Caractérisation de nouveaux analogues des cannabinoides

Ce mémoire présente l’étude de certains effets pharmacologiques de nouveaux analogues synthétiques des cannabinoïdes. Un des objectifs de longue date des recherches sur les cannabinoïdes a été la découverte de puissants analogues synthétiques de substances naturelles, qui pourraient être développés comme médicaments. Cela nécessite, entre autres, qu’ils soient exempts d’effets psychotropes qui caractérisent l’usage récréatif du Cannabis. Le moteur derrière cet objectif a été la longue histoire de l’usage du Cannabis comme substance médicale, en particulier dans le traitement de la douleur et de l’inflammation. Parmi les nombreux effets pharmacologiques des cannabinoïdes, deux sont d’un grand intérêt thérapeutique : l’effet antiprolifératif sur les cellules tumorales et l’effet anti-angiogène. Dans ce mémoire, l’étude de ces deux effets a été réalisée sur des cultures cellulaires tumorales et endothéliales humaines. Les tests de prolifération sur les deux types de cellules n’ont pas montré de cytotoxicité. Ce qui a permis de poursuivre l’étude de l’effet anti-angiogène, et qui a mis fin à l’étude de l’effet anti-tumoral. L’inhibition de l’angiogénèse a été investiguée en réalisant des tests de recolonisation d’une zone dénudée dans une monocouche de cellules endothéliales et des tests de formation de microtubules sur matrice gélifiée. L’effet anti-angiogène n’a pas pu être évalué à cause de problèmes de contamination, néanmoins certaines molécules montrent un effet anti-migratoire. L’absence de cytotoxicité et l’analogie structurale avec le -tétrahydrocannabinol encourage à continuer l’investigation des effets pharmacologiques de ces nouvelles molécules synthétiques. Il serait aussi pertinent d’étudier, dans une thèse de doctorat, les mécanismes d’actions moléculaires par lesquels agissent ces molécules.

Étude du rôle de Pax6 dans la gliogenèse

Les astrocytes sont des cellules gliales présentes dans le système nerveux central, qui exercent de nombreuses fonctions physiologiques essentielles et sont impliquées dans la réponse aux lésions et dans plusieurs pathologies du cerveau. Les astrocytes sont générés par les cellules de la glie radiale, les précurseurs communs de la plupart des cellules neuronales et gliales du cerveau, après le début de la production des neurones. Le passage de la neurogenèse à la gliogenèse est le résultat de mécanismes moléculaires complexes induits par des signaux intrinsèques et extrinsèques responsables du changement de propriété des précurseurs et de leur spécification. Le gène Pax6 code pour un facteur de transcription hautement conservé, impliqué dans plusieurs aspects du développement du système nerveux central, tels que la régionalisation et la neurogenèse. Il est exprimé à partir des stades les plus précoces dans les cellules neuroépithéliales (les cellules souches neurales) et dans la glie radiale, dérivant de la différenciation de ces cellules. L’objectif de cette étude est d’analyser le rôle de Pax6 dans la différenciation et dans le développement des astrocytes. À travers l’utilisation d’un modèle murin mutant nul pour Pax6, nous avons obtenu des résultats suggérant que la suppression de ce gène cause l'augmentation de la prolifération et de la capacité d'auto-renouvellement des cellules souches neurales embryonnaires. In vitro, les cellules mutantes prolifèrent de façon aberrante et sous-expriment les gènes p57Kip2, p16Ink4a, p19Arf et p21Cip1, qui inhibent la progression du le cycle cellulaire. De plus, Pax6 promeut la différenciation astrocytaire des cellules souches neurales embryonnaires et est requis pour la différenciation des astrocytes dans la moëlle épinière. Les mutants nuls pour Pax6 meurent après la naissance à cause de graves défauts développementaux dus aux fonctions essentielles de ce gène dans le développement embryonnaire de plusieurs organes. En utilisant un modèle murin conditionnel basé sur le système CRE/ loxP (hGFAP-CRE/ Pax6flox/flox) qui présente l’inactivation de Pax6 dans les cellules de la glie radiale, viable après la naissance, nous avons montré que Pax6 est impliqué dans la maturation et dans le développement post-natal des astrocytes. Le cortex cérébral des souris mutantes conditionnelles ne présente pas d’astrocytes matures à l’âge de 16 jours et une très faible quantité d’astrocytes immatures à l’âge de trois mois, suggérant que Pax6 promeut la différenciation et la maturation des astrocytes. De plus, Pax6 semble jouer un rôle même dans le processus de différenciation et de maturation de cellules gliales rétiniennes. L’étude des gènes et des mécanismes moléculaires impliqués dans la génération des astrocytes est crucial pour mieux comprendre le rôle physiologique et les altérations pathologiques des ces cellules.

Development and disease of the photoreceptor cilium

Primary cilia are microtubule-rich hair-like extensions protruding from the surface of most post-mitotic cells. They act as sensory organelles that help interpret various environmental cues. Mutations in genes encoding proteins involved in ciliogenesis or protein transport to the primary cilia lead to a wide variety of diseases commonly referred to as ciliopathies,which include primary ciliary dyskinesia, situs invertus, hydrocephalus, kidney diseases, respiratory diseases, and retinal degenerations. In the retina, the photoreceptor cells have a highly specialized primary cilium called the outer segment (OS), which is essential for photosensation. Development of the photoreceptor OS shares key regulatory mechanisms with ciliogenesis in other cell types. Accumulating evidence indicates that mutations that affect OS development and/or protein transport to the OS generally lead to photoreceptor degeneration, which can be accompanied by a range of other clinical manifestations due to the dysfunction of primary cilia in different cell types. Here, we review the general mechanisms regulating ciliogenesis, and present different examples of mutations affecting OS ciliogenesis and protein transport that lead to photoreceptor degeneration. Overall, we conclude that the genetic and molecular evidence accumulated in recent years suggest a clear link between the development and function of the primary cilium and various clinical conditions. Future studies aimed at uncovering the cellular and molecular mechanisms implicated in ciliogenesis in a wide variety of animal models should greatly increase our understanding of the pathophysiology of many human diseases, including retinal degenerations.

Ninjurin-1 est une molécule d'adhérence de la barrière hémato-encéphalique impliquée dans le recrutement de monocytes au sein du système nerveux central

La sclérose en plaques (SEP) est caractérisée par des infiltrations périvasculaires de cellules immunitaires et par de la démyélinisation au sein du système nerveux central (SNC). Ces deux paramètres de la maladie sont associés à la fragilisation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). En ce sens, le recrutement des cellules présentatrices d’antigène (CPA) myéloïdes, telles que les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques, dans le SNC à travers la BHE, est une étape cruciale dans l’initiation et la persistance de l’inflammation cérébrale. Nerve injury-induced protein (Ninjurin)-1 est une nouvelle molécule d’adhérence qui médie une interaction de type homophilique et dont l’expression sur l’endothélium vasculaire de la BHE humaine fut identifiée grâce à une analyse protéomique des protéines associées à la BHE. Les résultats présentés dans ce mémoire montrent que l’expression de Ninjurin-1 augmente dans un contexte inflammatoire dans les cultures primaires de cellules endothéliales de la BHE (CE-BHE) et sur les CPA myéloïdes humaines ex vivo et générées in vitro. De plus, les CPA infiltrantes retrouvées dans les lésions cérébrales de patients atteints de SEP et dans le SNC des souris atteintes d’encéphalomyélite autoimmune expérimentale (EAE), le modèle murin de la SEP, expriment de hauts niveaux de Ninjurin-1. À l’aide du modèle in vitro de la BHE, la neutralisation de Ninjurin-1 restreint spécifiquement la migration des monocytes à travers les CE-BHE sans affecter le recrutement des lymphocytes, ni la perméabilité des CE-BHE. Enfin, les souris atteintes d’EAE et traitées avec un peptide bloquant dirigé contre Ninjurin-1 présentent une maladie moins sévère ainsi qu’une diminution des CPA infiltrant le SNC et ce comparé au groupe contrôle. Ces résultats suggèrent que Ninjurin-1 est une molécule d’adhérence de la BHE impliquée dans le recrutement de CPA myéloïdes au sein du SNC et qu’elle peut être considérée comme une cible thérapeutique potentielle en SEP.

Rôle de l'axe CD40/CD40L dans la régulation de la fonction paquettaire

Le CD40 ligand (CD40L) est une molécule inflammatoire appartenant à la famille du Facteur de Nécrose Tumorale ("Tumor Necrosis Factor", TNF), originalement identifié au niveau des cellules immunitaires. L’interaction du CD40L avec son récepteur de haute affinité présent sur les cellules B, le CD40, est d’une importance cruciale à la production d’immunoglobulines lors de la réponse immunitaire. Aujourd’hui, nous savons que ces deux molécules qui constituent l’axe CD40/CD40L sont aussi exprimées au niveau des cellules du système vasculaire et occupent une place importante dans une variété de réactions inflammatoires, de sorte que le CD40L est présentement reconnu comme une molécule thrombo-inflammatoire prédictive des évènements cardiovasculaires. Les plaquettes sont la principale source du CD40L soluble ("soluble CD40L", sCD40L) plasmatique et il fut démontré être impliqué dans l’activation plaquettaire, malgré que son impact exact sur la fonction plaquettaire et les mécanismes sous-jacents demeurent inconnus. Ainsi, le but de ce projet était de déterminer l’impact du sCD40L sur la fonction plaquettaire et d’élucider les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. Les objectifs spécifiques étaient : 1) d’évaluer l’impact du sCD40L sur l’activation et l’agrégation plaquettaire in vitro; 2) de déterminer le récepteur cible (CD40 ou autre) impliqué dans ces effets; 3) de décortiquer les voies signalétiques intracellulaires et moléculaires induites par le sCD40L, impliquant la participation potentielle de la famille du facteur associé du récepteur du TNF ("Tumor Necrosis Factor Receptor Associated Factor", TRAF) et 4) d’analyser l’effet du sCD40L sur la formation du thrombus in vivo. Le sCD40L augmente fortement l’activation et l’agrégation plaquettaire induite par de faibles doses d’agonistes. Les plaquettes humaines traitées avec une forme mutante du sCD40L qui n’interagit pas avec le CD40 et les plaquettes de souris CD40 déficientes (CD40-/-) ne furent pas en mesure d’induire ces effets. De plus, nous démontrons la présence de plusieurs membres de la famille des TRAFs dans les plaquettes, parmi lesquels seulement TRAF-2 interagit avec le CD40 suite à la stimulation par le sCD40L. Le sCD40L agit sur les plaquettes au repos par l’entremise de la protéine Rac1 et de sa cible en aval, soit la protéine kinase activatrice du mitogène p38 ("Mitogen Activating Protein Kinase", MAPK). Ceci mène ultimement au changement de forme plaquettaire et à la polymérisation de l’actine. Par ailleurs, il est intéressant de noter que les souris CD40-/- démontrent un défaut significatif de l’agrégation plaquettaire en réponse au collagène, ce qui souligne l’importance du CD40 dans les interactions plaquettes-plaquettes. Dans un deuxième temps, le sCD40L amplifie l’agrégation plaquettaire en sang complet, accélère les temps de thrombose in vitro mesurés à l’aide du système PFA-100 et augmente l’adhésion plaquettaire au collagène sous condition de flux, le tout par l’entremise du CD40. Finalement, dans un modèle de thrombose artérielle murin, l’infusion du sCD40L exacerbe la formation du thrombus chez les souris du type sauvage ("Wild Type", WT), mais non chez les souris CD40-/-. Ceci fut en plus associé à une augmentation significative du nombre de leucocytes au sein du thrombus des souris WT traitées à l’aide du sCD40L, tel que démontré par marquage immuno-histologique anti-CD45 et par quantification des coupes artérielles par microscopie optique. En résumé, ce projet identifie une nouvelle voie signalétique, TRAF-2/Rac1/p38 MAPK, en réponse au sCD40L et démontre ses effets sur l’activation et l’agrégation plaquettaire. De manière encore plus importante, nous démontrons pour la première fois la présence d’une corrélation positive entre les niveaux circulants du sCD40L et la thrombose artérielle, tout en soulignant l’importance du CD40 dans ce processus. Ainsi, le sCD40L constitue un activateur important des plaquettes, les prédisposant à une thrombose exacerbée en réponse au dommage vasculaire. Ces résultats peuvent expliquer le lien étroit qui existe entre les niveaux circulants du sCD40L et l’incidence des maladies cardiovasculaires.

Études des rôles physiopathologiques de PTEN dans le tractus reproducteur femelle

La tumeur des cellules de la granulosa (GCT) représente 5% des cas de cancers ovariens chez la femme. Bien que considérées comme peu malignes, la mort survient dans 80% des cas suite à une recrudescence de la maladie. En dépit de ces statistiques sinistres, peu d’études ont été portées sur ce type de cancer. Le premier objectif de cette étude consistait à élucider les mécanismes moléculaires causant les GCT en démontrant l’implication de la voie de signalisation PI3K/AKT dans leur étiologie. Pour ce faire, nous avons employé la technologie Cre-Lox afin de cibler le gène Pten (antagoniste de cette voie) spécifiquement dans les cellules de la granulosa chez la souris. Ces souris (Ptenflox/flox;Amhr2cre/+) ont occasionnellement développé des GCT, soutenant notre hypothèse de l’importance de la voie PI3K/AKT dans leur étiologie. La voie WNT/CTNNB1 est une autre voie de signalisation qui a récemment été impliquée dans le développement des GCT. Dans le cadre de ce projet, nous avons également testé l’existence possible d’une synergie fonctionnelle entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le développement de la maladie. Pour ce faire, nous avons créé le modèle transgénique Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+, chez lequel les cellules de la granulosa présentant non seulement une désinhibition de la voie PI3K/AKT, mais aussi une suractivation de la voie WNT/CTNNB1. Tel que prédit, les souris Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ ont développé une forme de GCT beaucoup plus agressive que celle observée chez les femelles Ptenflox/flox;Amhr2cre/+. Spécifiquement, le développement des tumeurs se déclenchait plus tôt, leur croissance était beaucoup plus rapide, nous avons pu observer des métastases pulmonaires et la dissémination des cellules tumorales dans la cavité péritonéale, et la maladie était invariablement fatale avant l’âge de 8 semaines. Le modèle Ptenflox/flox;Ctnnb1flox (ex3)/+;Amhr2cre/+ a donc servi à démontrer l'existence d'une synergie entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le développement de la GCT. De façon inattendue, les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ ont aussi présenté un phénotype de sous-fertilité qui n’était pas d’origine ovarienne. Il a récemment été démontré que la souche Amhr2cre dirige l’expression de Cre non seulement aux cellules de la granulosa, mais aussi au stroma utérin et au myomètre. Le second objectif de ce travail était donc de démontrer si et comment le phénotype d’infertilité chez les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ pouvait découler d’un défaut utérin. Lors de l'implantation, les cellules du stroma utérin se différencient en cellules déciduelles pour former la décidua maternelle (DM), qui se régresse ensuite par apoptose afin de faciliter l’invasion des cellules trophoblastiques. De plus, la DM, en collaboration avec le tissu foetal, recrute des uNKs dont le rôle est de remodeler les artères spiralées pour augmenter l’apport sanguin maternel vers le foetus en développement. Nous avons pu démontrer que l'utérus des femelles gestantes Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ présentait une DM anormalement résistante à l'apoptose, moins de uNKs et des artères spiralées non-remodelées. Par conséquent, l’invasion des cellules du trophoblaste était restreinte, compromettant le développement et la survie de l'embryon. Nous avons donc établi pour la première fois l’importance de Pten lors de la décidualisation et de l’invasion du trophoblaste.

Identification de nouveaux partenaires protéiques des récepteurs couplés aux protéines G contrôlant leur transport du reticulum endoplasmique à la membrane plasmique

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande et la plus diversifiée des familles de protéines localisées à la surface cellulaire et responsables de la transmission de signaux à l’intérieur des cellules. D’intenses recherches effectuées au cours des trente dernières années ont mené à l’identification de dizaines de protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant la signalisation, la désensibilisation, l’internalisation et la dégradation de ces importantes cibles pharmacologiques. Contrairement aux processus régulant l’activité des récepteurs à partir de la membrane plasmique, les mécanismes moléculaires contrôlant la biosynthèse des RCPGs dans le reticulum endoplasmique (RE) et leur transport jusqu’à la surface cellulaire sont très peu caractérisés. Une meilleure compréhension de ces processus nécessite l’identification de la machinerie protéique responsable de la maturation des RCPGs. Un crible protéomique basé sur le transfert d’énergie de résonance de bioluminescence (BRET), qui permet la mesure d’interactions protéiques dans les cellules vivantes, a mené à l’identification de plusieurs nouvelles protéines localisées dans la voie de sécrétion et interagissant potentiellement avec les RCPGs. Ces protéines étant localisées dans les compartiments cellulaires (reticulum endoplasmique et appareil de Golgi) responsables de la synthèse, du repliement adéquat et du transport à la membrane plasmique des récepteurs, il est très probable qu’elles soient impliquées dans le contrôle de l’expression des RCPGs à la surface cellulaire. La caractérisation de l’homologue humain de cornichon 4 (CNIH4), un nouvel intéracteur des RCPGs identifié dans le crible, a démontré que cette protéine localisée dans les compartiments précoces de la voie de sécrétion (RE et ERGIC) interagit de façon sélective avec les RCPGs. De plus, la suppression de l’expression endogène de cette protéine préalablement non-caractérisée, diminue le transport à la membrane plasmique d’un récepteur, indiquant que CNIH4 influence positivement l’export des RCPGs du RE. Ceci est supporté par l’observation que la surexpression de CNIH4 à de faibles niveaux favorise la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE. Nous avons également pu démontrer que CNIH4 est associée à la protéine Sec23, une des composantes de l’enveloppe des vésicules COPII qui sont responsables du transport des protéines du RE vers le Golgi, suggérant que CNIH4 pourrait favoriser le recrutement des récepteurs dans ces vésicules. La surexpression de CNIH4 à de très hauts niveaux provoque également la rétention intracellulaire des récepteurs. Cet effet dominant négatif pourrait être causé par la titration d’un autre facteur d’export des RCPGs. Une deuxième étude a permis de révéler que la protéine transmembranaire 9 (TMEM9), un nouvel intéracteur des RCPGs également identifié dans le crible, interagit sélectivement avec les récepteurs et avec CNIH4. La surexpression de cette protéine aux fonctions précédemment inconnues, rétablit le transport normal d’un récepteur en présence de CNIH4 surexprimée. De plus, la co-expression de TMEM9 potentialise la capacité de CNIH4 à augmenter la maturation d’un récepteur mutant normalement retenu dans le RE, suggérant que ces deux protéines forment un complexe régulant la maturation des RCPGs. Au cours de cette thèse, de nouvelles protéines interagissant avec les RCPGs et contrôlant leur expression à la membrane plasmique ont donc été identifiées, permettant une meilleure compréhension des mécanismes régulant le transport des récepteurs du RE à la surface cellulaire.

Modulation of Endothelin-1 and Insulin-like Growth Factor Type 1-induced Signaling by Curcumin in A-10 Vascular Smooth Muscle Cells

Les maladies cardio-vasculaires (MCV), telles que l’hypertension et l’athérosclérose, s’accompagnent de modifications structurales et fonctionnelles au niveau vasculaire. Un fonctionnement aberrant de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires à l’origine de ces changements. L’endothéline-1 (ET-1) contribue à la pathogénèse des anomalies vasculaires, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, des composantes clés impliquées dans les voies prolifératives et de croissance cellulaires. Il a été suggéré que le stress oxydant jouerait un rôle intermédiaire dans les effets pathophysiologiques vasculaires de l’ET-1. En conséquence, une modulation de la signalisation induite par l’ET-1 peut servir comme éventuelle stratégie thérapeutique contre le développement des MCV. Il apparaît de nos jours un regain d’intérêt dans l’utilisation des agents phyto-chimiques pour traiter plusieurs maladies. La curcumine, constituant essentiel de l’épice curcuma, est dotée de plusieurs propriétés biologiques parmi lesquelles des propriétés anti-oxydantes, anti-prolifératrices et cardio-protectrices. Cependant, les mécanismes moléculaires de son effet cardio-protecteur demeurent obscurs. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’efficacité de la curcumine à inhiber la signalisation induite par l’ET-1 dans les CMLV. La curcumine a inhibé la phosphorylation des protéines IGF-1R, PKB, c-Raf et ERK1/2, induite par l’ET-1 et l’IGF-1. De plus, la curcumine a inhibé l’expression du facteur de transcription Egr-1 induite par l’ET-1 et l’IGF-1, dans les CMLV. Ces résultats suggèrent que la capacité de la curcumine à atténuer ces voies de signalisation serait un mécanisme d’action potentiel de ses effets protecteurs au niveau cardiovasculaire.

MAST3 : facteur de risque génétique aux maladies inflammatoires de l’intestin et modulateur d’inflammation

La maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (CU) sont des maladies inflammatoires chroniques du tube digestif qu’on regroupe sous le terme maladies inflammatoires de l’intestin (MII). Les mécanismes moléculaires menant au développement des MII ne sont pas entièrement connus, mais des études génétiques et fonctionnelles ont permis de mettre en évidence des interactions entre des prédispositions génétiques et des facteurs environnementaux - notamment la flore intestinale – qui contribuent au développement d’une dérégulation de la réponse immunitaire menant à l’inflammation de la muqueuse intestinale. Des études d’association pangénomiques et ciblées ont permis d’identifier plusieurs gènes de susceptibilité aux MII mais les estimations de la contribution de ces gènes à l’héritabilité suggèrent que plusieurs gènes restent à découvrir. Certains d’entre eux peuvent se trouver dans les régions identifiées par des études de liaison génétique. L’objectif de mon projet de doctorat était d’identifier un ou des facteurs de risque génétique dans la région chromosomale 19p (identifiée comme région de liaison IBD6) et de le/les caractériser au niveau fonctionnel. Nous avons d’abord entrepris une cartographie d’association de la région 19p. À la suite du génotypage successif de deux cohortes indépendantes, nous avons identifié un SNP intronique et quatre SNP codants dont un non-synonyme, rs8108738, tous localisés dans le gène microtubule associated serine threonine kinase gene-3 (MAST3) et associés aux MII. Peu d’information fonctionnelle sur MAST3 était disponible. Par contre MAST2, une protéine encodée par un gène de la même famille, régule l’activité du facteur de transcription inflammatoire NF-kappaB. Nous avons confirmé l’implication de MAST3 dans l’activité de NF-kappaB via un knockdown de MAST3 et des essais gène-rapporteur. Pour poursuivre la caractérisation fonctionnelle de MAST3, nous avons choisi une approche non ciblée pour étudier les effets de la variation des niveaux d’expression de MAST3 sur la cellule. C’est-à-dire que nous avons créé un 1er modèle cellulaire de surexpression du gène MAST3 dans les cellules HEK293 et analysé l’expression pangénomique endogène. La validation de l’expression génique dans un 2e modèle cellulaire de knockdown et de type cellulaire différent (THP1), nous a permis d’identifier et de contrer les effets non-spécifiques dus aux niveaux non-physiologiques. Notre étude d’expression a mené à l’identification d’un groupe de gènes dont l’expression est régulée par MAST3. Ces gènes sont majoritairement impliqués dans des fonctions immunitaires (cytokines pro-inflammatoires, régulateurs de NF-kappaB, migration cellulaire, etc.) et une forte proportion est régulée par NF-kappaB. Nous avons évalué l’importance du groupe de gènes régulés par MAST3 dans la présentation clinique des MII à travers des études d’expression dans des biopsies intestinales de patients atteints de CU. Nous avons constaté que l’expression de ces gènes est significativement supérieure dans les régions enflammées par rapport aux régions saines de la muqueuse intestinale des patients atteints de CU. Globalement, les résultats de nos études suggèrent que le facteur de risque aux MII MAST3 agit via la voie du facteur de transcription NF-kappaB pour influencer l’expression d’un groupe de gènes impliqués dans l’inflammation intestinale typique des MII. Chaque étude génétique sur les MII a le potentiel d’orienter les recherches fonctionnelles vers de nouvelles voies biologiques causales. Le dévoilement des mécanismes moléculaires sous-jacents à ces voies permet d’augmenter les connaissances sur le développement de ces maladies vers une compréhension plus complète de la pathogenèse qui permettra d’optimiser le diagnostic et le traitement de ces maladies.

Rôles et régulation du PI(4,5)P2 dans le remodelage cortical et la morphogénèse cellulaire en mitose

Doctorat réalisé en cotutelle avec le laboratoire de François Payre au Centre de Biologie du Développement à Toulouse, France (Université de Toulouse III - Paul Sabatier)

La protéine Nef du VIH-1 altère la fonction de Lck dans les thymocytes de souris transgéniques

La protéine Nef du VIH-1 joue un rôle important dans la pathogenèse du VIH-1 en modulant les voies de signalisation de la cellule hôte. La signalisation par le TcR est essentielle à la sélection positive pour générer les cellules simples positives (SP) CD4+ et simples positives (SP) CD8+, processus largement dépendant de l’activité de la Src kinase Lck et de son habileté à lier la queue cytoplasmique des corécepteurs CD4 et CD8. Nous avons précédemment trouvé que l’expression de Nef dans le VIH ou VIS peut induire une sévère déplétion des thymocytes et une baisse d’expression du corécepteur CD4 à la membrane. Nous avons également montré que Nef bloque la génération des thymocytes doubles positifs (DP) CD4+ CD8+ en plus d’altérer la transition des cellules DP vers CD4+ SP. Par contre, ce phénotype est récupérable par plusieurs approches dont le croisement d’une souris transgéniques exprimant Nef avec une souris exprimant la forme constitutivement active de Lck Y505F. Les résultats indiquent que la maturation des cellules CD4+ est altérée par le dysfonctionnement de la signalisation CD4-Lck. Toutefois, les mécanismes moléculaires par lesquels Nef contribue au bloc de la génération des cellules CD4+ dans le thymus demeurent très imprécis. Dans cette étude, en utilisant des approches biochimiques et de microscopie confocale, nous avons trouvé que les thymocytes transgéniques Nef+ expriment plus de Lck que les thymocytes Nef-. Malgré cette augmentation, une partie significative de Lck est incapable d’atteindre la membrane plasmique. Cette fraction était significativement accumulée dans un compartiment intracellulaire des thymocytes transgéniques exprimant Nef. Également, en utilisant la technique d’essai kinase in vitro, nous avons trouvé que l’activité kinase de Lck est significativement augmentée dans les thymocytes transgéniques mais demeure stable suite à une stimulation par un α-CD3ε + α-CD4. Également, comparativement aux thymocytes Nef-, la kinase Lck dans les thymocytes transgéniques était résistante à la dégradation suite à une stimulation. En examinant le statut de c-Cbl, le principal régulateur négatif de Lck, nous avons montré que c-Cbl colocalise faiblement avec Lck, malgré son hyperphosphorylation constitutive. Ceci pourrait expliquer l’échec de la dégradation de Lck. En plus, nous avons trouvé que suite à une stimulation par un α-CD3ε + α-CD4, la phosphorylation de Zap-70 en tyrosine 493 par Lck est diminuée, résultant d’une importante baisse de l’activité kinase de Zap-70 et d’un bloc des premiers évènements de la voie de signalisation par le TcR. Ces données indiquent que la signalisation CD4-Lck est interrompue par la présence de Nef.

Contribution différentielle du tissu adipeux mâle et femelle dans l’établissement du diabète de type 2 et des altérations cardiovasculaires : rôle de l’apport lipidique

Au cours des dernières années, il est devenu évident que les sociétés des pays industrialisés sont à haut risque de maladies métaboliques. Une alimentation riche en énergie (lipide/glucide), combinée à une sédentarité accrue, est un facteur environnemental contribuant à l'augmentation de la prévalence de maladies reliées spécifiquement à des troubles endocriniens comme l'obésité et le diabète. Le traitement de ces désordres métaboliques doit donc passer par la connaissance et la compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent ces désordres et le développement de traitements ciblés vers les facteurs responsables. Le tissu adipeux est une glande endocrine qui sécrète des substances, regroupées sous le terme d'adipokines, qui contrôlent l'homéostasie énergétique. L'augmentation de la masse adipeuse est responsable du développement de dérégulation hormonale qui mène à des dysfonctions physiologiques et métaboliques. Pour contrecarrer le développement démesuré du tissu adipeux, la signalisation insulinique ainsi que l’apport énergétique, responsables de la différenciation adipocytaire, doivent être inhibés. In vivo, la leptine, adipokine dont la concentration est corrélée à la masse adipeuse, présente des actions pro ou anti-insuliniques dans l’organisme pour réguler ce phénomène. Elle favorise l’effet inhibiteur de l’insuline sur la synthèse hépatique de glucose alors qu’elle s’oppose à son action sur l’expression des enzymes glucokinase et phosphoénol-pyruvate carboxykinase. La leptine influence aussi le taux circulant de triglycérides en diminuant sa concentration plasmatique. D'autre part, l'adiponectine, adipokine insulino- sensibilisante, voit sa sécrétion diminuée avec la prise de poids. La sensibilité à l'insuline est ainsi diminuée au fur et à mesure que le débalancement de ces deux adipokines s'accentue. La résistance à l'insuline s'installe alors pour s'opposer au stockage énergétique et à la prise illimitée de poids et la glycémie augmente. L'augmentation du glucose sanguin stimule la sécrétion d'insuline au niveau des cellules pancréatiques. C'est le diabète caractérisé par une hyperglycémie et une résistance à l'insuline. Le diabète, une des premières causes de mortalité dans le monde, est plus répandu sous sa forme non insulinodépendante (diabète de type 2, DT2) liée à l'obésité. Récemment, différents facteurs de transcription ont été identifiés comme régulateurs de l'expression d'une panoplie de gènes impliqués dans le métabolisme glucidique et lipidique. Parmi eux, les récepteurs des inducteurs de la prolifération des peroxysomes (PPAR, Peroxisome Proliferator-Activated Receptor), appartenant à la famille des récepteurs nucléaires. Les PPAR ont été démontrés comme ayant un rôle central dans le contrôle de la transcription des gènes codants pour des protéines impliquées dans le métabolisme : les adipokines. PPARg, en plus de son implication dans le contrôle de l'homéostasie glucidique et lipidique, est reconnu comme étant un facteur de transcription pivot régulant l'adipogenèse du fait de son expression majeure dans le tissu adipeux. D'autre part, il est bien établi maintenant que l'obésité et le diabète sont des facteurs contribuant au développement du processus inflammatoire vasculaire caractéristique de l’athérosclérose. En effet, les cellules endothéliales et musculaires lisses, principales composantes de la média de l’artère, sont très sensibles aux altérations métaboliques. Une diminution de la sensibilité à l’insuline entraine une réduction de la disponibilité du glucose et l’utilisation des acides gras comme alternatif par ces cellules. Ceci induit l’accumulation des acides gras oxydés dans l’intima et leur filtration dans la média pour former un core lipidique. Bien que l’induction de la dysfonction endothéliale soit impliquée très précocement, certaines études pointent l’accumulation lipidique dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CML) et leur dysfonction comme déclencheurs de l’athérosclérose. Ce travail visait donc, dans un premier temps, à développer un modèle d'altérations métaboliques liées à la modulation de l'activité du tissu adipeux via une alimentation riche en lipides. Dans un second temps, cette étude tentait d'évaluer l’impact des adipocytes de souris sur les CML vasculaires et sur la modulation de leurs fonctions dans ce modèle d'altérations métaboliques et DT2 liés à l'alimentation et à l'obésité. Ainsi, par le biais de deux diètes pauvres en cholestérol à profil lipidique différent, nous avons développé un modèle murin présentant divers stades d'altérations du métabolisme allant jusqu'au DT2 en lien avec l'obésité chez les mâles et chez les femelles. D’autre part, des signes de cardiomyopathie ainsi qu’une modulation du taux des adipokines sont reliés à ces mêmes diètes. Parallèlement, l’activité de PPAR!2 est modulée chez les souris sous diètes enrichies en gras. Ensuite, nous avons démontré que les adipocytes, provenant de souris alimentées avec une diète enrichie en gras, modulaient la migration et la prolifération des CML comparativement au groupe contrôle. Ces modulations dépendaient en grande partie de la nature de la diète consommée, mais également du sexe de la souris. Par ailleurs, les altérations fonctionnelles des CML, couplées à des modulations géniques, sont associées aux changements du profil de sécrétion des adipokines mesurées chez les adipocytes. L’ensemble de ces travaux suggère une action directe de la nature de la stimulation du tissu adipeux blanc dans la modulation du profil de sécrétion des adipokines et l'induction du DT2 in vivo. Ces altérations de la physiologie adipocytaire se reflètent in vitro où le tissu adipeux contribue aux altérations physiopathologiques des CML liées au DT2. Ainsi, cette étude est l'une des premières à établir un lien direct entre les modulations adipocytaires et les effets de leurs sécrétions sur la physiologie des CML. Ces observations peuvent être exploitées cliniquement dans un développement futur d’outils thérapeutiques visant à prévenir et à traiter les troubles métaboliques et le DT2, en ciblant le tissu adipeux comme entité métabolique et endocrine.

Rôles du stress du réticulum endoplasmique et de l'immunité innée dans l'inhibition de la transcription du gène de l'insuline : étude du facteur de transcription ATF6 et du récepteur TLR4

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance des tissus périphériques à l’action de l’insuline et par une insuffisance de la sécrétion d’insuline par les cellules β du pancréas. Différents facteurs tels que le stress du réticulum endoplasmique (RE) et l’immunité innée affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Toutefois, leur implication dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline demeure imprécise. Le but de cette thèse était d’identifier et de caractériser le rôle du stress du RE et de l’immunité innée dans la régulation de la transcription du gène de l’insuline. Les cellules β-pancréatiques ont un RE très développé, conséquence de leur fonction spécialisée de biosynthèse et de sécrétion d’insuline. Cette particularité les rend très susceptible au stress du RE qui se met en place lors de l’accumulation de protéines mal repliées dans la lumière du RE. Nous avons montré qu’ATF6 (de l’anglais, activating transcription factor 6), un facteur de transcription impliqué dans la réponse au stress du RE, lie directement la boîte A5 de la région promotrice du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans isolés de rat. Nous avons également montré que la surexpression de la forme active d’ATF6α, mais pas ATF6β, réprime l’activité du promoteur de l’insuline. Toutefois, la mutation ou l’absence de la boîte A5 ne préviennent pas l’inhibition de l’activité promotrice du gène de l’insuline par ATF6. Ces résultats montrent qu’ATF6 se lie directement au promoteur du gène de l’insuline, mais que cette liaison ne semble pas contribuer à son activité répressive. Il a été suggéré que le microbiome intestinal joue un rôle dans le développement du DT2. Les patients diabétiques présentent des concentrations plasmatiques élevées de lipopolysaccharides (LPS) qui affectent la fonction de la cellule β-pancréatique. Nous avons montré que l’exposition aux LPS entraîne une réduction de la transcription du gène de l’insuline dans les îlots de Langerhans de rats, de souris et humains. Cette répression du gène de l’insuline par les LPS est associée à une diminution des niveaux d’ARNms de gènes clés de la cellule β-pancréatique, soit PDX-1 (de l’anglais, pancreatic duodenal homeobox 1) et MafA (de l’anglais, mammalian homologue of avian MafA/L-Maf). En utilisant un modèle de souris déficientes pour le récepteur TLR4 (de l’anglais, Toll-like receptor), nous avons montré que les effets délétères des LPS sur l’expression du gène de l’insuline sollicitent le récepteur de TLR4. Nous avons également montré que l’inhibition de la voie NF-kB entraîne une restauration des niveaux messagers de l’insuline en réponse à une exposition aux LPS dans les îlots de Langerhans de rat. Ainsi, nos résultats montrent que les LPS inhibent le gène de l’insuline dans les cellules β-pancréatiques via un mécanisme moléculaire dépendant du récepteur TLR4 et de la voie NF-kB. Ces observations suggèrent ainsi un rôle pour le microbiome intestinal dans la fonction de la cellule β du pancréas. Collectivement, ces résultats nous permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la répression du gène de l'insuline en réponse aux divers changements survenant de façon précoce dans l’évolution du diabète de type 2 et d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles qui permettraient de prévenir ou ralentir la détérioration de l'homéostasie glycémique au cours de cette maladie, qui affecte plus de deux millions de Canadiens.

Identification et caractérisation des cibles transcriptionnelles de ETV6, un facteur de transcription impliqué dans la leucémie de l’enfant.

La leucémie lymphoblastique aiguë (LLA) est responsable d’environ 25% de l’ensemble des cancers pédiatriques. Chez 85% des enfants diagnostiqués, la LLA entraîne une prolifération massive et incontrôlée de lymphocytes immatures de type précurseurs B dans la moelle osseuse (LLA pré-B). Des avancées intéressantes ont été faites au cours des trente dernières années et ont mené à une augmentation de l’efficacité des traitements thérapeutiques. Plus de 80% des enfants atteints de LLA seront guéris de cette maladie. Malheureusement, ces traitements manquent de spécificité à cause du manque de connaissances sur les mécanismes moléculaires impliqués durant l’initiation et le développement de la LLA pré-B pédiatrique. En d’autres termes, nous connaissons peu de chose sur l’étiologie de cette maladie. Plus de 25% des enfants atteints de la LLA pré-B présentent la translocation chromosomique t(12;21)(p13;q22) qui implique les gènes ETV6 et AML1. Celle-ci est formée in utero et mène à l’expression de la protéine chimère transcriptionnelle ETV6-AML1, dont la présence seule ne suffit pas au développement de la LLA pré-B. Ainsi, d’autres événements génétiques sont nécessaires au développement de cette leucémie. La délétion de l’allèle résiduel de ETV6 est un événement génétique fréquemment rencontré au moment du diagnostic de la LLA pré-B t(12;21)+. Cette délétion entraîne l’inactivation complète de ETV6 dans les lymphocytes pré-B leucémiques. ETV6 est un répresseur transcriptionnel de la famille Ets. Mon hypothèse de recherche est que ETV6 agit comme gène suppresseur de tumeur dans la LLA pré-B pédiatrique. L’inactivation de ETV6 causerait une dérégulation de l’expression de ses cibles transcriptionnelles et, par le fait même, favoriserait l’initiation et le déroulement de la leucémogenèse pédiatrique. Dans le cadre de mon projet, comme peu de cibles transcriptionnelles de ETV6 sont connues, j’ai effectué des expériences d’immunoprécipitation de la chromatine et des essais luciférases qui ont permis d’identifier six nouvelles cibles transcriptionnelles: TP53 (p53 et Δ133p53), SPHK1, IL-18, PTGER4 et LUM. J’ai démontré que la régulation transcriptionnelle médiée par ETV6 requiert la présence de ses deux domaines fonctionnels: PNT (interactions protéiques) et ETS (liaison à l’ADN). Ces domaines favorisent la reconnaissance d’un site EBS consensus dans une région située près du promoteur de base. Ce mécanisme peut dépendre du promoteur régulé par ETV6, mais également du contexte cellulaire. Des études fonctionnelles réalisées sur des lymphocytes pré-B leucémiques ont permis de mesurer l’impact de la dérégulation de l’expression des cibles transcriptionnelles de ETV6 sur trois voies biologiques: la prolifération cellulaire, l’apoptose induite par un stress génotoxique et la migration cellulaire dirigée par la voie de signalisation CXCL12/CXCR4. Ceci a permis de démontrer l’implication des gènes SPHK1, IL-18 et PTGER4 durant la leucémogenèse pédiatrique. Cette étude est une des premières à suggérer le rôle de ETV6 comme gène suppresseur de tumeur dans la LLA pré-B pédiatrique. Suite à l’inactivation du répresseur transcriptionnel ETV6, l’augmentation de l’expression de ses cibles transcriptionnelles favoriserait la prolifération et la survie des lymphocytes pré-B leucémiques dans la moelle osseuse. L’identification de nouveaux gènes impliqués dans le développement de la LLA pré-B pédiatrique ouvre la porte au développement de nouveaux traitements thérapeutiques qui pourront présenter une meilleure spécificité envers l’étiologie de la maladie.

Caractérisation des complexes ribonucléoprotéiques de Staufen1 et Staufen2

Dans la cellule, chaque ARNm se doit d’être régulé finement au niveau transcriptionnel, bien entendu, mais également au niveau de sa traduction, de sa dégradation ainsi que de sa localisation intracellulaire, et ce, afin de permettre l’expression de chaque produit protéique au moment et à l’endroit précis où son action est requise. Lorsqu’un mécanisme physiologique est mis de l’avant dans la cellule, il arrive souvent que plusieurs ARNm se doivent d’être régulés simultanément. L’un des moyens permettant d’orchestrer un tel processus est de réguler l’action d’une protéine commune associée à chacun de ces ARNm, via un mécanisme post-traductionnel par exemple. Ainsi l’expression d’un groupe précis d’ARNm peut être régulée finement dans le temps et dans l’espace selon les facteurs protéiques auxquels il est associé. Dans l’optique d’étudier certains de ces complexes ribonucléoprotéiques (mRNP), nous nous sommes intéressés aux isoformes et paralogues de Staufen, une protéine à domaine de liaison à l’ARN double-brin (dsRBD) impliquée dans de nombreux aspects de la régulation post-transcriptionnelle, tels la dégradation, la traduction ou encore la localisation d’ARNm. Chez la drosophile, un seul gène Staufen est exprimé alors que chez les mammifères, il existe deux paralogues de la protéine, soit Stau1 et Stau2, tous deux possédant divers isoformes produits suite à l’épissage alternatif de leur gène. Stau1 et Stau2 sont identiques à 50%. Les deux isoformes de Stau2, Stau259 et Stau262 ne diffèrent qu’en leur extrémité N-terminale. En effet, alors que Stau259 arbore un dsRBD1 tronqué, celui de Stau262 est complet. Ces observations introduisent une problématique très intéressante à laquelle nous nous sommes attaqué : ces différentes protéines, quoique très semblables, font-elles partie de complexes ribonucléoprotéiques distincts ayant des fonctions propres à chacun ou, au contraire, vu cette similarité de séquence, travaillent-elles de concert au sein des mêmes complexes ribonucléoprotéiques? Afin d’adresser cette question, nous avons entrepris d’isoler, à partir de cellules HEK293T, les différents complexes de Stau1 et Stau2 par la technique d’immunoprécipitation. Nous avons isolé les ARNm associés à chaque protéine, les avons identifiés grâce aux micropuces d’ADN et avons confirmé nos résultats par RT-PCR. Malgré la présence d’une population commune d’ARNm associée à Stau1 et Stau2, la majorité des transcrits identifiés furent spécifiques à chaque orthologue. Cependant, nous avons remarqué que les diverses populations d’ARNm participaient aux mêmes mécanismes de régulation, ce qui suggère que ces deux protéines possèdent des rôles complémentaires dans la mise en œuvre de divers phénomènes cellulaires. Au contraire, les transcrits associés à Stau259 et Stau262 sont davantage similaires, indiquant que celles-ci auraient des fonctions plutôt semblables. Ces résultats sont très intéressants, car pour la première fois, nous avons identifié des populations d’ARNm associées aux isoformes Stau155, Stau259 et Stau262. De plus, nous les avons analysées en parallèle afin d’en faire ressortir les populations spécifiques à chacune de ces protéines. Ensuite, connaissant l’importance de Stau2 dans le transport dendritique d’ARNm, nous avons cherché à caractériser les complexes ribonucléoprotéiques neuronaux associés à celle-ci. Dans un premier temps et à l’aide de la technique d’immunoprécipitation, nous avons identifié une population d’ARNm neuronaux associés à Stau2. Plus de 1700 ARNm montraient une présence d’au moins huit fois supérieure dans le précipité obtenu avec l’anticorps anti-Stau2 par rapport à celui obtenu avec le sérum pré-immun. Ces ARNm codent pour des protéines impliquées dans des processus de modifications post-traductionnelles, de traduction, de transport intracellulaire et de métabolisme de l’ARN. De façon intéressante, cette population d’ARNm isolée du cerveau de rat est relativement différente de celle caractérisée des cellules humaines HEK293T. Ceci suggère que la spécificité d’association Stau2-ARNm peut diffèrer d’un tissu à un autre. Dans un deuxième temps, nous avons isolé les protéines présentes dans les complexes ribonucléoprotéiques obtenus de cerveaux de rat et les avons identifiées par analyse en spectrométrie de masse. De cette façon, nous avons identifié au sein des particules de Stau2 des protéines liant l’ARN (PABPC1, hnRNPH1, YB1, hsc70), des protéines du cytosquelette (α- et β-tubuline), de même que la protéine peu caractérisée RUFY3. En poussant davantage la caractérisation, nous avons établi que YB1 et PABPC1 étaient associées à Stau2 grâce à la présence de l’ARN, alors que la protéine hsc70, au contraire, interagissait directement avec celle-ci. Enfin, cette dernière association semble être modulable par l’action de l’ATP. Ce résultat offre de nombreuses possibilités quant à la régulation de la fonction de Stau2 et/ou de son mRNP. Entre autres, cette étude suggère un mécanisme de régulation de la traduction au sein de ces particules. Pour faire suite à la caractérisation des mRNP de Stau, nous avons voulu déterminer au niveau neurophysiologique l’importance de ceux-ci. Comme l’étude de Stau2 avait déjà été entreprise préalablement par un autre laboratoire, nous avons décidé de concentrer notre étude sur le rôle de Stau1. Ainsi, nous avons démontré que celle-ci était nécessaire à la mise en place d’une forme de plasticité synaptique à long terme, la forme tardive de potentialisation à long terme ou L-LTP, dépendante de la transcription et de l’activité des récepteurs NMDA. La transmission de base, de même que la faculté de ces épines à faire de la E-LTP, la forme précoce de potentialisation à long terme, et la dépression à long terme ou LTD sont conservées. Ceci indique que les épines conservent la capacité d’être modulées. Ainsi, l’inhibition de la L-LTP, suite à la sous-expression de Stau1, n’est pas simplement due à la perte d’éléments fonctionnels, mais réside plutôt dans l’incapacité de ceux-ci à induire les changements synaptiques spécifiquement nécessaires à la mise en place de la L-LTP. De plus, au niveau synaptique, la sous-expression de Stau1 réduit à la fois l’amplitude et la fréquence des mEPSC. Ces résultats concordent avec l’observation que la sous-expression de Stau1 augmente significativement la proportion d’épines allongées et filopodales, des épines formant des synapses dites silencieuses. Par le fait même, elle diminue le nombre d’épines fonctionnelles, de forme dite normale. Ainsi, nous avons été en mesure de démontrer que l’absence, au niveau neuronal, de la protéine Stau1 induisait un déficit probable dans la localisation et/ou la traduction d’ARNm responsable de la restructuration de l’épine et de facteurs nécessaires à la mise en place de la L-LTP. En conclusion, nous avons participé à lever le voile sur la composition et l’importance des complexes ribonucléoprotéiques de Stau1 et Stau2. Nous avons identifié des populations distinctes et communes d’ARNm associées aux différents isoformes de Stau, à partir des mRNP présents au sein des cellules HEK293. De plus, nous avons réussi à mettre à l’avant plan certaines composantes des mRNP neuronaux de Stau2, dont un partenaire protéique direct, hsc70, partenaire dont l’association est modulable par l’action de l’ATP, ainsi qu’une population neuronale de transcrits d’ARNm. Enfin, nous avons mis en lumière l’importance de Stau1 dans la morphologie des épines dendritiques ainsi que dans le phénomène de la plasticité synaptique.