Fonction de l'AmtB dans la régulation de la nitrogénase chez Rhodobacter capsulatus

La fixation de l’azote diatomique est un processus très important à la vie, vu sa nécessité dans la biosynthèse de plusieurs molécules de base; acides aminés, acides nucléiques, etc. La réduction de l’azote en ammoniaque est catalysée par la nitrogénase, une enzyme consommatrice de beaucoup d’énergie étant donné qu’elle nécessite 20 à 30 moles d’ATP pour la réduction d’une mole d’azote. De ce fait une régulation rigoureuse est exigée afin de minimiser le gaspillage d’énergie. Plusieurs systèmes de contrôle sont connus, aussi bien au niveau post-traductionnel que traductionnel. Chez la bactérie photosynthétique pourpre non-sulfureuse R. capsulatus, la régulation de l’activité de la nitrogénase nécessite une panoplie de protéines dont la protéine membranaire AmtB, qui est impliquée dans le transport et la perception d’ammonium, et les protéines PII qui jouent plusieurs rôles clés dans la régulation de l’assimilation d’azote. Suite à l’ajout de l’ammonium dans le milieu, une inhibition réversible de l’activité de la nitrogénase est déclenchée via un mécanisme d’ADP-ribosylation de la nitrogénase. La séquestration de GlnK (une protéine PII) par l’AmtB permet à DraT, une ADP-ribosyltransférase, d’ajouter un groupement ADP-ribose sur la protéine-Fe de la nitrogénase l’empêchant ainsi de former un complexe avec la protéine-MoFe. Donc, le transfert d’électrons est bloqué, engendrant ainsi l’inhibition de l’activité de la nitrogénase qui dure aussi long que la concentration d’azote fixé reste élevé, phénomène appelé le « Switch-off/Switch-on » de la nitrogénase. Dans ce mémoire, pour mieux comprendre ce phénomène de régulation, des mutations ponctuelles au niveau de certains résidus conservés de la protéine AmtB, dont D338, G367, H193 et W237, étaient générées par mutagénèse dirigée, afin d’examiner d’avantage leur rôle dans le transport d’ammonium, la formation du complexe AmtB-GlnK, ainsi que dans le « Switch-off » et l’ADP-ribosylation. Les résultats permettent de conclure l’importance et la nécessité de certains résidus telle que le G367 dans la régulation de la nitrogénase et le transport d’ammonium, contrairement au résidu D338 qui ne semble pas être impliqué directement dans la régulation de l’activité de la nitrogénase. Ces résultats suggèrent d’autres hypothèses sur les rôles des acides aminés spécifiques d’AmtB dans ses fonctions comme transporteur et senseur d’ammonium.

Transport d’iode par le transporteur de sodium/acide monocarboxylique SMCT1

Le transporteur de Na+/ acide monocarboxylique sensible à l’ibuprofène (SMCT1) est exprimé dans la membrane apicale de plusieurs épithélia. Son rôle physiologique dans la glande thyroïde reste cependant obscur mais on présume qu’il pourrait agir comme un transporteur apical d’iode nécessaire pour la synthèse des hormones thyroïdiennes. Récemment, on a montré que SMCT1 possède un courant de fuite anionique sensible à [Na+]e qui permettrait de transporter l’iode de façon électrogénique. Cependant, un efflux d’iode sensible à l’ibuprofène, mais indépendant de la [Na+]e a été aussi observé sur des cultures primaires des thyrocytes porcins, suggérant un autre mécanisme de transport d’iode par SMCT1. Ce travail vise à comprendre les caractéristiques de ce genre de transport en utilisant comme modèle d’expression les ovocytes de Xenopus laevis. Les résultats obtenus des essais de captation d’iode radioactif montrent que SMCT1 présente un transport d’iode sensible à l’ibuprofène de l’ordre de 30nmol/ovocyte/h. Si ce transport est non saturable en iode (0-100 mM), il nécessite du Na+ dans la solution externe. En effet, le remplacement du Na+ extracellulaire par le NMDG inhibe complètement le transport. En outre, on s’est intéressé à exclure la possibilité de différents artefacts. En ayant trouvé que la grande majorité de l’iode radioactif se trouve dans la partie soluble de l’ovocyte, on exclut une liaison non spécifique de l’iode à la membrane cellulaire. Cependant, une bonne proportion de l’iode transporté pourrait être liée à des protéines à l’intérieur de l`ovocyte. En effet, on observe une réduction du transport d’iode dans les ovocytes exprimant SMCT1 de 81,6 ± 2 % en présence de 2 % BSA dans la solution extracellulaire. Également, on écarte la possibilité que le transport d’iode soit le résultat de la surexpression de protéines de transport endogènes dont les canaux chlore. Le transport d’iode semble spécifique à l’expression de SMCT1 et de manière intéressante à l’expression d’un autre transporteur de monocarboxylates, MCT1. L’analyse de l’ensemble des essais, y compris le fait que l’amplitude du transport observé est 20 fois plus grande que celle du courant de fuite nous mène à proposer que SMCT1 puisse transporter l’iode de façon électroneutre. Cependant, le mécanisme par lequel ceci est accompli n’est pas évident à identifier. L’utilisation d’un autre modèle cellulaire serait surement utile pour répondre à cette question.

Étude et modélisation de la cinétique orale de l'amoxicilline chez le porcelet

Il est rapporté que la biodisponibilité orale de l’amoxicilline chez le porc est environ trois fois moindre que chez l’homme. Pour élucider les raisons de cette différence, la pharmacocinétique artérielle, veineuse porte et urinaire de cet antibiotique a été caractérisée à des doses intragastriques de 4 à 30 mg/kg et différents modèles compartimentaux physiologiques ont été conçus pour l’analyse des données. La biodisponibilité orale de l’amoxicilline est maximale à 4 mg/kg, avec une valeur moyenne de 52%. Les différences porto-systémiques de concentrations plasmatiques d’amoxicilline et la clairance urinaire ont permis de démontrer une augmentation de la clairance hépatique jusqu’à la dose de 30 mg/kg. Un modèle compartimental comprenant deux voies parallèles d’absorption (de type Michaelis- Menten d’accessibilité limitée dans le temps et d’ordre 1), deux compartiments de distribution (central et périphérique) deux voies d’élimination (excrétions urinaire et biliaire) est celui qui prédit le mieux les données observées. Ces résultats mettent en évidence le rôle prépondérant du transporteur saturable PepT1 dans l’absorption orale de l’amoxicilline administrée à faible dose, ainsi que l’importance croissante de l’absorption passive lors d’administration à forte dose.

Pathogenèse moléculaire de la neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux

La neuropathie sensitive et motrice héréditaire avec agénésie du corps calleux (NSMH/ACC) se traduit par une atteinte neurodégénérative sévère associée à des anomalies développementales dans le système nerveux central et du retard mental. Bien que rare dans le monde, ce désordre autosomique récessif est particulièrement fréquent dans la population Québécoise du Canada Français du fait d’un effet fondateur. L’unique étude réalisée sur la mutation québécoise du gène qui code pour le co-transporteur de potassiumchlore 3 (KCC3) a montré qu’il y a une perte de fonction de la protéine. Cependant, la maladie est également retrouvée hors du Québec et il reste encore à élucider les pathomécanismes mis en jeu. Nous avons donc séquencé les 26 exons du gène KCC3 chez des individus recrutés dans le monde entier et suspectés d’être atteints de la maladie. Nous avons ainsi identifié trois nouvelles mutations. L’étude fonctionnelle de ces mutations nous a confirmé la perte de fonction systématique des co-transporteurs mutés. Puisque l’inactivation de KCC3 se produit majoritairement via l’élimination de segments peptidiques en C-terminus, nous avons concentré notre attention sur l’identification des interactions qui s’y produisent. À l’aide d’approches double hybride, pull-down et immunomarquage, nous avons déterminé que KCC3 interagit avec la créatine kinase CK-B et que cette interaction est perturbée par les mutations tronquantes. De plus, l’utilisation d’un inhibiteur de créatine kinase inactive KCC3, ce qui démontre qu’il existe bien un lien fonctionnel et pathologique entre KCC3 et ses partenaires C-terminaux. Nous avons aussi identifié des anomalies majeures de localisation membranaire des KCC3 mutés. Que KCC3 soit tronqué ou pleine longueur, sa distribution subcellulaire est affectée dans des cellules en culture, dans les ovocytes de Xenopes et dans des échantillons de cerveau de patients. La perte d’interaction entre KCC3 et CK-B et/ou les défauts de transit intracellulaire de KCC3 sont donc les mécanismes pathologiques majeurs de la NSMH/ACC.

Modulation de la neurogénèse par la glycine

Les vertébrés, du poisson à l'homme, possèdent un potentiel membranaire médié en partie par les ions chlorure (Cl-). L’une des premières formes d’activité neuronale lors du développement est la dépolarisation médiée par les ions chlorures extrudés par les canaux glycinergiques (GlyR) et GABAergiques. Cette dépolarisation est rendu possible grâce à l’expression retardée du co-transporteur d’ions chlorure et de potassium KCC2 lors du développement qui génère un gradient hyperpolarisant postnatalement chez les mammifères. Le rôle de cette dépolarisation précoce paradoxale durant le développement est inconnu. En injectant l’ARNm de KCC2 dans des embryons de poissons zébrés nouvellement fertilisé, nous avons devancé l’expression de ce co-transporteur rendant ainsi la glycine hyperpolarisante dans tous les neurones dès les premières phases du développement. Nous avons aussi ciblé le récepteur glycinergique directement en bloquant son activité et son expression à l’aide d’une drogue spécifique, la strychnine et d’un morpholino antisens (Knockdown). Dans les trois cas (KCC2, strychnine et GlyR KD), les perturbations de l’activité neuronale ont provoqués des erreurs dans la neurogenèse, en particulier une diminution du nombre d’interneurones sans avoir d’effets sur les motoneurones et les neurones sensoriels. De plus, en bloquant les canaux calciques activés à bas voltage dans le développement avec la drogue nifedipine, il y a des erreurs dans la neurogénèse semblables à celles remarquées dans les trois conditions précédentes. Nous concluons que la dépolarisation précoce par la glycine permet l’entrée du calcium et l’activation de la neurogénèse chez les interneurones.

Effet de la N-acétylcystéine sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à une hypertrophie ventriculaire gauche dans un modèle porcin

Effet positif de la N-acétylcystéine sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à une hypertrophie ventriculaire gauche dans un modèle porcin A. A. HORN, M-C AUBIN, YF SHI, J-C TARDIF, M. CARRIER , L. P. PERRAULT INSTITUT DE CARDIOLOGIE DE MONTRÉAL, MONTRÉAL, CANADA, Objectif : Il a été démontré dans le laboratoire que dans notre modèle d’hypertrophie ventriculaire gauche, la dysfonction endothéliale est secondaire à une diminution de la biodisponibilité du NO, celle-ci étant causée par une augmentation du stress oxydant tel que démontré par Malo et al. (2003) et Aubin et al. (2006). Le but de la présente étude est d’étudier l’effet d’un traitement chronique de la N-acétylcystéine (NAC) (un antioxydant) sur la dysfonction endothéliale associée à une hypertrophie ventriculaire gauche (HVG). Méthodologie: L’HVG a été induite par cerclage aortique (CA) chez vingt-et-un porcelets âgés de deux mois qui furent divisés aléatoirement en quatre groupes expérimentaux. Le groupe témoin (groupe 1) a été soumis à une thoracotomie antérolatérale gauche sans cerclage aortique (n=3). Le groupe 2 a été soumis à un cerclage aortique pour une période de 60 jours (n=6). Le groupe 3 a subi un cerclage aortique et a reçu un traitement oral de N-acétylcystéine de 1000 mg/jour per os pendant 60 jours commençant le jour de la chirurgie (n=6). Le groupe 4 a été soumis à un cerclage aortique et a reçu un traitement oral de N-acétylcystéine : 1000 mg/par jour pendant 30 jours commençant le jour 30 (post-chirurgie) (n=6). L’hypertrophie fut évaluée par échocardiographie. La réactivité vasculaire fut étudiée à l’aide de chambres d’organes par la construction des courbes concentration-réponse à la sérotonine (5-HT: relaxations induites par les récepteurs 5-HT1D, couplés aux protéines Gi) et à la bradykinine (BK: relaxations induites par les récepteurs B2, couplés aux protéines Gq). Les quantités de nitrites/nitrates et la production basale de GMPc ont été mesurées pour évaluer la fonction endothéliale. Le stress oxydant a été étudié en quantifiant les concentrations plasmatiques d’hydroperoxydes lipidiques et de glutathion réduit, ainsi que l’activité plasmatique des enzymes antioxydantes peroxydase du glutathion et dismutase du superoxyde. Résultats: Le rapport masse ventricule gauche/masse corporelle était significativement plus élevé pour le groupe 2 comparativement au groupe 1 (p<0,05) confirmant la présence d’une HVG. Le développement de l’HVG dans le groupe 3 a pu être prévenu par la NAC et sa progression fut atténuée dans le groupe 4 (p<0,05 versus groupe 2). La présence de la dysfonction endothéliale a été confirmée chez le groupe 2, tel qu’illustré par une diminution significative des relaxations maximales à la 5-HT et à la BK comparativement au groupe témoin. Le traitement à la NAC a significativement potentialisé les relaxations maximales (p<0,05) induites par la sérotonine et par la bradykinine, chez les deux groupes traités. Cette amélioration des relaxations dépendantes de l’endothélium peut être la conséquence d’une augmentation significative (p<0,05) de la biodisponibilité du monoxyde d’azote pour les cellules musculaires lisses, tel que suggéré par l’augmentation du ratio nitrites/nitrates et de la production basale de GMPc chez les groupes 3 et 4 comparativement au groupe 2. Cette augmentation du facteur relaxant peut résulter d’une augmentation de sa production par les cellules endothéliales ou d’une diminution de sa neutralisation par les espèces réactives oxygénées. De fait, les concentrations d’hydroperoxydes lipidiques étaient significativement inférieures (p<0,05) et associées à une augmentation des concentrations de l’antioxydant glutathion réduit et de l’activité de la peroxydase du glutathion chez les deux groupes traités par rapport au groupe 2. Conclusion: Le traitement à la NAC prévient le développement de la dysfonction endothéliale coronaire ainsi que l’HVG qui lui est associée.

An examination of the effects of 4E-T-mediated re-localization of eIF4E on eIF4E function

Le facteur d'initiation de la traduction chez les eukaryotes eIF4E (4E) est un puissant oncogène en raison de sa capacité à faciliter l'export et/ou la traduction de certains transcripts, dont beaucoup sont eux-mêmes des oncogènes. 4E intéragit avec un grand nombre de protéines régulatrices dont la protéine 4E-T (pour 4E-Transporter). La capacité de 4E-T à modifier la localisation subcellulaire de 4E pourrait offrir un mécanisme permettant de modifier le potentiel oncogène d'une cellule. La surexpression de 4E-T dans des cellules d'ostéosarcome conduit à l’augmentation du nombre et de la taille des P-bodies, dans lesquels 4E colocalisent avec 4E-T mais pas avec la version tronquée 4E-T/Y30A. Cependant, les différentes expériences menées, permettant d’analyser les taux de transcription, la quantité de protéine, les profiles polysomiques ainsi que la distribution nucléo-cytoplasmique, montrent que la surexpression de 4E-T n'a pas d'effet sur la fonction de 4E. L'observation d’un enrichissement cytoplasmique et d’une charge réduite de ribosomes sur les transcripts codant les protéines cycline D1 et ODC (profile polysomique) dans la lignée 4E-T suggère un role de 4E-T dans la séquestration cytoplasmique de certains transcrips par un mécanisme qui reste encore à déterminer.

MiR-16, un nouveau régulateur du transporteur de glucose dépendant de l’insuline GLUT-4

Les microARNs sont des petits ARNs non codants d'environ 22 nucléotides qui régulent négativement la traduction de l'ARN messager cible (ARNm) et ont donc des fonctions cellulaires. Le microARN-16 (miR-16) est connu pour ses effets antiprolifératifs. Nous avons observé que l’expression de miR-16 est diminuée dans les cellules endothéliales humaines sénescentes et quiescentes en comparaison à des cellules prolifératives. Une analyse informatique des sites potentiels de liaison de miR-16 prévoit que GLUT-4, un transporteur du glucose insulinodépendant, pourrait être une cible potentielle du miR-16. Nous avons donc testé l'hypothèse que miR-16 régule négativement le métabolisme du glucose cellulaire. Dans des HUVEC, l'inhibition de miR-16 endogène avec des anti-miRNA oligonucléotides (AMO) augmente les niveaux protéiques de GLUT-4 de 1,7 ± 0,4 fois (p=0,0037 ; n=9). Dans des souris nourries avec un régime alimentaire normal ou riche en graisse et en sucre, l’expression de GLUT-4 dans le muscle squelettique a tendance à corréler négativement avec les niveaux de miR-16 (p=0,0998, r2=0,3866, n=4). Ces résultats suggèrent que miR-16 est un régulateur négatif de GLUT-4 et qu’il pourrait être impliqué dans la régulation du métabolisme cellulaire du glucose.

Groupage et protection du trafic dynamique dans les réseaux WDM

Avec les nouvelles technologies des réseaux optiques, une quantité de données de plus en plus grande peut être transportée par une seule longueur d'onde. Cette quantité peut atteindre jusqu’à 40 gigabits par seconde (Gbps). Les flots de données individuels quant à eux demandent beaucoup moins de bande passante. Le groupage de trafic est une technique qui permet l'utilisation efficace de la bande passante offerte par une longueur d'onde. Elle consiste à assembler plusieurs flots de données de bas débit en une seule entité de données qui peut être transporté sur une longueur d'onde. La technique demultiplexage en longueurs d'onde (Wavelength Division Multiplexing WDM) permet de transporter plusieurs longueurs d'onde sur une même fibre. L'utilisation des deux techniques : WDM et groupage de trafic, permet de transporter une quantité de données de l'ordre de terabits par seconde (Tbps) sur une même fibre optique. La protection du trafic dans les réseaux optiques devient alors une opération très vitale pour ces réseaux, puisqu'une seule panne peut perturber des milliers d'utilisateurs et engendre des pertes importantes jusqu'à plusieurs millions de dollars à l'opérateur et aux utilisateurs du réseau. La technique de protection consiste à réserver une capacité supplémentaire pour acheminer le trafic en cas de panne dans le réseau. Cette thèse porte sur l'étude des techniques de groupage et de protection du trafic en utilisant les p-cycles dans les réseaux optiques dans un contexte de trafic dynamique. La majorité des travaux existants considère un trafic statique où l'état du réseau ainsi que le trafic sont donnés au début et ne changent pas. En plus, la majorité de ces travaux utilise des heuristiques ou des méthodes ayant de la difficulté à résoudre des instances de grande taille. Dans le contexte de trafic dynamique, deux difficultés majeures s'ajoutent aux problèmes étudiés, à cause du changement continuel du trafic dans le réseau. La première est due au fait que la solution proposée à la période précédente, même si elle est optimisée, n'est plus nécessairement optimisée ou optimale pour la période courante, une nouvelle optimisation de la solution au problème est alors nécessaire. La deuxième difficulté est due au fait que la résolution du problème pour une période donnée est différente de sa résolution pour la période initiale à cause des connexions en cours dans le réseau qui ne doivent pas être trop dérangées à chaque période de temps. L'étude faite sur la technique de groupage de trafic dans un contexte de trafic dynamique consiste à proposer différents scénarios pour composer avec ce type de trafic, avec comme objectif la maximisation de la bande passante des connexions acceptées à chaque période de temps. Des formulations mathématiques des différents scénarios considérés pour le problème de groupage sont proposées. Les travaux que nous avons réalisés sur le problème de la protection considèrent deux types de p-cycles, ceux protégeant les liens (p-cycles de base) et les FIPP p-cycles (p-cycles protégeant les chemins). Ces travaux ont consisté d’abord en la proposition de différents scénarios pour gérer les p-cycles de protection dans un contexte de trafic dynamique. Ensuite, une étude sur la stabilité des p-cycles dans un contexte de trafic dynamique a été faite. Des formulations de différents scénarios ont été proposées et les méthodes de résolution utilisées permettent d’aborder des problèmes de plus grande taille que ceux présentés dans la littérature. Nous nous appuyons sur la méthode de génération de colonnes pour énumérer implicitement les cycles les plus prometteurs. Dans l'étude des p-cycles protégeant les chemins ou FIPP p-cycles, nous avons proposé des formulations pour le problème maître et le problème auxiliaire. Nous avons utilisé une méthode de décomposition hiérarchique du problème qui nous permet d'obtenir de meilleurs résultats dans un temps raisonnable. Comme pour les p-cycles de base, nous avons étudié la stabilité des FIPP p-cycles dans un contexte de trafic dynamique. Les travaux montrent que dépendamment du critère d'optimisation, les p-cycles de base (protégeant les liens) et les FIPP p-cycles (protégeant les chemins) peuvent être très stables.

Biogénèse des lipoprotéines de haute densité (HDL): implication du transporteur ABCA1

Les patients atteints de la maladie de Tangier présentent des niveaux très bas de lipoprotéines de haute densité (HDL), un facteur de risque pour le développement des maladies cardiovasculaires. In vivo, les HDL ont un effet protecteur important contre l’athérosclérose puisqu’elles effectuèrent le transport à rebours du cholestérol des tissus périphériques vers le foie. Or, la maladie de Tangier est causée par des mutations dans le gène du transporteur « ATP-binding cassette A1 » (ABCA1). Le modèle actuel stipule que ce transporteur assure la lipidation de l’apolipoprotéine A-I (apoA-I), la composante protéique majeure des HDL, pour former des particules HDL naissantes discoïdales. Un défaut dans la lipidation de l’apoA-I par l’ABCA1 abolit la biogénèse des HDL. Nous avons voulu étudier les sites d’interaction de l’ABCA1 avec son ligand (l’apoA-I), les voies de biogénèse impliquées, et l’implication des pré-β-HDL dans l’efflux du cholestérol par la voie de l’ABCA1. D’abord, nous avons utilisé un système de culture cellulaire (fibroblastes humaines et BHK-ABCA1-inductible) afin de déterminer les sites de liaison cellulaires de l’apoA-I, leurs localisations et l’implication de l’ABCA1. Nous avons trouvé que la majorité de l’apoA-I n’est pas associée à l’ABCA1 et, deux tiers de cet apoA-I, était à la membrane plasmique. Ensuite, Une étude plus détaillée examinait les voies de lipidation de l’apoA-I, soit au niveau de la membrane plasmique (MP), soit aux compartiments intracellulaires (CICs). Nous avons montré que la lipidation de l’apoA-I a lieu aux deux niveaux (MP et CICs) selon deux voies différentes cinétiquement. Finalement, nous avons montré que les pré-β-HDL effluent aussi (efficacement que l’apoA-I) le cholestérol par la voie de l’ABCA1. Ces observations réunies démontrent que 1) la majorité de l’apoA-I s’est trouvé non-associée à l’ABCA1; 2) deux tiers de l’apoA-I s’associent a la membrane plasmique; 3) la lipidation de l’apoA-I se fait en partie à la membrane plasmique et, par la voie de retro-endocytose du complexe apoA-I/ABCA1.

Modifications de l’activité préfrontale pendant le traitement de stimuli émotionnels visuels chez des patients schizophrènes avant et après médication à la Ziprasidone : étude en IRM fonctionnelle

Bien que les troubles cognitifs soient un aspect essentiel de la schizophrénie, le dysfonctionnement des systèmes émotionnels y est également considéré comme un élément très important de cette maladie d’autant plus que plusieurs régions du cerveau sont concernées par la régulation émotionnelle. Le principal objectif du présent travail était d’explorer, en imagerie par résonnance magnétique fonctionnelle (IRMf), l’effet de la ziprasidone sur les différentes réponses neuronales à l’affichage de stimuli émotionnels au niveau de la région préfrontale,particulièrement dans le cortex cingulaire antérieur [CCA], le cortex orbito-frontal [COF] et le cortex préfrontal dorso-latéral [CPFDL]. Nous avons examiné les activations cérébrales, chez des patients souffrants de schizophrénie avant et après médication à la ziprasidone, en leur présentant des séries d’images émotionnellement chargées (négatives, neutres et positives) associées à différentes instructions quand aux types d’images qu’ils devaient sélectionner (négatives,neutres et positives). Nous avons analysé les différents changements d’activation (avant et après médication) essentiellement pour les valences extrêmes des stimuli (positives et négatives), ensuite nous avons regardé l’effet du type d’instruction sur ces changements. L’échantillon comprenait 13 patients atteints de schizophrénie et 15 témoins sains. Nous avons également effectué une évaluation clinique des symptômes dépressifs, positifs et négatifs de la maladie ainsi que des mesures biochimiques et de poids avant et après 16 semaines de médication. Malgré l’absence de changement significatif sur les mesures cliniques (PANSS et Dépression) avant et après une moyenne de 14.3 semaines de médication à la ziprasidone, plusieurs régions préfrontales (CCA, COF, CPDL) ont sensiblement accru leur réponse aux stimuli positifs par rapport aux stimuli négatifs. En outre, dans les régions habituellement impliquées dans le contrôle cognitif (CCA et CPFDL), cette tendance s'est accentuée lorsque les patients ont été invités à ne sélectionner que les stimuli négatifs (effet du type d’instruction). Nous avons également trouvé plusieurs similitudes dans le fonctionnement préfrontal (à la fois dans le volume et la force d'activation) entre les contrôles sains et les patients après médication en tenant compte du type d’instruction plus que de la valence émotionnelle des images. Pour conclure, les résultats de la présente étude suggèrent que le traitement antipsychotique avec la ziprasidone améliore le fonctionnement cognitif lié au traitement de l'information émotionnelle dans le cortex préfrontal chez les patients souffrant de schizophrénie. Étant donné le mécanisme d'action neuro-pharmacologique de la ziprasidone (plus d'affinité pour la sérotonine que pour les récepteurs de la dopamine dans le cortex préfrontal), nous pensons que nos résultats démontrent que le contrôle cognitif et la régulation des réactions face à des stimuli émotionnellement chargés dans la schizophrénie sont liés à une plus forte concentration de dopamine dans les voies préfrontales.

Analyse cinématique de la marche de travailleurs exposés à une surcharge mécanique sur l’articulation fémoro-tibiale (AF-T)

De nombreuses études concluent que la charge mécanique supportée par le genou, qu’elle soit reliée à l’obésité, aux sports intenses, à une altération biomécanique des structures de l’articulation ou à une exposition à des charges lourdes durant les activités occupationnelles, est considérée comme un facteur de risque important au développement de la gonarthrose. La gonarthrose reliée au travail a été le sujet de nombreuses études et plusieurs d’entre elles ont rapporté une prévalence accrue de la gonarthrose chez les travailleurs de certains domaines en particulier, comme la construction, la pose de plancher, la peinture, l’exploitation minière, l’agriculture et le travail en atelier et en milieu de la santé. Les personnes qui travaillent dans ces métiers sont exposées à des positions ou des activités nuisibles, comme travailler à genoux ou accroupi, monter des escaliers ou des échelles, transporter des changes lourdes et marcher de façon prolongée. Ces gestes surchargent l’articulation du genou, ce qui cause des modifications aux structures de l’articulation du genou ou aux adaptations neuromusculaires de patron de mouvement du genou. Ces modifications structurelles et adaptations neuromusculaires peuvent apporter des changements cinématiques à la marche qui peuvent initier la gonarthrose ou contribuer à sa progression. L’objectif principal de la présente étude était d’analyser l’effet d’une surcharge mécanique sur l’articulation fémoro-tibiale (AF-T) subie au travail lors d’une tâche de marche et comparer le patron cinématique de l’articulation fémoro-tibiale des travailleurs exposés à une surcharge mécanique à celui des travailleurs non exposés. Vingt-quatre travailleurs exposés à une surcharge mécanique et neuf travailleurs non exposés ont participé à l’étude. Les données cinématiques de la marche ont été enregistrées au niveau du genou dans des conditions cliniques en utilisant un système de suivi du mouvement électromagnétique. Les paramètres suivant ont été extraits et utilisés pour la comparaison des groupes : l’angle maximum lors du contact initial, l’angle ii maximum de flexion durant la réponse à la charge, l’angle minimum au moment de l’appui unipodal et l’étendue max-min du cycle. La comparaison des groupes pour les variables cliniques et cinématiques a été effectué par l’utilisation de tests-t bilatéraux (« Student-t tests ») et de tests ANCOVA utilisant le poids et la vitesse comme covariables. Les travailleurs exposés à une surcharge mécanique présentaient un plus grand angle de flexion de l’articulation fémoro-tibiale au contact initial, durant la réponse au chargement et à la phase unipodale et ils ont démontré une étendue d’angle moindre que les travailleurs non exposés. Nous croyons que les données cinématiques de la marche peuvent donner des idées sur les facteurs biomécaniques qui pourraient prédisposer les travailleurs au développement ou à la progression de la gonarthrose. Une meilleure compréhension de ces facteurs pourrait être un premier pas vers le développement d’une intervention plus efficace pour cette population.

Caractérisation fonctionnelle chez le poisson zèbre de l'isoforme protéique WNK1/HSN2 mutée dans la neuropathie héréditaire sensitive et autonome de type 2

La neuropathie humaine sensitive et autonome de type 2 (NHSA 2) est une pathologie héréditaire rare caractérisée par une apparition précoce des symptômes et une absence d’affectation motrice. Cette pathologie entraîne la perte de perception de la douleur, de la chaleur et du froid ainsi que de la pression (toucher) dans les membres supérieurs et inférieurs et est due à des mutations autosomales récessives confinées à l’exon HSN2 de la protéine kinase à sérine/thréonine WNK1 (with-no-lysine protein kinase 1). Cet exon spécifique permettrait de conférer une spécificité au système nerveux à l’isoforme protéique WNK1/HSN2. La kinase WNK1 est étudiée en détails, en particulier au niveau du rein, mais son rôle au sein du système nerveux demeure inconnu. Considérant le début précoce de la neuropathie et le manque d’innervation sensorielle révélé par des biopsies chez les patients NHSA2, notre hypothèse de recherche est que les mutations tronquantes menant à la NHSA de type 2 causent une perte de fonction de l’isoforme WNK1/HSN2 spécifique au système nerveux entraînant un défaut dans le développement du système nerveux sensoriel périphérique. Chez l’embryon du poisson zèbre, WNK1/HSN2 est exprimé au niveau des neuromastes de la ligne latérale postérieure, un système mécanosensoriel périphérique. Nous avons obtenu des embryons knockdown pour WNK1/HSN2 par usage d’oligonucléotides morpholino antisens (AMO). Nos trois approches AMO ont révélé des embryons présentant des défauts d’établissement au niveau de la ligne latérale postérieure. Afin de déterminer la voie pathogène impliquant l’isoforme WNK1/HSN2, nous nous sommes intéressés à l’interaction rapportée entre la kinase WNK1 et le co-transporteur neuronal KCC2. Ce dernier est une cible de phosphorylation de WNK1 et son rôle dans la promotion de la neurogenèse est bien connu. Nous avons détecté l’expression de KCC2 au niveau de neuromastes de la ligne latérale postérieure et observé une expression accrue de KCC2 chez les embryons knockdown pour WNK1/HSN2 à l’aide de RT-PCR semi-quantitative. De plus, une sur-expression d’ARN humain de KCC2 chez des embryons a produit des défauts dans la ligne latérale postérieure, phénocopiant le knockdown de WNK1/HSN2. Ces résultats furent validés par un double knockdown, produisant des embryons n’exprimant ni KCC2, ni WNK1/HSN2, dont le phénotype fut atténué. Ces résultats nous mènent à suggérer une voie de signalisation où WNK1/HSN2 est en amont de KCC2, régulant son activation, et possiblement son expression. Nous proposons donc que la perte de fonction de l’isoforme spécifique cause un débalancement dans les niveaux de KCC2 activée, menant à une prolifération et une différenciation réduites des progéniteurs neuronaux du système nerveux périphérique. Les défauts associés à la NHSA de type 2 seraient donc de nature développementale et non neurodégénérative.

Données nouvelles sur l’innervation à dopamine du striatum et son co-phénotype glutamatergique

Une sous-population des neurones à dopamine (DA) du mésencéphale ventral du rat et de la souris étant connue pour exprimer l'ARN messager du transporteur vésiculaire 2 du glutamate (VGLUT2), nous avons eu recours à l'immunocytochimie en microscopie électronique, après simple ou double marquage de l'enzyme de synthèse tyrosine hydroxylase (TH) et de VGLUT2, pour déterminer la présence de l'une et/ou l'autre protéine dans les terminaisons (varicosités) axonales de ces neurones et caractériser leur morphologie ultrastructurale dans diverses conditions expérimentales. Dans un premier temps, des rats jeunes (P15) ou adultes (P90), ainsi que des rats des deux âges soumis à l'administration intraventriculaire cérébrale de la cytotoxine 6-hydroxydopamine (6-OHDA) dans les jours suivant la naissance, ont été examinés, afin d'étayer l'hypothèse d'un rôle de VGLUT2 au sein des neurones DA, au cours du développement normal ou pathologique de ces neurones. Chez le jeune rat, ces études ont montré: i) la présence de VGLUT2 dans une fraction importante des varicosités axonales TH immunoréactives du coeur du noyau accumbens ainsi que du néostriatum; ii) une augmentation de la proportion de ces terminaisons doublement marquées dans le noyau accumbens par suite de la lésion 6-OHDA néonatale; iii) le double marquage fréquent des varicosités axonales appartenant à l'innervation DA aberrante (néoinnervation), qui se développe dans la substance noire, par suite de la lésion 6-OHDA néonatale. Des différences significatives ont aussi été notées quant à la dimension des terminaisons axonales marquées pour la TH seulement, VGLUT2 seulement ou TH et VGLUT2. Enfin, à cet âge (P15), toutes les terminaisons doublement marquées sont apparues dotées d'une spécialisation membranaire synaptique, contrairement aux terminaisons marquées pour la TH ou pour VGLUT2 seulement. Dans un deuxième temps, nous avons voulu déterminer le devenir du double phénotype chez le rat adulte (P90) soumis ou non à la lésion 6-OHDA néonatale. Contrairement aux observations recueillies chez le jeune rat, nous avons alors constaté: i) l'absence complète de terminaisons doublement marquées dans le coeur du noyau accumbens et le néostriatum d'animaux intacts, de même que dans les restes de la substance noire des animaux 6-OHDA lésés; ii) une très forte baisse de leurnombre dans le coeur du noyau accumbens des animaux 6-OHDA lésés. Ces observations, suggérant une régression du double phénotype TH/VGLUT2 avec l'âge, sont venues renforcer l'hypothèse d'un rôle particulier d'une co-libération de glutamate par les neurones mésencéphaliques DA au cours du développement. Dans ces conditions, il est apparu des plus intéressants d'examiner l'innervation DA méso-striatale chez deux lignées de souris dont le gène Vglut2 avait été sélectivement invalidé dans les neurones DA du cerveau, ainsi que leurs témoins et des souris sauvages. D'autant que malgré l'utilisation croissante de la souris en neurobiologie, cette innervation DA n'avait jamais fait l'objet d’une caractérisation systématique en microscopie électronique. En raison de possibles différences entre le coeur et la coque du noyau accumbens, l'étude a donc porté sur les deux parties de ce noyau ainsi que le néostriatum et des souris jeunes (P15) et adultes (P70-90) de chaque lignée, préparées pour l'immunocytochimie de la TH, mais aussi pour le double marquage TH et VGLUT2, selon le protocole précédemment utilisé chez le rat. Les résultats ont surpris. Aux deux âges et quel que soit le génotype, les terminaisons axonales TH immunoréactives des trois régions sont apparues comparables quant à leur taille, leur contenu vésiculaire, le pourcentage contenant une mitochondrie et une très faible incidence synaptique (5% des varicosités, en moyenne). Ainsi, chez la souris, la régression du double phénotype pourrait être encore plus précoce que chez le rat, à moins que les deux protéines ne soient très tôt ségréguées dans des varicosités axonales distinctes des mêmes neurones DA. Ces données renforcent aussi l’hypothèse d’une transmission diffuse (volumique) et d’un niveau ambiant de DA comme élément déterminant du fonctionnement du système mésostriatal DA chez la souris comme chez le rat.

Axe et rotaxane parapluie : vers de nouveaux transporteurs transmembranaires de chlorures et de médicaments cycliques

La membrane cellulaire est principalement une bicouche phospholipidique constituant une barrière qui régule les échanges entre la cellule et son environnement. Son intérieur hydrophobe empêche le passage d’espèces hydrophiles, chargées, de grande masse moléculaire et polaires, qui sont généralement transportées par des protéines à travers la bicouche. Dans certains cas de systèmes défectueux (e.g. les canalopathies), l’équilibre des concentrations en ions à l’intérieur et à l’extérieur des cellules est perturbé et les cellules sont compromises. C’est pourquoi le développement de transporteurs transmembranaires synthétiques est nécessaire. De nombreux travaux ont été faits dans le développement de transporteurs synthétiques d’anions (particulièrement du chlorure). Dans cette thèse, nous présentons nos travaux sur un nouveau transporteur d’anion appelé axe parapluie, capable de changer de conformation dépendamment de la polarité de son environnement. Dans un premier temps, nous avons conçu le design, puis synthétisé ces axes parapluie qui montrent une importante activité en tant que transporteur de chlorures. Ces composés réunissent deux concepts : - Le parapluie, constitué d’acides biliaires amphiphiles (une face hydrophile, une face hydrophobe). La flexibilité des articulations combinée à la grande surface des acides choliques permettent d’empêcher les interactions défavorables entre les parties hydrophiles et hydrophobes, ce qui facilite l’insertion dans la bicouche. - Un site ammonium secondaire en tant que site de reconnaissance, capable de former des ponts hydrogène avec des ions chlorure. De plus, l’axe peut complexer une roue de type éther couronne pour former un pseudo-rotaxane ou rotaxane parapluie ce qui résulte en l’inhibition partielle de leurs propriétés de transport. Ceci nous mène au second objectif de cette thèse, le développement d’un nouveau moyen de transport pour les médicaments cycliques. Certains macrocycles polaires et biologiquement actifs tels que les nactines ont besoin d’atteindre leur objectif à l’intérieur de la cellule pour jouer leur rôle. La membrane cellulaire est alors un obstacle. Nous avons imaginé tirer profit de notre axe parapluie pour transporter un médicament cyclique (en tant que roue d’un rotaxane parapluie). Les assemblages des rotaxanes parapluie furent accomplis par la méthode de clipage. Le comportement de l’axe et du rotaxane parapluie fut étudié par RMN et fluorimétrie. Le mouvement du parapluie passant d’une conformation fermée à exposée dépendamment du milieu fut observé pour le rotaxane parapluie. Il en fut de même pour les interactions entre le rotaxane parapluie et des vésicules constituées de phospholipides. Finalement, la capacité du rotaxane parapluie à franchir la bicouche lipidique pour transporter la roue à l’intérieur de la vésicule fut démontrée à l’aide de liposomes contenant de la α-chymotrypsine. Cette dernière pu cliver certains liens amide de l’axe parapluie afin de relarguer la roue.