937 resultados para Inhibition de la traduction


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Une étape cruciale dans la fabrication des MEMS de haute fréquence est la gravure par plasma de la couche mince d’AlN de structure colonnaire agissant comme matériau piézoélectrique. Réalisé en collaboration étroite avec les chercheurs de Teledyne Dalsa, ce mémoire de maîtrise vise à mieux comprendre les mécanismes physico-chimiques gouvernant la cinétique ainsi que la formation de dommages lors de la gravure de l’AlN dans des plasmas Ar/Cl2/BCl3. Dans un premier temps, nous avons effectué une étude de l’influence des conditions opératoires d’un plasma à couplage inductif sur la densité des principales espèces actives de la gravure, à savoir, les ions positifs et les atomes de Cl. Ces mesures ont ensuite été corrélées aux caractéristiques de gravure, en particulier la vitesse de gravure, la rugosité de surface et les propriétés chimiques de la couche mince. Dans les plasmas Ar/Cl2, nos travaux ont notamment mis en évidence l’effet inhibiteur de l’AlO, un composé formé au cours de la croissance de l’AlN par pulvérisation magnétron réactive et non issu des interactions plasmas-parois ou encore de l’incorporation d’humidité dans la structure colonnaire de l’AlN. En présence de faibles traces de BCl3 dans le plasma Ar/Cl2, nous avons observé une amélioration significative du rendement de gravure de l’AlN dû à la formation de composés volatils BOCl. Par ailleurs, selon nos travaux, il y aurait deux niveaux de rugosité post-gravure : une plus faible rugosité produite par la présence d’AlO dans les plasmas Ar/Cl2 et indépendante de la vitesse de gravure ainsi qu’une plus importante rugosité due à la désorption préférentielle de l’Al dans les plasmas Ar/Cl2/BCl3 et augmentant linéairement avec la vitesse de gravure.

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Avec l’avancement en âge, les personnes âgées qui vivent à domicile ont besoin du soutien des membres de leur entourage, notamment d’un aidant familial dont le rôle n’est toutefois pas sans conséquence sur sa santé. Les écrits empiriques ont montré que certains aidants sont résilients, c’est-à-dire qu’ils s’adaptent à leur situation et continuent leur développement. Toutefois, aucune étude n’a été effectuée au Liban auprès des aidantes familiales pour expliquer la résilience dans ce contexte et, plus spécifiquement, pour déterminer les facteurs qui pourraient l’influencer. Cette étude à devis corrélationnel de prédiction avait pour but de vérifier certaines des relations postulées par un modèle empirique découlant des écrits, soit la contribution de facteurs personnels (stratégies de coping et auto-efficacité) et de facteurs contextuels (relations familiales, perception du soutien de l’entourage, et sens accordé au « prendre soin »),à la résilience des aidantes familiales libanaises qui prennent soin d’un proche âgé à domicile. L’étude a été effectuée au Liban auprès d’un échantillon de convenance composé de 140 aidantes familiales principales cohabitant à domicile avec un parent âgé de 65 ans et plus ayant une perte d’autonomie fonctionnelle ou cognitive. La collecte des données a été réalisée en arabe en utilisant un guide d’entrevue standardisé regroupant des instruments nord-américains traduits selon la méthode de traduction inversée parallèle, de même qu’une question ouverte portant sur la perception des aidantes de la résilience, soit des facteurs qui les aident à continuer à prendre soin de leur proche âgé tout en continuant à se développer. Une analyse de régression hiérarchique a permis de vérifier la contribution unique des facteurs personnels et contextuels à expliquer la résilience des aidantes familiales, en contrôlant pour l’âge et le niveau de scolarité des aidantes et pour le niveau de perte d’autonomie et la fréquence des comportements dysfonctionnels de leurs parents âgés. Une analyse de contenu a permis de décrire la perception des aidantes eu égard à la résilience. Les résultats ont montré que le modèle empirique, incluant les variables de contrôle explique 54% de la variance de la résilience et que quatre des facteurs considérés, soit les stratégies de coping centrées sur le problème, les stratégies de coping centrées sur les émotions, le sentiment d’auto-efficacité et le sens du « prendre soin » ont une contribution statistiquement significative à la résilience des aidantes. Parmi ces quatre facteurs, le sens du « prendre soin » et le sentiment d’auto-efficacité expliquent davantage de variance, soit 11% et 5% respectivement. L’analyse qualitative du discours des aidantes a montré qu’elles prennent soin de leur proche âgé surtout par souci de réciprocité, mais également parce qu’il s’agit d’un membre de la famille et par respect pour Dieu. Ce sont par ailleurs leurs croyances et la satisfaction liée au prendre soin qui les aident à continuer et à se développer. Cette étude offre une meilleure compréhension du concept de la résilience des aidantes familiales au Liban et de certains facteurs qui en sont des prédicteurs significatifs. Elle offre des pistes pour l’intervention infirmière dans le but de promouvoir la santé de la personne/famille en tant que partenaire de soins. Des recommandations pour la pratique, la formation et la recherche sont proposées.

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Les propriétés antioxydantes du resvératrol sont d’un grand intérêt pour contrer la dysfonction endothéliale où la contribution du stress oxydant est majeure. Cette dysfonction endothéliale est d’ailleurs bien caractérisée en hypertrophie ventriculaire gauche (HVG). Cette étude vise à explorer les effets thérapeutiques du resvératrol sur la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques associée à l’HVG. L’HVG est induite suite à un cerclage aortique (CA) sur des porcelets de 2 mois. Le resvératrol est ensuite administré à 20 mg/kg/jour per os aux animaux répertoriés dans différents groupes. Le groupe 1 comprend les animaux contrôles sans CA alors que le groupe 2 représente les porcelets ayant subit le CA sans traitement. Le groupe 3 comprend les animaux traités pendant les 60 jours après la chirurgie alors que le groupe 4 est traité seulement à partir du 30ème jour jusqu’au jour 60. Des analyses échocardiographiques et histologiques ont été effectuées afin de déterminer le degré d’hypertrophie et l’impact du resvératrol sur la progression de l’HVG alors que la réactivité vasculaire a été évaluée par des expériences de chambres d’organes. La dysfonction endothéliale a été étudiée in vitro par quantification des métabolites nitriques et des niveaux de GMPc tandis que le stress oxydant est décrit par les niveaux d’angiotensine II (Ang II) et de protéines carbonylées. Les courbes dose-réponse à la sérotonine du groupe 3 traité pendant les 60 jours au resvératrol ont démontré une relaxation vasculaire significativement améliorée comparé au groupe 2 non-traité (p<0,05). Le pourcentage de changement du rapport de la masse du ventricule gauche sur la masse corporelle (LVmass/BW) a démontré une inhibition du développement de l’HVG dans le groupe 3 alors que le groupe 4 n’a pas eu d’effets bénéfiques des 30 jours de traitement au resvératrol. La biodisponibilité du NO représentée par la mesure de ses métabolites en circulation (398,71±21,74 ; 151,04±14,95 ; 241,86±15,53 ; 208,17±26,52 uM pour les groupes 1, 2, 3 et 4 respectivement, p<0,001 pour groupe 1 et 3 vs groupe 2) et par le niveau de GMPc a été augmentée avec l’administration du polyphénol (2,54±0,63 ; 0,67±0,45 ; 1,71±0,25 ; 1,98±0,29 pmol/ml pour les groupes 1, 2, 3 et 4 respectivement, p<0,05 pour groupe 1, 3 et 4 vs groupe 2). Le rôle antioxydant du resvératrol a été confirmé avec une réduction des niveaux de protéines carbonylées chez le groupe 3 comparé aux valeurs du groupe 2 (0,14±0,05 vs 0,33±0,03 nmol/mg respectivement) sans diminution des niveaux d’Ang II. Le resvératrol a aussi réduit l’hypertrophie des cardiomyocytes et la fibrose interstitielle. Ainsi, le resvératrol peut effectivement réduire la dysfonction endothéliale des artères coronaires épicardiques et limiter l’occurrence de remodelage myocardique associé à l’HVG, principalement à travers l’activation de la signalisation dépendante du NO.

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La gazéification est aujourd'hui l'une des stratégies les plus prometteuses pour valoriser les déchets en énergie. Cette technologie thermo-chimique permet une réduction de 95 % de la masse des intrants et génère des cendres inertes ainsi que du gaz de synthèse (syngaz). Le syngaz est un combustible gazeux composé principalement de monoxyde de carbone (CO), d'hydrogène (H2) et de dioxyde de carbone (CO2). Le syngaz peut être utilisé pour produire de la chaleur et de l'électricité. Il est également la pierre angulaire d'un grand nombre de produits à haute valeur ajoutée, allant de l'éthanol à l'ammoniac et l'hydrogène pur. Les applications en aval de la production de syngaz sont dictées par son pouvoir calorifique, lui-même dépendant de la teneur du gaz en H2. L’augmentation du contenu du syngaz en H2 est rendu possible par la conversion catalytique à la vapeur d’eau, largement répandu dans le cadre du reformage du méthane pour la production d'hydrogène. Au cours de cette réaction, le CO est converti en H2 et CO2 selon : CO + H2O → CO2 + H2. Ce processus est possible grâce à des catalyseurs métalliques mis en contact avec le CO et de la vapeur. La conversion catalytique à la vapeur d’eau a jusqu'ici été réservé pour de grandes installations industrielles car elle nécessite un capital et des charges d’exploitations très importantes. Par conséquent, les installations de plus petite échelle et traitant des intrants de faible qualité (biomasse, déchets, boues ...), n'ont pas accès à cette technologie. Ainsi, la seule utilisation de leur syngaz à faible pouvoir calorifique, est limitée à la génération de chaleur ou, tout au plus, d'électricité. Afin de permettre à ces installations une gamme d’application plus vaste de leurs syngaz, une alternative économique à base de catalyseur biologique est proposée par l’utilisation de bactéries hyperthermophiles hydrogénogènes. L'objectif de cette thèse est d'utiliser Carboxydothermus hydrogenoformans, une bactérie thermophile carboxydotrophe hydrogénogène comme catalyseur biologique pour la conversion du monoxyde de carbone en hydrogène. Pour cela, l’impact d'un phénomène de biominéralisation sur la production d’H2 a été étudié. Ensuite, la faisabilité et les limites de l’utilisation de la souche dans un bioréacteur ont été évaluées. Tout d'abord, la caractérisation de la phase inorganique prédominante lorsque C. hydrogenoformans est inoculé dans le milieu DSMZ, a révélé une biominéralisation de phosphate de calcium (CaP) cristallin en deux phases. L’analyse par diffraction des rayons X et spectrométrie infrarouge à transformée de Fourier de ce matériau biphasique indique une signature caractéristique de la Mg-whitlockite, alors que les images obtenues par microscopie électronique à transmission ont montré l'existence de nanotiges cristallines s’apparentant à de l’hydroxyapatite. Dans les deux cas, le mode de biominéralisation semble être biologiquement induit plutôt que contrôlé. L'impact du précipité de CaP endogène sur le transfert de masse du CO et la production d’H2 a ensuite été étudié. Les résultats ont été comparés aux valeurs obtenues dans un milieu où aucune précipitation n'est observée. Dans le milieu DSMZ, le KLa apparent (0.22 ± 0.005 min-1) et le rendement de production d’H2 (89.11 ± 6.69 %) étaient plus élevés que ceux obtenus avec le milieu modifié (0.19 ± 0.015 min-1 et 82.60 ± 3.62% respectivement). La présence du précipité n'a eu aucune incidence sur l'activité microbienne. En somme, le précipité de CaP offre une nouvelle stratégie pour améliorer les performances de transfert de masse du CO en utilisant les propriétés hydrophobes de gaz. En second lieu, la conversion du CO en H2 par la souche Carboxydothermus hydrogenoformans fut étudiée et optimisée dans un réacteur gazosiphon de 35 L. Parmi toutes les conditions opérationnelles, le paramètre majeur fut le ratio du débit de recirculation du gaz sur le débit d'alimentation en CO (QR:Qin). Ce ratio impacte à la fois l'activité biologique et le taux de transfert de masse gaz-liquide. En effet, au dessus d’un ratio de 40, les performances de conversion du CO en H2 sont limitées par l’activité biologique alors qu’en dessous, elles sont limitées par le transfert de masse. Cela se concrétise par une efficacité de conversion maximale de 90.4 ± 0.3 % et une activité spécifique de 2.7 ± 0.4 molCO·g–1VSS·d–1. Malgré des résultats prometteurs, les performances du bioréacteur ont été limitées par une faible densité cellulaire, typique de la croissance planctonique de C. hydrogenoformans. Cette limite est le facteur le plus contraignant pour des taux de charge de CO plus élevés. Ces performances ont été comparées à celles obtenues dans un réacteur à fibres creuses (BRFC) inoculé par la souche. En dépit d’une densité cellulaire et d’une activité volumétrique plus élevées, les performances du BRFC à tout le moins cinétiquement limitées quand elles n’étaient pas impactées par le transfert de masse, l'encrassement et le vieillissement de la membrane. Afin de parer à la dégénérescence de C. hydrogenoformans en cas de pénurie de CO, la croissance de la bactérie sur pyruvate en tant que seule source de carbone a été également caractérisée. Fait intéressant, en présence simultanée de pyruvate et de CO, C. hydrogenoformans n’a amorcé la consommation de pyruvate qu’une fois le CO épuisé. Cela a été attribué à un mécanisme d'inhibition du métabolisme du pyruvate par le CO, faisant ainsi du pyruvate le candidat idéal pour un système in situ de secours.

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Le récepteur V2 (V2R) de la vasopressine est un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), jouant un rôle fondamental dans le maintien de l’homéostasie hydrosodique. À l’instar de nombreux RCPGs, il est capable d’interagir avec plusieurs types de protéines G hétérotrimériques et possède des voies de signalisation peu explorées aux mécanismes mal compris. Ces voies non canoniques font l’objet des travaux exposés dans ce mémoire. Il s’agit d’explorer les caractéristiques et mécanismes de la signalisation de V2R via G12, et de la voie d’activation d’ERK 1/2 par transactivation du récepteur de l’insulin-like growth factor 1, IGF1R. Par des études de transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), nous exposons la capacité de V2R à interagir avec la sous-unité Gα12 ainsi que la modulation de la conformation de l’hétérotrimère G12 par l’agoniste de V2R, l’arginine-vasopressine. Ces travaux dévoilent également la modulation de l’interaction entre Gα12 et son effecteur classique RhoA, suggérant un engagement de RhoA, ainsi que la potentialisation via Gα12 de la production d’AMP cyclique. À l’aide de diverses méthodes d’inhibition sélective, nos résultats précisent les mécanismes de la transactivation. Ils supportent notamment le rôle initiateur de l’activation de Src par V2R et l’absence d’implication des ligands connus d’IGF1R dans la transactivation. La métalloprotéase MMP 3 apparaît par ailleurs comme un bon candidat pour réguler la transactivation. Ce projet met en lumière des modes de signalisation peu explorés de V2R, dont l’implication physiologique et physiopathologique pourrait s’avérer significative, au-delà d’un apport fondamental dans la compréhension de la signalisation des RCPGs.

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L’azote est l’élément le plus abondant dans l’atmosphère terrestre avec un pourcentage atteignant 78 %. Composant essentiel pour la biosynthèse des matériels organiques cellulaires, il est inutilisable sous sa forme diatomique (N2) très stable par la plupart des organismes. Seules les bactéries dites diazotrophiques comme Rhodobacter capsulatus sont capables de fixer l’azote moléculaire N2 par le biais de la synthèse d’une enzyme, la nitrogénase. Cette dernière catalyse la réduction du N2 en ammonium (NH4) qui peut alors être assimilé par d’autres organismes. La synthèse et l’activité de la nitrogénase consomment beaucoup d’énergie ce qui implique une régulation rigoureuse et son inhibition tant qu’une quantité suffisante d’ammonium est disponible. Parmi les protéines impliquées dans cette régulation, la protéine d’intérêt AmtB est un transporteur membranaire responsable de la perception et le transport de l’ammonium. Chez R. capsulatus, il a été démontré que suite à l’addition de l’ammonium, l’AmtB inhibe de façon réversible (switch off/switch on) l’activité de la nitrogénase en séquestrant la protéine PII GlnK accompagnée de l’ajout d’un groupement ADP ribose sur la sous unités Fe de l’enzyme par DraT. De plus, la formation de ce complexe à lui seul ne serait pas suffisant pour cette inactivation, ce qui suggère la séquestration d’une troisième protéine, DraG, afin d’inhiber son action qui consiste à enlever l’ADP ribose de la nitrogénase et donc sa réactivation. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de l’AmtB dans la régulation et le transport de l’ammonium à un niveau moléculaire et par la même occasion la fixation de l’azote, le premier volet de ce mémoire a été d’introduire une mutation ponctuelle par mutagénèse dirigée au niveau du résidu conservé W237 de l’AmtB. La production d’hydrogène est un autre aspect longtemps étudié chez R. capsulatus. Cette bactérie est capable de produire de l’hydrogène à partir de composés organiques par photofermentation suite à l’intervention exclusive de la nitrogénase. Plusieurs études ont été entreprises afin d’améliorer la production d’hydrogène. Certaines d’entre elles se sont intéressées à déterminer les conditions optimales qui confèrent une production maximale de gaz tandis que d’autres s’intéressent au fonctionnement de la bactérie elle même. Ainsi, le fait que la bioproduction de H2 par fermentation soit catalysée par la nitrogénase cela implique la régulation de l’activité de cette dernière par différents mécanismes dont le switch off par ADP ribosylation de l’enzyme. De ce fait, un mutant de R. capsulatus dépourvu d’AmtB (DG9) a été étudié dans la deuxième partie de cette thèse en termes d’activité de la nitrogénase, de sa modification par ADP ribosylation avec la détection des deux protéines GlnK et DraG qui interviennent dans cette régulation pour connaitre l’influence de différents acides aminés sur la régulation de la nitrogénase et pour l‘utilisation future de cette souche dans la production d’H2 car R. capsulatus produit de l’hydrogène par photofermentation grâce à cette enzyme. Les résultats obtenus ont révélé une activité de la nitrogénase continue et ininterrompue lorsque l’AmtB est absent avec une activité maximale quand la proline est utilisée comme source d’azote durant la culture bactérienne ce qui implique donc que l’abolition de l’activité de cette protéine entraine une production continue d’H2 chez R. capsulatus lorsque la proline est utilisée comme source d’azote lors de la culture bactérienne. Par ailleurs, avec des Western blots on a pu déterminer l’absence de régulation par ADP ribosylation ainsi que les expressions respectives de GlnK et DraG inchangées entre R. capsulatus sauvage et muté. En conclusion, la nitrogénase n’est pas modifiée et inhibée lorsque l’amtB est muté ce qui fait de la souche R. capsulatus DG9 un candidat idéal pour la production de biohydrogène en particulier lorsque du glucose et de la proline sont respectivement utilisés comme source de carbone et d'azote pour la croissance.

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Chez la bactérie Escherichia coli, la topoisomérase I et la gyrase représentent deux topoisomérases majeures qui participent à la régulation du surenroulement de l’ADN. Celles-ci sont codées respectivement par les gènes topA et par gyrA et gyrB. Chez les mutants topA, l’excès de surenroulement négatif qui est généré en amont de la polymérase ARN lors de la phase d’élongation de la transcription de l’ADN, entraine la formation de R-loops. Les R-loops sont des hybrides ARN-ADN qui in vivo sont formés lorsque l’ARN nouvellement transcrit forme un hybride avec le brin d’ADN matrice, le brin d’ADN complémentaire demeurant sous forme simple brin. La RNase HI est une endoribonucléase codée par le gène rnhA. Elle dégrade l’ARN de R-loops, entre autres, pour empêcher l’initiation de la réplication à des sites autres que l’origine normale, oriC. Chez les mutants rnhA, on observe une réplication indépendante de l’origine oriC. Ce type de réplication appelé cSDR, pourrait donc expliquer, du moins en partie, l’inhibition de la croissance de doubles mutants topA rnhA. A l’aide de la mutagenèse au transposon Tn5, il a été possible d’isoler des suppresseurs extragéniques qui permettaient la croissance des doubles mutants topA rnhA. Plusieurs de ces suppresseurs ont le transposon inséré dans le gène codant pour la RNase E, l’endoribonucléase principale impliquée dans la dégradation des ARNms chez E. coli. La majorité des insertions se retrouvent dans la partie C-terminale de la protéine qui est impliquée dans l’assemblage d’un complexe multiprotéique appelé l’ARN dégradosome. Les résultats obtenus démontrent que ces suppresseurs diminuent le cSDR ainsi que la réponse SOS induite constitutivement en l’absence de la RNase HI. Sachant que la RNase HI est une endoribonucléase tout comme la RNase E, une collaboration entre les deux enzymes suggère que la RNase E pourrait également jouer un rôle potentiel dans le contrôle de la formation des R-loops et bien évidemment de leur retrait au sein de la cellule. À l’opposé, il est possible que la RNase HI puisse avoir comme autre fonction la prise en charge de la maturation et de la dégradation des molécules d’ARNs.

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Le virus du papillome humain (VPH) est l’agent étiologique du cancer du col utérin, ainsi que d’autre néoplasies anogénitales et des voies aérodigestives supérieures. La réplication de son génome d’ADN double brin est assurée par les protéines virales E1 et E2, de concert avec la machinerie cellulaire de réplication. E1 assure le déroulement de l’ADN en aval de la fourche de réplication, grâce à son activité hélicase, et orchestre la duplication du génome viral. Nos travaux antérieurs ont démontré que le domaine N-terminal de E1 contient un motif de liaison à la protéine cellulaire p80/UAF1 qui est hautement conservé chez tous les VPH anogénitaux. L’intégrité de ce motif est essentielle au maintien de l’épisome viral. Les travaux présentés dans cette thèse ont d’abord déterminé que le motif de liaison à UAF1 n’est pas requis pour l’assemblage du pré-réplisome viral, mais important pour la réplication subséquente de l’ADN du VPH. Nous avons constaté qu’en présence de E1 et E2, UAF1 est relocalisé dans des foyers nucléaires typiques de sites de réplication du virus et qu’en outre, UAF1 s’associe physiquement à l’origine de réplication du VPH. Nous avons aussi déterminé que l’inhibition du recrutement de UAF1 par la surexpression d’un peptide dérivé de E1 (N40) contenant le motif de liaison à UAF1 réduit la réplication de l’ADN viral. Cette observation soutient le modèle selon lequel UAF1 est relocalisé par E1 au réplisome pour promouvoir la réplication de l’ADN viral. UAF1 est une protéine à domaine WD40 n’encodant aucune activité enzymatique et présumée exploiter des interactions protéine-protéine pour accomplir sa fonction. Nous avons donc investigué les protéines associées à UAF1 dans des cellules du col utérin et avons détecté des interactions avec les enzymes de déubiquitination USP1, USP12 et USP46, ainsi qu’avec la phosphatase PHLPP1. Nous avons établi que E1 forme un complexe ternaire avec UAF1 et n’importe laquelle des USP associés : USP1, USP12 ou USP46. Ces USP sont relocalisés au noyau par E1 et s’associent à l’ADN viral. De plus, l’activité enzymatique des USP est essentielle à la réplication optimale du génome viral. Au contraire, PHLPP1 ne forme pas de complexe avec E1, puisque leurs interactions respectives avec UAF1 sont mutuellement exclusives. PHLPP1 contient un peptide de liaison à UAF1 homologue à celui de E1. Ce peptide dérivé de PHLPP1 (P1) interagit avec le complexe UAF1-USP et, similairement au peptide N40, antagonise l’interaction E1-UAF1. Incidemment, la surexpression du peptide P1 inhibe la réplication de l’ADN viral. La génération de protéines chimériques entre P1 et des variants de E1 (E1Δ) défectifs pour l’interaction avec UAF1 restaure la capacité de E1Δ à interagir avec UAF1 et USP46, ainsi qu’à relocaliser UAF1 dans les foyers nucléaires contenant E1 et E2. Ce recrutement artificiel de UAF1 et des USP promeut la réplication de l’ADN viral, un phénotype dépendant de l’activité déubiquitinase du complexe. Globalement, nos travaux suggèrent que la protéine E1 du VPH interagit avec UAF1 afin de recruter au réplisome un complexe de déubiquitination dont l’activité est importante pour la réplication de l’ADN viral.

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Le diabète est une maladie chronique dont la principale caractéristique est un niveau plasmatique élevé de glucose, qui est causé soit par un défaut dans la production d’insuline, l’action de l’insuline, ou les deux à la fois. Plusieurs études ont démontré que l’hyperglycémie chronique peut mener à la dysfonction et même la défaillance de plusieurs organes, dont le coeur, le système vasculaire, les yeux et les reins, se traduisant par des infarctus du myocarde, des accidents cérébro-vasculaires et des complications rétinales et rénales, respectivement. La néphropathie diabétique (DN) est la principale cause de déficience rénale et affecte près de 25-40% des patients diabétiques. La DN est invariablement associée à un risque élevé d’accident cérébrovasculaire et de dysfonction cardivasculaire. L’angiotensinogène (Agt) est l’unique précurseur de tous les types d’angiotensines. En plus du système rénine-angiotensine (RAS) sytémique, le rein possède son propre système intrarénal et exprime tous les composants du RAS. L’Agt est fortement exprimé dans les cellules du tubule proximal rénal (RPTC) et y est converti en angiotensine II (AngII), le peptide biologiquement actif du RAS. Les patients diabétiques présentent de hauts niveaux d’AngII et une augmentation de l’expression des gènes du RAS, suggérant que l’activation du RAS intrarénal joue un rôle important dans la progression de la DN. Les mécanismes qui contrôlent la régulation du niveau rénal d’Agt par l’hyperglycémie et l’insuline demeurent mal compris. Le but global de cette thèse est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent l’expression du gène Agt chez la souris Akita (un modèle murin de diabète de type 1). Dans cette optique, la première partie de la thèse se concentre sur deux facteurs de transcription de la famille des ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNP). Chan et collaborateurs ont déjà identifié 2 protéines nucléaires hnRNP F et hnRNP K, de 48kD et 70kD respectivement. HnRNP F et hnRNP K forment un hétérodimère et se lient à l’élément de réponse à l’insuline (IRE) présent dans le promoteur du gène Agt du rat et inhibent la transcription du gène Agt in vitro. Afin de déterminer si hnRNP F / K sont responsables de l’inhibition de l’expression rénale de Agt par l’insuline in vivo, nous avons étudié des souris Akita males traités ou non avec des implants d’insuline pour une période de 4 semaines. Des souris non-Akita males ont été employées comme contrôles. Les souris Akita développent de l’hypertension et de l’hypertrophie rénale. Le traitement à l’insuline rétablit les niveaux de glucose plasmatiques et la pression systolique (SBP), et atténue l’hypertrophie rénale, l’albuminurie (ratio albumine/créatinine urinaire, ACR) et les niveaux urinaires d’Agt et AngII chez les souris Akita. De plus, le traitement à l’insuline inhibe l’expression rénale du gène Agt, tout en augmentant l’expression des gènes hnRNP F, hnRNP K et ACE2 (enzyme de conversion de l’angiotensine-2). Dans des RPTC in vitro, l’insuline inhibe Agt, mais stimule l’expression de hnRNP F et hnRNP K en présence de hautes concentrations de glucose, et ce via la voie de signalisation MAPK p44/42 (protéine kinase activée par un mitogène). La transfection avec des petits ARN interférents (siRNA) contre hnRNP F et hnRNP K prévient l’inhibition de l’expression d’Agt par l’insuline dans les RPTC. Cette étude démontre bien que l’insuline prévient l’hypertension et atténue les dommages rénaux observés chez les souris Akita diabétiques, en partie grâce à la suppression de la transcription rénale de Agt, via une augmentation de l’expression de hnRNP F et hnRNP K. La seconde partie de cette thèse change de focus et se tourne vers le facteur Nrf2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2). Nrf2 est un facteur de transcription qui contrôle les gènes de la réponse antioxydante cellulaire en réponse au stress oxydant ou aux électrophiles. Le but de cette étude est d’examiner l’impact de la surexpression de la catalase (Cat) dans les RPTC sur l’expression du gène Agt via Nrf2 et sur le développement de l’hypertension et des dommages rénaux résultants chez les souris diabétiques Akita transgéniques (Tg). Nos études ont démontré que la surexpression de Cat dans les souris Akita Cat-Tg normalise la SBP, atténue les dommages rénaux et inhibe l’expression des gènes Nrf2 et Agt dans les RPTC. In vitro, le glucose élevé (HG) et l’oltipraz (un activateur de Nrf2) stimulent l’expression de Nrf2 et Agt, et cet effet peut être bloqué par la trigonelline (inhibiteur de Nrf2), des siRNA contre Nrf2, des antioxydants ou des inhibiteurs pharmacologiques NF-κB et MAPK p38. La suppression de sites de réponse à Nrf2 présents dans le promoteur du gène Agt du rat abolit la stimulation par l’oltipraz. Finalement, des souris males adultes non-transgéniques traitées avec l’oltipraz montrent une augmentation de l’expression de Nrf2 et Agt dans leurs RPTC et cette augmentation peut être normalisée par la trigonelline. Ces données permettent d’identifier un nouveau mécanisme d’action de Nrf2, par la stimulation du gène Agt intrarénal et l’activation du RAS, qui induisent l’hypertension et les dommages rénaux par le glucose élevé et les espèces réactives de l’oxygène chez les souris diabétiques. Nos conclusions permettent de démontrer que l’insuline induit l’expression de hnRNP F et hnRNP K, qui jouent ensuite un rôle protecteur en prévenant l’hypertension. La surexpression de la catalase dans les RPTC vient quant à elle atténuer l’activation de Nrf2 et ainsi réduit la SBP chez les souris Akita.

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Les kinines sont des peptides vasoactifs et des neuromédiateurs centraux impliqués dans un bon nombre de processus biologiques et inflammatoires. Elles agissent sur deux types de récepteurs (R) couplés aux protéines G, le RB2 constitutif et le RB1 qui est induit par le stress oxydatif et les cytokines pro-inflammatoires via le facteur de transcription nucléaire, le NF-kB. Le RB1 est un puissant activateur de la iNOS et il augmente son expression chez le rat insulino-résistant. Dans ce modèle de rats soumis à une diète riche en D-glucose, un traitement d’une semaine avec un antagoniste non peptidique du RB1, le SSR240612, renverse la plupart des complications diabétiques. Ces travaux nous mènent à émettre l’hypothèse que la iNOS contribue aux effets délétères du RB1 chez le rat insulino-résistant. Nous avons donc évalué les effets d’un traitement prolongé d’une semaine soit avec le 1400W (1 mg/kg x 2 fois/jour), un inhibiteur sélectif de la iNOS, ou avec le Mergetpa (1mg/kg x 2 fois/jour), un inhibiteur non sélectif de la carboxypeptidase M (CPM) qui supprime la formation d’agonistes du RB1. Ces deux traitements devraient reproduire les effets bénéfiques de l’antagoniste du RB1 (SSR240612). En effet, le 1400W et le Mergetpa corrigent l’hyperglycémie, la résistance à l’insuline (l’indice HOMA), l’allodynie au froid et l’expression de plusieurs marqueurs de l’inflammation (Cox-2, iNOS, RB1, IL-1, anion superoxyde). Ces résultats confirment la contribution de la iNOS dans les effets délétères du RB1 chez le rat insulino-résistant. Dans un autre volet, ce mémoire vise à mieux comprendre l’impact de l’inhibition du RB1 par le SSR240612 (10 μg/g/jour) combiné ou pas avec le Pioglitazone (1.6 mg/g/jour) (un anti-diabétique de la famille des thiazolidinediones, le TZD) dans un modèle de diabète de type 2 associé à l’obésité chez la souris C57BL/6J soumise à une diète riche vi en gras pendant vingt semaines. Un traitement pendant deux semaines avec le TZD corrige l’intolérance au glucose et réduit les taux plasmatiques d’insuline alors que le SSR n’a pas d’effet. Les traitements combinés du TZD avec le SSR corrigent davantage la perte de la sensibilité à l’insuline et réduisent les taux plasmatiques de leptine. Les résultats obtenus suggèrent que le SSR n’apporte pas l’effet bénéfique souhaité, dans ce modèle avancé de diabète de type 2, contrairement au modèle des rats insulino-résistants (pré-diabétiques).

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Les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) régulent une multitude de processus cellulaires, incluant la prolifération, la survie et la différenciation. Ces kinases représentent l’élément terminal de la voie ERK/MAPK, laquelle est activée dans près de 30% de tous les cancers humains et donc généralement perçue comme étant un effecteur critique de la progression tumorale. Cependant, une accumulation d’observations suggèrent que les kinases ERK pourraient également induire la suppression tumorale. Le but premier de cette thèse est de démontrer comment la signalisation par ERK peut contribuer à la suppression tumorale et de concilier les mécanismes impliqués avec son rôle dans la progression du cancer. Puisque nos travaux ont une incidence sur les bénéfices attendus de certaines thérapies actuellement en développement, le deuxième objectif de la thèse est de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre le cancer. Nous avons démontré qu’une hyperactivation des kinases ERK induit la sénescence cellulaire. Le mécanisme implique la dégradation sélective et dépendante du protéasome de nombreuses protéines, ce que nous avons nommé le SAPD (Senescence-Associated Protein Degradation). Ce processus cible des protéines requises pour différentes fonctions cellulaires, incluant la progression du cycle cellulaire, les fonctions mitochondriales et la biogenèse des ribosomes. Ensuite, nos résultats montrent qu’en plus d’inhiber l’établissement de la sénescence, une diminution de la signalisation par les kinases ERK favorise la reprogrammation cellulaire, laquelle permet aux cellules précancéreuses de développer leur tumorigénicité et aux cellules cancéreuses d’acquérir des propriétés attribuables aux cellules souches. Ces observations suggèrent que les mécanismes qui inhibent la voie ERK/MAPK pourraient favoriser l’initiation du cancer, la formation de métastases et la résistance à diverses thérapies. Enfin, nous avons démontré que la metformine, utilisée pour le traitement du diabète, inhibe le facteur de transcription NF-kB. Ce dernier joue un rôle central dans la reprogrammation cellulaire et dans la production de cytokines pro-inflammatoires nocives par les cellules sénescentes. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que la metformine pourrait être utilisée en combinaison avec certaines thérapies afin d’éviter les effets secondaires tant d’une inhibition des kinases ERK que d’une hyperactivation. Globalement, les résultats présentés démontrent que l’effet de la voie ERK/MAPK dépend de la force de son activation. Alors qu’une activation modérée peut contribuer à la prolifération de la plupart des cellules, une forte activation induit la sénescence tandis qu’au contraire, une faible activation favorise la reprogrammation des cellules cancéreuses et donc une augmentation de l’agressivité de la tumeur. Cette polyvalence de la voie suggère une certaine prudence face à l’usage des inhibiteurs de la voie ERK/MAPK. Cependant, elle nous motive à travailler au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, lesquelles pourraient inclure la metformine.

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Le fer est un oligo-élément nécessaire pour le fonctionnement normal de toutes les cellules de l'organisme et joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions biologiques. Cependant, le niveau de fer dans le corps doit être bien réglé, sinon la carence en fer entraine des divers états pathologiques tels que l'anémie et la diminution de l’immunité. D'autre part, une surcharge en fer potentialise la multiplication des germes, aggrave l’infection et la formation de radicaux libres ayant des effets toxiques sur les cellules et leurs composants, ce qui favorise les maladies cardio-vasculaires, l'inflammation et le cancer. L'hepcidine (HAMP), un régulateur négatif de l'absorption du fer, induit la dégradation de la ferroportine (FPN), le seul exportateur connu de fer ce qui réduit sa libération par les macrophages et inhibe son absorption gastro-intestinale. HAMP est synthétisé principalement par les hépatocytes, mais aussi par les macrophages. Cependant, il y a très peu de données sur la façon dont HAMP est régulé au niveau des macrophages. Plus récemment, nous avons constaté que l’induction de l’hepcidin dans le foie par le polysaccharide (LPS) est dépendante de la voie de signalisation médiée par « Toll-like receptor 4 » (TLR4). Grâce au TLR4, le LPS induit l'activation des macrophages qui sécrètent de nombreuses différentes cytokines inflammatoires, y compris Interleukine 6 (IL-6), responsable de l'expression de HAMP hépatique. Dans le premier chapitre de la présente étude, nous avons étudié la régulation de HAMP dans la lignée cellulaire macrophagique RAW264.7 et dans les macrophages péritonéaux murins stimulés par différents ligands des TLRs. Nous avons constaté que TLR2 et TLR4 par l'intermédiaire de la protéine adaptatrice « myeloid differentiation primary response gene 88 » (MyD88) activent l'expression de HAMP dans les cellules RAW264.7 et les macrophages péritonéaux sauvages murins, tandis que cette expression a été supprimée dans les macrophages isolés des souris TLR2-/-, TLR4-déficiente ou MyD88-/-. En outre, nous avons constaté que la production d'IL-6 par les cellules RAW264.7 stimulées avec du LPS a été renforcée par l’ajout des quantités élevées de fer dans le milieu de culture. Au cours de l’inflammation, le niveau de HAMP est fortement augmenté. Ainsi, lorsque l'inflammation persiste, l’expression de HAMP continue à être activée par des cytokines pro-inflammatoires conduisant à une hyposidérémie. Malgré que cette dernière soit considérée comme une défense de l'hôte pour priver les micro-organismes de fer, celle ci cause un développement d'anémies nommées anémies des maladies chroniques. Ainsi, dans le deuxième chapitre de la présente étude, nous avons étudié l'implication des TLRs et leurs protéines adaptatrices MyD88 et TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF) dans le développement des hyposidérémies. En utilisant des souris déficientes en MyD88 et TRIF, nous avons montré que les voies de signalisations MyD88 et TRIF sont essentielles pour l’induction de HAMP par le LPS. Malgré l'absence de HAMP, les souris déficientes ont été capables de développer une hyposidérémie, mais la réponse des souris déficientes en MyD88 a été très légère, ce qui indique l'exigence de cette protéine pour assurer une réponse maximale au LPS. En outre, nous avons constaté que la signalisation MyD88 est nécessaire pour le stockage du fer au niveau de la rate, ainsi que l'induction de lipocaline 2 (LCN2), qui est une protéine impliquée dans la fixation du fer pour limiter la croissance bactérienne. Indépendamment de MyD88 ou TRIF, l'activation de TLR4 et TLR3 a conduit, au niveau de la rate, à une diminution rapide de l’expression de FPN et du « Human hemochromatosis protein » (HFE) qui est une protéine qui limite la séquestration du fer cellulaire à partir de la circulation. Cependant, malgré cette baisse d’expression, le manque de la signalisation MyD88 a altéré de manière significative la réponse hyposidérémique. En établissant le rôle des TLRs et de la protéine adaptatrice MyD88 dans la diminution du taux du fer sérique au cours de la réponse inflammatoire, nous avons remarqué qu’en réponse au surcharge en fer les souris déficientes en MyD88 accumulent de manière significative plus de fer hépatique par rapport aux souris sauvages, et cela indépendamment des TLRs. Ainsi, dans le troisième chapitre de la présente étude, nous avons étudié le phénotype observé chez les souris déficientes en MyD88. Nous avons trouvé que l'expression de HAMP chez ces souris a été plus faible que celle des souris de type sauvage. Pour cela, nous avons exploré la signalisation à travers la voie du « Bone Morphogenetic Proteins 6 » (BMP6) qui est considérée comme étant la voie fondamentale de la régulation de HAMP en réponse aux concentrations du fer intracellulaires et extracellulaires et nous avons trouvé que l'expression protéique de Smad4, un régulateur positif de l'expression de HAMP, est significativement plus faible chez les souris MyD88-/- par rapport aux souris sauvages. En outre, on a montré que MyD88 interagit avec « mothers against decapentaplegic, Drosophila, homolog 4 » (Smad4) et que cette interaction est essentielle pour l’induction de HAMP à travers la voie BMP6. En conclusion, notre étude montre que l'expression de HAMP dans les macrophages est régulée principalement par TLR2 et TLR4 à travers la voie MyD88 et que l'accumulation du fer dans les macrophages peut affecter les niveaux des cytokines pro-inflammatoires. En outre, nos analyses démontrent que le développement d’hyposidérémie en réponse au LPS se produit par l'intermédiaire d’un mécanisme dépendant de MyD88 qui est dissociée de la production de cytokines et de HAMP. En plus, nos recherches montrent que MyD88 est nécessaire pour l'expression de Smad4 et cela pour garantir une réponse optimale à travers la signalisation BMP6, conduisant ainsi à une expression adéquate de HAMP. Enfin, la protéine MyD88 joue un rôle crucial dans, la régulation de HAMP au niveau des macrophages, la diminution du taux du fer sérique en réponse au LPS et le maintien de l'homéostasie du fer.

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Thèse effectuée en cotutelle (Université de Poitiers, France)

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Il existe plusieurs défis au développement d’une thérapie visant à stimuler l’immunité cellulaire. Dans la prévention contre certains virus et en immunothérapie du cancer, l’induction de lymphocytes T spécifiques est cependant primordiale. Dans la première partie de l’étude, nous avons porté notre attention sur la compréhension de la présentation croisée par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I) médiée par des particules pseudo-virales (VLP) composées de la protéine de surface de potexvirus à laquelle nous avons ajouté un épitope de la protéine M1 du virus de l’influenza ou un épitope de la protéine gp100 du mélanome. Cette VLP se caractérise par sa capacité à stimuler, sans l’aide d’adjuvant, le système immunitaire et de présenter de façon croisée l’épitope inséré dans sa protéine de surface et ce, indépendamment de l’activité du protéasome. Nous avons, tout d’abord, comparé les propriétés de présentation antigénique croisée des VLP formées du virus de la mosaïque de la malva (MaMV) à celles des VLP du virus de la mosaïque de la papaye (PapMV). Les résultats confirment que ces propriétés sont partagées par plusieurs membres de la famille des potexvirus malgré des divergences de séquences (Hanafi et al. Vaccine 2010). De plus, nous avons procédé à des expériences pour préciser le mécanisme menant à la présentation de l’épitope inséré dans les VLP de PapMV. Les résultats nous confirment une voie vacuolaire dépendante de l’activité de la cathepsine S et de l’acidification des lysosomes pour l’apprêtement antigénique. L’induction de l’autophagie par les VLP semble également nécessaire à la présentation croisée par les VLP de PapMV. Nous avons donc établi un nouveau mécanisme de présentation croisée vacuolaire dépendant de l’autophagie (Hanafi et al. soumis Autophagy). En second lieu, en immunothérapie du cancer, il est aussi important de contrôler les mécanismes d’évasion immunitaire mis en branle par la tumeur. Nous avons spécifiquement étudié l’enzyme immunosuppressive indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) (revue de la littérature dans les tumeurs humaines; Hanafi et al. Clin. Can. Res 2011) et son inhibition dans les cellules tumorales. Pour ce faire, nous avons tenté d’inhiber son expression par la fludarabine, agent chimiothérapeutique précédemment étudié pour son activité inhibitrice de l’activation de STAT1 (signal transducers and activators of transcription 1). Étonnamment, nos résultats ont montré l’inhibition d’IDO dans les cellules tumorales par la fludarabine, indépendamment de l’inhibition de la phosphorylation de STAT1. Nous avons démontré que le mécanisme d’action dépendait plutôt de l’induction de la dégradation d’IDO par le protéasome (Hanafi et al. PlosOne 2014). Les travaux présentés dans cette thèse ont donc portés autant sur la compréhension d’une nouvelle plateforme de vaccination pouvant médier l’activation de lymphocytes T CD8+ cytotoxiques et sur le contrôle d’une immunosuppression établie par les cellules tumorales pour évader au système immunitaire. Ces deux grandes stratégies sont à considérer en immunothérapie du cancer et la combinaison avec d’autres thérapies déjà existantes pourra permettre une meilleure réponse clinique.

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L’évaluation de l’exposition aux composés organiques volatils (COV) recourt couramment à l’analyse des métabolites urinaires en assumant qu’aucune interaction ne survient entre les composés. Or, des études antérieures ont démontré qu’une inhibition de type compétitive survient entre le toluène (TOL), l’éthylbenzène (EBZ) et le m-xylène (XYL). Le chloroforme, qui est également un solvant métabolisé par le CYP2E1, se retrouve souvent en présence des autres COV dans les échantillons de biosurveillance. La présente étude visait donc à évaluer si le chloroforme (CHL) peut lui aussi interagir avec ces COV et évaluer ces interactions au niveau de l’excrétion des biomarqueurs urinaires associés, soit l’o-crésol, l’acide mandélique et l’acide m-méthylhippurique pour TOL, EBZ et XYL respectivement. Afin d’obtenir des données humaines, cinq volontaires ont été exposés par inhalation à différentes combinaisons de COV (seuls et mélanges binaires ou quaternaires) où la concentration de chacun des composés était égale à 1/4 ou 1/8 de la valeur limite d’exposition (VLE) pour une durée de 6h. Des échantillons d’air exhalé, de sang et d’urine ont été récoltés. Ces données ont ensuite été comparées aux modèles pharmacocinétiques à base physiologique (PCBP) existants afin de les ajuster pour l’excrétion urinaire. Certaines différences ont été observées entre les expositions aux solvants seuls et les coexpositions, mais celles-ci semblent majoritairement attribuables aux remplacements de participants à travers les différentes expositions. Les valeurs de Vmax pour EBZ et CHL ont été optimisées afin de mieux prédire les niveaux sanguins de ces COV. À l’exception du modèle pour EBZ, tous les paramètres pour l’excrétion urinaire ont été obtenus à partir de la littérature. Les modèles adaptés dans cette étude ont permis de simuler adéquatement les données expérimentales.