortent lhypothse dune activation et dune internalisation soutenues des rNK1 par la SP dans les neurones 5-HT du NRD caudal. Ils suggrent aussi que le trafic des rNK1 dans les neurones 5-HT du NRD reprsente un mcanisme cellulaire en contrle de lactivation du systme 5-HT par les affrences SP en provenance de lhabenula.
