Effects of antihypertensive drugs in the differentiation and activation of human bone cells

O osso é um tecido metabolicamente ativo e a sua remodelação é importante para regular e manter a massa óssea. Esse processo envolve a reabsorção do material ósseo por ação dos osteoclastos e a síntese de novo material ósseo mediado pelos osteoblastos. Vários estudos têm sugerido que a pressão arterial elevada está associada a alterações no metabolismo do cálcio, o que leva ao aumento da perda de cálcio e da remoção de cálcio do osso. Embora as alterações no metabolismo ósseo sejam um efeito adverso associado a alguns fármacos antihipertensores, o conhecimento em relação a este efeito terapêutico ligado com os bloqueadores de canais de cálcio é ainda muito escasso. Uma vez que os possíveis efeitos no osso podem ser atribuídos à ação antihipertensiva dessas moléculas, ou através de um efeito direto nas atividades metabólicas ósseas, torna-se necessário esclarecer este assunto. Devido ao facto de que as alterações no metabolismo ósseo são um efeito adverso associado a alguns fármacos antihipertensores, o objetivo deste trabalho é avaliar o efeito que os bloqueadores dos canais de cálcio exercem sobre as células ósseas humanas, nomeadamente osteoclastos, osteoblastos e co-culturas de ambos os tipos celulares. Verificou-se que os efeitos dos fármacos antihipertensores variaram consoante o fármaco testado e o sistema de cultura usado. Alguns fármacos revelaram a capacidade de estimular a osteoclastogénese e a osteoblastogénese em concentrações baixas. Independentemente da identidade do fármaco, concentrações elevadas revelaram ser prejudiciais para a resposta das células ósseas. Os mecanismos intracelulares através dos quais os efeitos foram exercidos foram igualmente afetados de forma diferencial pelos diferentes fármacos. Em resumo, este trabalho demonstrou que os bloqueadores dos canais de cálcio utilizados possuem a capacidade de afetar direta- e indiretamente a resposta de células ósseas humanas, cultivadas isoladamente ou co-cultivadas. Este tipo de informação é crucial para compreender e prevenir os potenciais efeitos destes fármacos no tecido ósseo, e também para adequar e eventualmente melhorar a terapêutica antihipertensora de cada paciente.

Immune responses in Bathymodiolus azoricus upon Vibrio challenges : approaches to characterize mussel survival strategies and physiological adaptations in deep sea extreme environments

Tese de Doutoramento, Ciências do Mar, especialidade de Biologia Marinha, 18 de Dezembro de 2015, Universidade dos Açores.

Deteção eletroquímica da norfloxacina e trimetoprim em amostras de urina utilizando polímero molecularmente impresso modificado e grafeno

A norfloxacina e o trimetoprim são dois antibióticos antibacterianos usados para o tratamento de infeções urinárias, intestinais e respiratórias. A maioria dos fármacos exige uma dosagem que garanta os níveis de segurança e eficácia de atuação. A necessidade de dosear os medicamentos e os seus metabolitos é assim um controlo imperioso e em muitos casos regular no tratamento de um paciente. Neste trabalho desenvolveram-se dois sensores eletroquímicos para a deteção da norfloxacina (NFX) e do trimetoprim (TMP), usando como superfície de suporte o carbono vítreo. A busca de novos materiais que conferiram maior seletividade e sensibilidade aos sistemas de deteção e por outro lado apresentem menores riscos para o paciente quando usados em dispositivos que permitam uma análise point-of-care, é especialmente importante e pode ser uma parte crucial do processo de decisão clínica. Assim, os polímeros molecularmente impresos enquadram-se nesse perfil e o seu uso tem vindo a ser cada vez mais avaliado. A impressão molecular é uma tecnologia capaz de produzir polímeros que incorporam as moléculas do analito e que após remoção por solventes específicos, permitem dotá-los de locais específicos de reconhecimento estereoquímico. A seleção do pirrol como polímero molecularmente impresso (MIP) permitiu construir com sucesso os sensores para doseamento dos antibióticos. A fim de aumentar a sensibilidade do método incorporou-se grafeno na superfície do elétrodo. Este material tem vindo a ser largamente utilizado devido às suas propriedades: estrutura molecular, condutividade elétrica e aumento da superfície são algumas das características que mais despertam o interesse para a sua aplicação neste projeto. Os sensores desenvolvidos foram incorporados em sistemas eletroquímicos. Os métodos voltamétricos aplicados foram a voltametria cíclica, a voltametria de onda quadrada e ainda a impedância. As condições de análise foram otimizadas no que respeita à polimerização do pirrol (concentração do polímero, número de ciclos de eletropolimerização e respetivos potenciais aplicados, tempo de incubação, solvente de remoção do analito), ao pH da solução do fármaco, à gama de concentrações dos antibióticos e aos parâmetros voltamétricos dos métodos de análise. Para cada um dos antibióticos um elétrodo não-impresso foi também preparado, usando o procedimento de polimerização mas sem a presença da molécula do analito, e foi usado como controlo. O sensor desenvolvido para o trimetoprim foi usado no doseamento do fármaco em amostras de urina. As amostras foram analisadas sem qualquer diluição, apenas foram centrifugadas para remoção de proteínas e algum interferente. Os sensores construídos apresentaram comportamento linear na gama de concentrações entre 102 e 107 mol/L. Os resultados mostram boa precisão (desvios padrão inferiores a 11%) e os limites de deteção foram de 8,317 e 1,307 mol/L para a norfloxacina e o trimetoprim, respetivamente. Para validação do método foram ainda efetuados ensaios de recuperação tendo obtido valores superiores a 94%.

Characterization of the effects of antiepileptic drugs on bone metabolism: in vitro studies with human osteoblastic and osteoclastic cells

Bone is constantly being molded and shaped by the action of osteoclasts and osteoblasts. A proper equilibrium between both cell types metabolic activities is required to ensure an adequate skeletal tissue structure, and it involves resorption of old bone and formation of new bone tissue. It is reported that treatment with antiepileptic drugs (AEDs) can elicit alterations in skeletal structure, in particular in bone mineral density. Nevertheless, the knowledge regarding the effects of AEDs on bone cells are still scarce. In this context, the aim of this study was to investigate the effects of five different AEDs on human osteoclastic, osteoblastic and co-cultured cells. Osteoclastic cell cultures were established from precursor cells isolated from human peripheral blood and were characterized for tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) activity, number of TRAP+ multinucleated cells, presence of cells with actin rings and expressing vitronectin and calcitonin receptors and apoptosis rate. Also, the involvement of several signaling pathways on the cellular response was addressed. Osteoblastic cell cultures were obtained from femur heads of patients (25-45 years old) undergoing orthopaedic surgery procedures and were then studied for cellular proliferation/viability, ALP activity, histochemical staining of ALP and apoptosis rate. Also the expression of osteoblast-related genes and the involvement of some osteoblastogenesis-related signalling pathways on cellular response were addressed. For co-cultured cells, osteoblastic cells were firstly seeded and cultured. After that, PBMC were added to the osteoblastic cells and co-cultures were evaluated using the same osteoclast and osteoblast parameters mentioned above for the corresponding isolated cell. Cell-cultures were maintained in the absence (control) or in the presence of different AEDs (carbamazepine, gabapentin, lamotrigine, topiramate and valproic acid). All the tested drugs were able to affect osteoclastic and osteoblastic cells development, although with different profiles on their osteoclastogenic and osteoblastogenic modulation properties. Globally, the tendency was to inhibit the process. Furthermore, the signaling pathways involved in the process also seemed to be differently affected by the AEDs, suggesting that the different drugs may affect osteoclastogenesis and/or osteoblastogenesis through different mechanisms. In conclusion, the present study showed that the different AEDs had the ability to directly and indirectly modulate bone cells differentiation, shedding new light towards a better understanding of how these drugs can affect bone tissue.

Métodos "verdes" de produção de nanomateriais que promovem nanotecnologias sustentáveis

Trabalho Final de Mestrado para obtenção do grau de Mestre em Engenharia Química

Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas

RESUMO A Leptospirose é uma zoonose re-emergente causada por espiroquetídeos patogénicos do género Leptospira. Em Portugal, é reconhecida, desde 1931, como uma importante doença infecciosa humana, cuja notificação é obrigatória desde 1986 para todos os serovares. Porém, devido ao acentuado polimorfismo clínico e à dificuldade de um diagnóstico laboratorial especializado, esta patologia nem sempre é confirmada. Com efeito, o isolamento do agente é difícil e o método convencional de diagnóstico, baseado no teste serológico de referência TAM (Teste de Aglutinação Microscópica), não é muito sensível na primeira semana da doença. Assim, foram três os principais objectivos desta dissertação: actualizar o padrão epidemiológico da Leptospirose, após uma extensa revisão bibliográfica da doença (Capítulos 1 e 2); esclarecer os aspectos imunológicos relacionados com os marcadores antigénicos que mais influenciam a regulação da resposta humoral na infecção humana, em particular, em área endémica (Capítulo 3); e, por último, promover a identificação molecular de alguns isolados de Leptospira, avaliar o respectivo poder patogénico no modelo murino e contribuir para o diagnóstico precoce da doença humana (Capítulo 4). O primeiro dos temas investigados, com base no estudo retrospectivo de uma larga série de 4.618 doentes sintomáticos analisados representa uma caracterização única da epidemiologia da Leptospirose, em particular, na Região Centro do País, e nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), nos últimos 18 e 12 anos, respectivamente. Foram confirmados 1.024 (22%) casos, com uma distribuição média de 57 casos/ano, sendo a maior frequência no sexo masculino (67%). As áreas analisadas corresponderam à maioria das notificações em Portugal, com uma taxa de incidência média anual nas ilhas muito superior à registada no continente (11,1 vs 1,7/100.000 habitantes, respectivamente). Os adultos em idade activa (25-54 anos) foram os mais afectados, nos meses de Dezembro e Janeiro. A doença foi causada por serovares de nove serogrupos presuntivos de Leptospira interrogans sensu lato, com predomínio de Icterohaemorrhagiae, Pomona e Ballum, em cerca de 66% dos casos. A seropositividade da Leptospirose esteve associada às formas anictérica e ictérica da doença, sendo evidente uma elevada sub-notificação ( 20 casos/ano). Foram detectados e analisados os diversos factores de risco, verificando-se um risco elevado de transmissão em áreas geográficas onde a circulação dos agentes zoonóticos se processa em ciclos silváticos e/ou domésticos bem estabelecidos. Este estudo confirma que a incidência da Leptospirose em Portugal tem aumentado nos últimos anos, particularmente, nos Açores, onde a seropositividade elevada e a ocorrência de casos fatais confirmam esta patologia como um problema emergente de Saúde Pública. No âmbito do Capítulo 3, investigaram-se os aspectos imunológicos da Leptospirose humana na Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas Região Centro e nas ilhas de São Miguel e Terceira, caracterizando as proteínas e os lipopolissacáridos (LPS) envolvidos durante as fases aguda (estádio único) e tardia da doença (três estádios), através do follow-up serológico de 240 doentes com confirmação clínica e laboratorial de Leptospirose. Foram incluídos no estudo 463 soros, 320 (69%) dos quais, obtidos durante a fase de convalescença (até 6 anos após o início dos sintomas). Soros de dadores de sangue (n=200) e de doentes com outras patologias infecciosas (n=60) foram usados como controlos. As amostras foram testadas pela técnica de Western Blot com lisados de oito estirpes patogénicas pertencentes aos serogrupos mais prevalentes. O reconhecimento dos antigénios leptospíricos, nos quatro estádios evolutivos, resultou da detecção de reactividade específica anti-IgM e anti IgG, nos diferentes immunoblots. Detectaram-se cinco proteínas major (45, 35, 32, 25 e 22 kDa) comuns a todos os serovares. Os soros estudados com as estirpes dos serogrupos homólogos, previamente identificados pela TAM, reagiram contra as proteínas de 45, 32 e 22 kDa, conhecidas como LipL45, LipL32 e LpL21, respectivamente, sendo estes, os antigénios imunodominantes durante o período estudado, nas duas regiões geográficas. Os doentes açorianos mostraram, ainda, uma reactividade elevada contra os LPS, cujo significado é discutido face aos resultados negativos dos soros controlo para os marcadores referidos. Esta investigação indica, pela primeira vez, uma forte persistência da resposta humoral e o importante papel protector da LipL45, Lip32 e LipL21, anos após o início dos sintomas. Por último, procedeu-se à identificação de estirpes Portuguesas, isoladas de murinos e de um caso humano fatal (L. inadai), numa perspectiva polifásica de intervenção. Utilizaram-se três testes fenotípicos (testes de crescimento sob diferentes temperaturas e na presença de 8-azaguanina, a par de um teste de alteração morfológica induzida pela adição de NaCl 1M). Paralelamente, efectuaram-se ensaios de amplificação do gene rrs (16S ARNr) de Leptospira spp por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando um par de primers “universais” (331 pb) e um segundo par, que apenas amplifica o gene secY (285 pb) de estirpes patogénicas, para definição da identidade dos isolados em estudo. Da integração dos resultados obtidos, confirmou-se que estes ocupam uma posição taxonómica “intermédia” entre as leptospiras saprófitas e as patogénicas. Desenvolveu-se, ainda, uma investigação (complementar) “in vivo” do carácter taxonómico “intermédio” do referido isolado humano, por cultura e amplificação do respectivo ADN de tecidos de hamsters inoculados para o efeito. Esta metodologia molecular foi posteriormente utilizada, com sucesso, no diagnóstico precoce de doentes com Leptospirose, sendo uma mais-valia na confirmação laboratorial de infecção por Leptospira, na ausência de anticorpos específicos na fase inicial da doença.

Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em Áreas Endémicas

RESUMO A Leptospirose é uma zoonose re-emergente causada por espiroquetídeos patogénicos do género Leptospira. Em Portugal, é reconhecida, desde 1931, como uma importante doença infecciosa humana, cuja notificação é obrigatória desde 1986 para todos os serovares. Porém, devido ao acentuado polimorfismo clínico e à dificuldade de um diagnóstico laboratorial especializado, esta patologia nem sempre é confirmada. Com efeito, o isolamento do agente é difícil e o método convencional de diagnóstico, baseado no teste serológico de referência TAM (Teste de Aglutinação Microscópica), não é muito sensível na primeira semana da doença. Assim, foram três os principais objectivos desta dissertação: actualizar o padrão epidemiológico da Leptospirose, após uma extensa revisão bibliográfica da doença (Capítulos 1 e 2); esclarecer os aspectos imunológicos relacionados com os marcadores antigénicos que mais influenciam a regulação da resposta humoral na infecção humana, em particular, em área endémica (Capítulo 3); e, por último, promover a identificação molecular de alguns isolados de Leptospira, avaliar o respectivo poder patogénico no modelo murino e contribuir para o diagnóstico precoce da doença humana (Capítulo 4). O primeiro dos temas investigados, com base no estudo retrospectivo de uma larga série de 4.618 doentes sintomáticos analisados representa uma caracterização única da epidemiologia da Leptospirose, em particular, na Região Centro do País, e nas ilhas de São Miguel e Terceira (Açores), nos últimos 18 e 12 anos, respectivamente. Foram confirmados 1.024 (22%) casos, com uma distribuição média de 57 casos/ano, sendo a maior frequência no sexo masculino (67%). As áreas analisadas corresponderam à maioria das notificações em Portugal, com uma taxa de incidência média anual nas ilhas muito superior à registada no continente (11,1 vs 1,7/100.000 habitantes, respectivamente). Os adultos em idade activa (25-54 anos) foram os mais afectados, nos meses de Dezembro e Janeiro. A doença foi causada por serovares de nove serogrupos presuntivos de Leptospira interrogans sensu lato, com predomínio de Icterohaemorrhagiae, Pomona e Ballum, em cerca de 66% dos casos. A seropositividade da Leptospirose esteve associada às formas anictérica e ictérica da doença, sendo evidente uma elevada sub-notificação ( 20 casos/ano). Foram detectados e analisados os diversos factores de risco, verificando-se um risco elevado de transmissão em áreas geográficas onde a circulação dos agentes zoonóticos se processa em ciclos silváticos e/ou domésticos bem estabelecidos. Este estudo confirma que a incidência da Leptospirose em Portugal tem aumentado nos últimos anos, particularmente, nos Açores, onde a seropositividade elevada e a ocorrência de casos fatais confirmam esta patologia como um problema emergente de Saúde Pública. No âmbito do Capítulo 3, investigaram-se os aspectos imunológicos da Leptospirose humana na Aspectos da caracterização antigénica e molecular da Leptospirose em áreas endémicas Região Centro e nas ilhas de São Miguel e Terceira, caracterizando as proteínas e os lipopolissacáridos (LPS) envolvidos durante as fases aguda (estádio único) e tardia da doença (três estádios), através do follow-up serológico de 240 doentes com confirmação clínica e laboratorial de Leptospirose. Foram incluídos no estudo 463 soros, 320 (69%) dos quais, obtidos durante a fase de convalescença (até 6 anos após o início dos sintomas). Soros de dadores de sangue (n=200) e de doentes com outras patologias infecciosas (n=60) foram usados como controlos. As amostras foram testadas pela técnica de Western Blot com lisados de oito estirpes patogénicas pertencentes aos serogrupos mais prevalentes. O reconhecimento dos antigénios leptospíricos, nos quatro estádios evolutivos, resultou da detecção de reactividade específica anti-IgM e anti IgG, nos diferentes immunoblots. Detectaram-se cinco proteínas major (45, 35, 32, 25 e 22 kDa) comuns a todos os serovares. Os soros estudados com as estirpes dos serogrupos homólogos, previamente identificados pela TAM, reagiram contra as proteínas de 45, 32 e 22 kDa, conhecidas como LipL45, LipL32 e LpL21, respectivamente, sendo estes, os antigénios imunodominantes durante o período estudado, nas duas regiões geográficas. Os doentes açorianos mostraram, ainda, uma reactividade elevada contra os LPS, cujo significado é discutido face aos resultados negativos dos soros controlo para os marcadores referidos. Esta investigação indica, pela primeira vez, uma forte persistência da resposta humoral e o importante papel protector da LipL45, Lip32 e LipL21, anos após o início dos sintomas. Por último, procedeu-se à identificação de estirpes Portuguesas, isoladas de murinos e de um caso humano fatal (L. inadai), numa perspectiva polifásica de intervenção. Utilizaram-se três testes fenotípicos (testes de crescimento sob diferentes temperaturas e na presença de 8-azaguanina, a par de um teste de alteração morfológica induzida pela adição de NaCl 1M). Paralelamente, efectuaram-se ensaios de amplificação do gene rrs (16S ARNr) de Leptospira spp por PCR (Polymerase Chain Reaction), utilizando um par de primers “universais” (331 pb) e um segundo par, que apenas amplifica o gene secY (285 pb) de estirpes patogénicas, para definição da identidade dos isolados em estudo. Da integração dos resultados obtidos, confirmou-se que estes ocupam uma posição taxonómica “intermédia” entre as leptospiras saprófitas e as patogénicas. Desenvolveu-se, ainda, uma investigação (complementar) “in vivo” do carácter taxonómico “intermédio” do referido isolado humano, por cultura e amplificação do respectivo ADN de tecidos de hamsters inoculados para o efeito. Esta metodologia molecular foi posteriormente utilizada, com sucesso, no diagnóstico precoce de doentes com Leptospirose, sendo uma mais-valia na confirmação laboratorial de infecção por Leptospira, na ausência de anticorpos específicos na fase inicial da doença.

Interacção Parasita-Hospedeiro e susceptibilidade de Leishmania infantum a fármacos

RESUMO As leishmanioses são doenças causadas por um protozoário intracelular pertencente à ordem Kinetoplastida, da família Trypanosomatidae, do género Leishmania. Os parasitas são transmitidos aos hospedeiros vertebrados por dípteros pertencentes à sub-família Phlebotominae. Devido à inexistência de vacinas a quimioterapêutica continua a representar o único mecanismo de prevenção e controlo. Os fármacos de primeira linha para o tratamento da leishmaniose visceral continuam a ser os antimoniais pentavalentes e a anfotericina B (AMB). A AMB lipossómica está a ser cada vez mais utilizada como 1ª linha. O conhecimento do(s) mecanismo(s) utilizados pelos parasitas, responsáveis pela resistência, é fundamental de modo a permitir o desenvolvimento de novos fármacos anti-Leishmania que possam substituir e/ou complementar os fármacos existentes, de uma forma eficaz assim como contribuir para o desenvolvimento de metodologias para avaliar e monitorizar a resistência. Espera-se do modelo animal a reprodução da infecção na Natureza. Os modelos canino e murino têm ajudado na compreensão dos mecanismos responsáveis pela patogénese e pela resposta imunitária à infecção por Leishmania. Sendo o cão o principal hospedeiro da infecção por L. infantum e o principal reservatório doméstico da leishmaniose visceral humana, procedeu-se à caracterização da evolução da infecção experimental em canídeos de raça Beagle através da análise clínica, hematológica, histopatológica, parasitária, assim com através da resposta imunitária desenvolvida. As alterações hematológicas observadas foram as associadas à leishmaniose visceral: anemia, leucopenia, trombocitopenia com aumento das proteínas totais e da fracção gama-globulina, e diminuição da albumina. Histologicamente observou-se nos órgãos viscerais uma reacção inflamatória crónica, acompanhada por vezes da formação de granulomas ricos em macrófagos. Apesar de todos os animais terem ficado infectados (confirmado pela presença do parasita nos vários tecidos e órgãos recolhidos na necrópsia), os únicos sinais clínicos observados transitoriamente foram adenopatia e alopécia. As técnicas moleculares foram significativamente mais eficazes na detecção do parasita do que os métodos parasitológicos convencionais. As amostras não invasivas (sangue periférico e conjuntiva) mostraram ser significativamente menos eficazes na detecção de leishmanias. No nosso modelo experimental não se observou a supressão da resposta celular ao antigénio parasitário e confirmou-se que, apesar de não protectora, a resposta humoral específica é pronunciada e precoce. A bipolarização da resposta imunitária Th1 ou Th2, amplamente descrita nas infecções experimentais por L. major no modelo murino, não foram observadas neste estudo. O facto dos animais não evidenciarem doença apesar do elevado parasitismo nos órgãos viscerais poderá estar relacionado com a expressão simultânea de citocinas de ambos os tipos Th1 e Treg, no baço, fígado, gânglio, medula óssea e sangue periférico. Neste estudo também se caracterizou o efeito da saliva do vector Phlebotomus perniciosus na infecção experimental de murganhos BALB/c com estirpes de L. infantum selvagem e tratada com AMB, inoculadas por via intradérmica. A visceralização da infecção ocorreu após a utilização da via de administração do inóculo que mais se assemelha ao que ocorre na Natureza. Apesar da disseminação dos parasitas nos animais co-inoculados com extracto de uma glândula salivar ter sido anterior à do grupo inoculado apenas com parasitas, não se detectaram diferenças significativas na carga parasitária, entre os três grupos, ao longo do período de observação pelo que, embora a saliva do vector esteja descrita como responsável pela exacerbação da infecção, tal não foi observado no nosso estudo. O aumento de expressão de citocinas esteve relacionado com o aumento do parasitismo mas, tal como no modelo canino, não se observou bipolarização da resposta imunitária. Os animais dos três grupos infectados parecem ter desenvolvido nos diferentes órgãos uma resposta mista dos tipos Th1 e Th2/Treg. Contudo, verificou-se a predominância da expressão Th1 (TNF-α), no fim do período de observação, o que pode estar relacionado com a resolução da infecção. Por outro lado, a presença de parasitas na pele dos animais inoculados com a estirpe L. infantum tratada com AMB permite colocar a hipótese da existência de parasitas resistentes na Natureza e destes poderem ser transmitidos. Após se ter verificado que a estirpe de L. infantum tratada com AMB tinha a capacidade de infectar e visceralizar no modelo murino, analisou-se o seu comportamento em dois dos principais vectores de L. infantum, Lutzomyia longipalpis e P. perniciosus. Os parasitas tratados com AMB apresentaram uma menor capacidade de permanecerem no interior do vector assim como um desenvolvimento mais lento apontando para uma menor capacidade de transmissão das estirpes resistentes a este fármaco, pelo que o tratamento com AMB poderá ser favorável à prevenção e controlo através da interrupção do ciclo de vida do parasita. De modo a determinar in vitro a susceptibilidade de Leishmania aos diferentes fármacos utilizados na terapêutica da leishmaniose humana e canina (Glucantime®, Fungizone®, miltefosine e alopurinol) comparou-se o sistema de promastigotas axénicos com o sistema amatigota-macrófago. Verificou-se que, para as estirpes estudadas, os resultados de ambos os sistemas não apresentavam diferenças significativas sendo a utilização do primeiro mais vantajosa ao ser menos moroso e de mais fácil execução. Seleccionaram-se estirpes quimio-resistentes in vitro, por exposição prolongada a doses crescentes de AMB, tendo-se verificado que os parasitas tratados, apresentaram uma menor susceptibilidade do que os não tratados à acção dos fármacos estudados, com excepção do alopurinol. A diminuição da susceptibilidade das estirpes aos fármacos utilizados poderá facilitar a dispersão de parasitas multiresistentes. Sendo a apoptose um dos mecanismos utilizados pelos parasitas para evitar a indução de uma resposta imune por acção de compostos anti- Leishmania, determinou-se o número de amastigotas apoptóticos assim como a produção de TNF-α e IL-10 pelos macrófagos tratados. Concluiu-se que os compostos conseguiram suprimir a produção de IL-10, inibidora da activação dos macrófagos, contudo nem a produção da citocina pro-inflamatória TNF- α nem a apoptose pareceram ser os principais mecanismos responsáveis à sobrevivência dos parasitas ao contacto com os fármacos.

Desenvolvimento de Métodos de Extração de Resíduos de Antimicrobianos e Quantificação em Amostras Alimentares

O leite é um alimento complexo, pela sua composição rico em água, proteínas, lípidos, vitaminas e minerais. Devido ao seu alto valor nutricional é fundamental para a amamentação de crianças e animais em crescimento, pois fornece componentes fundamentais para o desenvolvimento e manutenção da saúde. Os antimicrobianos são amplamente utilizados como uma medida terapêutica no tratamento de infeções bacterianas, profilaxia e como promotores de crescimento (aditivos). A presença de resíduos de antimicrobianos no leite pode representar riscos para a saúde humana, como reações alérgicas em indivíduos hipersensíveis e resistências. Os objetivos deste estudo são o desenvolvimento de novos métodos de limpeza e de pré-concentração para amostras de leite, por meio de extração em fase sólida (SPE), com a finalidade de realizar uma melhor identificação e quantificação de antimicrobiana por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC). Todos os métodos desenvolvidos são de fácil execução, com taxas de recuperação dos agentes antimicrobianos viáveis, com uma percentagem de recuperação a partir de 85%. O método cromatográfico utilizado para a deteção e quantificação (HPLC-DAD) têm os limites de deteção (LD) entre 2.43ng / mL e 1.62ng / mL e os limites de quantificação (LQ) entre 7,36 ng / mL e 4.92 ng / mL, o que significa este método vai de encontro às diretrizes estipuladas pela União Europeia para os agentes antimicrobianos estudados. A combinação dos métodos propostos de limpeza e pré-concentração por SPE e multirresíduo por HPLC-DAD permite, por conseguinte, a deteção e quantificação de resíduos de antibióticos no leite, tornando esta uma alternativa importante e útil no processo de controlo de qualidade para a indústria de alimentos e outras área.

Effects of the Mediterranean diet and exercise in subjects with coronary artery disease

Introduction The association of the Mediterranean diet and exercise appears to have a protective role, reducing cardiovascular risk. This study investigated the effects of education sessions on the Mediterranean diet and an exercise program in modifying eating behaviors, body composition and abdominal fat. Methods An experimental study was performed on 20 subjects with known coronary heart disease randomly assigned to experimental (n=10) and control (n=10) groups. Both groups received education sessions on the Mediterranean diet, but the experimental group also followed an eight-week program of specific exercises. A semiquantitative food frequency questionnaire was administered to analyze food intake, bioimpedance was used to measure weight, fat mass and lean mass, and waist circumference was measured to calculate waist-to-height ratio. Results After eight weeks, protein (p<0.05) and cholesterol (p<0.05) intake in the experimental group had decreased significantly compared with the control group. Between the beginning and end of the study, there were significant decreases in the control group in carbohydrate (p<0.05) and saturated fat intake (p<0.05). In both groups the percentage of total fat (p<0.05) and fat mass (p<0.05) was significantly decreased. In the experimental group the waist-to-height ratio was significantly reduced (p<0.05). Conclusion The Mediterranean diet reduced carbohydrate and saturated fat intake, reflected in reduced fat mass. The association of the exercise program showed additional benefits in reduction of protein and cholesterol intake and abdominal fat.

Valorização da Borra de Café: Otimização da Produção de Biodiesel por Catálise Enzimática

O decréscimo das reservas de petróleo e as consequências ambientais resultantes do recurso a combustíveis fósseis nos motores a diesel têm levado à procura de combustíveis alternativos. Esta pesquisa alicerçada nas fontes de energia renovável tornou-se essencial, face à crescente procura de energia e ao limitado fornecimento de combustíveis fósseis . Resíduos de óleo de cozinha, gordura animal, entre outros resíduos de origem biológica, tais como a borra de café, são exemplos de matérias-primas para a produção de biodiesel. A sua valorização tem interesse quer pela perspetiva ambiental, quer pela económica, pois aumenta não só a flexibilidade e diversificação das matérias-primas, mas também contribui para uma estabilidade de custos e alteração nas políticas agrícolas e de uso do solo. É neste contexto que se enquadra o biodiesel e a borra de café, pretendendo-se aqui efetuar o estudo da produção, à escala laboratorial, de biodiesel a partir da borra de café, por transesterificação enzimática, visando a procura das melhores condições reacionais. Iniciando-se com a caracterização da borra de café, foram avaliados antes e após a extração do óleo da borra de café, diversos parâmetros, de entre os quais se destacam: o teor de humidade (16,97% e 6,79%), teor de cinzas (1,91 e 1,57%), teor de azoto (1,71 e 2,30%), teor de proteínas (10,7 e 14,4%), teor de carbono (70,2 e 71,7%), teor de celulose bruta (14,77 e 18,48%), teor de lenhina (31,03% e 30,97%) e poder calorifico superior (19,5 MJ/kg e 19,9 MJ/kg). Sumariamente, constatou-se que os valores da maioria dos parâmetros não difere substancialmente dos valores encontrados na literatura, tendo sido evidenciado o potencial da utilização desta biomassa, como fonte calorifica para queima e geração de energia. Sendo a caracterização do óleo extraído da borra de café um dos objetivos antecedentes à produção do biodiesel, pretendeu-se avaliar os diferentes parâmetros mais significativos. No que diz respeito à caracterização do óleo extraído, distingue-se a sua viscosidade cinemática (38,04 mm2/s), densidade 0,9032 g/cm3, poder calorífico de 37,9 kcal/kg, índice de iodo igual a 63,0 gI2/ 100 g óleo, o teor de água do óleo foi de 0,15 %, o índice de acidez igual a 44,8 mg KOH/g óleo, ponto de inflamação superior a 120 ºC e teor em ácidos gordos de 82,8%. Inicialmente foram efetuados ensaios preliminares, a fim de selecionar a lipase (Lipase RMIM, TL 100L e CALB L) e álcool (metanol ou etanol puros) mais adequados à produção de biodiesel, pelo que o rendimento de 83,5% foi obtido através da transesterificação mediada pela lipase RMIM, utilizando como álcool o etanol. Sendo outro dos objetivos a otimização do processo de transesterificação enzimática, através de um desenho composto central a três variáveis (razão molar etanol: óleo, concentração de enzima e temperatura), recorrendo ao software JMP 8.0, determinou-se como melhores condições, uma razão molar etanol: óleo 5:1, adição de 4,5% (m/m) de enzima e uma temperatura de 45 ºC, que conduziram a um rendimento experimental equivalente a 96,7 % e teor de ésteres 87,6%. Nestas condições, o rendimento teórico foi de 99,98%. Procurou-se ainda estudar o efeito da adição de água ao etanol, isto é, o efeito da variação da concentração do etanol pela adição de água, para teores de etanol de 92%, 85% e 75%. Verificou-se que até 92% decorreu um aumento da transesterificação (97,2%) para um teor de ésteres de (92,2%), pelo que para teores superiores de água adicionada (75% e 85%) ocorreu um decréscimo no teor final em ésteres (77,2% e 89,9%) e no rendimento da reação (84,3% e 91,9%). Isto indica a ocorrência da reação de hidrólise em maior extensão, que leva ao desvio do equilíbrio no sentido contrário à reação de formação dos produtos, isto é, dos ésteres. Finalmente, relativamente aos custos associados ao processo de produção de biodiesel, foram estimados para o conjunto de 27 ensaios realizados neste trabalho, e que corresponderam a 767,4 g de biodiesel produzido, sendo o custo dos reagentes superior ao custo energético, de 156,16 € e 126,02 €, respetivamente. Naturalmente que não esperamos que, a nível industrial os custos sejam desta ordem de grandeza, tanto mais que há economia de escala e que as enzimas utilizadas no processo deveriam ser reutilizadas diversas vezes.

New roles of Rab GTPases on eye diseases: targeting VEGF secretion

RESUMO: A retina é composta, entre outras estruturas, pelo epitélio pigmentar da retina (EPR)e pela coróide. A região central da retina denomina-se mácula, e é a zona mais afetada na degenerescência macular relacionada com a idade, a forma mais comum de degenerescência da retina. Nesta doença, a secreção de fatores de crescimento pelo EPR é afetada, nomeadamente a do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF), e pouco se sabe ainda sobre os mecanismos moleculares conducentes a esta condição. A família de proteínas Rab GTPases está envolvida nas vias intracelulares de sinalização e tráfego membranares, essenciais na transdução de sinais extracelulares em respostas biológicas. A sua crucial importância nestes mecanismos levou-nos a considerar o seu potencial envolvimento nas vias de secreção do VEGF, e a questionar-nos se teriam algum papel regulador sobre as mesmas. O principal objetivo deste trabalho é identificar Rab GTPases importantes para as vias de secreção e endocitose do VEGF no EPR. Essa identificação ajudará a esclarecer a patogénese da degenerescência macular da retina, e poderá servir para uma procura mais direcionada de novos agentes terapêuticos. A caracterização de dois modelos in vitro do EPR, células primárias isoladas de murganho e a linha celular B6-RPE07,levou-nos a concluir que são ambos semelhantes. Contudo, a linha celular foi escolhida como protótipo do EPR por permitir o acesso a um número ilimitado de células. No decurso deste trabalho, desenvolvemos e caracterizámos uma biblioteca de ferramentas moleculares que nos permitiram reduzir os níveis proteicos das proteínas Rab GTPases, com base na tecnologia de ácido ribonucleico (ARN) de interferência. O papel das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF no EPR foi estudado com base no silenciamento de apenas uma proteína, ou combinando várias, segundo a sua localização e funções intracelulares descritas. Este trabalho permitiu-nos concluir que as proteínas Rab GTPases são importantes intervenientes no processo de secreção de VEGF pelo EPR, e confirmar dados anteriores que relatam o envolvimento de algumas Rab GTPases endocíticas no processo. Propomos ainda um novo modelo para a interação destas proteínas no EPR, e sugerimos que a Rab10 e a Rab14 atuam negativamente sobre a Rab8, controlando o seu funcionamento. Os nossos resultados evidenciam a importância das proteínas Rab GTPases na secreção do VEGF pelas células do EPR, e servem de base a futuros estudos que melhor procurem compreender este mecanismo e de que modo a sua alteração se relaciona com a degenerescência da retina.--------ABSTRACT: Retinal pigment epithelium (RPE) and choroid are components of the mammalian retina, of which the central region is called macula. The most common form of retinaldegeneration, age-related macular degeneration (AMD), involves primarily deregulation of growth factors secretion by the RPE. Very little is known about the molecular mechanisms that lead to impairment of RPE’s homeostatic intracellular processes, namely the secretion of vascular endothelial growth factor (VEGF). Rab GTPases’ family regulates membrane targeting and traffic, being essential in the transduction of signal pathways. Given Rab proteins’ role in intracellular trafficking, we propose to identify key regulatory Rab proteins involved in either the secretory or the recycling pathways of VEGF in RPE. Understanding how Rab proteins’ function disruption could lead to retinal and choroidal pathology would ultimately contribute to find new therapeutic agents. Here, we characterized two mouse RPE in vitro cell models, primary cells and B6-RPE07 cell line, and concluded that both display important epithelial features as the RPE presents in vivo. Considering unlimited cell number and results reproducibility, we chose B6-RPE07 cells to further study Rab proteins’ function. To scrutinize the consequences of Rab proteins’ absence or diminished levels, we have developed novel molecular tools to achieve silencing of these key proteins using miRNA technology. We further addressed the effect of Rab proteins’ absence on VEGF secretion by performing an extensive screening where different Rab proteins were silenced, both individually and in multiple combinations considering their cellular/ compartment location. We conclude that Rab GTPases are important intervenients in VEGF secretion by RPE cells, confirming endocytic Rab proteins’ role in regulation of VEGF biology. We also propose a novel model for Rab proteins’ interaction in RPE. Our results suggest that Rab10 and Rab14 might influence Rab8 in a negative feedback mechanism, important for controlling VEGF secretion. Our achievements’ unravel Rab proteins’ role in VEGF secretion by RPE cells and are the basis for future studies to better understand RPE molecular secretory machinery.

Optimização da produção biológica de polihidroxialcanoatos por aplicação de processos de separação com membranas

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Química e Bioquímica

Caracterização bioquímica de metaloproteinases de parasitas tripanosomatídeos

A identificação e caracterização de processos mediados por metaloproteinases de uma grande variedade de eucariotas está a avançar rapidamente, tanto a nível molecular como celular – e os muitos papéis que as proteases desempenham nestes organismos estão a ser trazidas para o foco. As metaloproteinases de matriz executam tarefas de ―housekeeping” comuns a muitos organismos, bem como funcionam a um nível muito mais específico no ciclo de vida dos parasitas, por exemplo. Papéis pivotais foram propostos em diferentes processos, como invasão e egressão de células, enquistação e desenquistação, catabolismo de proteínas, diferenciação, progressão do ciclo celular, citoaderência, e ainda estimulação e evasão ao sistema imune. No presente estudo, é feito o reconhecimento e a caracterização de metaloproteinases de dois diferentes extractos de parasitas protozoários: Trypanosoma brucei brucei e Leishmania infantum. A classificação de metaloproteases foi obtida a partir da inibição diferencial da actividade destas proteases sobre diferentes substratos (gelatina e caseína), tendo sido efectuada uma prospecção de inibidores selectivos com potencial para serem empregues em novas estratégias de quimioterâpeutica contra estes agentes. Adicionalmente, é feito um estudo bioinformático sobre uma metaloproteinase comum aos parasitas aqui abordados, alargando o estudo a outros organismos relacionados. Os resultados obtidos demonstram a presença de metaloproteinases capazes de degradar proteínas de matriz em ambos os extractos estudados, sendo possível inibir a sua actividade com concentrações relativamente moderadas de inibidores. Além disso, sugerem que em todos os eventos patológicos abordados neste estudo, a presença de metaloproteinases activas é estável no seu ciclo de vida e provavelmente na progressão da patologia provocada pelos diferentes agentes em estudo. A análise de todos os resultados e observações poderá possivelmente levar à identificação e integração de elementos comuns nos processos de invasão celular e progressão parasitária aqui abordados. Por essa razão, a compreensão destas interacções permanece um desafio importante.

Melanosome transfer between melanocytes and keratinocytes

RESUMO: A pele é o maior órgão do corpo humano e a sua pigmentação é essencial para a sua coloração e proteção contra os efeitos nocivos da radiação ultravioleta (UV). A pigmentação da pele resulta essencialmente de três processos: a síntese e o armazenamento de melanina pelos melanócitos, em organelos especializados denominados melanossomas; o transporte dos melanossomas dentro dos melanócitos; e finalmente, a transferência dos melanossomas para os queratinócitos adjacentes. Nos queratinócitos, a melanina migra para a região perinuclear apical da célula para formar um escudo protetor,responsável pela proteção do DNA dos danos causados pela radiação UV. Os melanócitos estão localizados na camada basal da epiderme e contactam com 30-40 queratinócitos. Em conjunto, estas células formam a “unidade melano-epidérmica”. Apesar dos processos de síntese e transporte de melanina nos melanócitos estarem bastante bem caracterizados, os mecanismos moleculares subjacentes à transferência inter-celular de melanina são menos conhecidos e ainda controversos. Dados preliminares obtidos pelo nosso grupo, que se basearam na observação de amostras de pele humana por microscopia electrónica, indicam que a forma predominante de transferência de melanina na epiderme consiste na exocitose dos melanossomas pelos melanócitos e subsequente endocitose da melanina por queratinócitos. Para além disso sabe-se que as proteínas Rab, que controlam o tráfego membranar, estão envolvidas em várias etapas de pigmentação da pele, nomeadamente na biogénese e no transporte de melanina. Assim, dado o seu papel fundamental nestes processos, questionámo-nos sobre o seu envolvimento na transferência de melanina. Com este trabalho, propomo-nos a expandir o conhecimento atual sobre a transferência de melanina na pele, através do estudo detalhado dos seus mecanismos moleculares, identificando as proteínas Rab que regulam o processo. Pretendemos também confirmar o modelo de exo/endocitose como sendo o mecanismo principal de transferência de melanina. Primeiro, explorámos a regulação da secreção de melanina pelos melanócitos e analisámos o papel de proteínas Rab neste processo. Os resultados foram obtidos recorrendo a um método in vitro, desenvolvido previamente no laboratório, que avalia a quantidade de melanina segregada para o meio de cultura por espectrofotometria, e ainda por microscopia, contando o número de melanossomas transferidos para os queratinócitos. Através de co-culturas de melanócitos e queratinócitos, verificou-se que os queratinócitos estimulam a libertação de melanina dos melanócitos para o meio extra-celular, bem como a sua transferência para os queratinócitos. Além disso, a proteína Rab11b foi identificada como um regulador da exocitose de melanina e da sua transferência para os queratinócitos. De facto, a diminuição da expressão de Rab11b em melanócitos provocou a redução da secreção de melanina estimulada por queratinócitos, bem como da transferência desta. Em segundo lugar, para complementar o nosso estudo, centrámos a nossa investigação na internalização de melanina por queratinócitos. Especificamente, usando uma biblioteca de siRNA, explorámos o envolvimento de proteínas Rab na captação de melanina por queratinócitos. Como primeira abordagem, usámos esferas fluorescentes como substituto de melanina, avaliando os resultados por citometria de fluxo. No entanto, este método revelou-se ineficaz uma vez que a internalização destas esferas é independente do recetor PAR-2 (recetor 2 ativado por protease), que foi previamente descrito como essencial na captação de melanina por queratinócitos Posteriormente, foi desenvolvido um novo protocolo de endocitose baseado em microscopia, usando melanossomas sem a membrana envolvente (melanocores) purificados do meio de cultura de melanócitos, incluindo um programa informático especialmente desenhado para realizar uma análise semi-automatizada. Após internalização, os melanocores acumulam-se na região perinuclear dos queratinócitos, em estruturas que se assemelham ao escudo supranuclear observado na pele humana. Seguidamente, o envolvimento do recetor PAR-2 na captação de melanocores por queratinócitos foi confirmado, utilizando o novo protocolo de endocitose desenvolvido. Para além disso, a necessidade de quatro proteínas Rab foi identificada na internalização de melanocores por queratinócitos. A redução da expressão de Rab1a ou Rab5b em queratinócitos diminuiu significativamente o nível de internalização de melanocores, enquanto o silenciamento da expressão de Rab2a ou Rab14 aumentou a quantidade de melanocores internalizados por estas células. Em conclusão, os resultados apresentados corroboram as observações anteriores, obtidas em amostras de pele humana, e sugerem que o mecanismo de transferência predominante é a exocitose de melanina pelos melanócitos, induzida por queratinócitos, seguida por endocitose pelos queratinócitos. A pigmentação da pele tem implicações tanto ao nível da cosmética, como ao nível médico, relacionadas com foto-envelhecimento e com doenças pigmentares. Assim sendo, ao esclarecer quais os mecanismos moleculares que regulam a transferência de melanina na pele, este trabalho pode conduzir ao desenvolvimento de novas estratégias para modular a pigmentação da pele.----------------ABSTRACT: Skin pigmentation is achieved through the highly regulated production of the pigment melanin in specialized organelles, termed melanosomes within melanocytes. These are transported from their site of synthesis to the melanocyte periphery before being transferred to keratinocytes where melanin forms a supra-nuclear cap to protect the DNA from UVinduced damage. Together, melanocytes and keratinocytes form a functional complex, termed “epidermal-melanin unit”, that confers color and photoprotective properties to the skin. Skin pigmentation requires three processes: the biogenesis of melanin; its intracelular transport within the melanocyte to the cell periphery; and the melanin transfer to keratinocytes. The first two processes have been extensively characterized. However, despite significant advances that have been made over the past few years, the mechanisms underlying inter-cellular transfer of pigment from melanocytes to keratinocytes remain controversial.Preliminary studies from our group using electron microscopy and human skin samples found evidence for a mechanism of coupled exocytosis-endocytosis. Rab GTPases are master regulators of intracellular trafficking and have already been implicated in several steps of skin pigmentation. Thus, we proposed to explore and characterize the molecular mechanisms of melanin transfer and the role of Rab GTPases in this process. Moreover, we investigated whether the exo/endocytosis model is the main mechanism of melanin transfer. We first focused on melanin exocytosis by melanocytes. Then, we started to investigate the key regulatory Rab proteins involved in this step by establishing an in vitro tissue culture model of melanin secretion. Using co-cultures of melanocytes and keratinocytes, we found that keratinocytes stimulate melanin release and transfer. Moreover, depletion of Rab11b decreases keratinocyte-induced melanin exocytosis by melanocytes. In order to determine whether melanin exocytosis is a predominant mechanism of melanin transfer, the amount of melanin transferred to keratinocytes was then assayed in conditions where melanin exocytosis was inhibited. Indeed, Rab11b depletion resulted in a significant decrease in melanin uptake by keratinocytes. Taken together, these observations suggest that Rab11b mediates melanosome exocytosis from melanocytes and transfer to keratinocytes. To complement and extend our study, we of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptakecentred our attention in the internalization of melanin by keratinocytes. Thus, we aimed to explore the effect of depleting Rab GTPases on melanin uptake and trafficking within keratinocytes. As a first approach, we used fluorescent microspheres as a melanin surrogate. However, the uptake of microspheres was observed to be independent of PAR-2, a receptor that is required for melanin uptake.Therefore, we concluded that microspheres were uptaken by keratinocytes through a different pathway than melanin. Subsequently, we developed a microscopy-based endocytosis assay using purified melanocores (melanosomes lacking the limiting membrane) from melanocytes, including a program to perform a semi-automated analysis. Melanocores are taken up by keratinocytes and accumulate in structures in the perinuclear area that resemble the physiological supranuclear cap observed in human skin. We then confirmed the involvement of PAR-2 receptor in the uptake of melanocores by keratinocytes, using the newly developed assay. Furthermore, we identified the role of four Rab GTPases on the uptake of melanocores by keratinocytes. Depletion of Rab1a and Rab5b from keratinocytes significantly reduced the uptake of melanocores, whereas Rab2a, and Rab14 silencing increased the amount the melanocores internalized by XB2 keratinocytes. In conclusion, we present evidence supporting keratinocyte-inducedmelanosome exocytosis from melanocytes, followed by endocytosis of the melanin core by keratinocytes as the predominant mechanism of melanin transfer in skin. Although advances have been made, there is a need for more effective and safer therapies directed at pigmentation disorders and also treatments for cosmetic applications. Hence, the understanding of the above mechanisms of skin pigmentation will lead to a greater appreciation of the molecular machinery underlying human skin pigmentation and could interest the pharmaceutical and cosmetic industries.