A biomimetic model membrane system on oxidic surfaces designed for the investigation of cytochrome c oxidase and other membrane proteins by fluorescence and waveguide spectroscopy

Die transmembrane Potenzialdifferenz Δφm ist direkt mit der katalytischen Aktivität der Cytochrom c Oxidase (CcO) verknüpft. Die CcO ist das terminale Enzym (Komplex IV) in der Atmungskette der Mitochondrien. Das Enzym katalysiert die Reduktion von O2 zu 2 H2O. Dabei werden Elektronen vom natürlichen Substrat Cytochrom c zur CcO übertragen. Der Eleltronentransfer innerhalb der CcO ist an die Protonentranslokation über die Membran gekoppelt. Folglich bildet sich über der inneren Membrane der Mitochondrien eine Differenz in der Protonenkonzentration. Zusätzlich wird eine Potenzialdifferenz Δφm generiert.rnrnDas Transmembranpotenzial Δφm kann mit Hilfe der Fluoreszenzspektroskopie unter Einsatz eines potenzialemfindlichen Farbstoffs gemessen werden. Um quantitative Aussagen aus solchen Untersuchungen ableiten zu können, müssen zuvor Kalibrierungsmessungen am Membransystem durchgeführt werden.rnrnIn dieser Arbeit werden Kalibrierungsmessungen von Δφm in einer Modellmembrane mit inkorporiertem CcO vorgestellt. Dazu wurde ein biomimetisches Membransystem, die Proteinverankerte Doppelschicht (protein-tethered Bilayer Lipid Membrane, ptBLM), auf einem transparenten, leitfähigem Substrat (Indiumzinnoxid, ITO) entwickelt. ITO ermöglicht den simultanen Einsatz von elektrochemischen und Fluoreszenz- oder optischen wellenleiterspektroskopischen Methoden. Das Δφm in der ptBLM wurde durch extern angelegte, definierte elektrische Spannungen induziert. rnrnEine dünne Hydrogelschicht wurde als "soft cushion" für die ptBLM auf ITO eingesetzt. Das Polymernetzwerk enthält die NTA Funktionsgruppen zur orientierten Immobilisierung der CcO auf der Oberfläche der Hydrogels mit Hilfe der Ni-NTA Technik. Die ptBLM wurde nach der Immobilisierung der CcO mittels in-situ Dialyse gebildet. Elektrochemische Impedanzmessungen zeigten einen hohen elektrischen Widerstand (≈ 1 MΩ) der ptBLM. Optische Wellenleiterspektren (SPR / OWS) zeigten eine erhöhte Anisotropie des Systems nach der Bildung der Doppellipidschicht. Cyklovoltammetriemessungen von reduziertem Cytochrom c bestätigten die Aktivität der CcO in der Hydrogel-gestützten ptBLM. Das Membranpotenzial in der Hydrogel-gestützten ptBLM, induziert durch definierte elektrische Spannungen, wurde mit Hilfe der ratiometrischen Fluoreszenzspektroskopie gemessen. Referenzmessungen mit einer einfach verankerten Dopplellipidschicht (tBLM) lieferten einen Umrechnungsfaktor zwischen dem ratiometrischen Parameter Rn und dem Membranpotenzial (0,05 / 100 mV). Die Nachweisgrenze für das Membranpotenzial in einer Hydrogel-gestützten ptBLM lag bei ≈ 80 mV. Diese Daten dienen als gute Grundlage für künftige Untersuchungen des selbstgenerierten Δφm der CcO in einer ptBLM.

In vitro synthesis of the light-harvesting complex into artificial membrane systems

In green plants, the function of collecting solar energy for photosynthesis is fulfilled by a series of light-harvesting complexes (LHC). The light-harvesting chlorophyll a/b protein (LHCP) is synthesized in the cytosol as a precursor (pLHCP), then imported into chloroplasts and assembled into photosynthetic thylakoid membranes. Knowledge about the regulation of the transport processes of LHCP is rather limited. Closely mimicking the in vivo situation, cell-free protein expression system is employed in this dissertation to study the reconstitution of LHCP into artificial membranes. The approach starts merely from the genetic information of the protein, so the difficult and time-consuming procedures of protein expression and purification can be avoided. The LHCP encoding gene from Pisum sativum was cloned into a cell-free compatible vector system and the protein was expressed in wheat germ extracts. Vesicles or pigment-containing vesicles were prepared with either synthetic lipid or purified plant leaf lipid to mimic cell membranes. LHCP was synthesized in wheat germ extract systems with or without supplemented lipids. The addition of either synthetic or purified plant leaf lipid was found to be beneficial to the general productivity of the expression system. The lipid membrane insertion of the LHCP was investigated by radioactive labelling, protease digestion, and centrifugation assays. The LHCP is partially protected against protease digestion; however the protection is independent from the supplemented lipids.

Purificazione di plasminogeno con membrane di affinita'

Alcune patologie dell’occhio come la retinopatia diabetica, il pucker maculare, il distacco della retina possono essere curate con un intervento di vitrectomia. I rischi associati all’intervento potrebbero essere superati ricorrendo alla vitrectomia enzimatica con plasmina in associazione o in sostituzione della vitrectomia convenzionale. Inoltre, l’uso di plasmina autologa eviterebbe problemi di rigetto. La plasmina si ottiene attivando il plasminogeno con enzimi quali l’attivatore tissutale (tPA) e l’urochinasi ( uPA ) . La purificazione del plasminogeno dal sangue avviene normalmente attraverso cromatografia di affinità con resina. Tuttavia, le membrane di affinità costituiscono un supporto ideale per questa applicazione poiché possono essere facilmente impaccate prima dell’intervento, permettendo la realizzazione di un dispositivo monouso che fornisce un processo rapido ed economico. Obiettivo di questo lavoro è la preparazione di membrane di affinità per la purificazione del plasminogeno utilizzando L-lisina come ligando di affinità. Per questo scopo sono state usate membrane in cellulosa rigenerata ad attivazione epossidica, modificate con due diversi protocolli per l’immobilizzazione di L-lisina. La densità ligando è stata misurata mediante un saggio colorimetrico che usa l’acido arancio 7 come indicatore. La resa di immobilizzazione è stata studiata in funzione del tempo di reazione e della concentrazione di L-lisina. Le membrane ottimizzate sono state caratterizzate con esperimenti dinamici usando siero bovino e umano, i risultati sono stati confrontati con quelli ottenuti in esperimenti paralleli condotti con una resina commerciale di affinità con L-lisina. Durante gli esperimenti con siero, le frazioni provenienti da ogni fase cromatografica sono state raccolte e analizzate con HPLC ed elettroforesi SDS-PAGE. In particolare, l’elettroforesi dei campioni eluiti presenta una banda del plasminogeno ben definita indicando che le membrane di affinità con L-lisina sono adatte alla purificazione del plasminogeno. Inoltre, è emerso che le membrane hanno maggiore produttività della resina commerciale di riferimento.

Safety, Security And safeguards In GEN IV sodium fast reactors

This work presents first a study of the national and international laws in the fields of safety, security and safeguards. The international treaties and the recommendations issued by the IAEA as well as the national regulations in force in France, the United States and Italy are analyzed. As a result of this, a comparison among them is presented. Given the interest of the Japan Atomic Energy Agency for the aspects of criminal penalties and monetary, also the Japanese case is analyzed. The main part of this work was held at the JAEA in the field of proliferation resistance (PR) and physical protection (PP) of a GEN IV sodium fast reactor. For this purpose the design of the system is completed and the PR & PP methodology is applied to obtain data usable by designers for the improvement of the system itself. Due to the presence of sensitive data, not all the details can be disclosed. The reactor site of a hypothetical and commercial sodium-cooled fast neutron nuclear reactor system (SFR) is used as the target NES for the application of the methodology. The methodology is applied to all the PR and PP scenarios: diversion, misuse and breakout; theft and sabotage. The methodology is applied to the SFR to check if this system meets the target of PR and PP as described in the GIF goal; secondly, a comparison between the SFR and a LWR is performed to evaluate if and how it would be possible to improve the PR&PP of the SFR. The comparison is implemented according to the example development target: achieving PR&PP similar or superior to domestic and international ALWR. Three main actions were performed: implement the evaluation methodology; characterize the PR&PP for the nuclear energy system; identify recommendations for system designers through the comparison.

Membrane properties and synaptic integration of identified neuronal populations in the developing rodent neocortex

In my PhD work I concentrated on three elementary questions that are essential to understand the interactions between the different neuronal cell populations in the developing neocortex. The questions regarded the identity of Cajal-Retzius (CR) cells, the ubiquitous expression of glycine receptors in all major cell populations of the immature neocortex, and the role of taurine in the modulation of immature neocortical network activity.rnTo unravel whether CR cells of different ontogenetic origin have divergent functions I investigated the electrophysiological properties of YFP+ (derived from the septum and borders of the pallium) and YFP− CR cells (derived from other neocortical origins). This study demonstrated that the passive and active electrophysiological properties as well as features of GABAergic PSCs and glutamatergic currents are similar between both CR cell populations. These findings suggest that CR cells of different origins most probably support similar functions within the neuronal networks of the early postnatal cerebral cortex.rnTo elucidate whether glycine receptors are expressed in all major cell populations of the developing neocortex I analyzed the functional expression of glycine receptors on subplate (SP) cells. Activation of glycine receptors by glycine, -alanine and taurine elicited membrane responses that could be blocked by the selective glycinergic antagonist strychnine. Pharmacological experiments suggest that SP cells express functional heteromeric glycine receptors that do not contain 1 subunits. The activation of glycine receptors by glycine and taurine induced a membrane depolarization, which mediated excitatory effects. Considering the key role of SP cells in immature cortical networks and the development of thalamocortical connections, this glycinergic excitation may influence the properties of early cortical networks and the formation of cortical circuits.rnIn the third part of my project I demonstrated that tonic taurine application induced a massive increase in the frequency of PSCs. Based on their reversal potential and their pharmacological properties these taurine-induced PSCs are exclusively transmitted via GABAA receptors to the pyramidal neurons, while both GABAA and glycine receptors were implicated in the generation of the presynaptic activity. Accordingly, whole-cell and cell-attached recordings from genetically labeled interneurons revealed the expression of glycine and GABAA receptors, which mediated an excitatory action on these cells. These findings suggest that low taurine concentrations can tonically activate exclusively GABAergic networks. The activity level maintained by this GABAergic activity in the immature nervous system may contribute to network properties and can facilitate the activity dependent formation of adequate synaptic projections.rnIn summary, the results of my studies complemented the knowledge about neuronal interactions in the immature neocortex and improve our understanding of cellular processes that guide neuronal development and thus shape the brain.rn

Severe Accident Simulation of Small Modular Reactors

Since the Three Mile Island Unit 2 (TMI-2), accident in 1979 which led to the meltdown of about one half of the reactor core and to limited releases of radioactive materials to the environment, an important international effort has been made on severe accident research. The present work aims to investigate the behaviour of a Small Modular Reactor during severe accident conditions. In order to perform these analyses, a SMR has been studied for the European reference severe accident analysis code ASTEC, developed by IRSN and GRS. In the thesis will be described in detail the IRIS Small Modular Reactor; the reference reactor chosen to develop the ASTEC input deck. The IRIS model was developed in the framework of a research collaboration with the IRSN development team. In the thesis will be described systematically the creation of the ASTEC IRIS input deck: the nodalization scheme adopted, the solution used to simulate the passive safety systems and the strong interaction between the reactor vessel and the containment. The ASTEC SMR model will be tested against the RELAP-GOTHIC coupled code model, with respect to a Design Basis Accident, to evaluate the capability of the ASTEC code on reproducing correctly the behaviour of the nuclear system. Once the model has been validated, a severe accident scenario will be simulated and the obtained results along with the nuclear system response will be analysed.

The biological basis of autism spectrum disorders: evaluation of oxidative stress and erytrocyte membrane alterations

This case-control study involved a total of 29 autistic children (Au) aged 6 to 12 years, and 28 gender and age-matched typically developing children (TD). We evaluated a high number of peripheral oxidative stress parameters, erythrocyte and lymphocyte membrane functional features and membrane lipid composition of erythrocyte. Erythrocyte TBARS, Peroxiredoxin II, Protein Carbonyl Groups and urinary HEL and isoprostane levels were elevated in AU (confirming an imbalance of the redox status of Au); other oxidative stress markers or associated parameters (urinary 8-oxo-dG, plasma Total antioxidant capacity and plasma carbonyl groups, erythrocyte SOD and catalase activities) were unchanged, whilst peroxiredoxin I showed a trend of elevated levels in red blood cells of Au children. A very significant reduction of both erythrocyte and lymphocyte Na+, K+-ATPase activity (NKA), a reduction of erythrocyte membrane fluidity, a reduction of phospatydyl serine exposition on erythrocyte membranes, an alteration in erythrocyte fatty acid membrane profile (increase in MUFA and in ω6/ω3 ratio due to decrease in EPA and DHA) and a reduction of cholesterol content of erythrocyte membrane were found in Au compared to TD, without change in erythrocyte membrane sialic acid content and in lymphocyte membrane fluidity. Some Au clinical features appear to be correlated with these findings; in particular, hyperactivity score appears to be related with some parameters of the lipidomic profile and membrane fluidity, and ADOS and CARS score are inversely related to peroxiredoxin II levels. Oxidative stress and erythrocyte structural and functional alterations may play a role in the pathogenesis of Autism Spectrum Disorders and could be potentially utilized as peripheral biomarkers.

Studio ed ottimizzazione di processi per la produzione di membrane ceramiche per la separazione di idrogeno

Questa tesi descrive l’attività scientifica svolta presso l’istituto CNR-ISTEC di Faenza. Lo scopo è stato lo studio e l’ottimizzazione del processo per la realizzazione di una membrana ceramica permselettiva all’idrogeno usufruibile in applicazioni industriali. Grazie alle prove effettuate è stata possibile la realizzazione tramite colaggio su nastro dei due strati ceramici che formano la membrana: un supporto poroso e un film sottile e denso. I nastri, dopo essiccamento, sono stati tagliati con la geometria desiderata, impilati uno sull’altro, termocompressi e sinterizzati. L’attività svolta ha permesso l’ingegnerizzazione di una membrana ad elevato contenuto tecnologico con le proprietà necessarie per poter essere impiegata in un processo di purificazione di idrogeno più semplice, efficiente ed economico rispetto a quelli utilizzati fino ad ora.

Studio di un sistema di misura dello spessore senza contatto di membrane nanofibrose da elettrofilatura.

Questo lavoro tratta lo sviluppo di un sistema di misura contactless dello spessore da applicare nel campo delle membrane ottenute tramite il processo di elettrofilatura. Il sistema è di tipo ottico e sfrutta lo spostamento dello spot di un puntatore laser, applicato con inclinazione nota, per risalire alla variazione di spessore.

Sintesi di membrane polimeriche nanoporose, funzionalizzate con N-metil-D-glucammina, per la rimozione dell'arsenico dalle acque

L’obbiettivo del lavoro è la messa a punto di membrane polimeriche nanoporose funzionalizzate con la N-metil-D-glucamina (NMDG), per la rimozione dell’arsenico dalle acque. Al fine di ottenere membrane con proprietà di filtro molecolare selettivo, si è deciso di sfruttare la capacità della NMDG di chelare selettivamente gli ossianioni dell’arsenico. La NMDG è stata funzionalizzata in maniera da ottenere due monomeri: metacrilato della N-metil-D-glucammina e 4-vinilbenzil-N-metil-D-glucammina, sui quali è stata effettuata una sililazione dei gruppi ossidrilici della glucammina in maniera da ottenere composti liquidi e quindi adatti al processo produttivo delle membrane. Con l’obbiettivo di ottenere un elevata area superficiale la morfologia della membrana è stata controllata mediante imprinting di nanoparticelle di silice colloidale. La cattura del arsenico da parte delle membrane polimeriche è stata valutata mediante analisi di assorbimento atomico a seguito dell’attacco acido con HF 5% che rimuove le particelle di silice ed i gruppi protettori.

Sviluppo di un sistema integrato innovativo per la contemporanea produzione e separazione di H2 ultrapuro, attraverso oxy-reforming, water-gas shift e membrane al Pd

Il presente lavoro di tesi si è focalizzato sullo studio e sulla ottimizzazione di un sistema integrato, che utilizzi la reazione di oxy-reforming del metano al fine di produrre syngas che venga trattato attraverso la water-gas shift al fine di abbattere il contenuto di CO e al tempo stesso aumentare la resa in H2. Con l’obiettivo di ottenere H2 ad elevata purezza (>99%) da poter essere inviato direttamente a celle a combustible ed in impianti di piccola taglia con possibile delocalizzazione della produzione industriale di energia elettrica e termica “pulita”, la miscela reale uscente dal processo di oxy-reforming è stata processata tramite successiva water-gas shift direttamente all’interno di una membrana ceramica al Pd selettiva nella separazione di H2. L’innovativià di questo progetto di studio è data da diversi parametri quali: 1) l’impiego dell’oxy-reforming in alternativa al normale steam-reforming del CH4, che permette di condurre il processo a temperature decisamente inferiori (700-750°C), utilizzando un minor quantitativo di vapore (S/C = 0.7); 2) l’utilizzo di due nuove formulazioni di catalizzatore di WGS per alte temperature, capace di operare in un unico stadio conversioni di CO ottenibili industrialmente solo attraverso i convenzionali due due stadi di reazione (e due diverse formulazioni di catalizzatori a base di Fe/Cr e Cu); 3) l’utilizzo di supporti ceramici con membrana a base di Pd, capaci di ospitare al loro interno un catalizzatore eterogeneo per la reazione di WGS a 400°C, rendendo quindi possibile la produzione e contemporanea separazione di H2 con un ulteriore effetto positivo poiché la membrana rimuovendo H2 dalla zona di reazione favorisce il superamento dell’equilibrio termodinamico per la conversione del CO, abbassandone il contenuto nel flusso uscente dei gas reazione e rendendo non più necessari sistemi aggiuntivi di separazione quali PSA o PROXY.

Preparazione e proprietà di trasporto di gas di membrane a base di polimeri e nanoplatelets grafenici per la cattura di CO2 da processi energetici

Lo scopo di questo studio sperimentale è stato quello di determinare l’effetto dell’aggiunta di piccole quantità (1wt%) di grafene e ossido di grafene al poli(1-trimetilsilil-1-propino) (PTMSP). Il PTMSP è uno dei polimeri più promettenti per la separazione di gas tramite membrane polimeriche grazie al suo elevato volume libero (26%). Sono state studiate sia membrane spesse (60-180 micron) preparate per solvent casting che sottili (2-10 micron) preparate per spin coating supportate su un film poroso di polipropilene commerciale. L’ossido di grafene aumenta la permeabilità del PTMSP, mentre il grafene ha mostrato un comportamento variabile in funzione del protocollo di preparazione che è risultato dipendere fortemente dalla velocità di evaporazione del solvente. Le membrane così ottenute sono state testate al permeometro. È stata osservata una dipendenza della permeabilità in funzione dello spessore del film e del grado di invecchiamento. In particolare, la presenza di nanofiller riduce il grado di invecchiamento dei film di PTMSP. Nel caso specifico della coppia di gas permeanti He/CO2, i campioni hanno mostrato un comportamento intercambiabile di selettività all’He o alla CO2, modulabile in funzione della temperatura tra 30-60°C e del filler utilizzato.

Studio di membrane nanofibrose ottenute da elettrofilatura di poliarammidi per il rinforzo di materiali compositi

Uno tra i principali problemi dei compositi è il fenomeno della delaminazione. In questo lavoro di tesi sono state prodotte membrane nanofibrose ottenute mediante elettrofilatura di poliarammidi, da impiegare come rinforzo per contrastare tale fenomeno. Sono state quindi preparate soluzioni di Nomex con differenti combinazioni di concentrazione e solvente da sottoporre ad elettrofilatura, e sono stati ricercati i parametri di processo ottimali. La qualità delle nanofibre è stata valutata attraverso analisi SEM e successivamente sono state determinate le proprietà termo-meccaniche delle membrane migliori. Le stesse sono state impiegate per la produzione di compositi in fibra di carbonio a matrice epossidica e l’effetto sulla delaminazione è stato valutato tramite test preliminari ILSS e DCB. Inoltre, è stato valutato al cono-calorimetro il comportamento alla fiamma del composito nano-rinforzato. Sono state anche tentate prove preliminari di elettrofilatura di soluzioni di Kevlar.

Funzionalizzazione di derivati grafenici mediante tecniche chimico-meccaniche utilizzabili in membrane polimeriche per la separazione di gas

La tesi di laurea sperimentale tratta la produzione di membrane polimeriche ricoperte con coating grafenici mediante la tecnica del layer by layer per la separazione di miscele gassose. Il grafene utilizzato è stato prodotto in laboratorio mediante un mulino a sfere che ha portato contemporaneamente sia all’esfoliazione della grafite sia alla sua funzionalizzazione, mentre è stato utilizzato un ossido di grafene commerciale. I campioni sono stati preparati utilizzando sia membrane porose che non porose. Le membrane così preparate sono state testate al permeometro per verificarne la permeabilità a coppie di gas di interesse industriale, come H2/CO2.

Expression, regulation and clinical significance of soluble and membrane CD14 receptors in pediatric inflammatory lung diseases

BACKGROUND: Inflammatory lung diseases are a major morbidity factor in children. Therefore, novel strategies for early detection of inflammatory lung diseases are of high interest. Bacterial lipopolysaccharide (LPS) is recognized via Toll-like receptors and CD14. CD14 exists as a soluble (sCD14) and membrane-associated (mCD14) protein, present on the surface of leukocytes. Previous studies suggest sCD14 as potential marker for inflammatory diseases, but their potential role in pediatric lung diseases remained elusive. Therefore, we examined the expression, regulation and significance of sCD14 and mCD14 in pediatric lung diseases. METHODS: sCD14 levels were quantified in serum and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of children with infective (pneumonia, cystic fibrosis, CF) and non-infective (asthma) inflammatory lung diseases and healthy control subjects by ELISA. Membrane CD14 expression levels on monocytes in peripheral blood and on alveolar macrophages in BALF were quantified by flow cytometry. In vitro studies were performed to investigate which factors regulate sCD14 release and mCD14 expression. RESULTS: sCD14 serum levels were specifically increased in serum of children with pneumonia compared to CF, asthma and control subjects. In vitro, CpG induced the release of sCD14 levels in a protease-independent manner, whereas LPS-mediated mCD14 shedding was prevented by serine protease inhibition. CONCLUSIONS: This study demonstrates for the first time the expression, regulation and clinical significance of soluble and membrane CD14 receptors in pediatric inflammatory lung diseases and suggests sCD14 as potential marker for pneumonia in children.