Etudes structurales et fonctionnelles des interactions de SUMO avec des proteines d'echafaudage modeles: TIF1beta, PIAS1 et PML

L’adaptation des cellules à leur environnement externe repose sur la transduction adéquate de signaux régulés par une pléthore d'événements moléculaires. Parmi ces événements moléculaires, les modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines aident à intégrer, à traduire et à organiser de façon spatiotemporelle ces signaux pour que les cellules puissent réagir aux stimuli externes. Parmi les modifications post-traductionnelles, les petites protéines de la famille de l’Ubiquitine (Ublps, Ubiquitin-like proteins) jouent un rôle majeur dans presque toutes les voies de signalisation. Cette thèse rapporte des études fonctionnelles et structurales des interactions covalentes et non covalentes entre SUMO (Small Ubiquitin related MOdifier), un membre de la famille des Ublps, et trois protéines d'échafaudage, TIF1beta, le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc, PIAS1, une ligase E3 pour SUMO et PML, un suppresseur de tumeur. La première étude rapporte l'identification et la caractérisation biochimique des sites de SUMOylation de TIF1beta. Nous avons déterminé que la modification covalente de six résidus lysine par SUMO est essentielle à l’activité de répression de la transcription induit par TIF1beta. En outre, nous présentons des évidences indiquant que la SUMOylation de TIF1 exige non seulement sa capacité à homo-oligomériser, mais est aussi positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB des protéines à doigts de zinc. Partant de ce constat, nous postulons que les protéines KRAB-multidoigt de zinc recrutent leur corépresseur TIF1betaà des gènes cibles, mais aussi accentuent son activité répressive grâce à l'augmentation de sa SUMOylation. Notre seconde étude révèle qu’en plus de réprimer la transcription en tant que MPT covalente, SUMO joue aussi un rôle important dans la répression en tant que partenaire non covalent d’interactions protéine-protéine. Nous avons montré que SUMO interagit simultanément avec deux enzymes de la machinerie de SUMOylation, l’unique enzyme de conjugaison E2, UBC9, et la ligase E3 PIAS1 au sein d’un complexe ternaire répresseur. En outre, nous révélons que la formation du complexe ternaire PIAS1:SUMO:UBC9 est modulée par le niveau de phosphorylation de résidus sérine juxtaposés à un motif d’interaction avec SUMO (SIM) dans PIAS1. Ainsi, SUMO agit comme un adaptateur spécifique qui stabilise les interactions UBC9 E2: E3 PIAS1. Partant de ce constat, nous proposons que les enzymes E2 et E3 des autres systèmes Ublps exploitent des mécanismes similaires dans le cadre de leur fonction Enfin, notre troisième étude explore la régulation des interactions non covalentes de SUMO par la phosphorylation. En utilisant une combinaison d'études in vivo et in vitro, nous démontrons que l'interaction entre SUMO1 et PML est régi par la phosphorylation dépendant de CK2 sur quatre résidus sérine de PML. Les structures cristallographiques des complexes PML-SIM:SUMO1 révèlent que les phospho-sérines de PML contactent des résidus de la région basique de SUMO1. Sachant que la kinase CK2 peut être induite par des kinases activables par le stress, ces résultats suggèrent que les interactions non-covalentes avec SUMO sont modulées par le stress cellulaire. Sur la base de cette constatation, nous postulons que des événements analogues affectent des protéines contenant des séquences SIM ciblées par CK2. En résumé, cette étude révèle qu’en plus de son rôle de MPT, SUMO peut fonctionner comme un adaptateur permettant des interactions spécifiques entre protéines tel que pour les enzymes E3 et E2.

La distribution des connaissances dans la gestion du risque : analyse des interactions dans le cadre du Comité de la protection civile de la Mairie de Tecoluca - Salvador

Le sujet de la gestion du risque m’a toujours interpelée, surtout après que j’ai vécu deux ouragans et un tremblement de terre dévastateurs au Salvador. Bien qu’on ait assez écrit sur le sujet en le reliant souvent aux changements climatiques, on ne sait pas comment les organisations gouvernementales et civiles vivent cette gestion du risque au quotidien. À partir d’une étude ethnographique de la Commission de la protection civile de la Mairie de Tecoluca au Salvador, j’observais les processus qui se mettent en place dans la recherche et l’analyse des facteurs structuraux causant les situations de vulnérabilité. Pour ce faire, j’adoptais une approche basée sur l’étude des interactions, mobilisant les théories de la cognition distribuée et de l’acteur réseau. Comme je le montre, la gestion du risque, vue comme un processus participatif, se caractérise, d’une part, par la coopération et la coordination entre les personnes et, d’autre part, par la contribution d’outils, de technologies, de documents et de méthodes contribuant à la détection de risques. Ceci exige la mobilisation de connaissances qui doivent être produites, partagées et distribuées entre les membres d’un groupe à travers les divers artéfacts, outils, méthodes et technologies qu’ils mobilisent et qui les mobilisent. À ce sujet, la théorie de la cognition distribuée permet d’explorer des interactions qui se produisent au sein d’un groupe de travail en se focalisant sur ce qui contribue à l’acte de connaitre, conçu comme une activité non pas seulement individuelle, mais surtout collective et distribuée. Par ailleurs, la théorie de l’acteur-réseau me permet, quant à elle, de montrer comment dans l’exécution de cette tâche (la gestion du risque), la contribution active d’acteurs non humains, tant en soi qu’en relations avec les acteurs humains, participe de l’activité de détection et de prévention du risque.

Interactions sociales et réseaux sociaux en économique : modélisation et estimation

Cette thèse comporte trois essais sur les interactions sociales en sciences économiques. Ces essais s’intéressent à la fois au côté théeorique qu’empirique des interactions sociales. Le premier essai (chapitre 2) se concentre sur l’étude (théorique et empirique) de la formation de réseaux sociaux au sein de petites économies lorsque les individus ont des préférences homophilique et une contrainte de temps. Le deuxième essai (chapitre 3) se concentre sur l’étude (principalement empirique) de la formation de réseau sociaux au sein de larges économies où les comportement d’individus très distants sont aproximativement indépendants. Le dernier essai (chapitre 4) est une étude empirique des effets de pairs en éducation au sein des écoles secondaires du Québec. La méthode structurelle utilisée permet l’identification et l’estimation de l’effet de pairs endogène et des effets de pairs exogènes, tout en contrôlant pour la présence de chocs communs.

Un outil d’évaluation neurocognitive des interactions humain-machine

De plus en plus de recherches sur les Interactions Humain-Machine (IHM) tentent d’effectuer des analyses fines de l’interaction afin de faire ressortir ce qui influence les comportements des utilisateurs. Tant au niveau de l’évaluation de la performance que de l’expérience des utilisateurs, on note qu’une attention particulière est maintenant portée aux réactions émotionnelles et cognitives lors de l’interaction. Les approches qualitatives standards sont limitées, car elles se fondent sur l’observation et des entrevues après l’interaction, limitant ainsi la précision du diagnostic. L’expérience utilisateur et les réactions émotionnelles étant de nature hautement dynamique et contextualisée, les approches d’évaluation doivent l’être de même afin de permettre un diagnostic précis de l’interaction. Cette thèse présente une approche d’évaluation quantitative et dynamique qui permet de contextualiser les réactions des utilisateurs afin d’en identifier les antécédents dans l’interaction avec un système. Pour ce faire, ce travail s’articule autour de trois axes. 1) La reconnaissance automatique des buts et de la structure de tâches de l’utilisateur, à l’aide de mesures oculométriques et d’activité dans l’environnement par apprentissage machine. 2) L’inférence de construits psychologiques (activation, valence émotionnelle et charge cognitive) via l’analyse des signaux physiologiques. 3) Le diagnostic de l‘interaction reposant sur le couplage dynamique des deux précédentes opérations. Les idées et le développement de notre approche sont illustrés par leur application dans deux contextes expérimentaux : le commerce électronique et l’apprentissage par simulation. Nous présentons aussi l’outil informatique complet qui a été implémenté afin de permettre à des professionnels en évaluation (ex. : ergonomes, concepteurs de jeux, formateurs) d’utiliser l’approche proposée pour l’évaluation d’IHM. Celui-ci est conçu de manière à faciliter la triangulation des appareils de mesure impliqués dans ce travail et à s’intégrer aux méthodes classiques d’évaluation de l’interaction (ex. : questionnaires et codage des observations).

Structural rules for the formation of backbone-backbone interactions between closely packed RNA double helices

Les interactions entre les squelettes sucre-phosphate de nucléotides jouent un rôle important dans la stabilisation des structures tertiaires de larges molécules d’ARN. Elles sont régies par des règles particulières qui gouverne leur formation mais qui jusque là demeure quasiment inconnues. Un élément structural d’ARN pour lequel les interactions sucre-phosphate sont importantes est le motif d’empaquetage de deux doubles hélices d’ARN le long du sillon mineur. Ce motif se trouve à divers endroits dans la structure du ribosome. Il consiste en deux doubles hélices interagissant de manière à ce que le squelette sucre-phosphate de l’une se niche dans le sillon mineur de l’autre et vice versa. La surface de contact entre les deux hélices est majoritairement formée par les riboses et implique au total douze nucléotides. La présente thèse a pour but d’analyser la structure interne de ce motif et sa dépendance de stabilité résultant de l’association optimale ou non des hélices, selon leurs séquences nucléotidiques. Il est démontré dans cette thèse qu’un positionnement approprié des riboses leur permet de former des contacts inter-hélices, par l’entremise d’un choix particulier de l’identité des pairs de bases impliquées. Pour différentes pairs de bases participant à ce contact inter-hélices, l’identité optimale peut être du type Watson-Crick, GC/CG, or certaines pairs de bases non Watson-Crick. Le choix adéquat de paires de bases fournit une interaction inter-hélice stable. Dans quelques cas du motif, l’identité de certaines paires de bases ne correspond pas à la structure la plus stable, ce qui pourrait refléter le fait que ces motifs devraient avoir une liberté de formation et de déformation lors du fonctionnement du ribosome.

Interactions médicamenteuses et réactions adverses aux soins intensifs: le rôle des sédatifs et des analgésiants

Les patients admis aux soins intensifs (SI) souffrent de comorbidités qui affectent leur pronostic. Deux problèmes sont potentiellement associés aux sédatifs et compliquent le séjour de 35 à 50% des malades : le délirium, un état confusionnel aigu; et le coma ‘iatrogénique’, une altération de la conscience induite pharmacologiquement. L’importance de l’association entre clinique et médicaments a un intérêt pour prévenir ces syndromes cliniques morbides. Nous voulions étudier le délirium et le coma iatrogénique, les doses administrées de midazolam et de fentanyl, leurs niveaux plasmatiques, les variantes génétiques de métabolisme et de transport et les facteurs inflammatoires et ce, chez 100 patients admis aux soins intensifs. Nos données soulignent l’importance des interactions médicamenteuses dans l’incidence du coma iatrogénique, et réfutent l’association entre les benzodiazépines et le délirium. Ces résultats clarifient la pathophysiologie du délirium, corroborent le manque d’association délirium-benzodiazépines avec un marqueur biologique, c.-à-d. les niveaux sériques, et ouvrent le débat quant aux agents les plus utiles pour traiter l’anxiété et le délirium. Finalement, plusieurs caractéristiques pharmacocinétiques des benzodiazépines administrées aux soins intensifs publiées récemment complètent les données de notre étude quant à la sédation en soins critiques. Un chapitre sur l’importance de la pharmacogénomique en soins intensifs et un débat publié quant au pro et con de l'utilisation des benzodiazépines aux SI, sont soumis en complément de l’étude clinique décrite ci-haut effectuée dans le cadre de cette maîtrise.

Étude de la dynamique des interactions des constituants du complexe de biosynthèse et d’insertion de la sélénocystéine dans la traduction des sélénoprotéines in vivo

Les sélénoprotéines sont des protéines auxquelles des sélénocystéines, soit le 21e acide aminé, sont incorporées durant leur traduction. Plus précisément, la sélénocystéine (Sec) est un dérivé métabolique de la sérine, mais structurellement équivalent à une cystéine dont on a remplacé l'atome de soufre par du sélénium. Elle se distingue des autres acides aminés puisqu’elle possède sa propre synthétase qui sert à convertir la sérine en Sec alors que le résidu est déjà fixé à l’ARNt. La position d’une Sec sur l’ARNm est indiquée par le codon UGA étant habituellement un signal STOP introduisant le concept de recoding. Grâce à une machinerie métabolique spécifique à l'ARNtSec et à la présence d’un SecIS (Selenocystein Insertion Sequence) sur l’ARNm, ce codon permet la présence d'une Sec dans la protéine. Il est connu que la synthèse débute avec l’acétylation de l’ARNt[Ser]Sec par la seryl-ARNt synthétase (SerRS) afin de donner la seryl-ARNt[Ser]Sec. Cette dernière est subséquemment phosphorylée par l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec kinase (PSTK) qui donnera l’O-phosphoséryl-ARNt[Ser]Sec. Par la suite, un complexe de plusieurs protéines et cofacteurs, agissant comme machinerie pour l’incorporation des Sec durant la traduction, s’associe avec l’ARNt[Ser]Sec puis l’ARNm et, finalement, les composantes du ribosome. Parmi ces protéines, SepSecS catalyse l’étape finale de la synthèse des Sec en convertissant le O-phosphoseryl-ARNt[Ser]Sec en selenocysteinyl-ARNt[Ser]Sec utilisant le sélénophosphate comme source de sélénium. Des études récentes montrent que l’association avec SECp43 serait nécessaire pour que SepSecS joue son rôle et soit ségrégée au noyau pour s’associer à la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines, soit le complexe moléculaire qui reconnaît le codon UGA. Parmi les protéines de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines que nous avons analysées, il y a eEFSec, RPL30, SPS2, SPS1, SBP2 et NSEP1. Nos résultats d’analyse de la dynamique de l’interaction entre les constituants de la machinerie de biosynthèse et d’incorporation des Sec, confirment plusieurs données de la littérature, mais remettent en question le modèle jusqu’à maintenant établi. Une meilleure compréhension de la dynamique des interactions entre ses constituants et la régulation de cette dynamique permet d’émettre des hypothèses quant au rôle de la machinerie de biosynthèse des sélénoprotéines et de l’importance de sa complexité. Nous avons analysé les interactions in vivo dans des cellules HEK293T au moyen de la technique de Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) en couplant, par un clonage moléculaire, les gènes de chacune des protéines d’intérêt avec des fragments des gènes de la protéine luciférase (hRluc). Nous avons ainsi réalisé une fusion en N-terminal et en C-terminal des fragments de luciférase pour chacune des protéines d’intérêt. Puis, nous avons analysé la dynamique des interactions avec les composantes de la machinerie de biosynthèse des Sec. D’autres travaux seront essentiels afin de bâtir sur les résultats présentés dans cette recherche.

Caractérisation structurale et fonctionnelle des interactions impliquant TFIIH et les domaines de transactivation viraux

Le facteur de transcription IIH (TFIIH) joue un rôle crucial dans la transcription et dans la réparation de l’ADN. La sous-unité Tfb1/p62 (levure et humain) de TFIIH interagit avec de nombreux facteurs de transcription (p53, NFκB, TFIIEα) et de réparation (Rad2/XPG and Rad4/XPC) (1). La majorité des interactions avec Tfb1/p62 requiert le domaine d’homologie à la Pleckstrin (PH) localisé dans la région N-terminal de la protéine (2, 3). Ce domaine PH forme des complexes avec des domaines de transactivation acide provenant de protéines cibles impliquées dans la transcription et la réparation de l’ADN. De récentes études ont montré que Tfb1/p62 est une cible pour les protéines virales telles que la protéine VP16 du virus de l’herpès simplex (HSV) de type 1, la protéine E1 du virus du papillome humain (VPH) et la protéine EBNA-2 du virus Epstein-Barr (EBV) (4, 5). Ces protéines virales interagissent avec la sous-unité Tfb1/p62 par un domaine de transactivation acide suggérant une interaction similaire à ce qui est observé chez les facteurs de transcription humains comme p53. Ce mémoire présente une caractérisation structurelle et fonctionnelle du complexe formé par la protéine virale EBNA2 et la protéine humaine Tfb1/p62. L’analyse est faite en utilisant le titrage calorimétrique isotherme (ITC), la résonance magnétique nucléaire (RMN) et une expérience de transactivation chez la levure. Cette étude amène une plus grande compréhension des protéines impliquées dans les maladies comme le lymphome de Burkitt et le lymphome de Hodgkin qui sont souvent associées à l’infection à l’EBV (revue dans (6)) et caractérise une cible potentielle pour un antiviral.

Interactions multimodales visuelles et tactiles dans l’espace

L’intégration de stimulations provenant de modalités sensorielles différentes nous offre des avantages perceptifs tels qu’une meilleure discrimination et une accélération des temps de réponse (TR) face aux évènements environnementaux. Cette thèse a investigué les effets de la position spatiale de stimulations visuelles et tactiles sur le gain de redondance (GR), qui correspond à une réduction du temps de réaction lorsque deux stimulations sont présentées simultanément plutôt qu’isolément. La première étude a comparé le GR lorsque les mêmes stimulations visuotactiles sont présentées dans une tâche de détection et une tâche de discrimination spatiale. Les stimulations étaient présentées unilatéralement dans le même hémichamp ou bilatéralement dans les hémichamps opposés. Dans la tâche de détection, les participants devaient répondre à toutes les stimulations, peu importe leur localisation. Les résultats de cette tâche démontrent que les stimulations unilatérales et bilatérales produisent un GR et une violation du modèle de course indissociables. Dans la tâche de discrimination spatiale où les participants devaient répondre seulement aux stimulations présentées dans l’hémichamp droit, les TR aux stimulations bilatérales étaient moins rapides. Nous n’avons pas observé de différence entre le GR maximal obtenu dans l’une ou l’autre des tâches de cette étude. Nous concluons que lorsque l’information spatiale n’est pas pertinente pour accomplir la tâche, les stimulations unilatérales et bilatérales sont équivalentes. La manipulation de la pertinence de l’information spatiale permet donc d’induire une altération du GR en fonction de la localisation des stimulations. Lors d’une seconde étude, nous avons investigué si la différence entre les gains comportementaux résultants de l’intégration multimodale et intramodale dépend de la configuration spatiale des stimulations. Les résultats montrent que le GR obtenu pour les conditions multimodales surpasse celui obtenu pour les stimulations intramodales. De plus, le GR des conditions multimodales n’est pas influencé par la configuration spatiale des stimulations. À l’opposé, les stimulations intramodales produisent un GR plus important iii lorsque les stimulations sont présentées bilatéralement. Nos résultats suggèrent que l’intégration multimodale et intramodale se distinguent quant au GR qu’ils produisent et quant aux conditions nécessaires à cette amélioration. La troisième étude examine le rôle du corps calleux (CC) dans l’observation du GR obtenu pour les stimulations multimodales et intramodales lorsque celles-ci sont présentées unilatéralement et bilatéralement. Quatre patients ayant une agénésie congénitale du corps calleux (AgCC) et un patient callosotomisé ont été comparés à des individus normaux dans une tâche de détection. Dans l’ensemble, les résultats suggèrent que le CC n’est pas nécessaire pour l’intégration interhémisphérique de stimulations multimodales. Sur la base d’études précédentes démontrant le rôle des collicules supérieurs (CS) dans l’intégration multimodale, nous concluons qu’en l’absence du CC, les bénéfices comportementaux résultants d’un traitement sous-cortical par les CS ne reflètent pas les règles d’intégration observées dans les études neurophysiologiques chez l’animal.

Étude structuro-fonctionnelle de SecP43 et caractérisation de ses interactions avec SepSecS et l’ARNtSec in vitro

Selenoproteins are proteins containing selenium in the form of the 21st amino acid, selenocysteine. Selenocysteine (Sec) is directly synthesized onto its cognate tRNA (tRNA[Ser]Sec or tRNASec) and inserted into selenoproteins co-translationally with the help of various cis- and trans-acting factors. Among those factors, SecP43 has been reported to possibly play an essential role in the methylation at the 2’-hydroxylribosyl moiety in the wobble position (Um34) of Sec-tRNA[Ser]Sec and consequently reduce the expression of glutathione peroxidase 1. SecP43 also called tRNASec-associated protein has also been reported to interact in with SepSecS and tRNASec in vivo and the targeted removal of one of these proteins affected the binding of the other to the Sec-tRNASec. The initial aim of the project was to solve the structure of SecP43 by means of x-ray crystallography. Secondly, we were interested in characterizing the interaction of the latter with some of the components of the selenocysteine insertion machinery. These factors are SepSecS and tRNASec. We were able to optimize the expression and the purification of soluble form of the human homologue of SecP43 and of SepSecS by using an adapted auto-induction protocol. This was a major challenge considering that full length SecP43 has not been expressed and purify to date. We did not succeed in crystallizing SecP43. Our failure to crystallize SecP43 is probably due to the fact that it is a partially folded protein as we were able to demonstrate by SAXS (Small Angle X-ray Scattering). The SecP43 envelope calculated by SAXS displayed a rod-shape like structure. In order to enhance the stability of SecP43 required for crystallization, binding affinity studies were conducted to characterize the interaction between SecP43, tRNASec and SepSecS. We did not detect an interaction between SecP43 and tRNASec by using EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) and gel filtration. We also could not detect an interaction between SecP43 and SepSecS using a cross-linking assay. In contrast, the tRNASec/SepSecS interaction was demonstrated by EMSA and the addition of SecP43 seemed to reduce the binding affinity. Therefore, SecP43 might induce a conformational change in SepSecS in the presence of tRNASec.

Is social phobia characterized by a distinct interpersonal pattern?

Traditionnellement, le construit de la phobie sociale a été défini selon une vision intrapersonnelle, en tant que trouble de l’anxiété. Une autre conception se propose de la définir d’un point de vue interpersonnel, comme un pattern global d’autoprotection. L’objectif principal de cette thèse est de tester des hypothèses tirées du modèle interpersonnel de la phobie sociale. Deux études, présentées sous forme d’articles, ont permis d’examiner si des patterns spécifiques d’autoprotection, tels que l’impuissance et la soumission, caractérisent le mode de fonctionnement des phobiques sociaux. Les études ont également évalué si l’autoprotection et l’anxiété sont interreliées. Pour la première étude, les patterns interpersonnels de 132 phobiques sociaux, évalués à l’aide d’une mesure dérivée du Circumplex interpersonnel, ont été comparés à ceux de 85 individus célibataires ayant une dysfonction sexuelle et 105 sujets normaux. La relation entre les patterns d’autoprotection, l’anxiété sociale, la détresse générale et le fonctionnement social a également été examinée chez les phobiques sociaux. La seconde étude a permis d’examiner l’évolution des patterns d’autoprotection ainsi que de l’anxiété sociale, de la détresse générale et du fonctionnement social, chez 85 phobiques sociaux à quatre moments : avant et après un traitement d’approche interpersonnelle, ainsi qu’aux relances de six mois et d’un an. L’étude a également comparé les participants en rémission et ceux satisfaisant les critères de la phobie sociale un an suivant la fin du traitement. Les résultats suggèrent que les patterns d’impuissance et de soumission sont caractéristiques de la phobie sociale. Plus précisément, ces patterns décrivent davantage les comportements des phobiques sociaux plutôt que ceux des groupes de comparaison. De plus, une réduction significative de l’autoprotection a été notée au post-traitement et maintenue jusqu’au suivi d’un an, surtout chez les participants en rémission.En outre, une relation entre l’autoprotection, l’anxiété sociale et la détresse générale a été mise en évidence chez les phobiques sociaux. Une amélioration de l’anxiété, de la détresse subjective et du fonctionnement social cohérente avec la dissolution des patterns d’autoprotection a également été obtenue au post-traitement. En conclusion, les résultats des deux études appuient une conception interpersonnelle de la phobie sociale.

Destins des S-RNases et interactions moléculaires dans le tube pollinique dans le cadre de l’auto-incompatibilité gamétophytique chez Solanum chacoense

L’auto-incompatibilité (AI) est une barrière reproductive prézygotique qui permet aux pistils d’une fleur de rejeter leur propre pollen. Les systèmes d’AI peuvent prévenir l’autofertilisation et ainsi limiter l’inbreeding. Dans l’AI gamétophytique, le génotype du pollen détermine son propre phénotype d’incompatibilité, et dans ce système, les déterminants mâles et femelles de l’AI sont codés par un locus multigénique et multi-allélique désigné le locus S. Chez les Solanaceae, le déterminant femelle de l’AI est une glycoprotéine stylaire extracellulaire fortement polymorphique possédant une activité ribonucléase et désignée S-RNase. Les S-RNases montrent un patron caractéristique de deux régions hypervariables (HVa et HVb), responsables de leur détermination allélique, et cinq régions hautement conservées (C1 à C5) impliquées dans l’activité catalytique ou la stabilisation structurelle de ces protéines. Dans ce travail, nous avons investigué plusieurs caractéristiques des S-RNases et identifié un nouveau ligand potentiel aux S-RNases chez Solanum chacoense. L’objectif de notre première étude était l’élucidation du rôle de la région C4 des S-RNases. Afin de tester l’hypothèse selon laquelle la région C4 serait impliquée dans le repliement ou la stabilité des S-RNases, nous avons généré un mutant dans lequel les quatre résidus chargés présents en région C4 furent remplacés par des résidus glycine. Cette protéine mutante ne s’accumulant pas à des niveaux détectables, la région C4 semble bien avoir un rôle structurel. Afin de vérifier si C4 est impliquée dans une liaison avec une autre protéine, nous avons généré le mutant R115G, dans lequel un acide aminé chargé fût éliminé afin de réduire les affinités de liaison dans cette région. Ce mutant n’affectant pas le phénotype de rejet pollinique, il est peu probable que la région C4 soit impliquée dans la liaison des S-RNases avec un ligand ou leur pénétration à l’intérieur des tubes polliniques. Enfin, le mutant K113R, dans lequel le seul résidu lysine conservé parmi toutes les S-RNases fût remplacé par un résidu arginine, fût généré afin de vérifier si cette lysine était un site potentiel d’ubiquitination des S-RNases. Toutefois, la dégradation des S-RNases ne fût pas inhibée. Ces résultats indiquent que C4 joue probablement un rôle structurel de stabilisation des S-RNases. Dans une seconde étude, nous avons analysé le rôle de la glycosylation des S-RNases, dont un site, en région C2, est conservé parmi toutes les S-RNases. Afin d’évaluer la possibilité que les sucres conjugués constituent une cible potentielle d’ubiquitination, nous avons généré une S11-RNase dont l‘unique site de glycosylation en C2 fût éliminé. Ce mutant se comporte de manière semblable à une S11-RNase de type sauvage, démontrant que l’absence de glycosylation ne confère pas un phénotype de rejet constitutif du pollen. Afin de déterminer si l’introduction d’un sucre dans la région HVa de la S11-RNase pourrait affecter le rejet pollinique, nous avons généré un second mutant comportant un site additionnel de glycosylation dans la région HVa et une troisième construction qui comporte elle aussi ce nouveau site mais dont le site en région C2 fût éliminé. Le mutant comportant deux sites de glycosylation se comporte de manière semblable à une S11-RNase de type sauvage mais, de manière surprenante, le mutant uniquement glycosylé en région HVa peut aussi rejeter le pollen d’haplotype S13. Nous proposons que la forme non glycosylée de ce mutant constitue un allèle à double spécificité, semblable à un autre allèle à double spécificité préalablement décrit. Il est intéressant de noter que puisque ce phénotype n’est pas observé dans le mutant comportant deux sites de glycosylation, cela suggère que les S-RNases ne sont pas déglycosylées à l’intérieur du pollen. Dans la dernière étude, nous avons réalisé plusieurs expériences d’interactions protéine-protéine afin d’identifier de potentiels interactants polliniques avec les S-RNases. Nous avons démontré que eEF1A, un composant de la machinerie de traduction chez les eucaryotes, peut lier une S11-RNase immobilisée sur résine concanavaline A. Des analyses de type pull-down utilisant la protéine eEF1A de S. chacoense étiquetée avec GST confirment cette interaction. Nous avons aussi montré que la liaison, préalablement constatée, entre eEF1A et l’actine est stimulée en présence de la S11-RNase, bien que cette dernière ne puisse directement lier l’actine. Enfin, nous avons constaté que dans les tubes polliniques incompatibles, l’actine adopte une structure agrégée qui co-localise avec les S-RNases. Ces résultats suggèrent que la liaison entre eEF1A et les S-RNases pourrait constituer un potentiel lien fonctionnel entre les S-RNases et l’altération du cytosquelette d’actine observée lors des réactions d’AI. Par ailleurs, si cette liaison est en mesure de titrer les S-RNases disponibles à l’intérieur du tube pollinique, ce mécanisme pourrait expliquer pourquoi des quantités minimales ou « seuils » de S-RNases sont nécessaires au déclenchement des réactions d’AI.

The study of RNA tertiary interactions in tRNA structure and function

Le rôle des deux paires de bases universelles inverse Hoogsteen U : A ( RHUAs ) présentent chez les ARNt standards , une dans la boucle T et l'autre dans le noyau de la forme en L , a été étudiée. Pour chacun des RHUAs , un criblage génétique spécialisé in vivo chez les bactéries , le système suppresseur ambre ( pour l'étude de la RHUA dans la boucle T ) et le système d'ARNt de la sélénocystéine ( tRNASec ) ( pour l'étude de la RHUA dans le noyau ) , ont été utilisé pour générer des variants fonctionnels à partir de multiples librairies combinatoires . Ces variants ont ensuite été séquencé et soumis à une analyse systématique qui comprend la modélisation informatique et un type d'analyse phylogénétique. Les résultats du système suppresseur ambre ont montré un ensemble de variants fonctionnels qui ne nécessitent pas le motif RHUA dans la boucle T et qui ont remplacé la méthode standard de l'interaction entre les boucles D et T avec une double hélice interboucle , ILDH . D'autres études ont abouti à la détermination d'un modèle In silico de l'alternative à la norme standard de la boucle T, sous le nom de type III . Les résultats du système tRNASec ont révélé que pour cette ARNt exceptionnel, l'absence de RHUA ( dans le noyau ) assure une flexibilité accrue qui est spécifiquement nécessaire pour la fonction de tRNASec . Ainsi, les ARNt standards , à la différence de tRNASec , avec la présence universelle de RHUA dans le noyau , a été naturellement sélectionnée pour être rigide . Pris ensemble, la RHUA joue un rôle essentiel dans la stabilisation des interactions tertiaires.

Searching for novel gene functions in yeast : identification of thousands of novel molecular interactions by protein-fragment complementation assay followed by automated gene function prediction and high-throughput lipidomics

La compréhension de processus biologiques complexes requiert des approches expérimentales et informatiques sophistiquées. Les récents progrès dans le domaine des stratégies génomiques fonctionnelles mettent dorénavant à notre disposition de puissants outils de collecte de données sur l’interconnectivité des gènes, des protéines et des petites molécules, dans le but d’étudier les principes organisationnels de leurs réseaux cellulaires. L’intégration de ces connaissances au sein d’un cadre de référence en biologie systémique permettrait la prédiction de nouvelles fonctions de gènes qui demeurent non caractérisées à ce jour. Afin de réaliser de telles prédictions à l’échelle génomique chez la levure Saccharomyces cerevisiae, nous avons développé une stratégie innovatrice qui combine le criblage interactomique à haut débit des interactions protéines-protéines, la prédiction de la fonction des gènes in silico ainsi que la validation de ces prédictions avec la lipidomique à haut débit. D’abord, nous avons exécuté un dépistage à grande échelle des interactions protéines-protéines à l’aide de la complémentation de fragments protéiques. Cette méthode a permis de déceler des interactions in vivo entre les protéines exprimées par leurs promoteurs naturels. De plus, aucun biais lié aux interactions des membranes n’a pu être mis en évidence avec cette méthode, comparativement aux autres techniques existantes qui décèlent les interactions protéines-protéines. Conséquemment, nous avons découvert plusieurs nouvelles interactions et nous avons augmenté la couverture d’un interactome d’homéostasie lipidique dont la compréhension demeure encore incomplète à ce jour. Par la suite, nous avons appliqué un algorithme d’apprentissage afin d’identifier huit gènes non caractérisés ayant un rôle potentiel dans le métabolisme des lipides. Finalement, nous avons étudié si ces gènes et un groupe de régulateurs transcriptionnels distincts, non préalablement impliqués avec les lipides, avaient un rôle dans l’homéostasie des lipides. Dans ce but, nous avons analysé les lipidomes des délétions mutantes de gènes sélectionnés. Afin d’examiner une grande quantité de souches, nous avons développé une plateforme à haut débit pour le criblage lipidomique à contenu élevé des bibliothèques de levures mutantes. Cette plateforme consiste en la spectrométrie de masse à haute resolution Orbitrap et en un cadre de traitement des données dédié et supportant le phénotypage des lipides de centaines de mutations de Saccharomyces cerevisiae. Les méthodes expérimentales en lipidomiques ont confirmé les prédictions fonctionnelles en démontrant certaines différences au sein des phénotypes métaboliques lipidiques des délétions mutantes ayant une absence des gènes YBR141C et YJR015W, connus pour leur implication dans le métabolisme des lipides. Une altération du phénotype lipidique a également été observé pour une délétion mutante du facteur de transcription KAR4 qui n’avait pas été auparavant lié au métabolisme lipidique. Tous ces résultats démontrent qu’un processus qui intègre l’acquisition de nouvelles interactions moléculaires, la prédiction informatique des fonctions des gènes et une plateforme lipidomique innovatrice à haut débit , constitue un ajout important aux méthodologies existantes en biologie systémique. Les développements en méthodologies génomiques fonctionnelles et en technologies lipidomiques fournissent donc de nouveaux moyens pour étudier les réseaux biologiques des eucaryotes supérieurs, incluant les mammifères. Par conséquent, le stratégie présenté ici détient un potentiel d’application au sein d’organismes plus complexes.

Psychopathie chez les individus non incarcérés et coopération dans un dilemme du prisonnier itératif

Au niveau interpersonnel, la psychopathie implique un manque de considération d’autrui pouvant se manifester par la tromperie, la manipulation et l’exploitation. La présente thèse a investigué la relation entre les caractéristiques psychopathiques d'individus non incarcérés et la tendance à coopérer dans un jeu du dilemme du prisonnier itératif. Un total de 85 hommes ont été recrutés via une annonce qui ciblait des traits de personnalité correspondant à des caractéristiques psychopathiques exprimées de façon non péjorative. Plusieurs méthodes ont été employées pour rejoindre les participants : 46 ont participés en personne après avoir répondu à une invitation affichée dans un journal local ainsi que sur des babillards à proximité d'une université; 39 ont complété l'étude sur Internet après avoir été recrutés via un site web de petites annonces. Chaque participant a répondu à un questionnaire incluant l’Échelle Auto-rapportée de Psychopathie (Levenson, Kiehl, & Fitzpatrick, 1995) et l’Échelle Auto-rapportée des Indicateurs de Psychopathie de l’Enfance et de l’Adolescence (Seto, Khattar, Lalumière, & Quinsey, 1997). Ils ont également complété une simulation informatique du dilemme du prisonnier itératif comprenant 90 essais. La simulation informatique utilisée pour évaluer les participants en personne ainsi que la version accessible par Internet ont été conçues et programmées spécifiquement pour la présente thèse. La simulation informatique incluait trois stratégies souvent associées au dilemme du prisonnier itératif : donnant-donnant, donnant-donnant-généreux et gagne/reste-perd/change. Les analyses préliminaires ont montré que les participants vus en personne et ceux rejoints par Internet ne différaient pas en termes de variables sociodémographiques, des caractéristiques psychopathiques, de la désirabilité sociale et des réponses au dilemme du prisonnier. Une régression multiple standard a indiqué que les mesures psychopathiques ne pouvaient pas prédire le nombre total de choix coopératifs dans le jeu. Par contre, une corrélation négative a été trouvée entre les caractéristiques interpersonnelles et affectives de la psychopathie et la coopération dans le premier tiers du jeu. De plus, les participants qui présentaient davantage de caractéristiques psychopathiques interpersonnelles et affectives avaient plus souvent réussi à exploiter l'ordinateur en dénonçant alors que la simulation informatique coopérait. Des analyses multi-niveaux ont exploré la contribution de variables au niveau de la décision et au niveau de l'individu dans la prédiction du choix de coopérer ou de dénoncer lors de chaque essai du jeu; les interactions entre ces variables ont aussi été considérées. Les résultats ont montré que les variables au niveau de la décision influençaient généralement plus fortement les chances de coopérer que les variables au niveau de l'individu. Parmi les mesures de la psychopathie, seulement les caractéristiques interpersonnelles et affectives ont montré une association significative avec les chances de coopérer; les interactions avec le premier choix effectué dans le jeu et le premier tiers du jeu étaient significatives. Ainsi, si un participant avait coopéré au premier essai, la présence de caractéristiques psychopathiques interpersonnelles et affectives était associée à une diminution de ses chances de coopérer par la suite. Aussi, durant les 30 premiers essais du jeu, la présence de caractéristiques psychopathiques interpersonnelles et affectives était associée à une diminution des chances de coopérer. La stratégie adoptée par la simulation informatique n'avait pas d'influence sur le lien entre les caractéristiques psychopathiques et la probabilité de coopérer. Toutefois, le fait de jouer contre donnant-donnant était associé à de plus fortes chances de coopérer d'un essai à l'autre pour l'ensemble des participants. Globalement, les résultats suggèrent que les hommes non incarcérés présentant des caractéristiques psychopathiques ne seraient pas nécessairement portés à choisir systématiquement la non-coopération. En fait, les caractéristiques interpersonnelles et affectives de la psychopathie ont semblé se traduire par une tendance à faire bonne impression au départ, tenter rapidement d'exploiter autrui en dénonçant, puis finir par coopérer. Cette tendance comportementale est discutée, ainsi que la pertinence d'utiliser le dilemme du prisonnier itératif et les analyses multi-niveaux pour étudier le comportement interpersonnel des psychopathes.