Avaliação de mutagenicidade, citotoxicidade e expressão de proteínas relacionadas a apoptose, Bak, BCL-2 e P53 fosforilado, em células tratadas com fuligem e particulado total de queima de cana-de-açúcar

Pós-graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR

Avaliação da atividade antinociceptiva e antiinflamatória do óleo essencial de Hyptis crenata (Pohl) ex Benth

Hyptis crenata (Pohl) ex Benth. é uma planta herbácea, medicinal e aromática, pertencente à família lamiaceae, conhecida popularmente como salva-do-marajó, malva-do-marajó e hortelã-bravo. Distribui-se no estuário do Rio Amazonas, Pantanal e no estado de Minas-Gerais. Seu óleo essencial é caracterizado pela presença de monoterpenos e sesquiterpenos. É utilizada popularmente como sudorífico, tônico, estimulante, bem como para tratar inflamação de olhos e garganta, constipação e artrite. Baseado nessas informações, decidiu-se avaliar a atividade antinociceptiva e antiinflamatória do óleo essencial desta espécie (OEHc) através dos seguintes testes: teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético, placa quente, formalina, dermatite induzida pelo óleo de croton, edemas induzidos por dextrana e carragenina e peritonite induzida por carragenina. Para a análise estatística utilizou-se ANOVA seguida de um método de múltiplas comparações (Teste de Student-Newman-Keuls ou teste "t" de Student). O óleo foi extraído por hidrodestilação, obtendo um rendimento de 0,6%. É composto predominantemente por monoterpenos (94,5%). A dose letal media DL50 foi de 5000 mg/kg. Nas contorções abdominais induzidas por ácido acético o óleo (250, 350 e 500 mg/kg) reduziu de forma significante de maneira dose-dependente estas contorções em 22,56%, 60,76% e 75,53%, respectivamente, cujo coeficiente de correlação linear foi de r = 0,9341 e DE50 = 364,22 mg/kg. No teste da placa quente, o óleo não foi capaz de aumentar o tempo de latência de maneira significante. No teste da formalina, o OEHc produziu uma inibição da 1 fase em 26,49% e da 2 fase em 43,39%. Além disso, a naloxona reverteu o efeito do OEHc neste teste. Na dermatite induzida pelo óleo de croton, o OEHc reduziu o edema de maneira significante em 44,26%. No edema induzido por dextrana, o óleo foi capaz de impedir o desenvolvimento do edema na dose de 364,22 mg/kg de maneira significante em relação ao grupo controle. Porém, no edema induzido por carragenina esta inibição não foi observada. Na peritonite induzida por carragenina, o OEHc reduziu o número de leucócitos e o de neutrófilos em 47,55% e 66,47%, respectivamente. A partir dos resultados obtidos, sugere-se que o OEHc apresenta atividade antinociceptiva provavelmente através da ação direta sobre as fibras nociceptivas, além de sugerir que os receptores opióides possam estar envolvidos neste processo; e atividade antiinflamatória provavelmente de origem periférica. Pode-se sugerir, também, que os possíveis componentes responsáveis por essas ações sejam os compostos monoterpênicos presentes no OEHc.

Avaliação antifúngica e citotoxicidade do ácido peracético e extrato de Camellia sinensis (chá verde) em Candida spp

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Caracterização fitoquímica e avaliação da atividade anti-inflamatória e antinociceptiva do óleo fixo de Euterpe oleracea Mart.

Euterpe oleracea Mart. é uma típica palmeira da Amazônia, que cresce espontaneamente nos estados do Pará e Amapá, apreciada por sua atrativa beleza e valor nutricional. O fruto de Euterpe oleracea, comumente conhecido como açaí, tem demonstrado exibir significante capacidade anti-oxidante in vitro, o que pode ter benefícios à saúde. Estudos químicos revelaram a presença de ácidos graxos, antocianinas e esteroides. O objetivo deste trabalho foi caracterizar fitoquimícamente o óleo fixo dos frutos desta espécie (OEO) e avaliar em modelos inflamatórios e hiperalgésicos in vivo, o possível envolvimento dos compostos nas respostas inflamatória e analgésica. Para tanto, os modelos experimentais usados foram: teste de contorção induzida por ácido acético, edema de pata de rato, teste do granuloma em ratos, permeabilidade vascular em ratos, migração leucocitária em ratos e eritema de orelha induzida por óleo de cróton em camundongos. Doses orais de 500, 1000 e 1500 mg/kg de OEO inibiu o número de contorções em 33,67%, 45,88% e 55,58, respectivamente. O OEO produziu efeito dose-dependente, e a dose média efetiva encontrada foi de 1226,8mg/kg. Com a administração oral da dose de 1226,8 mg/kg, o OEO inibiu o processo inflamatório em 29,18% quando comparado ao grupo controle. A administração diária de OEO por 6 dias inibiu a formação do tecido granulomatoso em 36,66%. No eritema de orelha por óleo de cróton, o OEO provocou efeito inibitório significativo em 37,9%. No teste de permeabilidade vascular, o OEO inibiu a permeabilidade vascular em 54,5%. Na peritonite induzida por carragenina, o OEO reduziu o número de neutrófilos quando comparado ao grupo controle (inibição de 80,14%). A partir dos resultados obtidos, sugere-se que o OEO apresenta atividade anti-inflamatória, sobre os processos inflamatórios agudo e crônico, e atividade antinociceptiva, provavelmente de origem periférica.

Avaliação biológica dos extratos obtidos das sementes de Vatairea guianensis (Aublet).

As plantas medicinais são ampla e culturalmente utilizadas de forma empírica na Amazônia no tratamento de diversas doenças. Grande parte dessas plantas ainda não foi investigada cientificamente sobretudo quanto aos aspectos relacionados as atividades biológicas. A espécie selecionada neste trabalho é Vatairea guianensis, utilizada na medicina tradicional para tratar infecções de pele como as micoses cutâneas. Este trabalho avaliou a atividade antibacteriana in vitro dos extratos hidroetanólico, henicosânico, clorofórmico e metanólico obtidos das sementes de Vatairea guianensis pelo método da microdiluição em caldo para obtenção da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM), frente a bactérias Gram-positivas (Staphylococus aureus e Enterecoccus faecalis) e Gram-negativas (Pseudomonas aeruginosa e Salmonella sp). Avaliou-se também a atividade cicatrizante sobre feridas cutâneas abertas em ratos pela aplicação tópica do extrato hidroetanólico, representados pelos grupos G1 controle positivo (fibrinase); G2 controle negativo (sol salina); e grupos experimentais, (G3 dose 500mg/kg; G4 250mg/kg; G5 100mg/kg) por sete dias e a toxicidade aguda por via oral. A análise histológica do processo cicatricial foi avaliada, por meio de técnica convencional incluindo coloração HE e Picrossírius para observação das características histomorfológicas da reação inflamatória e análise descritiva da deposição de colágeno,respectivamente. Todos os extratos demonstraram atividade antimicrobiana contra todos os microrganismos testados com CIM que variaram de 3,12μg/mL a 50μg/mL e CBM com valores 6,25μg/mL a 100μg/mL. A análise histológica mostrou que o extrato hidroetanólico diminuiu a intensidade da reação inflamatória nos grupos G3 e G1, estimulou a síntese de colágeno tipo III em G1, G3 e G4 e aumentou a síntese de colágeno em G2 e G5. O experimento com extrato hidroetanólico obtido das sementes de Vatairea guianensis pareceu retardar o processo cicatricial nas doses de 500 e 250mg/kg em feridas abertas o que pode ser um efeito positivo por impedir a formação de cicatriz hipertrófica, sugerindo assim um efeito modulatório por parte do extrato. A avaliação da toxicidade aguda em camundongos revelou que o extrato hidroetanólico apresentou baixa toxicidade por via oral.

Avaliação do promotor OCT-4 de equinos em uma abordagem transgênica em células-tronco embrionárias de murinos

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Cellular and Molecular Tissue Response to Triple Antibiotic Intracanal Dressing

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

GENOTOXIC AND MUTAGENIC EFFECTS OF DIFLUBENZURON, AN INSECT GROWTH REGULATOR, ON MICE

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Mirabegron relaxes urethral smooth muscle by a dual mechanism involving β3-adrenoceptor activation and α1-adrenoceptor blockade

Mirabegron is the first β3-adrenoceptor (AR) agonist approved for treatment of overactive bladder syndrome (OAB). This study aimed to investigate the effects of β3-adrenoceptor (AR) agonist mirabegron in mouse urethra. The possibility that mirabegron exerts α1-AR antagonism was also tested in rat smooth muscle preparations presenting α1A- (vas deferens and prostate), α1D- (aorta) and α1B-AR (spleen). Functional assays were carried out in mouse and rat isolated tissues. Competition assays for the specific binding of [(3) H]Prazosin to membrane preparations of HEK 293 cells expressing each of the human α1-ARs, as well as β-AR mRNA expression and cyclic AMP measurements in mouse urethra were performed. Mirabegron produced concentration-dependent urethral relaxations that were right shifted by the selective β3-AR antagonist L 748,337, but unaffected by β1- and β2-AR antagonists (atenolol and ICI 118,551, respectively). Mirabegron-induced relaxations were enhanced by the phosphodiesterase-4 inhibitor rolipram, and this agonist stimulated cAMP synthesis. Mirabegron also produced rightward shifts in urethral contractions induced by the α1-AR agonist phenylephrine. Schild regression analysis revealed that mirabegron behaves as a competitive antagonist of α1-AR in urethra, vas deferens and prostate (α1A-AR, pA2  ≅ 5.6) and aorta (α1D-AR, pA2  ≅ 5.4), but not in spleen (α1B-AR). The affinities estimated for mirabegron in functional assays were consistent with those estimated in radioligand binding with human recombinant α1A- and α1D-ARs (pKi ≅ 6.0). The effects of mirabegron in urethral smooth muscle are the result of β3-AR agonism together with α1A / α1D-AR antagonism.

Atividade anti-inflamatória e citotoxicidade dos extratos glicólicos de Cynara cardunculus var. scolymus (L.) Fiori (alcachofra), Myracrodruon urundeuva Allemão (aroeira-do-sertão) e Camellia sinensis (L.) Kuntze (chá verde)

Pós-graduação em Biopatologia Bucal - ICT

Atividade antimicrobiana, anti-inflamatória, citotoxicidade e genotoxicidade do extrato glicólico de Betula pendula Roth (Bétula)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Peptides of the Constant Region of Antibodies Display Fungicidal Activity

Synthetic peptides with sequences identical to fragments of the constant region of different classes (IgG, IgM, IgA) of antibodies (Fc-peptides) exerted a fungicidal activity in vitro against pathogenic yeasts, such as Candida albicans, Candida glabrata, Cryptococcus neoformans, and Malassezia furfur, including caspofungin and triazole resistant strains. Alanine-substituted derivatives of fungicidal Fc-peptides, tested to evaluate the critical role of each residue, displayed unaltered, increased or decreased candidacidal activity in vitro. An Fc-peptide, included in all human IgGs, displayed a therapeutic effect against experimental mucosal and systemic candidiasis in mouse models. It is intriguing to hypothesize that some Fc-peptides may influence the antifungal immune response and constitute the basis for devising new antifungal agents.

Isolation and characterization of moojenin, an acid-active, anticoagulant metalloproteinase from Bothrops moojeni venom

A fibrinogenolytic metalloproteinase from Bothrops moojeni venom, named moojenin, was purified by a combination of ion-exchange chromatography on DEAE-Sephacel and gel filtration on Sephacryl S-300. SDS-PAGE analysis indicated that moojenin consists of a single polypeptide chain and has a molecular mass about 45 kDa. Sequencing of moojenin by Edman degradation revealed the amino acid sequence LGPDIVSPPVCGNELLEV-GEECDCGTPENCQNE, which showed strong identity with many other snake venom metalloproteinases (SVMPs). The enzyme cleaves the A alpha-chain of fibrinogen first, followed by the E beta-chain, and shows no effects on the gamma-chain. Moojenin showed a coagulant activity on bovine plasma about 3.1 fold lower than crude venom. The fibrinogenolytic and coagulant activities of the moojenin were abolished by preincubation with EDTA, 1,10-phenanthroline and beta-mercaptoethanol. Moojenin showed maximum activity at temperatures ranging from 30 to 40 degrees C and its optimal pH was 4.0. Its activity was completely lost at temperatures above 50 degrees C. Moojenin induced necrosis in liver and muscle, evidenced by morphological alterations, but did not cause histological alterations in mouse lungs, kidney or heart. Moojenin rendered the blood uncoagulatable when it was intraperitoneally administered into mice. This metalloproteinase may be of medical interest because of its anticoagulant activity. (C) 2012 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Mercury-induced autoimmunity : Genetics and immunoregulation

The existence of immune self-tolerance allows the immune system to mount responses against infectious agents, but not against self-molecular constitutes. Although self-tolerance is a robust phenomenon, in some individuals as well as in experimental models, the self-tolerance breaks down and as a result, a self-destructive autoimmune disease emerges. The underlying mechanisms for the development of autoimmune diseases are not known, but genetic, environmental and immunological factors are suggested to be involved. In this thesis, we used murine mercury-induced autoimmunity to test this suggestion. In susceptible mice mercuric chloride induces a systemic autoimmune disease characterized by increased serum levels of IgG1 and IgE, production of anti-nucleolar autoantibodies (ANolA) and formation of renal IgG deposits. In contrast, in resistant DBA/2 (H-2d) mice, none of these characteristics develop after exposure to mercury. By crossing and backcrossing mercury-resistant DBA/2 mice to mercury susceptible strains, we found that the resistance was inherited as a dominant trait in F1 hybrids and that one gene or a cluster of genes located in the H-2 loci determined the resistance to ANolA production, whereas resistance to the other characteristics was found to be controlled by two or three non-H-2 genes. We further put forward the “cryptic peptide hypothesis” to investigate whether mercury and another xenobiotic metal use similar pathway(s) to induce the H-2 linked production of ANolA. We found that while mercury stimulated ANolA synthesis in all H-2 susceptible (H-2s, H-2q and H-2f) mouse strains, silver induced only ANolA responses in H-2s and H-2q mice, but not in H-2f mice. Further studies showed that the resistance to silver-induced ANolA production in H-2f mice was inherited as a dominant trait. We next tested the proposition that mercury induces more adverse immunological effects in mouse strains, which are genetically prone to develop autoimmune diseases, using tight-skin 1 mice, an animal model for human Scleroderma. It was found that in this strain, mercury induced a strong immune activation with autoimmune characteristics, but did not accelerate the development of dermal fibrosis, a characteristic in Tsk/1 mice. Finally we addressed the Th1/Th2 cross-regulation paradigm by examining if a Th1-type of response could interact with a Th2-type of response if simultaneous induced in susceptible mice. Our findings demonstrated that mercury-induced autoimmunity (Th2-type) and collagen-induced arthritis (CIA) (Th1-type) can interact in a synergistic, antagonistic or additive fashion, depending on at which stage of CIA mercury is administered.

Studio del pathway della Displasia Ectodermica Anidrotica (EDA)

Anhidrotic Ectodermal Dysplasia (EDA), is the most frequent form among Ectodermal Dysplasias, hereditary genetic disorders causing ectodermal appendages defective development. Indeed, EDA is characterized by defective formation of hair follicles, sweat glands and teeth both in human patients and animals. EDA, the gene mutated in Anhidrotic Ectodermal Dysplasia, encodes Ectodysplasin, a TNF family member that activates NF-kB mediated transcription. This disease can occur with mutations in other EDA-NF-kB pathway members, as EDA receptor, EDAR and its adapter, EDARADD. Moreover, mutations in TRAF6, NEMO, IKB and NF-kBs genes are responsible for Immunodeficiency associated EDA (EDA-ID). Several molecules, as SHH, WNT/DKK, BMP and LTβ, have already been reported to be EDA pathway regulators or effectors although the knowledge of the full spectrum of EDA targets remains incomplete. During the first part of the research project a gene expression analysis was performed in primary keratinocytes from Wild-type and Tabby (EDA model mouse) mice to identify novel EDA target genes. Earlier expression profiling at various developmental time points in Tabby and Wild-type mouse skin reported genes differentially expressed in the two samples and, to increase the resolution to find genes whose expression may be restricted to epidermal cells, the study was extended to primary keratinocyte cultures established from E19 Wild-type and Tabby skin. Using microarrays bearing 44,000 gene probes, we found 385 “preliminary candidate” genes whose expression was significantly affected by Eda defect. By comparing expression profiles to those from Eda-A1 (where Eda-A1 is highly expressed) transgenic skin, we restricted the list to 38 “candidate EDA targets”, 14 of which were already known to be expressed in hair follicles or epidermis. This work confirmed expression changes for 3 selected genes, Tbx1, Bmp7, and Jag1, both in primary keratinocytes and in Wild-type and Tabby whole skin, by Q-PCR and Western blotting analyses. Thus, this study detected novel candidate pathways downstream of EDA. In the second part of the research project, plasmid constructs were produced and analyzed to create a transgenic mouse model for Immunodeficiency associated EDA disease (XL-EDA-ID). In particular, plasmids containing mouse Wild-type and mutated Nemo cDNA under K-17 epidermis-specific promoter control and a Flag tag, were prepared, on the way to confine transgene expression to mice epidermis and to determine EDA phenotype without immunodeficiency for a comparison to Tabby model phenotype. EDA-ID mutations reported in patients and selected for this study are: C417R (C409R in mouse), causing Zinc Finger protein domain destabilization and A288G (A282G in mouse) affecting oligomerization of the protein. Moreover, the ex-novo mutation, ZnF, C-terminal Zinc Finger domain deletion, was tested. Thus, the constructs were analyzed by transient transfection, Western blotting and luciferase assays techniques, detecting Nemo Wild-type and mutant protein products and residue NF-kB activity in presence of mutants, after TNF stimulation. In particular, MEF_Nemo-/- cell line was used to monitor NF-kB activity without endogenous Nemo gene. Results show reduced NF-kB activity in presence of mutated Nemo forms compared to Wild-type: 81% for A282G (A288G in human); 24% for C409R (C417R in human); 15% for ZnF. C409R mutation (C417R in human), reported in 6 EDA-ID human patients, was selected to prepare transgenic model mouse. Mice (white, FVP) born following K17-promoter-Flag-Nemo_C409R plasmid region pronuclear injection, were analyzed for the transgene presence in the genotype and a preliminar examination of their phenotype was performed. In particular, one mouse showed considerable coat defects if compared to Wild-type mice. This preliminar analysis suggests a possible influence of Nemo mutant over-expression in epidermis without immunodeficiency. Still, more microscopic studies to analyze hair subtypes, Guard, Awl and Zigzag (usually alterated inTabby mouse model), Immunohistochemistry experiments to detect epidermis restricted Nemo expression and sweat glands analysis, will follow. This and other transgene positive mice will be crossed with black mice C57BL6 to obtain at least two indipendent agouti lines to analyze. Theses mice will be used in EDA target genes detection through microarrays. Following, plasmid constructs containing other Nemo mutant forms (A282G and ZnF) might be studied by the same experimental approaches to prepare more transgenic model mice to compare to Nemo_C409R and Tabby mouse models.