999 resultados para Estudio de Asociación del Genoma Completo


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Human Papillomavirus (HPV) is the cause of cervical cancers (among these, adenocarcinoma, AdCa) and is associated to a subgroup of oropharyngeal carcinomas (OPSCCs). Even if the risk for cancer development is linked to the infection by some viral genotypes, mainly HPV16 and 18, viral DNA alone seems not to be sufficient for diagnosis. Moreover, the role of the virus in OPSCCs has not been totally clarified yet. In the first part of the thesis, the performances concerning viral genotyping in clinical cervical samples of a new pyrosequencing-based test and a well-known hybridization-based assay have been compared. Similar results between the methods have been obtained. However, the former showed advantages in detecting intratype variants, higher specificity and a broader spectrum of detectable HPV types. The second part deals with the evaluation of virological markers (genotyping, viral oncoproteins expression, viral load, physical state and CpG methylation of HPV16 genome) in the diagnosis/prognosis of cervical AdCa and HPV-associated OPSCCs. HPV16 has been confirmed the most prevalent genotype in both the populations. Interestingly, the mean methylation frequency of viral DNA at the early promoter showed the tendency to be associated to invasion for cervical AdCa and to a worse prognosis for OPSCCs, suggesting a promising role as diagnostic/prognostic biomarker. The experiments of the third part were performed at the DKFZ in Heidelberg (Germany) and dealt with the analysis of the response to IFN-k transfection in HPV16-positive cervical cancer and head&neck carcinoma cell lines to evaluate its potential role as new treatment. After 24h, we observed increased IFN-b expression which lead to the up-regulation of genes involved in the antigens presentation pathway (MHC class I and immunoproteasome) and antiviral response as well, in particular in cervical cancer cell lines. This fact suggested also the presence of different HPV-mediated carcinogenic pathways between the two anatomical districts.

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Il Parvovirus B19, virus patogeno umano della famiglia Parvoviridae, mostra uno specifico tropismo per i precursori eritroidi e una limitata replicazione in alcune linee cellulari megacarioblastoidi. Allo scopo di sviluppare sistemi utili allo studio delle caratteristiche biologiche del virus, diversi laboratori si sono occupati della costruzione di cloni genomici di B19 dotati di competenza funzionale e capaci di generare virus infettante. Parte del presente lavoro ha riguardato l’analisi funzionale di diversi cloni genomici di B19 e ha permesso di caratterizzare le regioni terminali del virus e di identificare requisiti essenziali per la loro funzionalità. Nel contesto intracellulare, esistono differenti livelli di restrizione in relazione alla capacità della cellula di supportare la replicazione virale, non ancora del tutto caratterizzati. Inoltre si sono accumulate evidenze circa la capacità del B19 di instaurare persistenza in numerosi tessuti. Non sono ancora note le caratteristiche funzionali del genoma virale in questo stato, è possibile che il virus persista in forma silente e meccanismi epigenetici possano regolare tale silenziamento. In questo studio è stato analizzato lo stato di metilazione del genoma di B19 e il suo possibile effetto sul ciclo replicativo virale ed è stata investigata la possibile associazione del DNA virale agli istoni cellulari nel corso di infezione in vitro. I risultati ottenuti confermano la presenza di questi meccanismi epigenetici, potendo ipotizzare che giochino un importante ruolo nella regolazione della funzionalità virale e nell’interazione B19-cellula e siano un elemento critico per l’adattamento del virus nell’ambiente in cui si trova. Inoltre l’ipotesi che anche i microRNA possano assumere un importante significato nell’interazione B19-cellula è stata proposta da diversi lavori e nel presente studio è stata valutata la produzione di queste piccole molecole durante l'infezione in vitro, ricercando microRNA (cellulari e/o virali) con omologia di sequenza per il genoma di B19 e quindi specifici per il virus.

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Enterobacteriaceae genomes evolve through mutations, rearrangements and horizontal gene transfer (HGT). The latter evolutionary pathway works through the acquisition DNA (GEI) modules of foreign origin that enhances fitness of the host to a given environment. The genome of E. coli IHE3034, a strain isolated from a case of neonatal meningitis, has recently been sequenced and its subsequent sequence analysis has predicted 18 possible GEIs, of which: 8 have not been previously described, 5 fully meet the pathogenic island definition and at least 10 that seem to be of prophagic origin. In order to study the GEI distribution of our reference strain, we screened for the presence 18 GEIs a panel of 132 strains, representative of E. coli diversity. Also, using an inverse nested PCR approach we identified 9 GEI that can form an extrachromosomal circular intermediate (CI) and their respective attachment sites (att). Further, we set up a qPCR approach that allowed us to determine the excision rates of 5 genomic islands in different growth conditions. Four islands, specific for strains appertaining to the sequence type complex 95 (STC95), have been deleted in order to assess their function in a Dictyostelium discoideum grazing assays. Overall, the distribution data presented here indicate that 16 IHE3034 GEIs are more associated to the STC95 strains. Also the functional and genetic characterization has uncovered that GEI 13, 17 and 19 are involved in the resistance to phagocitation by Dictyostelium d thus suggesting a possible role in the adaptation of the pathogen during certain stages of infection.

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Although bacteria represent the simplest form of life on Earth, they have a great impact on all living beings. For example the degrader bacterium Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 is used in bioremediation procedures for the recovery of polluted sites. Indeed, KF707 strain is know for its ability to degrade biphenyl and polychlorinated biphenyls - to which is chemotactically attracted - and to tolerate the oxydative stress due to toxic metal oxyanions such as tellurite and selenite. Moreover, in bioremediation processes, target compounds can be easily accessible to KF707 through biofilm formation. All these considerations suggest that KF707 is such a unique microorganism and this Thesis work has been focused on determining the molecular nature of some of the peculiar physiological traits of this strain. The genome project provided a large set of informations: putative genes involved in the degradation of aromatic and toxic compounds and associated to stress response were identified. Notably, multiple chemotactic operons and cheA genes were also found. Deleted mutants in the cheA genes were constructed and their role in motility, chemotaxis and biofilm formation were assessed and compared to those previously attributed to a cheA1 gene in a KF707 mutant constructed by a mini-Tn5 transposon insertion and which was impaired in motility and biofilm development. The results of this present Thesis work, taken together, were interpreted to suggest that in Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 strain, multiple factors are involved in these networks and they might play different roles depending on the environmental conditions. The ability of KF707 strain to produce signal molecules possibly involved in cell-to-cell communication, was also investigated: lack of a lux-like QS system - which is conversely widely present in Gram negative bacteria – keeps open the question about the actual molecular nature of KF707 quorum sensing mechanism.

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L’agricoltura si trova ad affrontare una diminuzione della disponibilità d’acqua ed una crescente domanda della produzione di cereali per scopi alimentari. Sono perciò necessarie strategie di coltivazione innovative per migliorare la produttività e nuovi genotipi migliorati nell'efficienza dell’uso delle risorse in condizioni di siccità. Questi rappresentano gli obietti principali del progetto “DROPS” (Drought tolerant yielding Plants) all’interno del quale ha avuto luogo il mio progetto di Dottorato. La mia attività di ricerca è stata svolta come segue: 1. Caratterizzazione molecolare di un panel di188 accessioni di frumento duro con marcatori SSR e DaRT; 2. Esperimenti in serra su 100 accessioni del panel per valutare la Water-Use Efficiency (WUE) in sei repliche secondo un Alpha Lattice design; 3. Prove sul campo, effettuate secondo un Alpha Lattice design, in due stagioni di crescita: a. 2010/11, valutazione di 100 accessioni presso l’Azienda sperimentale dell'Università di Cadriano (BO); b. 2011/12, valutazione del panel completo in 3 ambienti, con due diversi regimi irrigui In entrambi gli anni, abbiamo valutato caratteri agronomici correlati con il ciclo di sviluppo, la resa di granella e sue componenti, nonché diversi fattori ambientali e del suolo. Per quanto riguarda WUE, abbiamo trovato differenze altamente significative tra accessioni; inoltre, cinque accessioni hanno mostrato elevati valori di WUE e cinque accessioni valori molto bassi di WUE in tutte e sei le repliche. Gli esperimenti di campo nelle stagioni 2011 e 2012 hanno evidenziato differenze altamente significative tra le accessioni del panel per la maggior parte dei caratteri analizzati, confermando inoltre che il panel di fiorisce entro una settimana. L'esperimento del secondo anno ci ha permesso osservare un significativa interazione Genotipo X Ambiente. Questi risultati saranno integrati con ulteriori analisi QTL, per identificare regioni cromosomiche coinvolte nel controllo genetico dei caratteri di interesse e verificare la stabilità dei QTL in diversi ambienti.

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L'epatite E è una malattia umana con caratteristiche di epatite acuta, causata da un ssRNA virus (HEV). Nel 1997, HEV è stato identificato per la prima volta nei suini (SwHEV). In seguito, diverse evidenze, tra cui la vicinanza genetica tra ceppi umani e suini, suggerirono la trasmissione zoonotica del virus. Nella presente tesi, l’identificazione di SwHEV è stata condotta mediante ricerca di porzioni di genoma virale attraverso RT-PCR. Dal 2011 al 2013, sono stati analizzati 343 campioni fecali (da 19 allevamenti) e 70 bili (da 2 macelli) prelevati da altrettanti suini, in diverse Regioni italiane. E’ stato inoltre condotto uno studio retrospettivo su 78 feci (da 3 allevamenti) raccolte nel 2000. Il virus è stato identificato nel 24,5% e 19,2% delle feci raccolte rispettivamente nel 2011-2013 e nel 2000. Nessuna bile è risultata positiva. Mediante sequenziamento del genoma intero di uno dei virus identificati, è stata condotta l’analisi filogenetica per valutarne il grado di correlazione con alti ceppi suini e umani. La presenza di HEV è stata valutata lungo la filiera di produzione suina, dal macello al punto vendita. Trentaquattro campioni di feci, fegato e muscolo sono stati raccolti in un macello da altrettanti suini sani (età:6-7 mesi). Quattordici feci e 2 fegati, sono risultati positivi per HEV. Sono state prelevate 129 salsicce sia allo stabilimento di trasformazione sia alla vendita, ma nessuna è risultata positiva. La presenza di HEV è stata valutata anche nelle salsicce di fegato, fresche e secche, acquistate presso una macelleria. Il genoma virale è stato rilevato nel 22,2% delle salsicce fresche e nel 4,3 % di quelle secche ma la vitalità del virus non è stata dimostrata. In conclusione, lo studio condotto ha confermato l’ampia circolazione di HEV nei suini e la possibile contaminazione dei prodotti carnei derivati, confermando la necessità di una continua sorveglianza.

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Nella seguente tesi sono stati affrontati differenti protocolli di purificazione di componenti della DNA polimerasi III di Escherichia coli, previamente sovraespressi nel microrganismo. A distanza di oltre 20 anni dall’identificazione della DNA polimerasi III quale enzima responsabile della replicazione del genoma di E. coli, sono stati fatti progressi riguardo la sua conoscenza. Tuttavia molti sono gli aspetti rimasti incogniti riguardo al meccanismo d’azione dell’enzima, così come il ruolo svolto dalle sue subunità e parte della loro struttura. Al fine di migliorare la comprensione di questo enzima, è necessario insistere sulla diffrattometria di raggi X, per la quale è indispensabile l’isolamento di cristalli delle proteine. Si intuisce la necessità di sviluppare metodi appropriati che consentano di ottenere una resa il più possibile elevata dei suoi componenti. Una metodica generale per la sovraespressione del core catalitico e della singola subunità α, deputata all’attività polimerasica a carico di entrambi i filamenti di DNA, era già stata perfezionata presso il laboratorio ospitante. Con il presente lavoro sono stati sperimentati alcuni procedimenti, volti ad aumentare la resa di purificazione, adottando differenti soluzioni. In primo luogo, si è cercato di recuperare le proteine contenute nel flow through eluito da una colonna cromatografica Q-Sepharose, alla quale non erano riuscite a legarsi durante il primo stadio di purificazione. Inoltre, sono stati sperimentati metodi alternativi di lisi cellulare di estrazione delle proteine. In sintesi, il contenuto della tesi potrebbe agevolare la valutazione di diverse strategie per incrementare la resa di purificazione della subunità α e del core polimerasico della DNA Polimerasi III di E. coli.

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Creazione di un modello semplificato per l’analisi modale FEM di un carter motociclistico. La scelta degli elementi da considerare nel modello è stata fatta in funzione della loro importanza in termini di variazione di massa del basamento completo, elemento fondamentale che ha influenzato anche la scelta delle semplificazioni da apportare ai vari elementi.

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La Valvola Aortica Bicuspide (BAV) rappresenta la più comune anomalia cardiaca congenita, con un’incidenza dello 0,5%-2% nella popolazione generale. Si caratterizza per la presenza di due cuspidi valvolari anziché tre e comprende diverse forme. La BAV è frequentemente associata agli aneurismi dell’aorta toracica (TAA). La dilatazione dell’aorta espone al rischio di sviluppare le complicanze aortiche acute. Materiali e metodi Sono stati reclutati 20 probandi consecutivi sottoposti a chirurgia della valvola aortica e dell'aorta ascendente presso l'Unità di Chirurgia Cardiaca di Policlinico S.Orsola-Malpighi di TAA associata a BAV. Sono stati esclusi individui con una condizione sindromica predisponente l’aneurisma aortico. Ciascun familiare maggiorenne di primo grado è stato arruolato nello studio. L’analisi di mutazioni dell’intero gene ACTA2 è stata eseguita con la tecnica del “bidirectional direct sequencing”. Nelle forme familiari, l’intera porzione codificante del genoma è stata eseguita usando l’exome sequencing. Risultati Dopo il sequenziamento di tutti i 20 esoni e giunzioni di splicing di ACTA2 nei 20 probandi, non è stata individuata alcuna mutazione. Settantasette familiari di primo grado sono stati arruolati. Sono state identificate cinque forme familiari. In una famiglia è stata trovata una mutazione del gene MYH11 non ritenuta patogenetica. Conclusioni La mancanza di mutazioni, sia nelle forme sporadiche sia in quelle familiari, ci suggerisce che questo gene non è coinvolto nello sviluppo della BAV e TAA e, l’associazione che è stata riportata deve essere considerata occasionale. L’architettura genetica della BAV verosimilmente dovrebbe consistere in svariate differenti varianti genetiche che interagiscono in maniera additiva nel determinare un aumento del rischio.

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Questa tesi si inserisce nell'ambito delle analisi statistiche e dei metodi stocastici applicati all'analisi delle sequenze di DNA. Nello specifico il nostro lavoro è incentrato sullo studio del dinucleotide CG (CpG) all'interno del genoma umano, che si trova raggruppato in zone specifiche denominate CpG islands. Queste sono legate alla metilazione del DNA, un processo che riveste un ruolo fondamentale nella regolazione genica. La prima parte dello studio è dedicata a una caratterizzazione globale del contenuto e della distribuzione dei 16 diversi dinucleotidi all'interno del genoma umano: in particolare viene studiata la distribuzione delle distanze tra occorrenze successive dello stesso dinucleotide lungo la sequenza. I risultati vengono confrontati con diversi modelli nulli: sequenze random generate con catene di Markov di ordine zero (basate sulle frequenze relative dei nucleotidi) e uno (basate sulle probabilità di transizione tra diversi nucleotidi) e la distribuzione geometrica per le distanze. Da questa analisi le proprietà caratteristiche del dinucleotide CpG emergono chiaramente, sia dal confronto con gli altri dinucleotidi che con i modelli random. A seguito di questa prima parte abbiamo scelto di concentrare le successive analisi in zone di interesse biologico, studiando l’abbondanza e la distribuzione di CpG al loro interno (CpG islands, promotori e Lamina Associated Domains). Nei primi due casi si osserva un forte arricchimento nel contenuto di CpG, e la distribuzione delle distanze è spostata verso valori inferiori, indicando che questo dinucleotide è clusterizzato. All’interno delle LADs si trovano mediamente meno CpG e questi presentano distanze maggiori. Infine abbiamo adottato una rappresentazione a random walk del DNA, costruita in base al posizionamento dei dinucleotidi: il walk ottenuto presenta caratteristiche drasticamente diverse all’interno e all’esterno di zone annotate come CpG island. Riteniamo pertanto che metodi basati su questo approccio potrebbero essere sfruttati per migliorare l’individuazione di queste aree di interesse nel genoma umano e di altri organismi.

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Il passo preliminare del presente elaborato è quello di mettere a punto un metodica solida e riproducibile per la sovraespressione della subunità α di D. radiodurans per via eterologa. L’ospite ideale per realizzare la sovraespressione è E. coli, microorganismo ampiamente discusso e impiegato per via della sua semplice manipolazione. Per realizzare la sovraespressione il ceppo di E. coli prescelto è stato trasformato con il plasmide pBAD-dnaE e la proteina in esame è stata ottenuta come corpi di inclusione (biologicamente inattiva). Successivamente alla fase di rinaturazione e alla purificazione tramite cromatografia liquida dell’enzima è stato possibile ottenere quantità sufficienti di proteina pura e biologicamente attiva con la quale condurre saggi spettrofotometrici di attività enzimatica per valutare il comportamento dell’enzima in vitro simulando le condizioni di substrato attese in vivo. È proprio in quest’ultimo frangente che si condensa lo scopo di questo lavoro. La conduzione dei saggi di attività enzimatica in condizioni ricombinative e non ricombinative (quindi in presenza o meno di RecAEc nell’ambiente di reazione) ci ha consentito di comprendere meglio il comportamento della pol III-α durante la fase di strand invasion mediata dalla ricombinasi e la successiva sintesi del neofilamento, contribuendo a chiarire alcuni aspetti dei meccanismi che intervengono lungo la via di riparazione del genoma danneggiato in D. radiodurans ancora poco discussi. Inoltre l’elaborazione di un sistema di espressione per la singola subunità α getterebbe le basi per sviluppare un sistema di co-espressione più complesso ove siano coinvolte anche altre subunità dell’oloenzima (τ-δ-δ’), in modo da poter verificare la tipologia di subassemblaggio che spontaneamente avverrebbe in vivo e gli stimoli relativi tra le diverse subunità che ne migliorerebbero l’efficienza.

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Individuare e conoscere la natura degli inquinanti atmosferici e disporre dei dati delle emissioni sono azioni fondamentali per formulare politiche ambientali incentrate sul miglioramento della qualità dell'aria e monitorarne l'efficacia. Sorge l'esigenza di un controllo costante della qualità dell'aria, processo che avviene utilizzando delle centraline di monitoraggio fisse sparse nelle vie delle maggiori città o nei pressi dei principali insediamenti industriali. Lo scopo di questo progetto è quello di realizzare una stazione di monitoraggio mobile al fine di aumentare la superficie di controllo, realizzando un oggetto dinamico capace di acquisire dati sull'inquinamento. Questo è stato fatto applicando ad un drone un sistema di sensori capaci di rilevare le variazioni dei livelli di concentrazione degli agenti inquinanti. Ciò permette di eliminare le stazioni di monitoraggio fisse, le quali rappresentano una spesa ingente. Inoltre, attraverso l'utilizzo di un drone, è possibile monitorare siti più vasti, permettendo un monitoraggio costante e ripetuto nel tempo. La prima parte dell'elaborato analizza il sistema Embedded utilizzato per l'acquisizione dei dati, concentrando l'attenzione prevalentemente sui moduli utilizzati. La seconda descrive quali sono i primi passi per cominciare ad utilizzare i sensori posti sulla Gases Board 2.0 e risponde ai dubbi più comuni su quali parametri di configurazione adottare per un avere una risposta adeguata, quale processo di calibrazione seguire o come trasformare i dati acquisiti, espressi in tensioni, in valori di concentrazione di gas. La terza parte illustra i test effettuati per verificare il corretto funzionamento del sistema completo, con l’esposizione delle problematiche individuate, e una presentazione delle alternative più valide per superarle.

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Negli ultimi anni la biologia ha fatto ricorso in misura sempre maggiore all’informatica per affrontare analisi complesse che prevedono l’utilizzo di grandi quantità di dati. Fra le scienze biologiche che prevedono l’elaborazione di una mole di dati notevole c’è la genomica, una branca della biologia molecolare che si occupa dello studio di struttura, contenuto, funzione ed evoluzione del genoma degli organismi viventi. I sistemi di data warehouse sono una tecnologia informatica che ben si adatta a supportare determinati tipi di analisi in ambito genomico perché consentono di effettuare analisi esplorative e dinamiche, analisi che si rivelano utili quando si vogliono ricavare informazioni di sintesi a partire da una grande quantità di dati e quando si vogliono esplorare prospettive e livelli di dettaglio diversi. Il lavoro di tesi si colloca all’interno di un progetto più ampio riguardante la progettazione di un data warehouse in ambito genomico. Le analisi effettuate hanno portato alla scoperta di dipendenze funzionali e di conseguenza alla definizione di una gerarchia nei dati. Attraverso l’inserimento di tale gerarchia in un modello multidimensionale relativo ai dati genomici sarà possibile ampliare il raggio delle analisi da poter eseguire sul data warehouse introducendo un contenuto informativo ulteriore riguardante le caratteristiche dei pazienti. I passi effettuati in questo lavoro di tesi sono stati prima di tutto il caricamento e filtraggio dei dati. Il fulcro del lavoro di tesi è stata l’implementazione di un algoritmo per la scoperta di dipendenze funzionali con lo scopo di ricavare dai dati una gerarchia. Nell’ultima fase del lavoro di tesi si è inserita la gerarchia ricavata all’interno di un modello multidimensionale preesistente. L’intero lavoro di tesi è stato svolto attraverso l’utilizzo di Apache Spark e Apache Hadoop.

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Las actuales políticas educativas, se inscriben dentro de la denominada “perspectiva de derechos.” Hoy se considera a la educación como un derecho básico y debe garantizarse que todos los niños, jóvenes y adultos que la requieran, accedan a ella. En relación con la cuestión de garantizar accesibilidad e igualdad de oportunidades para todos, se inscribe la denominada “educación inclusiva.” En este marco, las escuelas se comprometerían a dar cabida a todos los niños, independientemente de sus condiciones físicas, intelectuales, sociales, emocionales, lingüísticas o de otro tipo; pasando a funcionar como “escuelas inclusivas.” Como consecuencia de esto, algunos/as niños/as y jóvenes con discapacidad, (que cumplen con ciertos requisitos) inician procesos de inclusión en escuelas comunes, para desarrollar en ellas su escolaridad. La mayoría de las investigaciones referidas a estas experiencias, se centran en los discursos y perspectivas acerca de las mismas, de los docentes que participan en ellas: tanto los docentes de Educación Común, como los docentes de Educación Especial. Pero se desconocen investigaciones sobre la percepción y las concepciones, desde la perspectiva de los alumnos/as de las escuelas en las que se implementan proyectos de inclusión, siendo que son parte fundamental de estos procesos, en tanto conforman el grupo que recibirá a los sujetos que se desea incluir y serán su pares durante las actividades escolares. Creemos que estudiando las cuestiones vinculares y valorativas, que se ponen en juego durante los procesos de inclusión, se podrá intervenir en ellas de modo de facilitar el proceso de inclusión escolar de niños y jóvenes con discapacidad. El abordaje metodológico será cualitativo, mediante grupos focales y entrevistas. El presente estudio, es continuación del Proyecto 16H291 “Concepciones acerca de la discapacidad de los niños y jóvenes de las escuelas de Misiones" desarrollado entre 2009 y 2012, que nos permitió indagar sobre las concepciones en los niños. Ahora, pretendemos hacer lo propio con los adolescentes.

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Grapholita molesta es una importante plaga que afecta brotes y frutos del duraznero en Mendoza, Argentina. Algunos autores han citado que Carpocapsa pomonella requiere, en condiciones artificiales, una densidad poblacional de 100 adultos para alcanzar una alta fecundidad y que esta situación se puede extender a la especie en estudio. El objetivo del trabajo fue evaluar distintas densidades poblacionales de la especie mediante la fecundidad, viabilidad y longevidad. La especie se crió en una cámara con condiciones abióticas controladas. El diseño fue en bloques al azar para eliminar la influencia de la luz y el desarrollo generacional. Se realizaron cuatro repeticiones. Los resultados se procesaron mediante el programa Statistica. El análisis de los resultados entre bloques y tratamientos no tuvo diferencias significativas por lo que no hubo variación en la incidencia de la luz y el desarrollo generacional. La viabilidad tuvo diferencias significativas entre los tratamientos mientras que la fecundidad y la longevidad no las presentaron. La densidad poblacional influyó positivamente sobre la viabilidad cuando la cantidad de parejas fue la menor y disminuyó al incrementarse la proporción de las mismas. Es decir, el hacinamiento de los individuos afectó la viabilidad de Grapholita molesta pero no la fecundidad ni la longevidad.