Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells

Proteins of the annexin family are believed to be involved in membrane-related processes, but their precise functions remain unclear. Here, we have made use of several experimental approaches, including pathological conditions, RNA interference and in vitro transport assays, to study the function of annexin II in the endocytic pathway. We find that annexin II is required for the biogenesis of multivesicular transport intermediates destined for late endosomes, by regulating budding from early endosomes-but not the membrane invagination process. Hence, the protein appears to be a necessary component of the machinery controlling endosomal membrane dynamics and multivesicular endosome biogenesis. We also find that annexin II interacts with cholesterol and that its subcellular distribution is modulated by the subcellular distribution of cholesterol, including in cells from patients with the cholesterol-storage disorder Niemann-Pick C. We conclude that annexin II forms cholesterol-containing platforms on early endosomal membranes, and that these platforms regulate the onset of the degradation pathway in animal cells.

Bovine-serum-albumin-containing receptor phase better predicts transdermal absorption parameters for lipophilic compounds

Based on the hypothesis that limited receptor solubility of lipophilic compounds may result in lower observed permeability parameters, the aim of this study was to determine the in vitro human epidermal permeability coefficients and membrane retention of a series of aliphatic alcohols (C1-C10, log p -0.72 to 4.06) using two different receptor solutions (water and 4% bovine serum albumin in phosphate-buffered saline). Aqueous solutions of radiolabeled alcohols were dosed into the stratum corneum side of membranes mounted in side-by-side glass diffusion cells. Appearance of alcohol in the receptor compartment filled with either of the two solutions was monitored over a 7 h period when both stratum corneum (assessed by tape stripping) and the remaining epidermis levels of radioactivity were determined. In a separate study the degree of binding of alcohols to 4% bovine serum albumin was determined. The data showed increased receptor phase solubility in the bovine serum albumin solution and higher permeability coefficients for the more lipophilic alcohols in the series. No changes were seen in the partitioning of the alcohols from the vehicle into either the stratum corneum or tape-stripped epidermis with the two receptor phases; however, a decrease in the amount of the more lipophilic alcohols partitioning into the water receptor phase from the tape-stripped epidermis was observed. We conclude that bovine serum albumin receptor phase allows better estimation of real permeability parameters for lipophilic compounds due to its increased solubility capacity and we question whether permeability parameters for lipophilic solutes from older data sets based on aqueous receptor phases are completely reliable.

Determination of the effect of lipophilicity on the in vitro permeability and tissue reservoir characteristics of topically applied solutes in human skin layers

In order to establish the relationship between solute lipophilicity and skin penetration (including flux and concentration behavior), we examined the in vitro penetration and membrane concentration of a series of homologous alcohols (C2-C10) applied topically in aqueous solutions to human epidermal, full-thickness, and dermal membranes. The partitioning/distribution of each alcohol between the donor solution, stratum corneum, viable epidermis, dermis, and receptor phase compartments was determined during the penetration process and separately to isolated samples of each tissue type. Maximum flux and permeability coefficients are compared for each membrane and estimates of alcohol diffusivity are made based on flux/concentration data and also the related tissue resistance (the reciprocal of permeability coefficient) for each membrane type. The permeability coefficient increased with increasing lipophilicity to alcohol C8 (octanol) with no further increase for C10 (decanol). Log vehicle:stratum corneum partition coefficients were related to logP , and the concentration of alcohols in each of the tissue layers appeared to increase with lipophilicity. No difference was measured in the diffusivity of smaller more polar alcohols in the three membranes; however, the larger more lipophilic solutes showed slower diffusivity values. The study showed that the dermis may be a much more lipophilic environment than originally believed and that distribution of smaller nonionized solutes into local tissues below a site of topical application may be estimated based on knowledge of their lipophilicity alone.

Effect of vehicle pretreatment on the flux, retention, and diffusion of topically applied penetrants in vitro

Purpose. The flux of a topically applied drug depends on the activity in the skin and the interaction between the vehicle and skin. Permeation of vehicle into the skin can alter the activity of drug and the properties of the skin barrier. The aim of this in vitro study was to separate and quantify these effects. Methods. The flux of four radiolabeled permeants (water, phenol, diflunisal, and diazepam) with log K-oct/water values from 1.4 to 4.3 was measured over 4 h through heat-separated human epidermis pretreated for 30 min with vehicles having Hildebrand solubility parameters from 7.9 to 23.4 (cal/cm(3))(1/2). Results. Enhancement was greatest after pretreatment with the more lipophilic vehicles. A synergistic enhancement was observed using binary mixtures. The flux of diazepam was not enhanced to the same extent as the other permeants, possibly because its partitioning into the epidermis is close to optimal (log K-oct 2.96). Conclusion. An analysis of the permeant remaining in the epidermis revealed that the enhancement can be the result of either increased partitioning of permeant into the epidermis or an increasing diffusivity of permeants through the epidermis.

GAIP participates in budding of membrane carriers at the trans-Golgi network

Galpha interacting protein (GAIP) is a regulator of G protein signaling protein that associates dynamically with vesicles and has been implicated in membrane trafficking, although its specific role is not yet known. Using an in vitro budding assay, we show that GAIP is recruited to a specific population of trans-Golgi network-derived vesicles and that these are distinct from coatomer or clathrin-coated vesicles. A truncation mutant (NT-GAIP) encoding only the N-terminal half of GAIP is recruited to trans -Golgi network membranes during the formation of vesicle carriers. Overexpression of NT-GAIP induces the formation of long, coated tubules, which are stabilized by microtubules. Results from the budding assay and from imaging in live cells show that these tubules remain attached to the Golgi stack rather than being released as carrier vesicles. NT-GAIP expression blocks membrane budding and results in the accumulation of tubular carrier intermediates. NT-GAIP-decorated tubules are competent to load vesicular stomatitis virus protein G-green fluorescent protein as post-Golgi, exocytic cargo and in cells expressing NT-GAIP there is reduced surface delivery of vesicular stomatitis virus protein G-green fluorescent protein. We conclude that GAIP functions as an essential part of the membrane budding machinery for a subset of post-Golgi exocytic carriers derived from the trans-Golgi network.

Microscopic structure of opalescent and nonopalescent pecans

The ultrastructure of pecans was investigated using light microscopy, environmental scanning electron microscopy, scanning electron microscopy, and transmission electron microscopy. Specific methodology for the sample preparation of pecans for electron microscopy investigations was developed. Electron microscopy of the ultrastructure of opalescent (discoloration of the interior) and nonopalescent kernels revealed that cellular damage was occurring in opalescent kernels. The damage was due to cell wall and membrane rupture, which accounted for the release of oil throughout the kernel. This rupture is due to the lower level of calcium in the cell membranes of opalescent pecans, as shown by energy dispersive X-ray spectrometry, making them more susceptible to damage.

Comparative study of the radiation-induced grafting of styrene onto poly(tetrafluoroethylene-co-perfluoropropylvinyl ether) and polypropylene substrates. I: Kinetics and structural investigation

A comparative study has been made of the radiation grafting of styrene onto poly(tetrafluoroethylene-co-perfluoropropyl vinyl ether) (PFA) and polypropylene (PP) substrates, using the simultaneous irradiation method. Effects of grafting conditions such as monomer concentrations, type of solvent, dose rate and irradiation dose on the grafting yield were investigated. Under the same grafting conditions it was found that a higher degree of grafting of styrene was obtained using a mixture of dichloromethane/methanol solvents for PFA and methanol for PP and the degree of grafting was higher in PP than in PFA at all doses. However, the micro-Raman spectroscopy analysis of the graft revealed that, for the same degree of grafting, the penetration depth of the grafted polystyrene into the substrate was higher in PFA than in PP substrates. In both polymers the crystallinity was hardly affected by the grafting process and the degree of crystallinity decreased slightly with grafting dose. The dependence of the initial rate of grafting on the dose rate and the monomer concentration was found to be 0.6 and 1.4 order for PFA and 0.15 and 2.2 for PP, respectively. The degree of grafting increased with increasing radiation dose in both polymers. However, the grafting yield decreased with an increase in the dose rate. The increase in the overall grafting yield for PFA and PP was accompanied by a proportional increase in the penetration depth of the graft into the substrates. (C) 2003 Society of Chemical Industry.

Cytotoxic iron chelators: Characterization of the structure, solution chemistry and redox activity of ligands and iron complexes of the di-2-pyridyl ketone isonicotinoyl hydrazone (HPKIH) analogues

Di-2-pyridyl ketone isonicotinoyl hydrazone (HPKIH) and a range of its analogues comprise a series of monobasic acids that are capable of binding iron (Fe) as tridentate (N,N,O) ligands. Recently, we have shown that these chelators are highly cytotoxic, but show selective activity against cancer cells. Particularly interesting was the fact that cytotoxicity of the HPKIH analogues is maintained even after complexation with Fe. To understand the potent anti-tumor activity of these compounds, we have fully characterized their chemical properties. This included examination of the solution chemistry and X-ray crystal structures of both the ligands and Fe complexes from this class and the ability of these complexes to mediate redox reactions. Potentiometric titrations demonstrated that all chelators are present predominantly in their charge-neutral form at physiological pH (7.4), allowing access across biological membranes. Keto-enol tautomerism of the ligands was identified, with the tautomers exhibiting distinctly different protonation constants. Interestingly, the chelators form low-spin (diamagnetic) divalent Fe complexes in solution. The chelators form distorted octahedral complexes with Fe-II, with two tridentate ligands arranged in a meridional fashion. Electrochemistry of the Fe complexes in both aqueous and non-aqueous solutions revealed that the complexes are oxidized to their ferric form at relatively high potentials, but this oxidation is coupled to a rapid reaction with water to form a hydrated (carbinolamine) derivative, leading to irreversible electrochemistry. The Fe complexes of the HPKIH analogues caused marked DNA degradation in the presence of hydrogen peroxide. This observation confirms that Fe complexes from the HPKIH series mediate Fenton chemistry and do not repel DNA. Collectively, studies on the solution chemistry and structure of these HPKIH analogues indicate that they can bind cellular Fe and enhance its redox activity, resulting in oxidative damage to vital biomolecules.

High energy radiation grafting of fluoropolymers

Fluoropolymers are known as chemically inert materials with good high temperature resistance, so they are often the materials of choice for harsh chemical environments. These properties arise because the carbon-fluorine bond is the strongest of all bonds between other elements and carbon, and, because of their large size, fluorine atoms can protect the carbon backbone of polymers such as poly(tetrafluoroethylene), PTFE, from chemical attack. However, while the carbon-fluorine bond is much stronger than the carbon hydrogen bond, the G values for radical formation on high energy radiolysis of fluoropolymers are roughly comparable to those of their protonated counterparts. Thus, efficient high energy radiation grafting of fluoropolymers is practical, and this process can be used to modify either the surface or bulk properties of a fluoropolymer. Indeed, radiation grafted fluoropolymers are currently being used as separation membranes for fuel cells, hydrophilic filtration membranes and matrix substrate materials for use in combinatorial chemistry. Herein we present a review of recent studies of the high energy radiation grafting of fluoropolymers and of the analytical methods available to characterize the grafts. (C) 2003 Elsevier Ltd. All rights reserved.

An investigation of the thermal and tensile properties of PFA following γ-radiolysis

For some applications for fluoropolymers they must be subjected to high-energy radiation, e.g., when they are grafted with styrene using an irradiation method to produce fuel cell membranes or matrix supports for combinatorial chemistry. In some of these applications they may be subjected to mechanical stress or elevated temperature, so it is important to elucidate the effects of the radiolysis on these properties. In the present work the effect of gamma-radiolysis on the glass transition, melting behavior, and thermal stability of PFA has been studied as well as the effect of the radiolysis on the tensile properties of the polymer.

Investigation of the vapor-phase grafting of styrene onto PFA

Poly(tetrafluoroethylene-co-perfluoropropyI vinyl ether), PFA, was grafted with styrene from the vapor phase using a simultaneous radiation grafting method. The graft yields were measured as a function of the dose and dose rate and were found to be initially linearly dependent on the dose and independent of the dose rate up to dose rates of similar to3 kGy/h. However, at a dose rate of 6.2 kGy/h, the slope of the yield-grafting time plot decreased. Raman depth profiles of the grafts showed that the polystyrene concentrations were greatest near the surface of the grafted samples and decreased with depth. The maximum penetration depth of the graft depended on the radiation dose for a fixed dose rate. Fmoc-Rink loading tests showed that the grafts displayed superior loading compared to grafts prepared from bulk styrene or from styrene solutions other than methanol.

Análise de fatores geográficos e climáticos relacionados à distribuição de Phlebotominae (Diptera: Psychodidae) em área de transmissão de leishmaniose tegumentar americana no estado do Espírito Santo, Brasil

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença que acomete pele e mucosas causada por parasitos dermotrópicos do gênero Leishmania Ross, 1903. Os parasitos são transmitidos através da picada de pequenos dípteros da família Psychodidae, os flebotomíneos. O município de Cariacica, Espírito Santo, Brasil, esteve nos últimos cinco anos (2009 a 2013) entre os cinco que apresentaram maior número de casos notificados no estado, segundo a Secretaria de Estado de Saúde (SESA-ES, 2014). A localidade de Roda D’Água demonstra grande importância, por concentrar elevado número de casos, contribuindo com grande parte das notificações do município. Avaliando os casos da doença na região, registrados nos prontuários médicos do serviço de referência, na Unidade de Medicina Tropical da Universidade Federal do Espírito Santo, observou-se que estes ocorriam a até 550 m de altitude, numa área que vai de 20 a 718 m. A hipótese mais provável seria a de que o fenômeno fosse relacionado aos vetores, já que o homem e os animais estariam presentes em todas as altitudes. De fevereiro de 2002 a janeiro de 2004 foram realizadas coletas mensais de flebotomíneos em Roda D’Água, que aconteciam simultaneamente em três níveis de altitude, sendo: nível 1 - até 250 m; nível 2 - entre 250 e 500m e nível 3 - acima de 500m. Em cada nível as coletas aconteciam em dois ambientes: mata e peridomicílio. As capturas eram feitas em armadilhas de Shannon modificadas e por busca ativa em repouso, com capturador de Castro. Avaliou-se o comportamento das espécies quanto à pluviosidade (períodos seco e chuvoso) e às estações do ano. Analisaram-se estatisticamente as principais espécies antropofílicas de importância epidemiológica (Falqueto, 1995). Foram calculados os índices ecológicos abundância, riqueza, diversidade, equitabilidade e dominância. Coletou-se um total de 13233 flebotomíneos, com identificação de 23 espécies. A espécie predominante foi Nyssomyia intermedia (61,12%), seguida por Pintomyia fischeri (18,20%) e Migonemyia migonei (8,68%), todas antropofílicas. Somou-se a estas a espécie Pintomyia monticola, que representou 1,67% do total de espécimes coletados e também é altamente antropofílica. As demais espécies somaram 10,10% do total de flebotomineos. A altitude influenciou a distribuição das quatro espécies analisadas, tendo Ny. intermedia e Pi. fischeri sido mais abundantes no nível 2, Mg. migonei mais abundante no nível 1 e Pi. monticola no nível 3. Em relação ao ambiente, as espécies Ny. intermedia e Mg. migonei foram estatisticamente mais abundantes no peridomicílio e Pi. monticola na mata. A distribuição de Pi. fisheri não apresentou diferença significativa entre os dois ambientes, porém foi a única afetada pelas chuvas e estações do ano, sendo a espécie mais encontrada no período seco e no inverno. Nyssomyia intermedia parece ser a principal espécie vetora da LTA em Roda D’Água, com Mg. migonei provavelmente tendo papel secundário. Pi. fisheri não parece estar envolvido localmente na transmissão da doença para humanos, apesar de já ter sido incriminado em outras regiões. A distribuição de Pi. monticola em relação à altitude e ao ambiente indica ser improvável sua participação na transmissão da LTA naquela região.

Comparação de desempenho entre a formulação direta do Método dos Elementos de Contorno com Funções Radiais e o Método dos Elementos Finitos em problemas de Poisson e Helmholtz

O presente trabalho objetiva avaliar o desempenho do MECID (Método dos Elementos de Contorno com Interpolação Direta) para resolver o termo integral referente à inércia na Equação de Helmholtz e, deste modo, permitir a modelagem do Problema de Autovalor assim como calcular as frequências naturais, comparando-o com os resultados obtidos pelo MEF (Método dos Elementos Finitos), gerado pela Formulação Clássica de Galerkin. Em primeira instância, serão abordados alguns problemas governados pela equação de Poisson, possibilitando iniciar a comparação de desempenho entre os métodos numéricos aqui abordados. Os problemas resolvidos se aplicam em diferentes e importantes áreas da engenharia, como na transmissão de calor, no eletromagnetismo e em problemas elásticos particulares. Em termos numéricos, sabe-se das dificuldades existentes na aproximação precisa de distribuições mais complexas de cargas, fontes ou sorvedouros no interior do domínio para qualquer técnica de contorno. No entanto, este trabalho mostra que, apesar de tais dificuldades, o desempenho do Método dos Elementos de Contorno é superior, tanto no cálculo da variável básica, quanto na sua derivada. Para tanto, são resolvidos problemas bidimensionais referentes a membranas elásticas, esforços em barras devido ao peso próprio e problemas de determinação de frequências naturais em problemas acústicos em domínios fechados, dentre outros apresentados, utilizando malhas com diferentes graus de refinamento, além de elementos lineares com funções de bases radiais para o MECID e funções base de interpolação polinomial de grau (um) para o MEF. São geradas curvas de desempenho através do cálculo do erro médio percentual para cada malha, demonstrando a convergência e a precisão de cada método. Os resultados também são comparados com as soluções analíticas, quando disponíveis, para cada exemplo resolvido neste trabalho.

Prevalência de Chlamydia trachomatis em casos de partos pretermo atendidos no Hospital Universitário Cassiano Antonio Moraes, Vitória - ES

Introdução: O parto pretermo (PPT) é um dos principais determinantes da morbimortalidade neonatal, acarretando consequências adversas para saúde. As causas são multifatoriais, sendo a infecção intrauterina a razão mais provável para explicar a maioria destes desfechos. Acredita-se que a infecção por Chlamydia trachomatis (CT) também esteja envolvida no PPT e rotura prematura de membranas (ROPREMA). Objetivo: Determinar a prevalência de CT em parturientes e os possíveis fatores de risco relacionados com os casos de partos prematuros atendidos no Hospital Universitário Cassiano Antonio Moraes. Métodos: Estudo de corte transversal, realizado entre parturientes que apresentaram PPT em um Hospital Universitário em Vitória - ES, entre junho de 2012 e agosto de 2013. As participantes responderam a um questionário contendo dados sóciodemográficos, comportamentais e clínicos. Foi coletada uma amostra de urina para rastreio de CT usando reação em cadeia da polimerase. Resultados: A prevalência de PPT durante o período do estudo foi de 26%. Um total de 378 casos de PPT foram registrados, entre eles 323 mulheres foram testadas para o CT; quarenta e cinco (13,9%) tiveram um resultado positivo, sendo que 31,6% possuiam até 24 anos e as mulheres infectadas pela CT eram mais jovens do que as demais (p = 0,022). Um total de 76,2% eram casadas/em união estável, e CT foi mais frequente entre as solteiras (p = 0,018); 16,7% relataram primeira relação sexual com menos de 14 anos de idade. As causas de PPT foram materno-fetais em 40,9%, ROPREMA em 29,7% e trabalho de parto prematuro em 29,4%. Na análise multivariada, ser casada foi um fator de proteção [OR = 12:48 (IC 95%: 0,24-0,97)]. Nenhuma das demais características foram associadas com a infecção por CT. Conclusões: Este estudo evidencia uma alta prevalência de infecção por CT entre parturientes com PPT. Essa alta prevalência reforça a necessidade da definição de estratégias de rastreamento e assistência durante o pré-natal.

Desenvolvimento e avaliação da acurácia do sistema de filtração (BacFil 6.0) na detecção de bacilos álcool-ácido resistentes em amostras de lavado broncoalveolar de pacientes com suspeita de tuberculose

A baciloscopia é o principal método diagnóstico da tuberculose (TB) em razão do seu baixo custo, rapidez e facilidade de execução. Porém sua sensibilidade é baixa, principalmente nas formas paucibacilares da doença. Nesse sentido, novas metodologias que resultem no aumento da sensibilidade da baciloscopia tornam-se absolutamente necessárias. Neste estudo, nos propusemos a aprimorar e padronizar o sistema de filtração BacFil e avaliar sua performance e acurácia em amostras paucibacilares (lavado broncoalveolar). Para alcançar esses objetivos desenvolvemos o estudo em duas fases. Na primeira fase, foram realizados ensaios para definir: 1) utilização de membranas brancas para visualização de BAAR corados por Auramina-O; 2) aumento do volume de NALC, utilização de pérolas de vidro no processo de digestão das amostras e mudança no sistema do suporte do pré-filtro; 3) meios de fixação da membrana de filtração na lâmina de microscopia; 4) limite de detecção da técnica; 5) aumento do volume de NaOCl e a influência desse aumento na visualização de BAAR na membrana. Verificou-se que: a membrana de policarbonato branca tem a mesma eficiência da membrana de policarbonato preta na visualização de BAAR fluorescentes; o método modificado utilizando maior concentração de NALC, pérolas de vidro e sistema de pré-filtro baseado em orifícios obteve 98% de passagem das amostras pelo sistema; a melhor forma de fixação da membrana na lâmina foi obtida por intermédio da utilização de fita dupla face; o limite de detecção da técnica de filtração utilizando o sistema BacFil versão 6.0 foi de 2 a 9 BAAR por mililitro de suspensão bacteriana com D.O de 0,250 ± 0,01 a 625nm; o aumento da concentração de NaOCl para 10% ajuda na passagem de um maior volume de amostra pelo sistema, porém ocasiona a diminuição da quantidade BAAR na membrana de filtração após o período necessário para todo o processo. Na segunda fase foi avaliado acurácia da técnica padronizada em 101 amostras de lavado broncoalveolar (LBA) de pacientes com suspeita de TB provenientes do Hospital Universitário Cassiano Antônio de Moraes. Observou-se que a sensibilidade da técnica de filtração (BacFil versão 6.0) foi de 76% e especificidade de 95%. A sensibilidade obtida foi significativamente maior do que a observada na baciloscopia após centrifugação que foi de 59% (p = 0,001). No entanto, constatou-se uma diminuição de especificidade na técnica de filtração (95%) em relação a técnica de 8 centrifugação (99%). Concluímos que as modificações realizadas nos sistema de filtração permitiu sanar os problemas técnicos apresentados nas versões anteriores e aumentar a sensibilidade da baciloscopia de amostras paucibacilares (lavado broncoalveolar) para o diagnóstico da TB pulmonar.