Studies On In Vitfio Production Of Secondary Metabolites From Medicinal Plants

In the light of the very huge demand for natural ephedrine and pseudoephidrine, a search for an angiosperm plant containing the alkaloid ephedrine was made and could locate Sida spp. of malvaceae family. Sida is a large genus of, herbs and shrubs distributed throughout the tropics. About a dozen species occur in India. The medicinally important species known are S.rhombrfolia S.cordata and S.spinosa (Anon, 1972). Among the various species, S.rh0mbIfolia is the most widely used one in the traditional system of medicine. An attempt was made in the present study to develop an ideal bioprocess for the in vitro production of ephedrine from the cell culture system of Sida rhombrfolia Linn. ssp. retusa. The callus and suspension culture were initiated and attempts were made to enhance the yield positively by employing various strategies like mutagenesis, immobilization and addition of precursors, elicitors and penneabilizing agents.

Ermittlung geeigneter Methoden zur Differenzierung und Qualitätsbeurteilung unterschiedlicher Milchqualitäten aus verschiedenen on-farm-Experimenten

Zusammenfassung: Ziel der Arbeit war ein Methodenvergleich zur Beurteilung der Milchqualität unterschiedlicher Herkünfte. Am Beispiel von Milchproben aus unterschiedlicher Fütterung sowie an Milchproben von enthornten bzw. horntragenden Kühen wurde geprüft, welche der angewendeten Methoden geeignet ist, die Vergleichsproben zu unterscheiden (Differenzierungsfähigkeit der Methoden) und inwieweit eine Qualitätsbeurteilung möglich ist (hinsichtlich Milchleistung, Fett-, Eiweiß-, Lactose- (=F,E,L), Harnstoff-gehalt und Zellzahl (=SCC), Säuerungseigenschaften (=SE), Fettsäuremuster (=FS-Muster), Protein- und Metabolit-Zusammensetzung (=Pr&M), Fluoreszenz-Anregungs-Spektroskopie-Eigenschaften (=FAS) und Steigbild-Merkmalen). Zusätzlich wurde vorab die Steigbildmethode (=SB-M) für das Produkt Rohmilch standardisiert und charakterisiert, um die Reproduzierbarkei der Ergebnisse sicherzustellen. Die Untersuchungen zur SB-M zeigten, dass es Faktoren gibt, die einen deutlichen Einfluß auf die Bildmerkmals-Ausprägung aufweisen. Dazu gehören laborseitig die Klimabedingungen in der Kammer, die Verdünnungsstufe der Probe, die Standzeiten der Vorverdünnung (Reaktionen mit der Luft, Alterung usw.), und tagesspezifisch auftretende Effekte, deren Ursache unbekannt ist. Probenseitig sind sehr starke tierindividuelle Effekte auf die Bildmerkmals-Ausprägung festzustellen, die unabhängig von Fütterung, Alter, Laktationsstadium und Genetik auftreten, aber auch Fütterungsbedingungen der Kühe lassen sich in der Bildmerkmals-Ausprägung wiederfinden. Die Art der Bildauswertung und die dabei berücksichtigten Bildmerkmale ist von großer Bedeutung für das Ergebnis. Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten 46 Probenpaare (aus den Fütterungsvergleichen (=FV) und zur Thematik der Hörner) konnten in 91% der Fälle korrekt gruppiert werden. Die Unterschiede konnten benannt werden. Drei FV wurden auf drei biologisch-dynamischen Höfen unter Praxis-Bedingungen durchgeführt (on-farm-Experimente). Es wurden jeweils zwei vergleichbare Gruppen à mindestens 11 Kühen gebildet, die im Cross-Over-Design gefüttert wurden, mit Probennahme am 14. und 21. Tag je Periode. Es wurden folgende FV untersucht: A: Wiesenheu vs. Kleegrasheu (=KG-Heu), B: Futterrüben (=FuR) vs. Weizen (Ergänzung zu Luzernegrasheu ad lib.), C: Grassilage vs. Grasheu. Bei Versuch A sind die Futtereffekte am deutlichsten, Gruppeneffekte sind gering. Die Milch der Wiesenheu-Variante hat weniger CLA’s und n3- FS und mehr mittellangkettige FS (MCT-FS), das Pr&M-Muster weist auf „Gewebereifung und Ausdifferenzierung“ vs. bei KG-Heu „Nährstoff-fülle, Wachstum und Substanz-Einlagerung und die SB zeigen fein ausdifferenzierte Bildmerkmale. Bei Versuch B sind die Futtereffekte ähnlich groß wie die Gruppeneffekte. Bei vergleichbarer Milchleistung weist die Milch der FuR-Variante höhere F- und E-Gehalte auf, sie säuert schneller und mehr, das FS-Muster weist auf eine „intensive“ Fütterung mit vermehrt MCT- FS, und die Pr&M-Untersuchungen charakterisieren sie mit „Eisentransport und Fetttröpfchenbildung“ vs. bei Weizen „mehr Abwehr-, Regulations- und Transportfunktion“ /. „mehr Lipidsynthese“. Die SB charakterisieren mit „große, kräftige Formen, verwaschen“ vs. „kleine, ausdifferenzierte Bildmerkmal“ für FuR vs. Weizen. Die FAS charakterisiert sie mit „Saftfutter-typisch“ vs. „Samentypisch“. Versuch C weist die geringsten Futtereffekt auf, und deutliche Gruppen- und Zeiteffekte. Milchleistung und F,E,L-Gehalte zeigen keinen Futtereffekt. Die Milch der Heu-Variante säuert schneller, und sie weist mehr SCT und MCT- FS auf. Pr&M-Untersuchungen wurden nicht durchgeführt. Die SB charakterisieren bei Heumilch mit „fein, zart, durchgestaltet, hell“, bei Silagemilch mit „kräftig, wäßrig-verwaschen, dunkler“. Die FAS kann keine konsistenten Unterschiede ermitteln. Der Horn-Einfluß auf die Milchprobe wurde an 34 Probenpaaren untersucht. Von 11 Höfen wurden je zwei möglichst vergleichbare Gruppen zusammengestellt, die sich nur im Faktor „Horn“ unterscheiden, und im wöchentlichen Abstand drei mal beprobt. F,E,L, SCC und SE der Proben sowie die FAS-Messungen weisen keine konsistenten signifikanten Unterschiede zwischen den Horn-Varianten auf. Pr&M weisen bei den untersuchten Proben (von zwei Höfen) auf Horneffekte hin: bei Eh eine Erhöhung von Immun-Abwehr-Funktionen, sowie einer Abnahme phosphorylierter C3- und C6-Metabolite und Beta-Lactoglobulin. Mit den SB ließen sich für die gewählten Merkmale (S-Größe und g.B.-Intensität) keine Horneffekte feststellen. FS, Pr&M-Muster sowie Harnstoffgehalt und SB (und z.T. Milchleistung) zeigten je FV ähnliche Effekt-Intensitäten für Futter-, Gruppen- und Zeiteffekte, und konnten die Cross-Over-Effekte gut wiedergeben. F- und E-Gehalte konnten neben tierindividuellen Effekten nur in FV B auch Futtereffekte aufzeigen. In FV C zeigten die SE der Proben den deutlichsten Futtereffekt, die anderen Methoden zeigten hier vorrangig Gruppen-Effekte, gefolgt von Futter- und Zeiteffekten. Die FAS zeigte den SB vergleichbare Ergebnisse, jedoch weniger sensibel reagierend. Die Interpretation von Qualitätsaspekten war bei konsistent differenzierbaren Proben (FV A, B, C) am fundiertesten mit Hilfe der FS möglich, da über die Synthese von FS und beeinflussende Faktoren schon vielfältige Erkenntnisse vorliegen. Das Pr&M-Muster war nach einer weiteren Methodenentwicklung bei der Deutung von Stoffwechselprozessen sehr hilfreich. Die FAS konnte z.T. eine zu der Fütterungsvariante passende Charakterisierung liefern. Für die SB-M fehlt es noch an Referenzmaterial, um Angaben zu Qualitätsaspekten zu machen, wenngleich Probenunterschiede aufgezeigt und Proben-Eigenschaften charakterisiert werden konnten.

Conditional compositional biplots: theory and application

The biplot has proved to be a powerful descriptive and analytical tool in many areas of applications of statistics. For compositional data the necessary theoretical adaptation has been provided, with illustrative applications, by Aitchison (1990) and Aitchison and Greenacre (2002). These papers were restricted to the interpretation of simple compositional data sets. In many situations the problem has to be described in some form of conditional modelling. For example, in a clinical trial where interest is in how patients’ steroid metabolite compositions may change as a result of different treatment regimes, interest is in relating the compositions after treatment to the compositions before treatment and the nature of the treatments applied. To study this through a biplot technique requires the development of some form of conditional compositional biplot. This is the purpose of this paper. We choose as a motivating application an analysis of the 1992 US President ial Election, where interest may be in how the three-part composition, the percentage division among the three candidates - Bush, Clinton and Perot - of the presidential vote in each state, depends on the ethnic composition and on the urban-rural composition of the state. The methodology of conditional compositional biplots is first developed and a detailed interpretation of the 1992 US Presidential Election provided. We use a second application involving the conditional variability of tektite mineral compositions with respect to major oxide compositions to demonstrate some hazards of simplistic interpretation of biplots. Finally we conjecture on further possible applications of conditional compositional biplots

Genomic architecture of adaptive color pattern divergence and convergence in Heliconius butterflies

Identifying the genetic changes driving adaptive variation in natural populations is key to understanding the origins of biodiversity. The mosaic of mimetic wing patterns in Heliconius butterflies makes an excellent system for exploring adaptive variation using next-generation sequencing. In this study, we use a combination of techniques to annotate the genomic interval modulating red color pattern variation, identify a narrow region responsible for adaptive divergence and convergence in Heliconius wing color patterns, and explore the evolutionary history of these adaptive alleles. We use whole genome resequencing from four hybrid zones between divergent color pattern races of Heliconius erato and two hybrid zones of the co-mimic Heliconius melpomene to examine genetic variation across 2.2 Mb of a partial reference sequence. In the intergenic region near optix, the gene previously shown to be responsible for the complex red pattern variation in Heliconius, population genetic analyses identify a shared 65-kb region of divergence that includes several sites perfectly associated with phenotype within each species. This region likely contains multiple cis-regulatory elements that control discrete expression domains of optix. The parallel signatures of genetic differentiation in H. erato and H. melpomene support a shared genetic architecture between the two distantly related co-mimics; however, phylogenetic analysis suggests mimetic patterns in each species evolved independently. Using a combination of next-generation sequencing analyses, we have refined our understanding of the genetic architecture of wing pattern variation in Heliconius and gained important insights into the evolution of novel adaptive phenotypes in natural populations.

Molecular mechanism involved in the mutagenicity induced by Aflatoxin B1

The aflatoxin B1 (AFB1) is a mycotoxin that has been identified as the most potent hepatocarcinogen. The metabolite resulting from detoxification process of AFB1 in liver, has the ability to react with the genomic DNA, generating AFB1-DNA adducts; during DNA replication process, this adduct induced the G:C→T:A transversion. Polymorphism in genes encoding for enzymes involved in the activation and detoxification of AFB1 and DNA repair enzymes has been associated with the risk of hepatocellular carcinoma (HCC) development. Additionally, in populations of high exposure to aflatoxin and high prevalence of hepatitis B virus (HBV) infection, has been demonstrated a synergism between these two risk factors for the development of HCC.

Polimorfismos del gen Butirilcolinesterasa responsables de reacciones adversas en pacientes consumidores de “cocaína”

La butirilcolinesterasa humana (BChE; EC 3.1.1.8) es una enzima polimórfica sintetizada en el hígado y en el tejido adiposo, ampliamente distribuida en el organismo y encargada de hidrolizar algunos ésteres de colina como la procaína, ésteres alifáticos como el ácido acetilsalicílico, fármacos como la metilprednisolona, el mivacurium y la succinilcolina y drogas de uso y/o abuso como la heroína y la cocaína. Es codificada por el gen BCHE (OMIM 177400), habiéndose identificado más de 100 variantes, algunas no estudiadas plenamente, además de la forma más frecuente, llamada usual o silvestre. Diferentes polimorfismos del gen BCHE se han relacionado con la síntesis de enzimas con niveles variados de actividad catalítica. Las bases moleculares de algunas de esas variantes genéticas han sido reportadas, entre las que se encuentra las variantes Atípica (A), fluoruro-resistente del tipo 1 y 2 (F-1 y F-2), silente (S), Kalow (K), James (J) y Hammersmith (H). En este estudio, en un grupo de pacientes se aplicó el instrumento validado Lifetime Severity Index for Cocaine Use Disorder (LSI-C) para evaluar la gravedad del consumo de “cocaína” a lo largo de la vida. Además, se determinaron Polimorfismos de Nucleótido Simple (SNPs) en el gen BCHE conocidos como responsables de reacciones adversas en pacientes consumidores de “cocaína” mediante secuenciación del gen y se predijo el efecto delos SNPs sobre la función y la estructura de la proteína, mediante el uso de herramientas bio-informáticas. El instrumento LSI-C ofreció resultados en cuatro dimensiones: consumo a lo largo de la vida, consumo reciente, dependencia psicológica e intento de abandono del consumo. Los estudios de análisis molecular permitieron observar dos SNPs codificantes (cSNPs) no sinónimos en el 27.3% de la muestra, c.293A>G (p.Asp98Gly) y c.1699G>A (p.Ala567Thr), localizados en los exones 2 y 4, que corresponden, desde el punto de vista funcional, a la variante Atípica (A) [dbSNP: rs1799807] y a la variante Kalow (K) [dbSNP: rs1803274] de la enzima BChE, respectivamente. Los estudios de predicción In silico establecieron para el SNP p.Asp98Gly un carácter patogénico, mientras que para el SNP p.Ala567Thr, mostraron un comportamiento neutro. El análisis de los resultados permite proponer la existencia de una relación entre polimorfismos o variantes genéticas responsables de una baja actividad catalítica y/o baja concentración plasmática de la enzima BChE y algunas de las reacciones adversas ocurridas en pacientes consumidores de cocaína.

Anàlisi polifàsica de soques de "Pseudomonas fluorescens" potencials agents de biocontrol de malalties de fruiters

Molts bacteris del grup fluorescent del gènere Pseudomonas són capaços de controlar malalties de les plantes causades per fongs i bacteris fitopatògens (ACBs) o mostren activitat com a bacteris promotors del creixement de les plantes (BPCPs). S'han descrit diversos metabòlits que intervenen de manera important en la seva activitat com a ACBs i BPCPs entre els quals en destaquen el 2,4-diacetilfloroglucinol (Phl), àcid fenazin-1-carboxílic (PCA), Pirrolnitrina (Prn), àcid cianhídric (HCN), àcid 3-indolacètic (IAA), sideròfors i quitinases. L'objectiu principal del nostre treball ha estat la comparació de les característiques d'un grup de Pseudomonas del grup fluorescent utilitzant una aproximació polifàsica amb la finalitat d'establir possibles relacions entre algunes de les característiques i la capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Atesa la importància en el biocontrol de la producció de metabòlits com Phl, PCA i Prn, l'objectiu preliminar ha estat la recerca i obtenció de soques productores d'aquests metabòlits. Per assolir aquest objectiu s'ha emprat una aproximació molecular basada en la detecció dels gens biosintètics implicats en la seva producció en lloc de la detecció directa dels metabòlits per evitar els efectes que poden tenir les condicions de cultiu en la inducció o repressió de la seva síntesi. S'han realitzat diferents protocols basats (i) en la cerca assistida de productors mitjançant l'ús de marcadors fenotípics i posterior confirmació per PCR i, (ii) en l'ús de la PCR per a la detecció dels gens directament dels extractes bacterians, d'enriquiments d'aquests extractes i la realització de la hibridació en colònies per al posterior aïllament. La cerca assistida de productors de Phl mitjançant marcadors fenotípics i posteriorment la utilització de tècniques moleculars (amplificació per PCR del gen phlD), ha estat el millor mètode en el tipus de mostres processades en el nostre treball, on la proporció de productors és relativament baixa. En total s'han aïllat a partir de diversos ambients 4 soques portadores dels gens de la síntesi de PCA, 15 de Phl i 1 de Prn. S'ha constituït una col·lecció de 72 soques de Pseudomonas del grup fluorescent que inclou 18 aïllats propis portadors dels gens biosintètics necessaris per la producció de Phl PCA i Prn; 6 soques de referència procedents de col·leccions de cultius tipus, 14 soques productores dels diferents antibiòtics cedides per altres investigadors i una selecció de 34 soques procedents d'un treball previ realitzat en el nostre grup de recerca. A la col·lecció s'hi troben soques candidates a ACB i BPCP de diverses malalties i plantes. Les 72 soques s'han caracteritzat fenotípica i genotípicament. La caracterització fenotípica s'ha portat a terme mitjançant la identificació a nivell d'espècie amb galeries API 20NE i proves bioquímiques específiques; la producció de metabòlits com PCA, Phl, Prn, IAA, HCN, quitinases i sideròfors mitjançant l'ús de diferents tècniques; antagonisme in vitro en diversos medis enfront dos fongs (Stemphylium vesicarium i Penicillium expansum) i tres bacteris fitopatògens (Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. syringae i Xanthomonas arboricola pv. juglandis); l'eficàcia de la inhibició de la infecció en bioassaigs in vivo sobre material vegetal enfront els fongs P. expansum en poma i S. vesicarium en fulles de perera i enfront el bacteri E. amylovora en fruits immadurs de perera i, finalment, en assaigs de promoció de creixement en dos portaempelts comercials de Prunus. Cal destacar que P. expansum causa la podridura blava en pomes i peres en postcollita, S. vesicarium la taca bruna de la perera i E. amylovora el foc bacterià de les rosàcies. El nombre de soques de Pseudomonas, sobre el total de les 72 estudiades, productores d'IAA (4) i quitinases (6) és baix, mentre que és elevat en el cas del HCN (32), que a més està associat a la producció de Phl. Els resultats obtinguts en l'antagonisme in vitro han mostrat en el cas dels bacteris que és dependent del patogen indicador i del medi de cultiu. La presència o absència de ferro no sembla ser un factor que potencií l'antagonisme. En el cas dels fongs no s'ha observat però, influència del medi de cultiu emprat. En el total de 72 soques s'ha observat un percentatge baix de soques que manifesten antagonisme en tots els medis assajats vers 3 o 4 dels patògens (7). Solament 2 d'aquestes 7 soques han mostrat ser també efectives en bioassaigs d'inhibició de les infeccions causades per 2 dels 3 patògens assajats. Algunes de les soques efectives en els bioassaigs no són antagonistes in vitro en cap dels medis assajats enfront el mateix patogen. En el cas de la promoció del creixement, s'han observat més soques promotores del creixement del portaempelts de prunera Marianna 2624 que no en l'híbrid de presseguer-ametller GF677 i les eficàcies assolides són també majors en el cas de Marianna 2624, detectant una elevada especificitat soca/portaempelts La caracterització genotípica s'ha realitzat mitjançant l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de restricció de DNA ribosomal (RFLP-rDNA) i l'anàlisi dels polimorfismes en la longitud dels fragments de macrorestricció genòmica de DNA cromosòmic separats per electroforesi en camp polsant (MRFLP-PFGE). Ambdues anàlisis van mostrar una gran heterogeneïtat genètica entre les soques caracteritzades i no s'ha pogut relacionar les agrupacions obtingudes amb les característiques fenotípiques o capacitat d'actuar com a ACB o BPCP. Els patrons de macrorestricció genòmica (MRFLP-PFGE) del bacteri model P. fluorescens EPS288 són estables en el temps i independents de les condicions de cultiu assajades al laboratori o en mostres naturals, mostrant ser una tècnica eficaç en la identificació de reaïllats de mostres naturals inoculades prèviament amb el bacteri. Una selecció de soques que comparteixen el fet de produir floroglucinol s'han caracteritzat mitjançant RFLP i seqüenciació del gen phlD. S'ha establert una relació entre les agrupacions obtingudes en les anàlisis RFLP-rDNA, RFLP-phlD i les seqüències del gen. En l'anàlisi filogenètica de les seqüències del gen phlD s'ha observat un elevat grau de polimorfisme obtenint-se 3 agrupacions principals. Les agrupacions semblen relacionar-se amb els patrons de producció de metabòlits (Phl, HCN i Prn en una primera agrupació; Phl i HCN en la segona i solament Phl en la tercera), però aquestes no s'han pogut relacionar amb l'origen geogràfic de les soques o la seva activitat com a ACBs i/o BPCP. Amb les dades obtingudes de la caracterització fenotípica i genotípica s'ha realitzat una anàlisi multivariant (correspondències, correlacions d'Spearman i de freqüències amb variables categòriques). S'ha demostrat la importància de disposar d'una tècnica que permeti depurar una col·lecció de soques descartant les soques genèticament idèntiques, ja que influeixen en els resultats de les anàlisis. Pels tres patògens assajats com a indicadors i els dos portaempelts emprats, no s'ha observat cap correlació entre la inhibició de la infecció o la promoció del creixement amb les característiques fenotípiques i genotípiques de les soques que fos significatiu i consistent en les tres tècniques emprades.

Caracterització de metabòlits produïts per soques de "Pseudomonas fluorescens" efectives en el control biològic de fongs fitopatògens

El principal objectiu d'aquest treball ha estat estudiar la producció de metabòlits amb activitat antibiòtica per soques de l'espècie Pseudomonas fluorescens de la col·lecció EPS, i també avaluar la seva potencialitat com a agents de biocontrol. Es va disposar també de diverses soques de P. fluorescens, cedides per altres investigadors, que van utilitzar-se com a referència perquè algunes són actives en control biològic i produeixen metabòlits secundaris d'interès en el biocontrol de malalties de plantes. La present memòria s'estructura en cinc capítols, que són, introducció al control biològic, descripció de l'etapa de selecció de soques i cerca dels metabòlits produïts, estudi de la producció d'HCN per la soca EPS288, estudi de la producció de l'antibiòtic 2,4-diacetilfloroglucinol (DAPG), i finalment, el darrer capítol, on s'ha estudiat la producció de DAPG sobre material vegetal i la capacitat de colonitzar arrels per diverses soques d'interès. En l'etapa de prospecció, va demostrar-se que un 37% del total de les soques de la col·lecció EPS produïen HCN, totes de l'espècie P. fluorescens, i un 90% d'aquestes provenien de les arrels de plantes. Es va confirmar la producció dels metabòlits secundaris 2,4-diacetilfloroglucinol, àcid fenazina-1-carboxílic, i pirrolnitrina, per diverses soques de la col·lecció EPS seleccionades mitjançant tècniques moleculars. Així, de la col·lecció EPS, les soques EPS317 i EPS808 produeixen DAPG, la EPS263 àcid fenazina-1-carboxílic i pirrolnitrina i, EPS894, EPS895, EPS945 produeixen àcid fenazina-1-carboxílic. La producció d'HCN es va estudiar més exhaustivament en la soca EPS288, seleccionada per la seva activitat antifúngica i candidata a agent de biocontrol contra Stemphylium vesicarium, causant de la estemfiliosi de la perera, i contra Penicillium expansum, causant de la podridura blava en conservació de fruita a postcollita. Per aquest estudi, es va dissenyar i validar un sistema per recollir l'HCN a partir de cultius en medi líquid. S'ha demostrat que la temperatura d'incubació, la concentració cel·lular de sembra i la composició del medi de cultiu afectaven a la producció d'HCN. Els medis complexos i la glicina n'afavorien la síntesi i la font de carboni no afectava. La soca EPS288 va produir més HCN que P. fluorescens CHA0, soca de referència productora d'HCN i descrita com a activa en processos de biocontrol de fongs fitopatògens. En l'estudi de la producció de DAPG, les soques de la col·lecció EPS i de referència, es van comparar en diversos medis de cultiu estudiant l'efecte de la complexitat i consistència del medi, i l'addició de ferro o de glucosa. Va demostrar-se que la producció de DAPG depèn principalment de la soca i de les característiques del medi de cultiu. La glucosa estimula la producció, mentre que el ferro pràcticament no afecta, i en general, el medi sòlid i complex estimula la producció de DAPG. Tanmateix, aquests efectes varien en alguna de les soques assajades donant lloc a comportaments singulars. En el seguiment del creixement amb un sistema automàtic es va comprovar que la velocitat específica de creixement i la concentració cel·lular assolida al final del cultiu, estaven condicionades per la composició del medi de cultiu. En les proves d'antagonisme vers fitopatògens que foren seleccionats com a indicadors, va observar-se que tant l'antagonisme in vitro com la inhibició d'infeccions sobre material vegetal estaven parcialment relacionades amb la producció dels metabòlits secundaris estudiats. La promoció del creixement de portaempelts per aquestes soques depenia de la soca i de l'hoste, però no es pogué establir una relació causa-efecte amb el metabòlits produïts. També es va comprovar que algunes de les soques podien sobreviure en ferides de pomes i de peres, on produïren DAPG. Mutants resistents a rifampicina de diverses soques de la col·lecció EPS i de referència es van inocular en llavors de pomera i de tomatera que es van sembrar i incubar en condicions controlades. Es va fer el seguiment de la població bacteriana total i resistent a rifampicina present a les arrels durant 72 dies. Totes les soques van colonitzar les arrels de les plantes, mantenint una elevada població durant 37 dies, cap d'elles va estimular el creixement ni mostrar efectes fitotòxics, no afectant tampoc signicativament a la població bacteriana espontània de les arrels. La soca EPS808, una de les seleccionades pel treball, va aconseguir uns nivells de producció de DAPG, una velocitat de creixement i una supervivència relativa a les arrels similar a altres soques de referència descrites com a bons agents de biocontrol. En conseqüència, se la considera una candidata a agent de biocontrol que hauria de ser objecte de futurs estudis d'eficàcia.

Desenvolupament de metodologia analítica per a la determinació de glifosat i adjuvants

El glifosat és un herbicida no selectiu àmpliament utilitzat en cultius agrícoles i zones no agrícoles que requereixen un control de la vegetació. Tot i la baixa toxicitat del glifosat en si mateix, la seva aplicació es realitza emprant formulacions comercials que contenen substàncies auxiliars que milloren l'eficàcia de l'herbicida, però modifiquen la toxicitat del producte final.Aquest treball s'ha centrat en la determinació de components de formulacions comercials d'herbicides i el seu comportament en el sòl. La primera part del treball s'ha dedicat al desenvolupament de mètodes d'anàlisi per a la determinació de glifosat i el seu principal metabòlit, AMPA, en matrius aquoses i sòls. A continuació s'ha desenvolupat un mètode d'anàlisi per les substàncies auxiliars addicionades freqüentment en les formulacions comercials, tensioactius no iònics. Finalment s'ha estudiat la mobilitat de l'herbicida en sòls de la zona mediterrània, incidint en els processos d'adsorció i degradació. També s'ha comparat el comportament de diversos herbicides comercials que contenen glifosat.

Desenvolupament de mètodes de preconcentració emprant membranes líquides suportades i extracció en fase sòlida per a la determinació de l'herbicida glifosat i el seu metabòlit AMPA en aigües naturals

El glifosat, N-(fosfonometil) glicina, és un dels herbicides més utilitzats arreu del món a causa de la seva baixa toxicitat i al seu ampli espectre d'aplicació. A conseqüència del gran ús que se'n fa, és necessari monitoritzar aquest compost i el seu principal metabòlit, l'àcid aminometilfosfònic (AMPA), en el medi ambient. S'han descrit diversos mètodes instrumentals basats en cromatografia de gasos (GC) i de líquids (HPLC), sent aquesta darrera l'opció més favorable a causa del caràcter polar dels anàlits. Per assolir nivells de concentració baixos cal, però, la preconcentració dels anàlits. En aquest treball s'estudien diferents alternatives amb aquest objectiu. S'ha avaluat la tècnica de membrana líquida suportada (SLM) on la membrana consisteix en una dissolució orgànica, que conté un transportador (en el nostre cas, un bescanviador d'anions comercial, Aliquat 336), que impregna un suport polimèric microporós que se situa entre dues solucions aquoses: la de càrrega, que conté els anàlits inicialment, i la receptora, on es retenen els anàlits després del seu transport a través de la membrana. Les condicions d'extracció més adequades s'obtenen treballant en medi bàsic amb NaOH on els anàlits estan en forma aniònica i les majors recuperacions s'obtenen amb HCl 0,1 M o NaCl 0,5 M, la qual cosa indica que l'ió clorur és la força impulsora del transport. Un cop dissenyat el sistema, es duen a terme experiments de preconcentració amb dues geometries diferents: un sistema de membrana laminar (LSLM) on recircula la fase receptora i un sistema de fibra buida (HFSLM). Els millors resultats s'obtenen amb el mòdul de fibra buida, amb factors de concentració de 25 i 3 per a glifosat i AMPA, respectivament, fent recircular durant 24 hores 100 ml de solució de càrrega i 4 ml de solució receptora. També s'aplica una tècnica més selectiva, la cromatografia d'afinitat amb ió metàl·lic immobilitzat (IMAC), basada en la interacció entre els anàlits i un metall immobilitzat en una resina a través d'un grup funcional d'aquesta. En aquest estudi s'immobilitza pal·ladi al grup funcional 8-hidroxiquinoleïna de la resina amb matriu acrílica Spheron Oxine 1000 i s'avalua per a l'extracció i preconcentració de glifosat i AMPA. Per a ambdós anàlits l'adsorció és del 100 % i les recuperacions són superiors al 80 % i al 60 % per a glifosat i AMPA, respectivament, utilitzant HCl 0,1 M + NaCl 1 M com a eluent. Aquests resultats es comparen amb els obtinguts amb dues resines més, també carregades amb pal·ladi: Iontosorb Oxin 100, que té el mateix grup funcional però matriu de cel·lulosa, i Spheron Thiol 1000, on el grup funcional és un tiol i la matriu també és acrílica. Per al glifosat els resultats són similars amb totes les resines, però per a l'AMPA la resina Spheron Thiol és la única que proporciona recuperacions superiors al 93 %. Finalment, una altra opció estudiada és l'acoblament de dues columnes de cromatografia líquida (LC-LC). En l'estudi l'objectiu és millorar el mètode existent per a glifosat i AMPA en aigües naturals on el LOD era de 0,25 ug/l. El mètode consisteix en la derivatització precolumna amb el reactiu fluorescent FMOC i l'anàlisi amb l'acoblament LC-LC-fluorescència. Variant lleugerament les condicions de derivatització s'aconsegueix quantificar 0,1 ug/l de glifosat i AMPA. Es fortifiquen aigües naturals amb 0,1, 1 i 10 ug/l dels anàlits per validar el mètode. S'obtenen recuperacions d'entre el 85 % i el 100 %, amb desviacions estàndard relatives inferiors al 8 %. Aplicant una tècnica de preconcentració prèvia a la derivatització i anàlisi utilitzant una resina de bescanvi aniònic, Amberlite IRA-900, es millora la sensibilitat del mètode i s'assoleix un LOD per al glifosat de 0,02 ug/l.

A Field Evaluation of the Time-of-Detection Method to Estimate Population Size and Density for Aural Avian Point Counts

The time-of-detection method for aural avian point counts is a new method of estimating abundance, allowing for uncertain probability of detection. The method has been specifically designed to allow for variation in singing rates of birds. It involves dividing the time interval of the point count into several subintervals and recording the detection history of the subintervals when each bird sings. The method can be viewed as generating data equivalent to closed capture–recapture information. The method is different from the distance and multiple-observer methods in that it is not required that all the birds sing during the point count. As this method is new and there is some concern as to how well individual birds can be followed, we carried out a field test of the method using simulated known populations of singing birds, using a laptop computer to send signals to audio stations distributed around a point. The system mimics actual aural avian point counts, but also allows us to know the size and spatial distribution of the populations we are sampling. Fifty 8-min point counts (broken into four 2-min intervals) using eight species of birds were simulated. Singing rate of an individual bird of a species was simulated following a Markovian process (singing bouts followed by periods of silence), which we felt was more realistic than a truly random process. The main emphasis of our paper is to compare results from species singing at (high and low) homogenous rates per interval with those singing at (high and low) heterogeneous rates. Population size was estimated accurately for the species simulated, with a high homogeneous probability of singing. Populations of simulated species with lower but homogeneous singing probabilities were somewhat underestimated. Populations of species simulated with heterogeneous singing probabilities were substantially underestimated. Underestimation was caused by both the very low detection probabilities of all distant individuals and by individuals with low singing rates also having very low detection probabilities.

Bile metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in European eels Anguilla anguilla from United Kingdom estuaries

A total of 94 European eels (Anguilla anguilla) were collected from five estuaries in the UK. The deconjugated metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) in the bile of the eels were separated using HPLC. Six PAH metabolites were identified: 1-hydroxy (1-OH) metabolites of phenanthrene, pyrene and chrysene; and the 1-OH, 3-OH and 7,8 dihydrodiol metabolites of benzo[a]pyrene (BaP). The mean concentration of the six metabolites was greatest in eels from the Tyne (49 muM) followed by the Wear (33 muM), Tees (19 muM), Thames (4 muM) and Severn (2 muM) estuaries. Although 1-OH pyrene was always the dominant compound, there were significant differences (P<0.05) between sites and between estuaries for some metabolites. Normalising the molar concentration of the bile metabolites to the bile biliverdin absorbance reduced sample variation. When the metabolites identified were-each expressed as a percentage of the total detected, the metabolite profile was characteristic for each estuary. (C) 2002 Elsevier Science B.V. All rights reserved.

Studying the Human Gut Microbiota in the Trans-Omics Era - Focus on Metagenomics and Metabonomics

The human gut microbiota comprises a diverse microbial consortium closely co-evolved with the human genome and diet. The importance of the gut microbiota in regulating human health and disease has however been largely overlooked due to the inaccessibility of the intestinal habitat, the complexity of the gut microbiota itself and the fact that many of its members resist cultivation and are in fact new to science. However, with the emergence of 16S rRNA molecular tools and "post-genomics" high resolution technologies for examining microorganisms as they occur in nature without the need for prior laboratory culture, this limited view of the gut microbiota is rapidly changing. This review will discuss the application of molecular microbiological tools to study the human gut microbiota in a culture independent manner. Genomics or metagenomics approaches have a tremendous capability to generate compositional data and to measure the metabolic potential encoded by the combined genomes of the gut microbiota. Another post-genomics approach, metabonomics, has the capacity to measure the metabolic kinetic or flux of metabolites through an ecosystem at a particular point in time or over a time course. Metabonomics thus derives data on the function of the gut microbiota in situ and how it responds to different environmental stimuli e. g. substrates like prebiotics, antibiotics and other drugs and in response to disease. Recently these two culture independent, high resolution approaches have been combined into a single "transgenomic" approach which allows correlation of changes in metabolite profiles within human biofluids with microbiota compositional metagenomic data. Such approaches are providing novel insight into the composition, function and evolution of our gut microbiota.

Synthesis of S-linked carbohydrate analogues via a Ferrier reaction

In this work, the synthetic utility of the Ferrier reaction to access S-linked disaccharides and S-linked glycoamino acids has been probed. Significantly, entry to a range of 1,4- and 1,6-S-linked disaccharides has been achieved using glycals derived from glucose and galactose, and sulfur containing coupling partners derived from methyl α-d-glucopyranoside. Access to S-linked glycoamino acids and glycopeptides has also been achieved using protected cysteine and homocysteine coupling partners within the Ferrier reaction. Functionalisation of the Ferrier products, for example, via dihydroxylation using OsO4 or amino acid coupling, and deprotection of the targets have also been achieved. In this way, entry to materials of interest as mimics of biologically interesting disaccharides and glycopeptides has been realised, including targets derived from rare sugars such as talopyranose and gulopyranose.

Bilateral high-frequency stimulation of the subthalamic nucleus on attentional performance: transient deleterious effects and enhanced motivation in both intact and parkinsonian rats.

It is now well established that subthalamic nucleus high-frequency stimulation (STN HFS) alleviates motor problems in Parkinson's disease. However, its efficacy for cognitive function remains a matter of debate. The aim of this study was to assess the effects of STN HFS in rats performing a visual attentional task. Bilateral STN HFS was applied in intact and in bilaterally dopamine (DA)-depleted rats. In all animals, STN HFS had a transient debilitating effect on all the variables measured in the task. In DA-depleted rats, STN HFS did not alleviate the deficits induced by the DA lesion such as omissions and latency to make correct responses, but induced perseverative approaches to the food magazine, an indicator of enhanced motivation. In sham-operated controls, STN HFS significantly reduced accuracy and induced perseverative behaviour, mimicking partially the effects of bilateral STN lesions in the same task. These results are in line with the hypothesis that STN HFS only partially mimics inactivation of STN produced by lesioning and confirm the motivational exacerbation induced by STN inactivation.