Modelling the Stoichiometric Regulation of C-Rich Toxins in Marine Dinoflagellates

Toxin production in marine microalgae was previously shown to be tightly coupled with cellular stoichiometry. The highest values of cellular toxin are in fact mainly associated with a high carbon to nutrient cellular ratio. In particular, the cellular accumulation of C-rich toxins (i.e., with C:N > 6.6) can be stimulated by both N and P deficiency. Dinoflagellates are the main producers of C-rich toxins and may represent a serious threat for human health and the marine ecosystem. As such, the development of a numerical model able to predict how toxin production is stimulated by nutrient supply/deficiency is of primary utility for both scientific and management purposes. In this work we have developed a mechanistic model describing the stoichiometric regulation of C-rich toxins in marine dinoflagellates. To this purpose, a new formulation describing toxin production and fate was embedded in the European Regional Seas Ecosystem Model (ERSEM), here simplified to describe a monospecific batch culture. Toxin production was assumed to be composed by two distinct additive terms; the first is a constant fraction of algal production and is assumed to take place at any physiological conditions. The second term is assumed to be dependent on algal biomass and to be stimulated by internal nutrient deficiency. By using these assumptions, the model reproduced the concentrations and temporal evolution of toxins observed in cultures of Ostreopsis cf. ovata, a benthic/epiphytic dinoflagellate producing C-rich toxins named ovatoxins. The analysis of simulations and their comparison with experimental data provided a conceptual model linking toxin production and nutritional status in this species. The model was also qualitatively validated by using independent literature data, and the results indicate that our formulation can be also used to simulate toxin dynamics in other dinoflagellates. Our model represents an important step towards the simulation and prediction of marine algal toxicity.

Tone

This is an article on ‘tone’ for the 1360 pages SAGE Encyclopedia "Music in the Social and Behavioral Sciences". This Encyclopedia is considered the first definitive reference resource to take a broad interdisciplinary approach to the nexus between music and the social and behavioral sciences examines how music affects human beings and their interactions in and with the world. The interdisciplinary nature of the work provides a starting place for students to situate the status of music within the social sciences in fields such as anthropology, communications, psychology, linguistics, sociology, sports, political science and economics, as well as biology and the health sciences.

The role of molecular, clinical and socioeconomic factors in the long-term survival of axillary node negative breast cancer patients

The overall objective of this study was to investigate factors associated with long-term survival in axillary node negative (ANN) breast cancer patients. Clinical and biological factors included stage, histopathologic grade, p53 mutation, Her-2/neu amplification, estrogen receptor status (ER), progesterone receptor status (PR) and vascular invasion. Census derived socioeconomic (SES) indicators included median individual and household income, proportions of university educated individuals, housing type, "incidence" of low income and an indicator of living in an affluent neighbourhood. The effects of these measures on breast cancer-specific survival and competing cause survival were investigated. A cohort study examining survival among axillary node negative (ANN) breast cancer patients in the greater Toronto area commenced in 1 989. Patients were followed up until death, lost-to-follow up or study termination in 2004. Data were collected from several sources measuring patient demographics, clinical factors, treatment, recurrence of disease and survival. Census level SES data were collected using census geo-coding of patient addresses' at the time of diagnosis. Additional survival data were acquired from the Ontario Cancer Registry to enhance and extend the observation period of the study. Survival patterns were examined using KaplanMeier and life table procedures. Associations were examined using log-rank and Wilcoxon tests of univariate significance. Multivariate survival analyses were perfonned using Cox proportional hazards models. Analyses were stratified into less than and greater than 5 year survival periods to observe whether known markers of short-tenn survival were also associated with reductions in long-tenn survival among breast cancer patients. The 15 year survival probabilities in this cohort were: for breast cancerspecific survival 0.88, competing causes survival 0.89 and for overall survival 0.78. Estrogen receptor (ER) and progesterone receptor (PR) status (Hazard Ratio (HR) ERIPR- versus ER+/PR+, 8.15,95% CI, 4.74, 14.00), p53 mutation (HR, 3.88, 95% CI, 2.00, 7.53) and Her-2 amplification (HR, 2.66, 95% CI, 1.36, 5.19) were associated with significant reductions in short-tenn breast cancer-specific survival «5 years following diagnosis), however, not with long-term survival in univariate analyses. Stage, histopathologic grade and ERiPR status were the clinicallbiologieal factors that were associated with short-term breast cancer specific survival in multivariate results. Living in an affluent neighbourhood (top quintile of median household income compared to the rest of the population) was associated with the largest significant increase in long-tenn breast cancer-specific survival after adjustment for stage, histopathologic grade and treatment (HR, 0.36, 95% CI, 0.12, 0.89).

Amibes à potentiel pathogène dans les unités dentaires

Il a été bien documenté que les différentes canalisations des unités de soins dentaires contiennent un épais biofilm. Ce biofilm est constitué entre autres de bactéries, mais aussi d’amibes. Certaines amibes ont un potentiel pathogène et peuvent causer des infections graves. Deux cas d’infections amibiennes et possiblement reliées aux unités dentaires ont retenu notre attention et sont à l’origine du présent projet. L’identification morphologique des amibes afin de déterminer si elles présentent un potentiel pathogène ou non est une tâche ardue, même pour les protozoologistes chevronnés. Nous avons donc utilisé la réaction de polymérase en chaîne (PCR) pour identifier les amibes. Des nouvelles amorces ont été élaborées pour détecter les amibes des genres Acanthamoeba ainsi que Naegleria. Des échantillons d’eau et de terre ont été prélevés dans l’environnement, et des échantillons d’eau et de biofilm ont été prélevés dans les unités dentaires. Une partie de chaque échantillon a été mise en culture selon une méthode améliorée pour une identification morphologique, et l’autre partie a été soumise à un PCR direct. Des Acanthamoebae et/ou des Naegleriae ont été détectées dans 100% des échantillons, mais les espèces varient d’un échantillon à l’autre. Des amibes à potentiel pathogènes sont détectables dans les unités dentaires ainsi que dans l’environnement, et celles-ci pourraient représenter un risque pour la santé de certains individus.

Caractérisation des souches de Salmonella Typhimurium responsables de septicémies chez le porc

Depuis quelques années, il y a émergence de souches de Salmonella enterica sérovar Typhimurium multirésistantes causant une septicémie et la mort chez le porc. Ceci constitue un problème majeur pour l’industrie porcine et possiblement pour la santé publique. L’objectif de ce projet était de comparer et de caractériser une souche capable de causer une septicémie chez le porc et une souche commensale, en observant l’interaction avec des cellules épithéliales, des macrophages humains et d’identifier des gènes exprimés par les souches septicémiques et les souches commensales. Tout d’abord, l’infection de cellules épithéliales permet d’observer l’adhérence et l’invasion des bactéries, pour ainsi mettre en évidence la capacité des souches à coloniser le tractus gastro-intestinal. La souche commensale possède un pouvoir d’adhésion supérieur à la souche septicémique. Par la suite, l’infection de macrophages permet de caractériser le niveau de phagocytose et de survie. L’importance de la survie dans les macrophages pourrait permettre de faire un lien avec la septicémie. Toutefois, aucune différence n’est observable dans les conditions qui ont été testé. Ensuite, la technique SCOTS (Selective Capture of Transcribed Sequences) est utilisée pour capturer des gènes uniques à la souche septicémique et un autre SCOTS est fait pour capturer les gènes spécifiques à la souche commensale. Finalement, les gènes sont clonés, leur spécificité face aux souches est analysé par dot blot et ils sont identifiés par séquençage suivient d’une analyses bioinformatiques. Les gènes identifiés par SCOTS, lors des captures pour la souche septicémique et la souche commensale, se trouvent à être des gènes communs aux Salmonella. Toutefois, la différence de pathologie causée par les deux souches, n’est peut-être pas l’acquisition de nouveaux gènes, mais plutôt une différence d’expression entre les deux souches.

Modulation des réactions alloimmunitaires par les cytokines maîtresses IFN-γ et TGF-β

L’injection de cellules immunologiquement compétentes à un hôte histo-incompatible amène une réaction qui peut se traduire par la maladie du greffon-contre-l’hôte (GVHD). La GVHD demeure une barrière importante à une utilisation plus répandue de la greffe allogénique de cellules hématopoïétiques (AHCT), pourtant un traitement efficace pour traiter de nombreuses maladies. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent cette pathologie pourrait en faciliter le traitement et la prévention. L’Interféron-gamma (IFN-γ) et le Transforming Growth Factor-béta (TGF-β) sont deux cytokines maîtresses de l’immunité impliquées dans la fonction et l’homéostasie des cellules greffées. Nous démontrons chez la souris que l’IFN-γ limite la reconstitution lympho-hématopoïétique de façon dose-dépendante en mobilisant des mécanismes d’apoptose et en inhibant la prolifération cellulaire. Le TGF-β est quant à lui généralement connu comme un immunosuppresseur qui contrôle l’immunité en utilisant plusieurs voies de signalisation. Le rôle relatif de ces voies en AHCT est inconnu. Nous avons étudié une de ces voies en greffant des cellules provenant de donneurs déficients pour le gène SMAD3 (SMAD3-KO), un médiateur central de la voie canonique du TGF-β, à des souris histo-incompatibles. Bien que l’absence de SMAD3 ne cause aucune maladie chez nos souris donneuses, l’injection de cellules SMAD3-KO amène une GVHD du colon sévère chez le receveur. Cette atteinte est caractérisée par une différenciation Th1 et une infiltration massive de granulocytes témoignant d’un rôle central de SMAD3 dans la physiologie des lymphocytes T CD4 et des cellules myéloïdes. Nous avons focalisé ensuite nos efforts sur le rôle de SMAD3 chez les lymphocytes T CD4 en sachant que SMAD3 était actif chez les lymphocytes T CD4 tolérants. Nous avons découvert que SMAD3 était rapidement inactivé après une activation des cellules T, suggérant que l’inactivation de SMAD3 était fonctionnellement importante pour briser l’état de tolérance. Des études de micro-puces d’ADNc nous ont montré que SMAD3 contrôlait en effet l’expression de nombreux transcrits de gènes connus comme étant reliés à la tolérance et/ou à des processus biologiques dont les rôles dans le maintien de la tolérance sont plausibles.

Chicken infectious anemia virus vaccination induces immune disorders and viral persistency in infectious bursal disease virus-infected young chicks

La bursite infectieuse aviaire (IBD) est une des causes majeures de pertes économiques pour l’industrie aviaire. La vaccination est le principal outil de contrôle de cette maladie et les oiseaux susceptibles doivent être vaccinés aussitôt que le niveau des anticorps maternels (MA) anti-IBDV est suffisamment bas. L’estimation du moment de vaccination est habituellement déterminée par la formule de Deventer qui utilise le titre initial de MA anti-IBDV et la demi-vie des anticorps pour prédire l’évolution du titre. Dans la présente étude, l’effet du gain de poids sur la vitesse de disparition des MA a été étudié dans le but de l’utiliser pour prédire la détermination du moment de la vaccination. L’analyse des taux d’anticorps neutralisants par ELISA a montré que les poussins avec une forte croissance avaient un taux de disparition plus rapide des MA que ceux à faible croissance. Une formule pour la prédiction du moment de vaccination contre le IBDV, basée sur le gain de poids et le niveau des MA a été développée et vérifiée. La prédiction du moment de vaccination avec cette formule a montré une haute corrélation avec les titres de MA mesurés par ELISA. Le virus de l’anémie infectieuse aviaire (CIAV) est une cause importante d’immunosuppression chez le poulet augmentant la pathogénicité des infections secondaires et en entraînant une réponse humorale suboptimale et une forte mortalité. D’autre part, l’infections sub-clinique du au CIAV provoque une immunosuppression qui facilite la coinfection par d’autre virus tel que le IBDV. Les effets de la coinfection à J1 avec une souche vaccinale de CIAV CAV-VAC® (Intervet) et à J14 avec une souche faiblement virulente de IBDV isolée au Québec, sur l’état de santé des poussins, sur la persistance virale et sur la réponse immunitaire ont été étudiés autant chez des poussins de 1 jour d’âge exempts d’agents pathogènes specifique (SPF) que ceux provenant d’élevages commerciaux. Les résultats ont montré que l’inoculation de la souche vaccinale du CIAV a entraîné une infection sub-clinique, une persistance virale dans la rate et le thymus, une altération de la thymopoièse et une réponse humorale temporaire chez les poussins SPF. Ces effets ont aussi été mis en évidence chez des poussins d’élevage commerciaux malgré des taux élevés de MA. Lors de l’infection avec la souche de IBDV chez des poussins déjà vaccinés contre le CIAV, la persistance du CIAV dans les organes lymphoïdes a été aggravée par une présence de réponses humorales temporaires contre les deux virus et une altération des populations lymphocytaires dans les organes lymphoïdes. Par contre, la présence des MA contre le CIAV a limité temporairement ces effets. Ces travaux ont mis en évidence des désordres immunitaires cellulaires et humoraux et une persistance virale chez des poussins vaccinés contre le CIAV et co-infectés avec le IBDV.

Modèles cellulaires pour étudier les interactions entre Actinobacillus pleuropneumoniae et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin

Durant une infection pulmonaire, les porcs sont souvent infectés par plus d’un microorganisme. Actinobacillus pleuropneumoniae et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (VSRRP) sont des pathogènes qui peuvent infecter de manière simultanée les porcs. L’objectif du présent projet est d’étudier l’interaction entre ces pathogènes. Les deux lignées cellulaires permissives au VSRRP utilisées sont les cellules « St-Jude porcine lung » (SJPL) et MARC-145. Les cellules ont été pré-infectées avec le VSRRP, puis infectées avec A. pleuropneumoniae. Un dosage de la lactate déshydrogénase a montré qu’une co-infection VSRRP-A. pleuropneumoniae comparée à une infection simple augmente significativement la cytotoxicité. Dans les mêmes conditions expérimentales, une pré-infection virale ne semble pas affecter l’adhérence d’A. pleuropneumoniae aux cellules. À l’aide de tests ELISA, il a été possible de démontrer la production d’IL-8 et d’INF-γ lorsqu’il y a infection des cellules. Pour ce qui est du TNF-α, d’IL-6 et d’IL-10, ces cytokines ne sont pas détectées en présence des pathogènes étudiés. Des expériences de pré-infection bactérienne suivie d’infection virale ont également été réalisées. Il a été démontré que la pré-infection avec A. pleuropneumoniae diminuait la réplication du VSRRP chez la lignée cellulaire SJPL, mais cela n’est pas observé avec la lignée cellulaire MARC-145. Les résultats préliminaires ont démontré que cette diminution de la réplication serait causée par une molécule de faible poids moléculaire sécrétée dans le surnageant bactérien et celle-ci serait résistante à la chaleur. Les lignées cellulaires SJPL et MARC-145 représentent de bons modèles pour l’étude des infections mixtes des voies respiratoires du porc.

Caractérisation moléculaire du rôle de facteurs accessoires ArgR et PepA au niveau de la recombinaison spécifique sur le site cer

Mon projet de recherche avait pour but de caractériser le rôle de deux protéines, ArgR et PepA, qui agissent en tant que facteurs accessoires de la recombinaison au niveau de deux sites cer du plasmide ColE1 présent dans la bactérie Escherichia coli. Ces deux protéines, couplées aux deux recombinases à tyrosine XerC et XerD, permettent la catalyse de la recombinaison site spécifique au niveau de la séquence cer, convertissant les multimères instables de ColE1 en monomères stables. Cette étude a principalement porté sur la région C-terminale de la protéine ArgR. Cette région de la protéine ArgR possède une séquence en acides-aminés et une structure similaire à celle de la protéine AhrC de Bacillus subtilis. De plus, AhrC, le répresseur de l’arginine de cette bactérie, est capable de complémenter des Escherichia coli mutantes déficientes en ArgR. Les régions C-terminales de ces protéines, montrent une forte similarité. De précédents travaux dans notre laboratoire ont démontré que des mutants d’ArgR comprenant des mutations dans cette région, en particulier les mutants ArgR149, une version tronquée d’ArgR de 149 acides-aminés, et ArgR5aa, une version comprenant une insertion de cinq acides-aminés dans la partie C-terminale, perdaient la capacité de permettre la recombinaison au niveau de deux sites cer présents dans le plasmide pCS210. Malgré cette incapacité à promouvoir la réaction de recombinaison en cer, ces deux mutants étaient toujours capables de se lier spécifiquement à l’ADN et de réprimer une fusion argA :: lacZ. Dans ce travail, les versions mutantes et sauvages d’ArgR furent surexprimées en tant que protéines de fusion 6-histidine. Des analyses crosslinking ont montré que la version sauvage et ArgR5aa pouvaient former des hexamères in-vitro de manière efficace, alors qu’ArgR149 formait des multimères de plus faible poids moléculaire. Des formes tronquées d’ArgR qui comportaient 150 acides-aminés ou plus, étaient encore capables de permettre la recombinaison en cer. Les mutants par substitution ArgRL149A et ArgRL151A ont tous montré que les substitutions d’un seul acide-aminé au sein de cette région avaient peu d’effets sur la recombinaison en cer. Les expériences de crosslinking protéine-à-protéine ont montré que le type sauvage et les formes mutantes d’ArgR étaient capables d’interagir avec la protéine accessoire PepA, également impliquée dans la recombinaison en cer. Les expériences de recombinaison in-vitro utilisant la forme sauvage et les formes mutantes d’ArgR combinées avec les protéines PepA, XerC et XerD purifiées, ont montré que le mutant ArgR149 ne soutenait pas la recombinaison, mais que le mutant ArgR5aa permettait la formation d’une jonction d’Holliday. Des expériences de topologie ont montré que PepA était capable de protéger l’ADN de la topoisomérase 1, et d’empêcher ArgRWt de se lier à l’ADN. Les deux mutants ArgR149 et ArgR5aa protègent aussi l’ADN avec plus de surenroulements. Quand on ajoute PepA, les profils de migration montrent un problème de liaison des deux mutants avec PepA. D’autres expériences impliquant le triplet LEL (leucine-acide glutamique-leucine) et les acides-aminés alentour devraient être réalisés dans le but de connaitre l’existence d’un site de liaison potentiel pour PepA.

Développement d'une méthode d'isolation des noyaux adaptée aux macrophages pour une caractérisation protéomique d'une nouvelle structure autophagique induite par le virus HSV-1

L’autophagie est un processus cellulaire catabolique qui a été conservé durant l’évolution de la levure à l’homme. Cet important mécanisme consiste en une dégradation des composants cytoplasmiques dans une structure lytique, le lysosome. Il existe trois types de l’autophagie : la microautophagie, l’autophagie médiée par les chaperones et la macroautophagie nommée « autophagie ». Il a été démontré que lors de l’autophagie, le matériel cytoplasmique (protéines cytosoliques et organites) est séquestré dans l’autophagosome qui finit par fusionner avec le lysosome, formant ainsi l’autophagolysosome. Le matériel séquestré et la membrane interne de l’autophagosome seront dégradés par les hydrolases lysosomales. Plusieurs études se sont focalisées sur la détermination de la machinerie moléculaire et les mécanismes de l’autophagie. Il a été démontré l’implication de 31 molécules Atg essentielles dans le processus de l’autophagie. L’identification de ces protéines a permis de déceler le rôle de l’autophagie non seulement dans le maintien de l’homéostasie cellulaire mais aussi dans la défense contre les agents pathogènes. En effet, l’autophagie joue un rôle important dans l’immunité innée conduisant à contrôler l’évasion des pathogènes dont les bactéries et les virus. Également, l’autophagie est impliquée dans l’immunité adaptative en favorisant la présentation des antigènes viraux par le CMH de classe II aux cellules T CD4+. De plus, une étude récente suggère que l’autophagie contribue à la présentation antigénique par le CMH de classe I aux cellules T CD8+ durant une infection virale par le virus HSV-1 (Herpes simplex type 1). Toutefois, certains virus y compris HSV-1 ont pu développer des mécanismes pour contourner et inhiber en partie le rôle protecteur de l’autophagie. Récemment, une étude dans notre laboratoire a mis en évidence, lors d’une infection virale par HSV-1 des cellules macrophages BMA, la présence d’une nouvelle structure autophagique dans une phase tardive de l’infection. Cette nouvelle structure est différente des autophagosomes classiques à double membrane et est caractérisée morphologiquement par quatre membranes dérivées de l’enveloppe nucléaire interne et externe. Peu de choses ont été rapportées sur cette nouvelle voie autophagique qui peut être un mécanisme de défense cellulaire quand l’autophagie classique dans le cytosol est inhibée par HSV-1. Il devient donc intéressant de caractériser les molécules impliquées dans la formation de ces autophagosomes issus du noyau par spectrométrie de masse. Pour ce faire, il était impératif d’établir un outil d’isolation des noyaux à partir de macrophages infectés par HSV-1 dans lesquels les autophagosomes issus des noyaux seront formés. La validation de cette méthode d’isolation a été effectuée en déterminant la pureté et l’intégrité des noyaux isolés à partir des cellules non infectées (contrôle) et infectées par HSV-1. La pureté des préparations de noyaux isolés a été caractérisée par l’absence de contaminants cellulaires et un enrichissement en noyaux. Également, il a fallu déterminer la cinétique de formation des autophagosomes issus des noyaux pour les deux lignées cellulaires de macrophages utilisées dans ce projet. Dans une perspective future, l’analyse protéomique à partir des échantillons purs des noyaux isolés (non infectés et infectés) mènera à identifier les protéines impliquées dans la formation des autophagosomes dérivés des noyaux, ce qui permettra ultérieurement d’effectuer des études sur les mécanismes moléculaires et les fonctions de cette nouvelle voie autophagique.

Étude fonctionnelle et génétique d'une population de lymphocytes T CD4-CD8- impliquée dans la résistance au diabète auto-immun chez la souris

Le diabète auto-immun résulte de la destruction des cellules bêta pancréatiques sécrétrices d’insuline par les lymphocytes T du système immunitaire. Il s’ensuit une déficience hormonale qui peut être comblée par des injections quotidiennes d’insuline d’origine exogène, toutefois il demeure à ce jour impossible de guérir les patients atteints de la maladie. De façon générale, un système immunitaire sain reconnaît une multitude d’antigènes différents et assure ainsi notre défense à l’égard de différents pathogènes ou encore de cellules tumorales. Il arrive cependant que, pour des raisons génétiques et/ou environnementales, les lymphocytes T puissent s’activer de façon aberrante suite à la reconnaissance d’antigènes provenant du soi. C’est ce bris de tolérance qui mène au développement de pathologies auto-immunes telles que le diabète auto-immun. Afin de limiter l’auto-immunité, des mécanismes de sélection stricts permettent d’éliminer la majorité des lymphocytes T présentant une forte affinité envers des antigènes du soi lors de leur développement dans le thymus. Certains de ces lymphocytes réussissent toutefois à échapper à l’apoptose et migrent en périphérie afin d’y circuler en quête d’un antigène spécifiquement reconnu. Il est alors primordial que des mécanismes périphériques assurent le maintien de la tolérance immunitaire en faisant obstacle à l’activation et à la prolifération des lymphocytes T auto-réactifs. L’une des avenues afin d’inhiber le développement de réponses immunitaires aberrantes est la génération de lymphocytes T régulateurs. Ces cellules, d’origine thymique ou périphérique, peuvent arborer différents phénotypes et agissent via de multiples mécanismes afin d’inactiver et/ou éliminer les cellules impliquées dans l’apparition de pathologies auto-immunes. L’utilisation de modèles murins transgéniques a permis la mise en évidence d’une population peu caractérisée de lymphocytes T au potentiel régulateur. En effet, la proportion de ces cellules T n’exprimant pas les corécepteurs CD4 et CD8 (double négatives, DN) a été inversement corrélée à la prédisposition à l’auto-immunité chez ces ii souris. L’objectif principal de cette thèse est de démontrer la fonction immuno-régulatrice des lymphocytes T DN, tout en investiguant les facteurs génétiques responsables du maintien de cette population cellulaire. Nous avons observé que les lymphocytes T DN exercent une activité cytotoxique à l’égard des lymphocytes B de façon spécifique à l’antigène, via la libération de granules cytolytiques contenant du granzyme B et de la perforine. Par ailleurs, nous avons établi qu’un unique transfert adoptif de ces cellules est suffisant afin d’inhiber le développement du diabète auto-immun chez des hôtes transgéniques prédisposés à la maladie. Le recours à des souris déficientes pour l’expression du gène CD47 a permis de constater que la voie de signalisation CD47-Sirp est essentielle dans le maintien de la proportion des lymphocytes T DN. De plus, le locus murin de prédisposition au diabète auto-immun Idd13, qui contient le gène Sirp, a été identifié pour son rôle dans la régulation de la proportion de ces cellules. Finalement, une analyse génétique a révélé que d’autres intervalles génétiques sont impliqués dans le contrôle de la population des lymphocytes T DN. Parmi ceux-ci, un locus situé en région proximale du chromosome 12 a été validé grâce à la création de souris congéniques. Grâce aux résultats présentés dans cette thèse, notre compréhension de la biologie ainsi que de la régulation des lymphocytes T DN est approfondie. Ces connaissances constituent un pas important vers la création de thérapies cellulaires novatrices permettant de prévenir et de guérir diverses pathologies auto-immunes.

Étude fonctionnelle de l’opéron fimbriaire stg de Salmonella enterica sérovar Typhi

La bactérie Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) provoque la fièvre typhoïde chez les humains et constitue un problème de santé publique important. La majorité de nos connaissances sur la pathogenèse de cette bactérie provient du modèle de fièvre entérique chez la souris causée par le sérovar Typhimurium. Peu d’études se sont penchées sur les facteurs de virulence uniques au sérovar Typhi, ni sur la possibilité que les pseudogènes retrouvés dans son génome puissent être fonctionnels. Le fimbria stg, unique au sérovar Typhi, renferme un codon d’arrêt TAA prématuré dans le gène stgC qui code pour le placier responsable de l’assemblage des sous-unités fimbriaires à la surface de la bactérie. Ainsi, le fimbria stg a été classifié dans la liste des pseudogènes non-fonctionnels. Les objectifs de cette étude étaient d’évaluer l’implication du fimbria stg lors de l’interaction avec les cellules humaines, puis de vérifier l’importance du pseudogène stgC lors de la biogenèse fimbriaire. Dans une première partie, la transcription de stg a été évaluée à l’aide d’une fusion lacZ. Malgré des niveaux d’expression observés généralement faibles en milieu riche, la croissance en milieu minimal a favorisé la transcription de l’opéron. La délétion complète de l’opéron fimbriaire stgABCD du génome de S. Typhi a été réalisée par échange allélique, puis a été complémentée sur un plasmide. Il a été démontré que la présence de stg chez S. Typhi, S. Typhimurium et E. coli contribue à une adhérence accrue sur les cellules épithéliales humaines. De plus, ce fimbria semble agir comme une structure anti-phagocytaire lors de l’interaction avec des macrophages humains. Ainsi, l’opéron stg semble fonctionnel, malgré son codon d’arrêt prématuré, puisque des phénotypes ont été observés. La seconde partie de cette étude consistait à vérifier le rôle joué par le pseudogène stgC dans la biogenèse du fimbria. Différentes variantes de l’opéron ont été générées, clonées dans un vecteur inductible à l’arabinose, puis transformées dans la souche afimbriaire d’E. coli ORN172. La translocation de la sous-unité fimbriaire StgD à la surface de la bactérie a été évaluée chez ces différents mutants par immunobuvardage de type Western. Cette expérience a permis de démontrer que le pseudogène stgC est essentiel pour l’exportation de la sous-unité StgD à la surface. L’ajout d’une étiquette de 6-histidines en C-terminal de StgC a permis de confirmer la traduction complète du gène, malgré le codon d’arrêt TAA prématuré. Le séquençage peptidique a révélé l’insertion d’une tyrosine à ce codon. Une fusion traductionnelle avec la protéine verte fluorescente a révélé qu’environ 0.8% de l’ARNm peut être traduit et permet la production complète du placier. Ce projet a permis la caractérisation d’un facteur de virulence unique à S. Typhi et constitue une étape de plus vers la compréhension de ses mécanismes de pathogenèse. Il s’agit de la première démonstration chez les bactéries de la fonctionnalité d’un gène interrompu prématurément par un codon d’arrêt TAA.

Étude de prévalence et associations des gènes de virulence et résistance aux antimicrobiens d’Escherichia coli de la flore intestinale du poulet sain

Les Escherichia coli pathogènes de la volaille (APEC) font partie des E. coli extra-intestinaux pathogènes (ExPEC) et seraient un réservoir possible de gènes de virulence et de résistance aux antimicrobiens (RAM) des ExPEC chez l’humain. L’objectif de cette étude était d’évaluer l’effet d’un prébiotique et d’un mélange d’acide organique et d’huiles essentielles encapsulés sur la prévalence des gènes de virulence des ExPEC et de RAM, ainsi que les associations entre ces gènes chez E. coli de l’intestin du poulet sain. Des échantillons de contenus caecaux de poulets de 29 jours d’âge ayant reçu un de ces ingrédients alimentaires comparativement à des témoins ont été analysés pour la présence des gènes de virulence iucD, tsh, papC et des gènes de RAM blaTEM, blaSHV, tetA, tetC, blaCMY-2, aadA1, aac3 par PCR. La prévalence d’iucD était supérieure dans le groupe témoin comparativement aux groupes «prébiotique» et «acide organique» et la prévalence de papC était affectée dans le groupe «acide organique». La prévalence d’isolats d’E.coli positifs pour blaCMY-2 était supérieure dans le groupe témoin comparée aux groupes «prébiotique» et «acide organique», tel que démontré par la technique d’hybridation de l’ADN sur HGMF (Hydrophobic Grid Membrane Filter). De plus, la prévalence des isolats d’E. coli positifs pour tetA, blaTEM, aadA1 ou tsh était affectée par les ingrédients alimentaires. Dans l’ensemble, des associations entre la présence de tsh et iucD, blaTEM et aadA1, et iucD et blaCMY-2 ont été observées. .Cette étude démontre l’utilité de certains ingrédients alimentaires pour dimunier le risque d’exposition en santé publique.

Genèse de l’immunopeptidome du CMH de classe I

La différentiation entre le « soi » et le « non-soi » est un processus biologique essentiel à la vie. Les peptides endogènes présentés par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I (CMH I) représentent le fondement du « soi » pour les lymphocytes T CD8+. On donne le nom d’immunopeptidome à l’ensemble des peptides présentés à la surface cellulaire par les molécules du CMH I. Nos connaissances concernant l’origine, la composition et la plasticité de l’immunopeptidome restent très limitées. Dans le cadre de cette thèse, nous avons développé une nouvelle approche par spectrométrie de masse permettant de définir avec précision : la nature et l’abondance relative de l’ensemble des peptides composant l’immunopeptidome. Nous avons trouvé que l’immunopeptidome, et par conséquent la nature du « soi » immun, est surreprésenté en peptides provenant de transcrits fortement abondants en plus de dissimuler une signature tissu-spécifique. Nous avons par la suite démontré que l’immunopeptidome est plastique et modulé par l’activité métabolique de la cellule. Nous avons en effet constaté que les modifications du métabolisme cellulaire par l’inhibition de mTOR (de l’anglais mammalian Target Of Rapamycin) provoquent des changements dynamiques dans la composition de l’immunopeptidome. Nous fournissons également la première preuve dans l’étude des systèmes que l’immunopeptidome communique à la surface cellulaire l’activité de certains réseaux biochimiques ainsi que de multiples événements métaboliques régulés à plusieurs niveaux à l’intérieur de la cellule. Nos découvertes ouvrent de nouveaux horizons dans les domaines de la biologie des systèmes et de l’immunologie. En effet, notre travail de recherche suggère que la composition de l’immunopeptidome est modulée dans l’espace et le temps. Il est par conséquent très important de poursuivre le développement de méthodes quantitatives au niveau des systèmes qui nous permettront de modéliser la plasticité de l’immunopeptidome. La simulation et la prédiction des variations dans l’immunopeptidome en réponse à différents facteurs cellulaires intrinsèques et extrinsèques seraient hautement pertinentes pour la conception de traitements immunothérapeutiques.

Importance of the HSP90 molecular chaperoning pathway for antibody diversification by determining AID stability

La protéine AID (déaminase induite par l’activation) joue un rôle central dans la réponse immunitaire adaptative. En désaminant des désoxycytidines en désoxyuridines au niveau des gènes immunoglobulines, elle initie l’hypermutation somatique (SHM), la conversion génique (iGC) et la commutation isotypique (CSR). Elle est essentielle à une réponse humorale efficace en contribuant à la maturation de l’affinité des anticorps et au changement de classe isotypique. Cependant, son activité mutagénique peut être oncogénique et causer une instabilité génomique propice au développement de cancers et de maladies autoimmunes. Il est donc critique de réguler AID, en particulier ses niveaux protéiques, pour générer une réponse immunitaire efficace tout en minimisant les risques de cancer et d’autoimmunité. Un élément de régulation est le fait qu’AID transite du cytoplasme vers le noyau mais reste majoritairement cytoplasmique à l’équilibre. AID est par ailleurs plus stable dans le cytoplasme que dans le noyau, ce qui contribue à réduire sa présence à proximité de l’ADN. Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux partenaires et déterminants d’AID régulant sa stabilité et ses fonctions biologiques. Dans un premier temps, nous avons identifié AID comme une nouvelle protéine cliente d’HSP90. Nous avons montré qu’HSP90 interagit avec AID dans le cytoplasme, ce qui empêche la poly-ubiquitination d’AID et sa dégradation par le protéasome. En conséquence, l’inhibition d’HSP90 résulte en une diminution significative des niveaux endogènes d’AID et corrèle avec une réduction proportionnelle de ses fonctions biologiques dans la diversification des anticorps mais aussi dans l’introduction de mutations aberrantes. Dans un second temps, nous avons montré que l’étape initiale dans la stabilisation d’AID par la voie de chaperonnage d’HSP90 dépend d’HSP40 et d’HSP70. En particulier, la protéine DnaJa1, qui fait partie de la famille des protéines HSP40s, limite la stabilisation d’AID dans le cytoplasme. La farnésylation de DnaJa1 est importante pour l’interaction entre DnaJa1 et AID et moduler les niveaux de DnaJa1 ou son état de farnésylation impacte à la fois les niveaux endogènes d’AID mais aussi la diversification des anticorps. Les souris DNAJA1-/- présentent une réponse immunitaire compromise en cas d’immunisation, qui est dûe à des niveaux réduits d’AID et un défaut de commutation de classe. Dans un troisième temps, nous avons montré que la protéine AID est intrinsèquement plus instable que sesprotéines paralogues APOBEC. Nous avons identifié l’acide aspartique en seconde position d’AID ainsi qu’un motif semblable au PEST comme des modulateurs de la stabilité d’AID. La modification de ces motifs augmente la stabilité d’AID et résulte en une diversification des anticorps plus efficace. En conclusion, l’instabilité intrinsèque d’AID est un élément de régulation de la diversification des anticorps. Cette instabilité est en partie compensée dans le cytoplasme par l’action protective de la voie de chaperonnage DnaJa1-HSP90. Par ailleurs, l’utilisation d’inhibiteurs d’HSP90 ou de farnésyltransférases pourrait être un outil intéressant pour la modulation indirecte des niveaux d’AID et le traitement de lymphomes/leucémies et de maladies auto-immunes causés par AID.