MADS-box基因在单子叶植物花发育中的功能研究

第一部分 水稻E类MADS-box 基因在花发育中的功能分析 MADS-box 基因是一个大的转录因子家族，在花发育过程中起重要作用。根据对双子叶模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛遗传突变体的研究，提出了花发育的ABCDE模型。该模型认为：A、B、C、D、E代表了5类功能不同的花器官特征基因，单独或联合控制花器官的发育。A类基因控制萼片的发育;A、B和E类基因控制花瓣的发育;B、C和E类基因控制雄蕊的发育;C和E类基因控制心皮的发育;D类基因控制胚珠的发育;A和C类基因相互抑制。在这5类基因中，E类基因的功能较为复杂，它不仅是花器官特征基因，而且具有花分生组织决定性（Floral meristem determinency）。在单子叶植物中，E类基因的功能发生了很大的分化。水稻是单子叶植物的模式植物，水稻中至少有5个E类基因，分别是OsMADS1、OsMADS5、OsMADS7、OsMADS8和OsMADS34，在这5个E类基因中，除了对OsMADS1基因有较深入的研究外，对其它几个E类基因的功能了解甚少。我们在现有的研究基础上，根据对双子叶植物中E类基因的研究结果，以OsMADS8基因为出发点，利用组织原位杂交，RNAi技术对水稻中的E类基因进行了深入的研究。结果表明：OsMADS8/7基因早在花序枝梗分生组织原基就有转录，随着小穗的生长发育，逐渐集中在小穗分生组织原基，小花分生组织原基，浆片、雄蕊和心皮中表达;在胚珠形成时，内外珠被有很强的杂交信号，而且在幼胚和胚乳中也有表达。OsMADS5在幼花时期，四轮花器官均有表达，在小穗发育后期及受精后的表达方式与OsMADS8/7基因相同。OsMADS8基因被抑制后，转基因植株没有任何表型变化，说明很可能有其它E类基因弥补了OsMADS8基因的功能缺失;当同时抑制其它E类基因的表达时，转基因植株抽穗期明显延长，四轮花器官的发育均受到影响：稃片类似叶片状;浆片转变为稃片类的结构;雄蕊没有花粉;心皮具有了稃片的特点;没有胚珠结构的形成，同时失去了花分生组织决定性，在心皮的部位产生了新的花器官或花分生组织逆转为花序分生组织。说明水稻四轮花器官及胚珠的正常发育需要E类基因的参与，但其功能与双子叶植物如拟南芥，西红柿、矮牵牛等直系同源基因相比已经发生变化;水稻中的E类基因在维持花分生组织特征性方面起重要作用;另外对抽穗期有影响。 第二部分 玉米MADS-box基因ZAG2转录调控区的研究 基因的时空表达受基因中的顺式作用元件及其反式作用因子调控。顺式作用元件由位于基因编码区上游的启动子区域和位置不确定的增强子区域组成。顺式作用元件对基因表达的开启至关重要。MADS-box 基因编码一类控制花器官发育的转录因子，在花的发育过程中顺序表达。MADS-box 基因突变，花器官发生同源异型转换。研究MADS-box 基因的调控序列可以进一步揭示影响基因时空表达的内外因素。ZAG2是玉米MADS-box 基因中的D类基因，控制胚珠的发育，在胚珠和心皮的内表面特异表达。ZAG2基因有7个外显子和6个内含子。我们从玉米基因组分离到了ZAG2基因翻译起始点上游3040bp的序列，并利用5’-RACE方法鉴定出了转录起始点的位置。序列比较发现，在 5’-UTR内有一个1299bp的内含子，这个内含子可能对基因的表达有调控作用，因此构建了两个与GUS基因融合的表达载体：一个是pZAG2-1::GUS，包括翻译起始点以上所有的调控序列;另一个是pZAG2-2::GUS，去掉了5’-UTR中的内含子序列，转化水稻。结果这两个构建都没有使GUS基因在正确的位置表达。pZAG2-1::GUS构建在心皮基部类似花托的部位及稃片顶端着色，pZAG2-2::GUS构建在内外稃片沿稃脉的部位有很强的着色，说明翻译起始点上游的调控序列不足以使基因正常表达。两个构建着色方式不同，可能pZAG2-1::GUS构建在5’-UTR部分含有抑制ZAG2基因在稃片表达的顺式元件，或者启用了在5’-UTR中的转录起始点，因为在5’-UTR的内含子中也有一个很典型的TATA-box。我们推测，在ZAG2基因编码区的第一内含子可能存在另外一些使基因正常表达的增强元件，需要进一步的序列缺失实验加以验证。

小麦TaRanBP基因功能的初步分析

小G蛋白（small GTPases）是真核生物中广泛存在的一类调节各种生命活动的信号分子。根据结构与功能的不同，小G蛋白家族成员可分成五个亚家族，分别为Ras，Rab，Rho，Arf和Ran。五类小G蛋白通过其活化态（GTP结合态）和非活化态（GDP结合态）的相互转换行使着各种功能。Ras GTPases在酵母和哺乳动物中调节细胞增殖过程; Rho GTPases调控肌动蛋白重组过程，并参与MAP 激酶的细胞信号转导过程等; Rab GTPases和Arf GTPases分别在膜转运过程中起着不同的重要作用;而Ran GTPases则在核孔位置调节着蛋白和RNA分子的运输过程。 小G蛋白附属蛋白调节着小G蛋白活化态与非活化态之间的转换，其中鸟核苷酸交换因子(guanine nucleotide exchange factors, GEFs)可以催化小G蛋白转换为GTP结合形式，即活化态;而GTPase 激活蛋白(GTPase-activating proteins, GAPs)和小G蛋白结合蛋白(small GTPases binding proteins)可以激活小G蛋白自身的水解活性，从而将其转变成非活化态形式。 相比其它小G蛋白，Ran GTPases及其附属蛋白在真核生物中的研究相对较少。已有的成果表明它们主要在核质运输过程中及对相应的信号转导途径起调节作用。而针对Ran GTPases及其附属蛋白在真核生物尤其是高等植物个体发育过程中的作用，目前报道还很少。 为了揭示Ran结合蛋白(Ran binding protein, RanBP)在植物发育过程中的作用，本文通过转基因手段对其功能进行 了研究。在此之前，本实验室已从小麦cDNA文库中成功克隆Ran结合蛋白基因：TaRanBP。该基因cDNA全长1035 bp，编码207个氨基酸。通过农杆菌介导叶圆片法，分别用正义、反义及TaRanBP与GFP融合蛋白等表达载体转化烟草，并成功获得转基因植株。亚细胞定位观察发现TaRanBP蛋白主要定位于细胞质内，尤其是在核膜附近富集。生理学和细胞学等方面的研究分析发现，TaRanBP基因在烟草个体发育过程中产生重要作用。过量表达TaRanBP基因的转基因植株在一定数量上表现出愈合的花冠筒上出现不同程度开裂，花冠筒上有附生舌状花瓣，及带有花瓣状颜 色的花萼等异常花表型。同时，转反义基因在一定程度上促进了转基因植株初生主根的生长（为对照烟草的2.3倍），而转正义基因烟草与对照烟草的初生主根长度差异不明显。用碘化丙锭(Propidium Iodide, PI)进行根部细胞染色。观察发现，不同的转基因烟草与对照烟草之间在根的各个不同形态区域的细胞大小差异不明显，推测根长的差异可能是由于整体细胞数目变化的原因导致。向重力性实验发现，转反义基因烟草幼苗较对照烟草的向重力性反应增加，而转正义基因的则表现为降低。激素吲哚乙酸(Indoleacetic Acid, IAA)的添加处理可以恢复转反义基因烟草的向重力性异常表型，而对转正义基因烟草几乎无影响。添加激动素(Kinetin, KT)的处理发现不同转基因烟草和对照烟草的向重力性均有减弱。观测后期，转正义基因的向重力敏感性较对照烟草得到恢复。测量不同转基因株系T1代幼苗鲜重，发现不同转基因烟草和对照烟草的幼苗鲜重动态变化在各个时间点有差异，且差异情况不尽相同。而不同转基因幼苗T1代幼苗可溶性蛋白含量较对照烟草有不同程度的下降。这种下降并没有影响转基因烟草的整体生长进程，开花期和结实情况与对照烟草相比也无明显变化。

小麦Ta-JA1基因功能的初步分析

茉莉酸是植物信号传递以及诱导植物产生防御反应的关键诱导激素之一，广泛存在于高等植物中，并在植物病虫害防御的信号传导通路中起着重要的作用。茉莉酸可以诱导植物抗性基因表达，产生茉莉酸调节蛋白来抵御病虫害。在禾本科的大麦中发现了一个分子量在32kDa茉莉酸调节蛋白家族（JPR-32），但其功能一直没有深入的研究。 木菠萝素是从桂木属木菠萝的种子中分离的一种可以和半乳糖或甘露糖特异结合的凝集素。近来的研究表明，植物的凝集素具有多种功能，主要有：可作为储存蛋白，对储存物质进行包装、运输;作为植物细胞的有丝分裂因子，参与细胞壁的延伸;生长调节及运输碳水化合物;具有酶的功能;参与豆科植物感染结瘤;协同其它防御蛋白参与植物防御反应。植物凝集素的功能复杂各异，对木菠萝素的功能研究更是相对较少。 本文在小麦中克隆出的cDNA（本文命名为Ta-JA1基因），该基因cDNA全长1158bp，编码304个氨基酸，分子量32.7kDa，与JPR-32蛋白质家族的基因序列具有很高的同源性。从蛋白结构分析中显示，Ta-JA1基因有两个典型的功能结构域：N末端的茉莉酸诱导的防御反应结构域和C末端的木菠萝素相关结构域。为我们研究这个新的蛋白家族的功能提供了一个典型的模式蛋白。本文即从Ta-JA1基因出发来研究这一类蛋白的相关功能。在此，我们构建了Ta-JA1基因的pBI121表达载体，并通过农杆菌介导叶圆片法转化烟草，成功获得转基因植株。通过硫酸铵盐析法获得了植物Ta-JA1蛋白粗提品，效率在0.01%左右。使用蛋白粗提物进行凝血效应分析，转基因植株的蛋白粗样品可以凝集新鲜的兔血，说明Ta-JA1蛋白具有植物凝集素的基本性质。选取烟草上典型的三类病原体：烟草花叶病毒，烟草黑胫病菌和烟草野火病菌。分别对转基因烟草进行侵染，并观察统计其抗病性，发现转基因烟草对烟草花叶病毒和烟草黑胫病具有显著的抗性，对烟草野火病也具有一定的抑制作用。通过与野生型烟草在抗盐，抗旱，抗虫和生长发育等方面的统计比较与分析，可以看出，基因烟草在抗逆性上也有了显著的提高，虽然Ta-JA1的过量表达没有影响转基因烟草的整体生长进程，开花期和结实情况与对照烟草相比也无明显变化，但是转基因烟草的种子在萌发时间上有了显著提高，一定数量上还表现出愈合的花冠筒上出现不同程度开裂，花冠筒上有附生舌状花瓣，及带有花瓣状颜色的花萼等异常花表型。

利用多基因转化技术培育重金属超富集植物的研究

植物耐受和积累重金属的细胞学基础是植物细胞内存在一些能够络合和区隔化金属离子的机制。细胞中络合重金属离子最重要的小肽分子是谷胱甘肽(GSH)和植物络合素(PCs)，而YCFⅠ基因编码的ABC-type 液泡膜转运蛋白负责将重金属离子及其与上述小肽形成的复合物转运进入细胞液泡中，即将重金属离子区隔化。植物细胞中合成GSH 和PCs 的关键酶分别是γ－谷氨酰氨半胱氨酸合成酶(GSHⅠ)和植物络合素合酶(PCS)，他们的编码基因分别为GSHⅠ 和PCS 。此外定位于细胞质中的小囊泡上且对二价阳离子的吸收和转运有重要作用的SMF2 蛋白可能也参与重金属离子的区隔化过程。 为了改良植物使之能够应用于清除土壤中的重金属污染，本研究基于植物耐受和积累重金属的细胞学机制，分别将酿酒酵母来源的GSHⅠ、YCFⅠ和SMF2 基因，以及GSHⅠ、YCFⅠ基因分别与镉抗性植物大蒜来源的AsPCSⅠ 基因构建为不同的基因组合表达载体，转化模式植物拟南芥。对不同组合转基因拟南芥的功能分析表明： 1、酵母来源的基因GHSⅠ、YCFⅠ分别在拟南芥中异源超表达可以在一定程度上提高转基因拟南芥耐受、积累重金属的能力;其中GSHⅠ基因在拟南芥超表达可以提高转基因拟南芥合成GSH 的能力，转基因拟南芥细胞中GSH 浓度比野生型增加。 2、将GSHⅠ基因和来自大蒜的AsPCSⅠ基因同时在拟南芥中超表达能够显著提高转基因拟南芥耐受和积累重金属的能力，且积累和耐受能力显著高于分别转GSHⅠ或AsPCSⅠ的单价转基因株系;将YCFⅠ基因和AsPCSⅠ基因同时在拟南芥中超表达也能够显著提高转基因拟南芥耐受和积累重金属的能力，且积累和耐受能力显著高于分别转YCFⅠ或AsPCSⅠ的单价转基因株系。两种双价转基因株系GSHⅠ＋AsPCSⅠ和YCFⅠ＋AsPCSⅠ在积累和耐受不同重金属胁迫方面没有明显差别。 3、将SMF2 基因在拟南芥中异源表达，研究了植物中囊泡转运是否参与了重金属离子的吸收和区隔化过程。研究结果表明：超表达SMF2 基因的拟南芥尽管耐受重金属胁迫的能力与野生型没有明显差异，但其积累重金属的能力显著提高。这为证明植物中小囊泡转运参与重金属转运提供了间接证据。 综上所述，同时将多个参与植物对重金属络合、转运和区隔化作用的关键基因在转基因植物中表达可以提高植物耐受和积累重金属的能力，是培育可用于植物修复的新型工程植物的值得探索的途径。本论文所设计和构建的双价基因组合及其对目标植物的转化，在环境重金属污染的清除中有潜在的应用价值。

Coastal climate reflected in carbon-13/carbon-12 ratio of organic carbon in varved sediment from Santa Barbara basin

A 1844-1987 time-series of carbon stable isotope ratios from dated sedimentary total organic carbon from the center of the Santa Barbara basin is compared with historical climate and oceanographic records. Carbon derived from carbon-13-depleted phytoplankton and carbon-13-enriched kelp appear responsible for a large part of the isotopic variance in sedimentary total organic carbon. El Niño/Southern Oscillation events are recorded by the isotopic response of marine organic carbon in sediments.

Historical evidence of abrupt coastal climatic change in Southern California, 1790-1880

Historical sources of the late-18th and 19th centuries were searched for information on coastal weather conditions in Southern California. Relatively calm winters until 1828 were followed by unusually stormy winters from about 1829 to 1839. Later periods were again predominantly calm, with notable exceptions related to the ENSO events of 1845 and 1878. Following decreases through the stormy 1830s, sizes of kelp forests appear to have rebounded in the 1840s. ENSO occurrences and eruption of the volcano Cosiguina in 1835 are likely causes for changing wind patterns. Our results link the unique AD 1840 Macoma leptonoidea pelecypod shell layer in laminated Santa Barbara Basin sediment ("Macoma event") to abruptly changing oceanographic and weather patterns.

生物安全信息建设和转基因棉花根际土壤微生物的分子生态学初探

第一部分：生物安全信息的建设 生物安全( biosafety)是指经过遗传修饰的生物释放到自然界以后对人类健康和生态环境的影响。随着生物技术的发展，转基因生物的大量涌现，其安全性问题越来越引起人们的关注。本文主要介绍了作者在生物安全信息建设的一些工作，建立了生物安全主页和生物安全文献数据库。对主页和数据库的结构和主要内容进行了详细介绍，生物安全主页介绍了全球转基因生物的发展情况，由此带来的一些潜在风险，国内外对生物安全管理的法规和管理机制，以及对风险评估的技术准则和风险的评价指标体系。生物安全文献数据库收录了600多篇有关的文献。 第二部分：转基因棉花根际土壤微生物分子生态学初探 应用分子生物学方法对转基因棉花和对照非转基因棉花根际土壤微生物的多样性进行了一个生长季的跟踪研究，直接从土壤中提取微生物的总DNA，用PCR方法扩增出原核生物核糖体小亚基16S基因和真核生物ITS片段，并对它们进行了克隆和序列测定，共获得80条16S基因全序列和50条ITS段序列，经过分析它们分别属于7个大类的原核微生物和5个大类的真核生物共计33个属。其中，有44个克隆是传统方法所不能分析的不能被培养的微生物种类。应用邻近法分别绘制了系统关系树状图。 这是首次应用全序列分析的方法研究棉花根际土壤微生物的种类组成。为国际核酸序列数据库贡献130条核酸序列，其中有50条是16S rDNA的全序列。在最后对分子生物学方法在微生物生态学中的应用进行了简短讨论。

油菜内源和外源蛋白的表达及环境因素的影响

植物与昆虫的互作关系是个长期进化的过程，虫害给农业生产带来巨大损失。本研究以甘蓝型油菜（Brassica napus）为例，研究了不同环境条件和遗传背景下外源基因的表达与效用，同时利用蛋白质组技术，研究了虫害损伤模拟条件下植物可能存在的内源抗性机制。甘蓝型油菜中转入了人工合成的Bt（Bacillus thuringiensis）杀虫基因，能使植物产生抗虫蛋白抵御虫害。我们在湖北湖南两个实验点进行了大田实验，按植株生长发育的4个不同时期从转基因植株的叶片上采样，研究抗虫蛋白在植物体内的表达动态。植株顶部第三片展开叶的Bt毒蛋白浓度在结荚期前随植物生长而不断增加，而在结荚期出现或增或减的现象。采样叶片的可溶性总蛋白浓度含量一直呈增加的趋势，直到结荚以后出现含量的明显降低。同时，收集了转基因油菜与湘油15号在田间自然杂交形成的杂交后代种子用于栽培，用GFP仪检测杂交后代的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein），并用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）检测并确认带有转基因的杂交植株。为了检测带有转基因的杂交后代油菜中Bt毒蛋白的杀虫效率，用对Bt毒蛋白敏感的试虫品系——初孵棉铃虫幼虫（Helicoverpa armigera）进行杀虫活性检测实验。结果表明，携带Bt基因的杂交湘油及其转基因亲本对试虫的体重增长量均产生了负面影响，可以推断在调查取样的植株生长发育阶段，转基因杂交后代与其转基因亲本植株的杀虫效率没有显著差异。转基因植物及其杂交后代中抗虫蛋白的持续表达及田间带有转基因的自播植物的出现会使害虫产生耐受抗性的潜在可能性增加。 相对于人为增加的抗虫基因，植物在长期对抗昆虫的过程中也进化形成了自我防御机制，能够产生特异的抗性蛋白来应对昆虫的取食。本研究用机械损伤模拟害虫取食，对比了油菜受到物理损伤前后可溶性总蛋白的含量变化并试图通过蛋白质组学技术来检测可能发生变化的蛋白质。Bradford定量测定发现，同一植株同一叶片损伤前后可溶性总蛋白含量差异显著，损伤后蛋白表达量显著增高。蛋白质组双向凝胶电泳及其差异分析显示，损伤前后有8个蛋白质点发生明显的上调或下调。选择其中2个差异蛋白点经过MALDI-TOF质谱鉴定，它们分别是Rubisco小亚基前体以及果糖－1，6－二磷酸醛缩酶和粪卟啉－3－氧化酶的混合物，这些蛋白质在其他植物的抗逆研究中也有报道，它们可能在油菜叶片应答机械损伤过程中对维持植物的生理功能也有重要作用。

转基因油菜和野芥菜杂交种的适合度

转基因植物与野生亲缘种间的基因流动是目前生物安全的研究热点。甘蓝型油菜（Brassica napus 以下简称油菜）及其亲缘种是基因流研究中的模式植物体系，油菜的亲缘种之一野芥菜(B. juncea)在中国分布广泛，是常见的农田杂草。本文以转基因抗虫油菜和野芥菜为研究材料，分别用综合适合度(基于生长和生殖)和适合度(仅基于种子产量)的指标来评估其杂交种在模拟农田情况下的适合度，揭示转基因在自然环境中的命运，以期为中国的油菜基因流的管理和控制提供参考。主要结果如下： 由于杂种优势和亲本效应的影响，转基因杂交种在不同的种植季节的生长与长势较好的亲本相近。因而转基因杂交种的综合适合度介于双亲之间，或与表现较好的亲本相似。因结实较差，从种子产量上来看，转基因杂交种的适合度较低。杂交种的后代因母本效应保留了一定的休眠特性，这有助于杂交种在种子库中持续存在。野芥菜和杂交种秋播时在冬季覆大棚条件下的适合度较高，在全球变暖的情况下，野芥菜和杂交种有可能在原先较冷不适宜的地区生长，从而促进转基因的散布。 杂交实验表明，转基因花粉与野芥菜的亲和性略高于非转基因花粉，但不显著；在两种花粉发生竞争时，转基因花粉的亲和性显著较高。混合花粉授粉的结实率高于单种花粉的结实率。可见在转基因花粉在授粉阶段不存在适合度代价。同时两季秋播田间实验表明，转基因油菜与非转基因油菜的适合度没有明显差异，即在植株的生长结实阶段，当没有竞争和虫害选择压力时，转基因没有适合度代价。也证明转基因散布的潜在可能性较大。此外，转基因杂交种的开花量很大，而回交实验中转基因杂交种花粉的育性高于胚珠的育性。转基因有可能通过持续的回交逃逸。 油菜的种子较大，野菜芥的种子较小，转基因油菜与野芥菜的杂交种基本都是小种子，其种子直径低于双亲。种子大小影响了发芽率、出苗率和营养生长期。小种子出苗率和发芽率较低，营养生长期较长。在没有竞争的条件下，春播实验中，种子大小对植物的适合度及综合适合度没有影响。秋播实验中种子大小对除转基因油菜外的所有植物基因型的综合适合度有显著影响。但对于依据种子产量计算的适合度指标来说，种子大小仅对野芥菜有影响，而对其它基因型影响不大。竞争扩大了种子大小之间生长表现的差异。竞争条件下，不同种子级别间的生长变异系数大于无竞争的情况。 总之，转基因花粉较强的竞争能力和其与野芥菜的亲和性使转基因杂交种的产生成为可能。来自母本的休眠特性有助于杂种种子在种子库中存在并在条件适宜时萌发、开花，有助于转基因的进一步扩散。转基因杂交种具有较高的综合适合度，虽然结实率很低，但其开花量比较大，可能会产生大量可育的花粉，在与野生亲本的持续回交过程中，转基因有可能逃逸。同时，转基因杂交种的种子级别偏小有可能会加剧这种逃逸。

马铃薯Y病毒外壳蛋白基因的导入以及转基因马铃薯植株的大田攻毒

应用四种不同的马铃薯试管微型薯诱导体系生产试管微型薯，通过比较建立了—种有效的试管微型薯诱导系统。这种诱导系统使用液体培养基，具有试管微型薯发生频率高、薯块体积大和微型薯形成早的特点。同时，此系统使用的培养基成分成本低、方法简便以及所用设备简单，适用于容器内大批量生产马铃薯试管微型薯以及马铃薯种质资源的保存。 对银离子在马铃薯叶片组织培养过程中对愈伤组织诱导或芽分化和再生的影响作了研究。结果表明银离子通过抑制叶片组织培养过程中形成的乙烯与其受体的结合从而促进芽再生，但是其对叶片愈伤组织的诱导无显著效果。银离子的这些作用在通过同时应用2，4-D而明显表现出来。2，4-D通过促进乙烯的生物合成而降低银离子的促进作用，两者则通过对乙烯的调节而影响马铃薯叶片的愈伤组织诱导和芽分化再生。 将马铃薯Y病毒外壳蛋白基因通过根癌农杆菌双元载体系统导入马铃薯品种Desiree、K4和Favorita，获得了若干转基因株系。除了K4品种中—转化株系具有非正常生长形态外，其余转基因植株都生长发育正常。由此表明以根癌农杆菌介导的马铃薯转化中，构建于双元载体上的外源目的基因是随机进入并整合到受体细胞的染色体上。具有畸形生长性状的转基因植株的产生说明了PVY CP基因的整合可能干扰了控制正常生长发育、尤其是形态建成的基因表达。 在转化试验中，应用了试管微型薯薄片、茎切段和叶片三种外植体作为转化材料。对转化过程中农杆菌对外植体的侵染时间、共培养时间、外植体的类型以基因型对转化频率的影响作了比较研究。发现以试管微型薯薄片和茎切段作为受体的最佳侵染时间是十分钟，而叶片则为五分钟，三种外植体的最佳共培养时间皆为四天。在各种处理的最佳条件下，Desiree比K4具有相对较高的转化频率，表明马铃薯Desiree比K4在转化反应上更温和或顺从。 通过比较几种由不同统计得出的农杆菌介导的转化频率，认为使用“净转换频率”(Net Transformation Frequency)能更精确地表达马铃薯的转化效率。而在以前的报导中还没有—种统一的、并且能被广泛接受和使用的表达转化效率的参数或指标。． 以叶片作为起始材料的转化具有较高的转化频率。在转化外植体的植株再生过程中应用了2，4-D和AgN03两种乙烯调节剂分别于愈伤组织诱导和芽分化再生阶段，使其产生高频的植株再生。尤其是它的净化频率明显高于其它外植体的转化频率，并且无显著品种之间的差异，具有高效马铃薯转化系统的特征。 以聚合酶链式反应(PCR)检测转化再生植株得到的结果与DNA杂交(Southern blot analysis)的鉴定结果比较，结论是相同的。由此表明在以农杆菌介导的马铃薯转化试验中，PCR可被用于证实外源目的DNA的导入，它以简便、迅速的特点帮助节省时间以及提供及时的转化证据。 对三个马铃薯品种的一系列转基因株系在大田条件下进行了攻毒试验．最后从Favorita 品种中筛选出了两个抗性较强的无性系，它们具有明显较低的病毒侵染发生频率以及正常的生长发育性状，具有很大潜力成为生产上推广应用的抗病新品种。

细胞分裂素基因（T-cyt）对转基因植物生长发育的调控

高等植物基因表达过程中的信号传导是目前植物分子生物学研究的前沿和热点之一。不少研究者已将脱落酸、乙烯、细胞分裂素及其它植物激素的作用一起归之于植物基因表达的信号传导系统。细胞分裂素作为—类重要的植物激素在植物的生长和发育过程中起重要的调节控制作用。因此研究细胞分裂素的基因与植物发育过程的关系是十分重要的。 为研究细胞分裂素对植物基因表达的调节，本文从转录和翻译水平上测定了黄瓜子叶在外源细胞分裂素诱导下微管蛋白基因表达的活性。发现经BAP处理的黄瓜子叶中α,β-tubulin mRNA迅速积累，微管蛋白的含量迅速增加。这表明外源细胞分裂素在诱导黄瓜子叶膨大的过程中激活了微管蛋白基因的表达。 为探索不同启动子驱动下的细胞分裂素基因转入植物后的表达对转基因植物生长发育的调控，本文将来自根癌农杆菌的细胞分裂素基因(T-cyt)分别置于CaMV 35S启动子，rbc S启动子和T-cyt基因自身启动子的调控下，构建了嵌合表达质粒，分别转化烟草和马铃薯。转基因烟草和马铃薯的PCR检测和Southern杂交鉴定均证实T-cyt基因已分别整合进烟草和马铃薯的核基因组中。标志基因NPTⅡ的酶活性测定表明有外源基因的表达。转基因烟草的Northern分析表明：CaMV 35s启动子驱动的T-cyt基因的mRNA在叶、茎和根中均有表达;rbc S启动子指导的T-cyt基因在叶中表达最强，茎中较弱，在根中几乎没有表达。转细胞分裂素基因的烟草在生长发育上与未转化的对照相比有明显不同。转基因烟草中叶绿素a，b含量明显增加，叶面积减小，叶衰老迟缓。T-cyt基因转化的烟草顶端优势受到抑制，侧芽生长旺盛;与对照相比，其节间短，株高降低，根生长受抑制。 本文还构建了T-cyt基因自身启动子与报告基因GUS编码区的嵌合表达质粒，转化烟草和马铃薯以研究T-cyt启动子在植物中的表达。组织化学定位测定表明，T-cyt启动子在植物的茎，叶中的表达较强，特别是在腋芽的生长点有很高的表达活性，但在根中的表达较弱。诱导性表达试验表明，T-cyt启动子的表达强度受细胞分裂素的诱导，而生长素对T-cyt启动子的表达无明显影响。这提示T-cyt启动子是一个细胞分裂素诱导性表达的启动子。 总之，将T-cyt基因转入植物，作为调节内源细胞分裂素的一种手段，可以对植物的生长发育进行调控。尤其是利用发育阶段特异性和各种器官特异性表达的启动子可以调节T-cyt基因的表达活性，有可能创造出具有经济价值的、具有新遗传特性的植物。

两种完熟相关基因反义RNA在转因番茄中的表达及其对果实完熟的仰制作用

植物激素乙烯作为一种信使分子调节控制果实完熟。ACC合成酶是植物体内乙烯生物合成途径的限速酶，其反义RNA的表达将能有效地抑制乙烯的生物合成而延缓果实完熟，利用反转录PCR技术克隆获得了ACC合成酶多基因家族成员之一LE-ACC2阅读框架约1.7kb的cDNA，经酶切图谱和序列分析鉴定无误后，反向连入植物表达载体pBin437中构建成组成型表达ACC合成酶反义RNA的双元载体。经农杆菌途径转化番茄“丽春”品种，获得了60株抗卡那再生杭株，PCR检测证明有6株为转基因植株，Southern杂交和Northern杂交分析进一步确证了外源基因的插入及其转录活性。反义番茄果实的乙烯释放受到明显抑制，表现出更好的耐储保鲜特性，并且与对照相比，在果实品质上没有明显差别。大田培育Fl和F2代转化番茄植株，反义番茄纯合品系的筛选工作正在进行之中。 同时，本研究利用已经获得的ACC合成酶和PG的cDNA克隆，构建了两个嵌合转化基因载体pPGACC1、pPGACC10，它包括1300bp的ACC合成酶cDNA编码序列，并分别含有反向与正向的250bp的5’端PG基因片断。酶切图谱和序列分析鉴定无误后，以pBin437为植物表达载体构建了双元载体pBPGACC1和pBPGACC10，分别表达PG正义RNA和反义RNA，并均表达ACC合成酶反义RNA。经农杆菌转化番茄子叶，植株的再生培育有待进行。通过对转基因植物的分析，我们期望阐明用单一嵌合基因表达载体通过反义抑制与抑制作用实现对内源两同源基因——PG和ACC合成酶下降调节的可能性，并可望得到具有更好耐储效果且品质优良的番茄品系。

水稻菠菜紫黄质脱环氧化酶基因的克隆遗传转化及其特性的研究

自发现叶黄素循环具有热耗散的作用后它被引起广泛的关注目前普遍认为叶黄素循环的色素定位于天线色素蛋白复合体上在跨膜质子梯度pH形成后玉米黄质Z和环氧玉米黄质A能够从叶绿素中吸收过多的激发能并以热能的形式耗散到体外从而保护光合器官免受强光的破坏紫黄质脱环氧化酶VDE是叶黄素循环的关键酶在较低的pH条件下它能在数分钟内将紫黄质V转变为Z和A本论文从水稻和菠菜中克隆了编码VDE酶的基因并通过转基因植物进一步研究了叶黄素循环在热耗散方面的作用主要获得了以下结果 首次从两个水稻亚种籼稻和粳稻中克隆了Rvde基因分别命名为iRvde和jRvde的全长cDNA序列分别长1647bp和1887bp两者开放阅读框的同源性为98%与其它已知vde基因的同源性在60以上推导两者均编码446个氨基酸其中转运肽序列长98个氨基酸两者成熟蛋白的氨基酸序列完全相同与已知VDE成熟蛋白的同源性在75%以上其中与小麦的同源性最高达87.4 通过PCR扩增获得了Rvde基因的核基因组DNA序列在它们的编码区中含有4个内含子其长度在jRvde中分别为105bp327bp81bp和69bp而iRvde基因的第2个内含子长425bp与jRvde的第2个内含子差别较大内含子的AT含量为6063%其两端为典型的GT/AG结构 构建了Rvde基因的原核表达载体pET-Rvde在0.4mmol/L IPTG的诱导下该基因能在大肠杆菌BL21(DE3)中大量表达SDS-PAGE和Western杂交表明表达蛋白的分子量约为 43 kDa随着IPTG诱导时间的延长蛋白量逐渐增加诱导4h后它占大肠杆菌总蛋白的25左右吸收光谱差值A502-540随反应的进行逐渐增大反应体系总色素的HPLC分析表明V逐渐降低而Z刚好相反说明表达的蛋白具有与活体VDE酶相同的功能能在体外将V转变为A和Z 从菠菜中克隆了Svde基因并构建了该基因的反义抑制植物表达载体pCB-antiSvde用根癌农杆菌介导法转化烟草获得了大量的转基因植株再生的愈伤组织经GUS染色后呈蓝色PCR扩增潮霉素抗性基因hpt和Svde基因结果显示在转基因植株T0和T1代中都分别扩增出1.0 kb和1.4 kb的目的片段而在未转化的对照植株中没有扩增转基因植株的T0代种子在潮霉素培养基上的萌发数与未萌发数的比值为3:1符合单基因的孟德尔分离规律从T1代转基因植株中筛选出抑制程度较强的一个株系A29Southern杂交结果表明外源Svde基因已整合到烟草的基因组中并且只有一个插入位点通过冻融法从该植株的类囊体中提取VDE酶其酶活性为3.2是对照植株的45.7表明VDE酶受到了抑制荧光动力学及HPLC测定结果显示强光处理后在转基因植株中Z和A的形成较少非光化学淬灭NPQ值较对照低Fv/Fm的下降较对照快表明转基因植株的热耗散能力下降进而说明叶黄素循环具有热耗散的功能 同时还建立了根癌农杆菌介导的水稻遗传转化体系并初步作了转化Svde基因的试验另外还建立了一种适合于筛选转基因植株的DNA微量提取法此方法操作快捷方便一个人在一天内能制备50多个样品100mg的植物鲜样平均可获得40µg的DNA提取的DNA可直接用于PCR反应酶切分析及Southern分析

转Rubisco 活化酶大型同工酶基因(rca)水稻的光合作用特性研究

Rubisco 是催化光合暗反应第一步反应的酶，是唯一能将CO2 转变成碳水化合物的酶，由它固定和最后转化成的碳水化合物提供了植物、动物和微生物的食物和能量。但是，Rubisco 催化该反应的效率十分低，使之成为光合作用的限速步骤。由于Rubisco 的合成和催化过程十分复杂，人们很难通过直接改造Rubisco 提高植物固定CO2 的能力。而Rubisco 活化酶能活化Rubisco，使植物在生理CO2 浓度下具有最大的CO2 同化速率，因此研究活化酶有重要意义。水稻活化酶有2 个同工酶，大型同工酶比小型同工酶C 端多37 个氨基酸，其中包括两个Cys 残基。这两个Cys 残基的存在使活化酶大型同工酶对ADP 的存在更加敏感，其活性在硫氧还蛋白的介导下能被基质中氧化还原状态的变化所调节。由于活化酶大型同工酶对调节Rubisco 的活性具有的这种特殊作用，在本研究中，将活化酶大型同工酶rca基因用正义和反义引入水稻基因组，获得了过量表达活化酶大型同工酶基因和反义抑制活化酶基因表达的转基因植株，对其光合作用进行了生理和生化分析。 本研究的主要结果如下： Rubisco 活化酶大型同工酶基因的克隆：从水稻镇恢249 中克隆了1525 bp 的活化酶大型同工酶cDNA 序列。经过测序，它与报道的粳稻品种活化酶大型同工酶cDNA 序列（rca）完全相同。 构建了4 个植物表达载体：3 个为过量表达rca的载体，分别是pCBUbirca，pCBSrca 和 pCBSUbirca ，其中rca分别在水稻中高效表达的玉米Ubiquitin 启动子、受光调控的Rubisco 小亚基基因启动子和由这两个启动子构成的双启动子控制下表达; 1 个在Ubiquitin 启动子控制的反义rca载体，即 pCBUbi-antirca。 获得了转化rca的水稻再生植株：用日本晴，台北309，武育梗7 号和籼稻品种培矮64S 水稻成熟种子诱导愈伤组织。用改良的农杆菌浸染法将rca基因转化这些愈伤组织，在潮霉素筛选压力下获得抗性愈伤组织，经过2 天的干燥处理后，转入到含山梨醇的高渗分化培养基上培养，能迅速获得大量的芽和转化体再生植株。 获得了转rca基因的水稻植株：抗性愈伤组织和再生水稻幼苗的叶片经GUS 染色呈蓝黑色。PCR 扩增转基因水稻基因组内的潮霉素基因和rca，大部分转基因水稻中含有841 bp 的潮霉素基因片段和1525 bp 长的rca cDNA 片段。251 粒T1 代转基因水稻种子中189粒呈现潮霉素抗性，抗性种子/非抗性种子的比率约为3：1，接近孟德尔分离规律。Southern杂交表明rca序列已整合到水稻基因组，一般含1－2个拷贝。Western 杂交显示Rubisco 活化酶含量在转pCBUbi －antirca 的水稻中和对照比，几乎看不出，被反义抑制;转pCBUbirca 的水稻与对照含量相差无几;转pCBSUbirca，pCBSrca 载体的水稻中活化酶的含量比对照有极显著的增加。 T1 代转rca水稻的光合作用发生显著变化：转pCBSrca 和pCBSUbirca 的水稻在饱和光强下的Rubisco 初始活性、羧化效率、光合速率都明显高于对照，但是表观量子效率、色素含量和Rubisco 总活性与对照相似。两者相比，前者比后者更高;转反义rca（pCBUbi-antirca）基因的水稻饱和光强下的光合速率、表观量子效率、羧化效率、Rubisco 初始活性明显降低，色素含量和Rubisco 总活性基本不变;转pCBUbirca 的水稻中，光合作用的各项参数与对照基本相似。 T1 代转rca水稻的叶绿素荧光明显改变：转pCBSrca 和pCBSUbirca 的水稻ΦPSII 的值明显高于对照，而且前者qP 的值明显高于对照。两者相比，前者的ΦPSII 和qP 的值比后者高;转反义rca的水稻ΦPSII，F′v/F′m，qP 值和对照比都明显降低，但qN 的值升高;转pCBUbirca 载体的水稻中，叶绿素荧光的各项参数与对照基本相似。 转rca基因的水稻生长发育的变化：转pCBUbirca 载体的水稻整个生长发育过程与对照相似;转化pCBSrca 和pCBSUbirca 载体的水稻和对照比，植株高大，生长发育速度加快，抽穗、开花和结籽的时间提前。两者本身相比，前者比后者明显;转反义rca（pCBUbi-antirca）基因的水稻生长发育延迟，植株矮小，种子败育。 由上可见，Rubisco 活化酶大型同工酶rca基因在Rubisco 小亚基基因启动子、Ubiquitin 基因启动子和Rubisco 小亚基基因启动子共同控制下正义转入水稻的转基因植物光合作用的参数最好，光合效率提高，植物表型最好，生长发育加快，提前开花结籽。这一研究可能为获得高光合效率和高产量的水稻奠定了基础。

谷子和甘蔗C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆及其转基因水稻光合效率的提高

水稻是我国重要的粮食作物之一，它是一种典型的C3植物。与其它C3作物不一样的是，水稻的生长需要相对较高的温度和充足的阳光照射。然而高温和高光强的生长环境更加适合于C4植物的生长，更加有利于发挥C4植物高光合效率的特点。因此本论文希望将C4植物中固定CO2的酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因导入水稻，获得一种更加适合高温和高光强生活环境的“C4型”水稻，这对于提高水稻的产量，满足人口增长对粮食需求具有重大意义。 本论文从C4植物谷子和甘蔗中克隆了其C4型磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶cDNA基因，获得了具有自主知识产权的基因克隆，并将它们导入粳稻品种中花8号，进而对转基因材料的光合生理特性进行了研究。结果如下： 首次从谷子中得到了ppc基因两个cDNA克隆，分别命名为Mppc1和Mppc2。前者是一个C3型的ppc基因，它可能属于在根中特异表达的C3-2型ppc基因;后者是在绿色叶片中大量表达的C4型ppc基因。它们所编码的蛋白的氨基酸残基数分别为961和964，序列同源性为82.5%。C4型PEPC多出的3个氨基酸位于N末端。利用RACE的方法我们得到了谷子C4型ppc基因完整的cDNA序列，包括63bp的5'非编码区，2895bp的编码区和256bp的3'非编码区。 首次获得了甘蔗C4型ppc基因完整的cDNA序列的克隆，命名为Sppc。它包括95bp的5'非编码区、2886bp的编码区，和224bp的3'非编码区。 利用所克隆的基因，分别连上强组成型启动子Ubiquitin启动子和强光调控启动子Rubisco小亚基启动子后，再插入两个标记基因不同的表达载体pCB和pPCB的多克隆位点中，构建了八个含有外源ppc基因的植物表达载体pCB-Pubi-Mppc、pCB-Pubi-Sppc、pCB-PrbcS-Mppc、pCB-PrbcS-Sppc、pPCB-Pubi-Mppc、pPCB-Pubi-Sppc、pPCB-PrbcS-Mppc和pPCB-PrbcS-Sppc。再加上含有玉米完整的C4型ppc 核基因的载体pCB-ZMppc，共有9个载体。利用农杆菌介导法进行了水稻的转化，各个载体都获得了大量的转基因植株。对标记基因潮霉素磷酸转移酶基因hpt和磷酸甘露糖异构酶基因pmi以及导入的目的ppc基因的PCR扩增检测，结果显示绝大多数转基因植株都能扩增出目的片段，而未转化的植株则没有扩增产物。对部分转基因水稻的Southern和Western杂交以及RT-PCR分析都表明，无论从DNA水平、mRNA水平，还是从蛋白质水平上都证明外源ppc基因都成功地导入了水稻，并获得了正确的表达。 对各载体转基因植株PEPC活性大规模的测定表明，转入玉米完整C4型PEPC核基因（有内含子）的水稻表现出极大的表达效率，大多数转基因材料的PEPC活性为对照的10-20倍，其活性最高可达到对照的44倍。转入谷子和甘蔗PEPC基因cDNA的水稻，表达的效率很低，多数材料活性增加仅为对照的2-5倍，但也有极少数材料活性增加了10倍以上。用Rubisco小亚基启动子控制的ppc基因在水稻的表达活性要略高于Ubiquitin启动子控制的ppc基因。以上结果说明ppc基因的内含子在其转录或mRNA的稳定上起着重要作用。 对部分转基因材料气体交换特征的研究发现，随着转基因水稻PEPC活性的增加，净光合速率也有逐渐增加的趋势。其中PEPC活性最大的ZM24株系的三个单株净光合速率比对照增加了39.8%、13.7%和28.6%，而它们的PEPC活性比对照分别增加了21.2、21.9和23.6倍。 转PEPC水稻的净光合速率与气孔导度具有显著的相关性。这说明表达的外源ppc 基因产物PEPC参与了转基因水稻的气孔运动，使气孔开放程度增加。更有意义的是过表达PEPC的水稻具有更高的水分利用效率，这就增加了其耐旱能力。在光抑制条件下转基因水稻也具有更高的光合能力。这些特征表明转ppc基因的水稻比对照更加适合于水稻高温高光强和干旱的原生环境。