Molecular characterization of the contribution of autophagy to antigen presentation using quantitative proteomics

L’autophagie est une voie hautement conservée de dégradation lysosomale des constituants cellulaires qui est essentiel à l’homéostasie cellulaire et contribue à l’apprêtement et à la présentation des antigènes. Les rôles relativement récents de l'autophagie dans l'immunité innée et acquise sous-tendent de nouveaux paradigmes immunologiques pouvant faciliter le développement de nouvelles thérapies où la dérégulation de l’autophagie est associée à des maladies auto-immunes. Cependant, l'étude in vivo de la réponse autophagique est difficile en raison du nombre limité de méthodes d'analyse pouvant fournir une définition dynamique des protéines clés impliquées dans cette voie. En conséquence, nous avons développé un programme de recherche en protéomique intégrée afin d’identifier et de quantifier les proteines associées à l'autophagie et de déterminer les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l’autophagosome dans la présentation antigénique en utilisant une approche de biologie des systèmes. Pour étudier comment l'autophagie et la présentation antigénique sont activement régulés dans les macrophages, nous avons d'abord procédé à une étude protéomique à grande échelle sous différentes conditions connues pour stimuler l'autophagie, tels l’activation par les cytokines et l’infection virale. La cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) est l'une des principales cytokines pro-inflammatoires qui intervient dans les réactions locales et systémiques afin de développer une réponse immune adaptative. La protéomique quantitative d'extraits membranaires de macrophages contrôles et stimulés avec le TNF-alpha a révélé que l'activation des macrophages a entrainé la dégradation de protéines mitochondriales et des changements d’abondance de plusieurs protéines impliquées dans le trafic vésiculaire et la réponse immunitaire. Nous avons constaté que la dégradation des protéines mitochondriales était sous le contrôle de la voie ATG5, et était spécifique au TNF-alpha. En outre, l’utilisation d’un nouveau système de présentation antigènique, nous a permi de constater que l'induction de la mitophagie par le TNF-alpha a entrainée l’apprêtement et la présentation d’antigènes mitochondriaux par des molécules du CMH de classe I, contribuant ainsi la variation du répertoire immunopeptidomique à la surface cellulaire. Ces résultats mettent en évidence un rôle insoupçonné du TNF-alpha dans la mitophagie et permet une meilleure compréhension des mécanismes responsables de la présentation d’auto-antigènes par les molécules du CMH de classe I. Une interaction complexe existe également entre infection virale et l'autophagie. Récemment, notre laboratoire a fourni une première preuve suggérant que la macroautophagie peut contribuer à la présentation de protéines virales par les molécules du CMH de classe I lors de l’infection virale par l'herpès simplex virus de type 1 (HSV-1). Le virus HSV1 fait parti des virus humains les plus complexes et les plus répandues. Bien que la composition des particules virales a été étudiée précédemment, on connaît moins bien l'expression de l'ensemble du protéome viral lors de l’infection des cellules hôtes. Afin de caractériser les changements dynamiques de l’expression des protéines virales lors de l’infection, nous avons analysé par LC-MS/MS le protéome du HSV1 dans les macrophages infectés. Ces analyses nous ont permis d’identifier un total de 67 protéines virales structurales et non structurales (82% du protéome HSV1) en utilisant le spectromètre de masse LTQ-Orbitrap. Nous avons également identifié 90 nouveaux sites de phosphorylation et de dix nouveaux sites d’ubiquitylation sur différentes protéines virales. Suite à l’ubiquitylation, les protéines virales peuvent se localiser au noyau ou participer à des événements de fusion avec la membrane nucléaire, suggérant ainsi que cette modification pourrait influer le trafic vésiculaire des protéines virales. Le traitement avec des inhibiteurs de la réplication de l'ADN induit des changements sur l'abondance et la modification des protéines virales, mettant en évidence l'interdépendance des protéines virales au cours du cycle de vie du virus. Compte tenu de l'importance de la dynamique d'expression, de l’ubiquitylation et la phosphorylation sur la fonction des proteines virales, ces résultats ouvriront la voie vers de nouvelles études sur la biologie des virus de l'herpès. Fait intéressant, l'infection HSV1 dans les macrophages déclenche une nouvelle forme d'autophagie qui diffère remarquablement de la macroautophagie. Ce processus, appelé autophagie associée à l’enveloppe nucléaire (nuclear envelope derived autophagy, NEDA), conduit à la formation de vésicules membranaires contenant 4 couches lipidiques provenant de l'enveloppe nucléaire où on retrouve une grande proportion de certaines protéines virales, telle la glycoprotéine B. Les mécanismes régissant NEDA et leur importance lors de l’infection virale sont encore méconnus. En utilisant un essai de présentation antigénique, nous avons pu montrer que la voie NEDA est indépendante d’ATG5 et participe à l’apprêtement et la présentation d’antigènes viraux par le CMH de classe I. Pour comprendre l'implication de NEDA dans la présentation des antigènes, il est essentiel de caractériser le protéome des autophagosomes isolés à partir de macrophages infectés par HSV1. Aussi, nous avons développé une nouvelle approche de fractionnement basé sur l’isolation de lysosomes chargés de billes de latex, nous permettant ainsi d’obtenir des extraits cellulaires enrichis en autophagosomes. Le transfert des antigènes HSV1 dans les autophagosomes a été determine par protéomique quantitative. Les protéines provenant de l’enveloppe nucléaire ont été préférentiellement transférées dans les autophagosome lors de l'infection des macrophages par le HSV1. Les analyses protéomiques d’autophagosomes impliquant NEDA ou la macroautophagie ont permis de decouvrir des mécanismes jouant un rôle clé dans l’immunodominance de la glycoprotéine B lors de l'infection HSV1. Ces analyses ont également révélées que diverses voies autophagiques peuvent être induites pour favoriser la capture sélective de protéines virales, façonnant de façon dynamique la nature de la réponse immunitaire lors d'une infection. En conclusion, l'application des méthodes de protéomique quantitative a joué un rôle clé dans l'identification et la quantification des protéines ayant des rôles importants dans la régulation de l'autophagie chez les macrophages, et nous a permis d'identifier les changements qui se produisent lors de la formation des autophagosomes lors de maladies inflammatoires ou d’infection virale. En outre, notre approche de biologie des systèmes, qui combine la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse avec des essais fonctionnels tels la présentation antigénique, nous a permis d’acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires régissant les fonctions de l'autophagie lors de la présentation antigénique. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettra de réduire les effets nuisibles de l'immunodominance suite à l'infection virale ou lors du développement du cancer en mettant en place une réponse immunitaire appropriée.

Biology and characterisation of polyalanine as an emerging pathological marker

Dix-huit maladies humaines graves ont jusqu'ici été associées avec des expansions de trinucléotides répétés (TNR) codant soit pour des polyalanines (codées par des codons GCN répétés) soit pour des polyglutamines (codées par des codons CAG répétés) dans des protéines spécifiques. Parmi eux, la dystrophie musculaire oculopharyngée (DMOP), l’Ataxie spinocérébelleuse de type 3 (SCA3) et la maladie de Huntington (MH) sont des troubles à transmission autosomale dominante et à apparition tardive, caractérisés par la présence d'inclusions intranucléaires (IIN). Nous avons déjà identifié la mutation responsable de la DMOP comme étant une petite expansion (2 à 7 répétitions supplémentaires) du codon GCG répété du gène PABPN1. En outre, nous-mêmes ainsi que d’autres chercheurs avons identifié la présence d’événements de décalage du cadre de lecture ribosomique de -1 au niveau des codons répétés CAG des gènes ATXN3 (SCA3) et HTT (MH), entraînant ainsi la traduction de codons répétés hybrides CAG/GCA et la production d'un peptide contenant des polyalanines. Or, les données observées dans la DMOP suggèrent que la toxicité induite par les polyalanines est très sensible à leur quantité et leur longueur. Pour valider notre hypothèse de décalage du cadre de lecture dans le gène ATXN3 dans des modèles animaux, nous avons essayé de reproduire nos constatations chez la drosophile et dans des neurones de mammifères. Nos résultats montrent que l'expression transgénique de codons répétés CAG élargis dans l’ADNc de ATXN3 conduit aux événements de décalage du cadre de lecture -1, et que ces événements sont néfastes. À l'inverse, l'expression transgénique de codons répétés CAA (codant pour les polyglutamines) élargis dans l’ADNc de ATXN3 ne conduit pas aux événements de décalage du cadre de lecture -1, et n’est pas toxique. Par ailleurs, l’ARNm des codons répétés CAG élargis dans ATXN3 ne contribue pas à la toxicité observée dans nos modèles. Ces observations indiquent que l’expansion de polyglutamines dans nos modèles drosophile et de neurones de mammifères pour SCA3 ne suffit pas au développement d'un phénotype. Par conséquent, nous proposons que le décalage du cadre de lecture ribosomique -1 contribue à la toxicité associée aux répétitions CAG dans le gène ATXN3. Pour étudier le décalage du cadre de lecture -1 dans les maladies à expansion de trinucléotides CAG en général, nous avons voulu créer un anticorps capable de détecter le produit présentant ce décalage. Nous rapportons ici la caractérisation d’un anticorps polyclonal qui reconnaît sélectivement les expansions pathologiques de polyalanines dans la protéine PABPN1 impliquée dans la DMOP. En outre, notre anticorps détecte également la présence de protéines contenant des alanines dans les inclusions intranucléaires (IIN) des échantillons de patients SCA3 et MD.

A Study on the Reversed Lack of Memory Property and its Generalizations

In this thesis, the concept of reversed lack of memory property and its generalizations is studied.We we generalize this property which involves operations different than the ”addition”. In particular an associative, binary operator ” * ” is considered. The univariate reversed lack of memory property is generalized using the binary operator and a class of probability distributions which include Type 3 extreme value, power function, reflected Weibull and negative Pareto distributions are characterized (Asha and Rejeesh (2009)). We also define the almost reversed lack of memory property and considered the distributions with reversed periodic hazard rate under the binary operation. Further, we give a bivariate extension of the generalized reversed lack of memory property and characterize a class of bivariate distributions which include the characterized extension (CE) model of Roy (2002a) apart from the bivariate reflected Weibull and power function distributions. We proved the equality of local proportionality of the reversed hazard rate and generalized reversed lack of memory property. Study of uncertainty is a subject of interest common to reliability, survival analysis, actuary, economics, business and many other fields. However, in many realistic situations, uncertainty is not necessarily related to the future but can also refer to the past. Recently, Di Crescenzo and Longobardi (2009) introduced a new measure of information called dynamic cumulative entropy. Dynamic cumulative entropy is suitable to measure information when uncertainty is related to the past, a dual concept of the cumulative residual entropy which relates to uncertainty of the future lifetime of a system. We redefine this measure in the whole real line and study its properties. We also discuss the implications of generalized reversed lack of memory property on dynamic cumulative entropy and past entropy.In this study, we extend the idea of reversed lack of memory property to the discrete set up. Here we investigate the discrete class of distributions characterized by the discrete reversed lack of memory property. The concept is extended to the bivariate case and bivariate distributions characterized by this property are also presented. The implication of this property on discrete reversed hazard rate, mean past life, and discrete past entropy are also investigated.

Studies Using Computer Simulation Models to Solve Problems Related to Logistics Terminals

This thesis deals with the use of simulation as a problem-solving tool to solve a few logistic system related problems. More specifically it relates to studies on transport terminals. Transport terminals are key elements in the supply chains of industrial systems. One of the problems related to use of simulation is that of the multiplicity of models needed to study different problems. There is a need for development of methodologies related to conceptual modelling which will help reduce the number of models needed. Three different logistic terminal systems Viz. a railway yard, container terminal of apart and airport terminal were selected as cases for this study. The standard methodology for simulation development consisting of system study and data collection, conceptual model design, detailed model design and development, model verification and validation, experimentation, and analysis of results, reporting of finding were carried out. We found that models could be classified into tightly pre-scheduled, moderately pre-scheduled and unscheduled systems. Three types simulation models( called TYPE 1, TYPE 2 and TYPE 3) of various terminal operations were developed in the simulation package Extend. All models were of the type discrete-event simulation. Simulation models were successfully used to help solve strategic, tactical and operational problems related to three important logistic terminals as set in our objectives. From the point of contribution to conceptual modelling we have demonstrated that clubbing problems into operational, tactical and strategic and matching them with tightly pre-scheduled, moderately pre-scheduled and unscheduled systems is a good workable approach which reduces the number of models needed to study different terminal related problems.

Virulence Potential And Antibiotic Susceptibility Pattern Of Motile Aeromonads Associated With Freshwater Ornamental Fish Culture Systems: A Possible Threat To public Health

Aeromonas spp. are ubiquitous aquatic organisms, associated with multitude of diseases in several species of animals, including fishes and humans. In the present study, water samples from two ornamental fish culture systems were analyzed for the presence of Aeromonas. Nutrient agar was used for Aeromonas isolation, and colonies (60 No) were identified through biochemical characterization. Seven clusters could be generated based on phenotypic characters, analyzed by the programme NTSYSpc, Version 2.02i, and identified as: Aeromonas caviae (33.3%), A. jandaei (38.3%) and A. veronii biovar sobria (28.3%). The strains isolated produced highly active hydrolytic enzymes, haemolytic activity and slime formation in varying proportions. The isolates were also tested for the enterotoxin genes (act, alt and ast), haemolytic toxins (hlyA and aerA), involved in type 3 secretion system (TTSS: ascV, aexT, aopP, aopO, ascF–ascG, and aopH), and glycerophospholipid-cholesterol acyltransferase (gcat). All isolates were found to be associated with at least one virulent gene. Moreover, they were resistant to frequently used antibiotics for human infections. The study demonstrates the pathogenic potential of Aeromonas, associated with ornamental fish culture systems suggesting the emerging threat to public health

Acción de organizaciones no gubernamentales frente a las semillas genéticamente modificadas en Colombia

Los efectos ambientales, económicos, sociales y culturales generados por las Semillas Genéticamente Modificadas-SGM y su control por empresas transnacionales como Monsanto, han incentivado la acción colectiva liderada por ONGs, tanto internacionalmente como en Colombia. El objetivo principal es analizar cómo la ONG “Semillas” ha incidido en las políticas colombianas relacionadas con la introducción y uso de SGM durante el periodo 2002-2013. Se centra en la Teoría de Redes Transnacionales de Defensa expuesta por M. Keck y K. Sikkink (1998). Además, se analiza el papel de las ONGs ambientales y las corporaciones transnacionales. El argumento central es que al crear vínculos con actores nacionales e internacionales y vincularse con redes y campañas con impacto transnacional, “Semillas” ha posicionado la lucha en contra de las SGM y ha logrado presionar al Estado influyendo parcialmente en sus políticas y leyes, al igual que en su posición y discurso frente al uso de SGM.

Impacto del proceso de eliminación del doble conteo del material importado por Carbones del Cerrejón Limited en términos de eficiencia y efectividad en el proceso de nacionalización y liberación del material

La operación de mega minería que abarca CERREJON se desarrolla bajo lo más altos estándares de seguridad y calidad, con el compromiso de entregar al mercado un excelente producto y evitando el deterioro del entorno. Uno de los puntos más fuertes de la compañía se haya en la integración de los procesos productivos entre la mina de carbón, el ferrocarril y el puerto, logrando que la operación sea eficiente y que garantice niveles altos de óptimos resultados y que los porcentajes de falla no existan o cada vez sean menores en el proceso de explotación y transporte del carbón de Colombia hacia el mundo. El departamento de MATERIALES es el punto de origen para garantizar que se desarrolle la operación, dado que el departamento tiene la gran labor de adquirir y entregar los bienes y servicios requeridos por la Compañía al más bajo costo total evaluado, en el menor tiempo posible y bajo el marco de la legislación Colombiana en el proceso de nacionalización, con un alto énfasis en el desarrollo de relaciones fuertes y sinérgicas entre todos los eslabones de la cadena. Todo el proceso del departamento se enmarca dentro de un ciclo que debe encaminarse a ser cada vez más efectivo y eficiente; de allí que se busquen opciones de mejoramiento para afinar los procesos. Para que sea posible y factible manejar una mega operación como esta se requiere afinar al máximo la red que se establece en su cadena de abastecimiento, buscando lograr un flujo de producto, información y fondos que garanticen disponibilidad del producto, para así generar una rentabilidad alta a la compañía, y controlar los costos por la operación. Dado que la cadena de suministro es susceptible a mejoras, gracias a la interacción con los proveedores, colaboradores y clientes; se pretende sacar el mejor provecho de esto, a través del análisis de la cadena actual de CERREJON; presentando una opción de mejora en uno de los eslabones del proceso productivo, esta opción ha sido contemplada desde años anteriores, pero en esta ocasión gracias a la integración de afinamientos en los sistemas de información, y la participación activa de los proveedores, se encuentra una opción viable de la eliminación de un reproceso, que garantiza eficiencia y efectividad en la agilización del ciclo de producción en CERREJON. A través de la ejecución del proyecto de reforma del conteo, se presenta la oportunidad de mejoramiento en la cadena del departamento; el proceso de reconteo en la mina, realizado posteriormente al conteo inicial en Puerto Bolívar, de los materiales que llegan importados vía marítima. El proceso de afinamiento del recibo documental en el consolidador de carga y los mayores proveedores de entrega directa (HITACHI y MCA) al transportador, genera la opción del uso de terminales portátiles, que de la mano con los ajustes documentales, permitirán que la carga sea contada y separada por localización, para enviarla vía tren a LMN, reduciendo tiempo de entrega al cliente final, los costos de remanejo al volver a contar, y los costos asociados a las entregas no oportunas de devolución de contenedores.

Módulo didáctico para el laboratorio de inmunología

este documento es un módulo de estudio con el cual usted desarrolla su aprendizaje básico sobre la asignatura, es un apoyo: no se contenté sólo con él: permítase investigar y ampliar su aprendizaje con lecturas apropiadas para cada tema

Estructura i dinàmica del sistema bentònic en llacunes costaneres dels aiguamolls de l'Empordà

S'ha estudiat l'estructura i dinàmica del sistema bentònic de llacunes costaneres de la maresma dels aiguamolls de l'Empordà (NE de la península Ibèrica) i els factors que les determinen. Amb aquesta finalitat es van prendre mostres d'organismes del bentos (mensualment), nutrients i pigments de l'aigua (setmanalment) i el sediment (mensualment), així com paràmetres físics de l'aigua (setmanalment), durant dos cicles d'inundació (1997-1998 i 1998-1999). En aquesta maresma els factors determinants per als organismes bentònics i el contingut en nutrients del sediment són principalment físics: el grau de permanència de l'aigua, el confinament i la granulometria. De manera que els factors tròfics tenen menys pes que els físics tal com es posa de manifest amb les associacions de nematodes. El règim hídric de les llacunes integra des del grau de permanència de l'aigua fins a la salinitat i el confinament, per la qual cosa a partir de la caracterització dels diferents tipus de règim hídric es poden discriminar les tres tipologies d'ambients amb comunitats bentòniques diferenciades en l'estructura, la composició i la dinàmica temporal. Així, les tres comunitats diferenciades són: (1) la d'aigües permanents caracteritzada per una riquesa i diversitat elevades i constants en el temps, i per un nombre més elevat de tàxons sense adaptacions per passar situacions adverses; (2) la d'aigües semipermanents i temporànies d'inundació pulsativa, caracteritzada per una menor riquesa i diversitat, i per la dominància d'organismes amb estructures de resistència per passar la fase seca i aguantar condicions desfavorables, i (3) la d'aigües temporànies d'inundació continuada, caracteritzada per una major variabilitat de la riquesa i diversitat al llarg del cicle i per una singularitat taxonòmica més elevada, ja que s'observen cladòcers i una major representació taxonòmica dels insectes. Durant la realització d'aquest estudi els dos cicles d'inundació van suposar entrades d'aigua en el sistema diferents, per això es va diferenciar un cicle humit (1997-1998) i un de sec (1998-1999). En relació amb la major importància de les entrades d'aigua en el sistema, es va observar un contingut en nutrients de l'aigua significativament superior durant el cicle humit. Pel que fa al sediment, la seva major inèrcia explicaria la manca de diferències significatives en el contingut en nutrients del sediment del cicle humit i del sec. Ara bé, sí que s'observa diferència en la composició d'organismes. Així, la variabilitat interanual en l'estructura de la comunitat bentònica de la maresma es pot atribuir a una situació d'estrès provocada pel cicle sec. Aquesta situació va comportar un augment de la diversitat per disminució de la dominància a totes les llacunes estudiades, determinada, en gran manera, per la disminució de l'abundància original de poblacions dominants i característiques d'ambients permanents, Corophium orientale, o temporànies, Gammarus aequicauda. No existeix un patró estacional en les comunitats estudiades, sinó que els principals canvis en el plàncton i el bentos són deguts a pertorbacions hídriques. Aquestes pertorbacions provoquen que s'estableixi una situació en què dominen uns tàxons característics en el plàncton (Synchaeta i Eutintinnus) i, en canvi, que en el bentos es perdi l'estructura pròpia de les comunitats característiques dels diferents ambients (comunitats dominades per Corophium orinetale en aigües permanents i per Chironomus salinarius en temporànies). La severitat és diferent en funció del grau de permanència de l'aigua, i és més alta en ambients permanents i més baixa en els temporanis. La major severitat en ambients permanents ve determinada per la menor adaptació del bentos d'aigües permanents a les fluctuacions ambientals i a l'efecte de la predació sobre el plàncton. A més, tant en el bentos com en el plàncton es donen fenòmens d'histèresi, segons els quals l'efecte de la pertorbació no solament depèn de la causa pertorbadora sinó també de l'estat en què es troba la comunitat en el moment de la pertorbació.

Global transcript analysis of rice leaf and seed using SAGE technology.

We have compiled two comprehensive gene expression profiles from mature leaf and immature seed tissue of rice (Oryza sativa ssp. japonica cultivar Nipponbare) using Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) technology. Analysis revealed a total of 50 519 SAGE tags, corresponding to 15 131 unique transcripts. Of these, the large majority (approximately 70%) occur only once in both libraries. Unexpectedly, the most abundant transcript (approximately 3% of the total) in the leaf library was derived from a type 3 metallothionein gene. The overall frequency profiles of the abundant tag species from both tissues differ greatly and reveal seed tissue as exhibiting a non-typical pattern of gene expression characterized by an over abundance of a small number of transcripts coding for storage proteins. A high proportion ( approximately 80%) of the abundant tags (> or = 9) matched entries in our reference rice EST database, with many fewer matches for low abundant tags. Singleton transcripts that are common to both tissues were collated to generate a summary of low abundant transcripts that are expressed constitutively in rice tissues. Finally and most surprisingly, a significant number of tags were found to code for antisense transcripts, a finding that suggests a novel mechanism of gene regulation, and may have implications for the use of antisense constructs in transgenic technology.

Can arable field margins be managed to enhance their biodiversity, conservation and functional value for soil macrofauna?

1. The establishment of grassy strips at the margins of arable fields is an agri-environment scheme that aims to provide resources for native flora and fauna and thus increase farmland biodiversity. These margins can be managed to target certain groups, such as farmland birds and pollinators, but the impact of such management on the soil fauna has been poorly studied. This study assessed the effect of seed mix and management on the biodiversity, conservation and functional value of field margins for soil macrofauna. 2. Experimental margin plots were established in 2001 in a winter wheat field in Cambridgeshire, UK, using a factorial design of three seed mixes and three management practices [spring cut, herbicide application and soil disturbance (scarification)]. In spring and autumn 2005, soil cores taken from the margin plots and the crop were hand-sorted for soil macrofauna. The Lumbricidae, Isopoda, Chilopoda, Diplopoda, Carabidae and Staphylinidae were identified to species and classified according to feeding type. 3. Diversity in the field margins was generally higher than in the crop, with the Lumbricidae, Isopoda and Coleoptera having significantly more species and/or higher abundances in the margins. Within the margins, management had a significant effect on the soil macrofauna, with scarified plots containing lower abundances and fewer species of Isopods. The species composition of the scarified plots was similar to that of the crop. 4. Scarification also reduced soil- and litter-feeder abundances and predator species densities, although populations appeared to recover by the autumn, probably as a result of dispersal from neighbouring plots and boundary features. The implications of the responses of these feeding groups for ecosystem services are discussed. 5. Synthesis and applications. This study shows that the management of agri-environment schemes can significantly influence their value for soil macrofauna. In order to encourage the litter-dwelling invertebrates that tend to be missing from arable systems, agri-environment schemes should aim to minimize soil cultivation and develop a substantial surface litter layer. However, this may conflict with other aims of these schemes, such as enhancing floristic and pollinator diversity.

The postfusion structure of baculovirus gp64 supports a unified view of viral fusion machines

Viral fusion proteins mediate the merger of host and viral membranes during cell entry for all enveloped viruses. Baculovirus glycoprotein gp64 (gp64) is unusual in promoting entry into both insect and mammalian cells and is distinct from established class I and class II fusion proteins. We report the crystal structure of its postfusion form, which explains a number of gp64's biological properties including its cellular promiscuity, identifies the fusion peptides and shows it to be the third representative of a new class (III) of fusion proteins with unexpected structural homology with vesicular stomatitis virus G and herpes simplex virus type 1 gB proteins. We show that domains of class III proteins have counterparts in both class I and II proteins, suggesting that all these viral fusion machines are structurally more related than previously thought.

Mono, di and polynuclear Cu(II)-azido complexes incorporating N,N,N reduced Schiff base: syntheses, structure and magnetic behavior

Three kinds of copper(II) azide complexes have been synthesised in excellent yields by reacting Cu(ClO4)(2) . 6H(2)O with N,N-bis(2-pyridylmethyl)amine (L-1); N-(2-pyridylmethyl)-N',N'-dimethylethylenediamine (L-2); and N-(2-pyridylmethyl)-N',N'-diethylethylenediamine (L-3), respectively, in the presence of slight excess of sodium azide. They are the monomeric Cu(L-1)(N-3)(ClO4) (1), the end-to-end diazido-bridged Cu-2(L-2)(2)(mu-1,3-N-3)(2)(ClO4)(2) (2) and the single azido-bridged (mu-1,3-) 1D chain [Cu(L-3)(mu-1,3-N-3)](n)(ClO4)(n) (3). The crystal and molecular structures of these complexes have been solved. The variable temperature magnetic moments of type 2 and type 3 complexes were studied. Temperature dependent susceptibility for 2 was fitted using the Bleaney-Bowers expression which led to the parameters J = -3.43 cm(-1) and R = 1 X 10(-5). The magnetic data for 3 were fitted to Baker's expression for S = 1/2 and the parameters obtained were J = 1.6 cm(-1) and R = 3.2 x 10(-4). Crystal data are as follows. Cu(L-1)(N-3)(ClO4): Chemical formula, C12H13ClN6O4Cu; crystal system, monoclinic; space group, P2(1)/c; a = 8.788(12), b = 13.045(15), c = 14.213(15) Angstrom; beta = 102.960(10)degrees; Z = 4. Cu(L-2)(mu-N-3)(ClO4): Chemical formula. C10H17ClN6O4Cu: crystal system, monoclinic; space group, P2(1)/c; a = 10.790(12), b = 8.568(9), c = 16.651(17) Angstrom; beta = 102.360(10)degrees; Z = 4. [Cu(L-3)(mu-N-3)](ClO4): Chemical formula, C12H21ClN6O4Cu; crystal system, monoclinic; space group, P2(1)/c; a = 12.331(14), b = 7.804(9), c = 18.64(2) Angstrom; beta = 103.405(10)degrees; Z = 4. (C) 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.

Fermentation of resistant starches: influence of in vitro models on colon carcinogenesis

Resistant starch type 2 (RS2) and type 3 (RS3) containing preparations were digested using a batch (a) and a dynamic in vitro model (b). Furthermore, in vivo obtained indigestible fractions from ileostomy patients were used (c). Subsequently these samples were fermented with human feces with a batch and a dynamic in vitro method. The fermentation supernatants were used to treat CAC02 cells. Cytotoxicity, anti-genotoxicity against hydrogen peroxide (comet assay) and the effect on barrier function measured by trans-epithelial electrical resistance were determine. Dynamically fermented samples led to high cytotoxic activity, probably due to additional compounds added during in vitro fermentation. As a consequence only batch fermented samples were investigated further. Batch fermentation of RS resulted in an anti-genotoxic activity ranging from 9-30% decrease in DNA damage for all the samples, except for RS2-b. It is assumed that the changes in RS2 structures due to dynamic digestion resulted in a different fermentation profile not leading to any anti-genotoxic effect. Additionally, in vitro batch fermentation of RS caused an improvement in integrity across the intestinal barrier by approximately 22% for all the samples. We have demonstrated that batch in vitro fermentation of RS2 and RS3 preparations differently pre-digested are capable of inhibiting the initiation and promotion stage in colon carcinogenesis in vitro.

Expression-system-dependent modulation of HIV-1 envelope glycoprotein antigenicity and immunogenicity.

Recombinant expression systems differ in the type of glycosylation they impart on expressed antigens such as the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) envelope glycoproteins, potentially affecting their biological properties. We performed head-to-head antigenic, immunogenic and molecular profiling of two distantly related Env surface (gp120) antigens produced in different systems: (a) mammalian (293 FreeStyle cells; 293F) cells in the presence of kifunensine, which impart only high-mannose glycans; (b) insect cells (Spodoptera frugiperda, Sf9), which confer mainly paucimannosidic glycans; (c) Sf9 cells recombinant for mammalian glycosylation enzymes (Sf9 Mimic), which impart high-mannose, hybrid and complex glycans without sialic acid; and (d) 293F cells, which impart high-mannose, hybrid and complex glycans with sialic acid. Molecular models revealed a significant difference in gp120 glycan coverage between the Sf9-derived and wild-type mammalian-cell-derived material that is predicted to affect ligand binding sites proximal to glycans. Modeling of solvent-exposed surface electrostatic potentials showed that sialic acid imparts a significant negative surface charge that may influence gp120 antigenicity and immunogenicity. Gp120 expressed in systems that do not incorporate sialic acid displayed increased ligand binding to the CD4 binding and CD4-induced sites compared to those expressed in the system that do, and imparted other more subtle differences in antigenicity in a gp120 subtype-specific manner. Non-sialic-acid-containing gp120 was significantly more immunogenic than the sialylated version when administered in two different adjuvants, and induced higher titers of antibodies competing for CD4 binding site ligand-gp120 interaction. These findings suggest that non-sialic-acid-imparting systems yield gp120 immunogens with modified antigenic and immunogenic properties, considerations that should be considered when selecting expression systems for glycosylated antigens to be used for structure-function studies and for vaccine use.