Les autotransporteurs auto-associatifs d’Escherichia coli : de facteurs de virulence à déterminants sociaux

Les autotransporteurs monomériques représentent le système de sécrétion le plus simple et le plus utilisé chez les bactéries à Gram négatif. Les autotransporteurs monomériques sont des protéines modulaires qui contiennent toute l’information pour leur sécrétion dans leur séquence. Les phénotypes associés à l’expression d’un autotransporteur peuvent être très variés et, souvent, les autotransporteurs sont des protéines multifonctionnelles. C’est le cas notamment des autotransporteurs AIDA-I, TibA et Ag43 d’Escherichia coli qui promouvoient l’adhésion et l’invasion de cellules épithéliales, l’auto-agrégation des bactéries et la formation de biofilm. Ces trois autotransporteurs ont d’ailleurs été regroupés dans une même famille, appelée les autotransporteurs auto-associatifs (SAATs). À cause de leur fonctionnalité, les SAATs sont considérés comme étant d’importants facteurs de virulence d’Escherichia coli. Toutefois, il existe plusieurs différences entre les SAATs qui ne sont pas bien comprises, si bien que leur rôle pour les bactéries n’est toujours pas bien compris. Nous avons donc d’abord caractérisé TibA, le membre des SAATs le moins bien étudié à l’aide d’une étude structure-fonction. Nous avons observé que TibA était une protéine modulaire et que son domaine fonctionnel était composé de deux modules : un module d’auto-agrégation en N-terminal et un module d’adhésion en C-terminal. En comparant nos résultats avec ceux obtenus pour les autres SAATs, nous avons réalisé que l’organisation des trois SAATs était très variée, c’est-à-dire que les trois SAATs sont composés de modules différents. Nous avons par ailleurs observé cet arrangement en modules lorsque nous avons analysé plusieurs séquences d’aidA, suggérant qu’un mécanisme d’échange et d’acquisition de modules était à la base de l’évolution des SAATs. Sans surprise, nous avons aussi observé que la famille des SAATs ne se limitait pas à AIDA-I, TibA et Ag43 et ne se limitait pas à Escherichia coli. La comparaison a aussi révélé l’importance du phénotype d’auto-agrégation dans la fonctionnalité des SAATs. Nous avons donc entrepris une étude du mécanisme d’auto-agrégation. Nos résultats on montré que l’auto-agrégation était le résultat d’une interaction directe SAAT/SAAT et ont mis en évidence un mécanisme similaire à celui utilisé par les cadhérines eucaryotes. De plus, nous avons observé que, comme les cadhérines, les SAATs étaient impliqués dans des interactions homophiliques; un SAAT interagit donc spécifiquement avec lui-même et non avec un différent SAAT. Finalement, les SAATs font parties des quelques protéines qui sont glycosylées chez Escherichia coli. Nous avons déterminé que le rôle de la glycosylation de TibA était de stabiliser la protéine et de lui donner la flexibilité nécessaire pour moduler sa conformation et, ainsi, être pleinement fonctionnelle. Globalement, nos résultats suggèrent que les SAATs sont des molécules « cadhérines-like » qui permettent la reconnaissance de soi chez les bactéries. Une telle habilité à discriminer entre le soi et le non-soi pourrait donc être utilisée par les bactéries pour organiser les communautés bactériennes.

Rôle du régulateur Fur et des petits ARN non codants RfrA et RfrB dans l’homéostasie du fer et la virulence de Salmonella

La régulation de l’homéostasie du fer est cruciale chez les bactéries. Chez Salmonella, l’expression des gènes d’acquisition et du métabolisme du fer au moment approprié est importante pour sa survie et sa virulence. Cette régulation est effectuée par la protéine Fur et les petits ARN non codants RfrA et RfrB. Le rôle de ces régulateurs est d’assurer que le niveau de fer soit assez élevé pour la survie et le métabolisme de Salmonella, et assez faible pour éviter l’effet toxique du fer en présence d’oxygène. Les connaissances concernant le rôle de ces régulateurs ont été principalement obtenues par des études chez S. Typhimurium, un sérovar généraliste causant une gastro-entérite chez les humains. Très peu d’informations sont connues sur le rôle de ces régulateurs chez S. Typhi, un sérovar humain-spécifique responsable de la fièvre typhoïde. Le but de cette étude était de déterminer les rôles de Fur, RfrA et RfrB dans l’homéostasie du fer et la virulence de Salmonella, et de démontrer qu’ils ont une implication distincte chez les sérovars Typhi et Typhimurium. Premièrement, Fur, RfrA et RfrB régulent l’homéostasie du fer de Salmonella. Les résultats de cette étude ont démontré que Fur est requis pour la résistance au stress oxydatif et pour une croissance optimale dans différentes conditions in vitro. La sensibilité du mutant fur est due à l’expression des petits ARN RfrA et RfrB, et cette sensibilité est beaucoup plus importante chez S. Typhi que chez S. Typhimurium. Également, Fur inhibe la transcription des gènes codant pour les sidérophores en conditions riches en fer, tandis que les petits ARN RfrA et RfrB semblent être importants pour la production d’entérobactine et de salmochélines chez S. Typhi lors de conditions pauvres en fer. Ensuite, ces régulateurs affectent la virulence de Salmonella. Fur est important pour la motilité de Salmonella, particulièrement chez S. Typhi. Fur est nécessaire pour l’invasion des deux sérovars dans les cellules épithéliales, et pour l’entrée et la survie de S. Typhi dans les macrophages. Chez S. Typhimurium, Fur ne semble pas impliqué dans l’interaction avec les macrophages. De plus, les petits ARN RfrA et RfrB sont importants pour la multiplication intracellulaire de Salmonella dans les macrophages pour les deux sérovars. Finalement, la protéine Fur et les petits ARN RfrA et RfrB régulent l’expression de l’opéron fimbriaire tcf, absent du génome de S. Typhimurium. Un site de liaison putatif de la protéine Fur a été identifié dans la région promotrice de tcfA chez S. Typhi, mais une régulation directe n’a pas été confirmée. L’expression de tcf est induite par le fer et par Fur, et est inhibée par les petits ARN RfrA et RfrB. Ainsi, ces régulateurs affectent des gènes de virulence qui sont retrouvés spécifiquement chez S. Typhi. En somme, ce projet a permis de démontrer que les régulateurs de l’homéostasie du fer de Salmonella peuvent affecter la résistance de cette bactérie pathogène à différents stress, notamment le stress oxydatif, la croissance en conditions de carence en fer ainsi que la virulence. Ces régulateurs jouent un rôle distinct chez les sérovars Typhi et Typhimurium.

Influence du microbiote intestinal sur le métabolisme et la virulence des Escherichia coli entérohémorragiques

Les Escherichia coli entérohémorragiques (EHEC) représentent un problème majeur de santé publique dans les pays développés. Les EHEC sont régulièrement responsables de toxi-infections alimentaires graves chez l’humain et causent des colites hémorragiques et le symptôme hémolytique et urémique, mortel chez les enfants en bas âge. Les EHEC les plus virulents appartiennent au sérotype O157:H7 et le bovin constitue leur réservoir naturel. À ce jour il n’existe aucun traitement pour éviter l’apparition des symptômes liés à une infection à EHEC. Par conséquent, il est important d’augmenter nos connaissances sur les mécanismes employés par le pathogène pour réguler sa virulence et coloniser efficacement la niche intestinale. Dans un premier temps, l’adaptation de la souche EHEC O157:H7 EDL933 à l’activité métabolique du microbiote intestinal a été étudiée au niveau transcriptionnel. Pour se faire, EDL933 a été cultivée dans les contenus caecaux de rats axéniques (milieu GFC) et dans ceux provenant de rats colonisés par le microbiote intestinal humain (milieu HMC). Le HMC est un milieu cécal conditionné in vivo par le microbiote. Dans le HMC par rapport au GFC, EDL933 change drastiquement de profile métabolique en réponse à l’activité du microbiote et cela se traduit par une diminution de l’expression des voies de la glycolyse et une activation des voies de l’anaplérose (voies métaboliques dont le rôle est d’approvisionner le cycle TCA en intermédiaires métaboliques). Ces résultats, couplés avec une analyse métabolomique ciblée sur plusieurs composés, ont révélé la carence en nutriments rencontrée par le pathogène dans le HMC et les stratégies métaboliques utilisées pour s’adapter au microbiote intestinal. De plus, l’expression des gènes de virulence incluant les gènes du locus d’effacement des entérocytes (LEE) codant pour le système de sécrétion de type III sont réprimés dans le HMC par rapport au GFC indiquant la capacité du microbiote intestinal à réprimer la virulence des EHEC. L’influence de plusieurs composés intestinaux présents dans les contenus caecaux de rats sur l’expression des gènes de virulence d’EDL933 a ensuite été étudiée. Ces résultats ont démontré que deux composés, l’acide N-acétylneuraminique (Neu5Ac) et le N-acétylglucosamine (GlcNAc) répriment l’expression des gènes du LEE. La répression induite par ces composés s’effectue via NagC, le senseur du GlcNAc-6-P intracellulaire et le régulateur du catabolisme du GlcNAc et du galactose chez E. coli. NagC est un régulateur transcriptionnel inactivé en présence de GlcNAc-6-P qui dérive du catabolisme du Neu5Ac et du transport GlcNAc. Ce travail nous a permis d’identifier NagC comme un activateur des gènes du LEE et de mettre à jour un nouveau mécanisme qui permet la synchronisation de la virulence avec le métabolisme chez les EHEC O157:H7. La concentration du Neu5Ac et du GlcNAc est augmentée in vivo chez le rat par le symbiote humain Bacteroides thetaiotaomicron, indiquant la capacité de certaines espèces du microbiote intestinal à relâcher les composés répresseurs de la virulence des pathogènes. Ce travail a permis l’identification des adaptations métaboliques des EHEC O157:H7 en réponse au microbiote intestinal ainsi que la découverte d’un nouveau mécanisme de régulation de la virulence en réponse au métabolisme. Ces données peuvent contribuer à l’élaboration de nouvelles approches visant à limiter les infections à EHEC.

New insights into small molecules inhibitors and protein-protein interactions of VirB8 : a critical conserved component of the type IV secretion system.

Les systèmes bactériens de sécrétion de type IV (T4SS) sont constitués d’un ensemble de 8 à 12 protéines conservées. Ces dernières sont utilisées lors de la translocation de protéines, la translocation de complexes ADN-protéines mais aussi pour le transport de ces derniers au travers de la membrane cellulaire. Les T4SS, en tant que facteurs de virulence pour beaucoup de pathogènes comme Brucella suis, sont donc d’excellents modèles cibles pour le développement de médicaments d’antivirulence. Ces médicaments, en privant le pathogène de son facteur essentiel de virulence : le T4SS, constituent une alternative ou encore une amélioration des traitements antibiotiques utilisés actuellement. VirB8, un facteur d’assemblage conservé dans le T4SS, forme des dimères qui sont importants pour la fonction des T4SS dans ces pathogènes. De par ses interactions multiples, VirB8 est un excellent modèle pour l’analyse des facteurs d’assemblage mais aussi en tant que cible de médicaments qui empêcheraient son interaction avec d’autres protéines et qui, in fine, désarmeraient les bactéries en les privant de leur fonctions essentielles de virulence. À ce jour, nous savons qu’il existe un équilibre monomère-dimère et un processus d’homodimerization de VirB8 dont l’importance est vitale pour la fonctionnement biologique des T4SSs. En se basant sur des essais quantitatifs d’interaction, nous avons identifié (i) des sites potentiels d’interaction avec d’autres protéines VirB du T4SS mais aussi (ii) isolé des petites molécules inhibitrices afin de tester la fonction protéique de VirB8. Afin de déterminer les acides aminés importants pour l’hétérodimérization de VirB8 avec VirB10, nous avons effectué des expériences de mutagenèse aléatoire, de phage display et d’arrimage moléculaire in silico. Ces expériences ont démontré l’importance de trois acides aminés localisés sur le feuillet β : R160, S162, T164 et I165. Ces derniers seraient importants pour l’association de VirB8 avec VirB10 étant donné que leur mutagenèse entraine une diminution de la formation du complexe VirB8-VirB10. L’objectif actuel de notre projet de recherche est de pouvoir mieux comprendre mais aussi d’évaluer le rôle de VirB8 dans l’assemblage du T4SS. Grace à un méthode de criblage adaptée à partir de la structure de VirB8, nous avons pu identifié une petite molécule inhibitrice BAR-068, qui aurait un rôle prometteur dans l’inhibition du T4SS. Nous avons utilisé la spectroscopie par fluorescence, l’essai à deux hybrides, le cross-linking et la cristallographie afin de déterminer le mécanisme d'interaction existant entre VirB8 et BAR-068. Ces travaux pourraient permettre de nombreuses avancées, notamment en termes de compréhension des mécanismes d’inhibition du T4SS. Notre objectif ultime est de pouvoir caractériser la séquence d’évènements essentiels à l’assemblage et au fonctionnement du T4SS. De manière globale, notre projet de recherche permettrait de révéler les grands principes d’assemblage des protéines membranaires, les processus de sécrétion de protéines chez les bactéries mais aussi de proposer une nouvelle stratégie lors du développement de drogues antimicrobiennes.

The staphylococcus aureus surface protein IsdA mediates resistance to the innate defenses of human skin

Resistance to human skin innate defenses is crucial for survival and carriage of Staphylococcus aureus, a common cutaneous pathogen and nasal colonizer. Free fatty acids extracted from human skin sebum possess potent antimicrobial activity against S. aureus. The mechanisms by which S. aureus overcomes this host defense during colonization remain unknown. Here, we show that S. aureus IsdA, a surface protein produced in response to the host, decreases bacterial cellular hydrophobicity rendering them resistant to bactericidal human skin fatty acids and peptides. IsdA is required for survival of S. aureus on live human skin. Reciprocally, skin fatty acids prevent the production of virulence determinants and the induction of antibiotic resistance in S. aureus and other Gram-positive pathogens. A purified human skin fatty acid was effective in treating systemic and topical infections of S. aureus suggesting that our natural defense mechanisms can be exploited to combat drug-resistant pathogens.

Hcp2, a secreted protein of the phytopathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, is required for competitive fitness against bacteria and yeasts

When analysing the secretome of the plant pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) DC3000, we identified hemolysin co-regulated protein (Hcp) as one of the secreted proteins. Hcp is assumed to be an extracellular component of the type VI secretion system (T6SS). Two copies of hcp genes are present in the Pst DC3000 genome, hcp1 (PSPTO_2539) and hcp2 (PSPTO_5435). We studied the expression patterns of hcp genes and tested the fitness of hcp knock-out mutants in host plant colonization and in inter-microbial competition. We found that the hcp2 gene is expressed, most actively at the stationary growth phase, and that the Hcp2 protein is secreted via T6SS and appears in the culture medium as covalently linked dimers. Expression of hcp2 is not induced in planta and it does not contribute to virulence or colonisation in tomato or Arabidopsis plants. Instead, hcp2 is required for survival in competition with enterobacteria and yeasts, and its function is associated with suppression of the growth of these competitors. This is the first report on bacterial T6SS-associated genes functioning in competition against yeast. Our results suggest that the T6SS of P. syringae may play an important role in bacterial fitness, allowing this plant pathogen to survive in conditions where it has to compete with other micro-organisms for resources.

The CtsR regulator of Listeria monocytogenes contains a variant glycine repeat region that affects piezotolerance, stress resistance, motility and virulence

A spontaneous high hydrostatic pressure (HHP)-tolerant mutant of Listeria monocytogenes ScottA, named AK01, was isolated previously. This mutant was immotile and showed increased resistance to heat, acid and H2O2 compared with the wild type (wt) (Karatzas, K.A.G. and Bennik, M.H.J. 2002 Appl Environ Microbiol 68: 3183–3189). In this study, we conclusively linked the increased HHP and stress tolerance of strain AK01 to a single codon deletion in ctsR (class three stress gene repressor) in a region encoding a highly conserved glycine repeat. CtsR negatively regulates the expression of the clp genes, including clpP, clpE and the clpC operon (encompassing ctsR itself), which belong to the class III heat shock genes. Allelic replacement of the ctsR gene in the wt background with the mutant ctsR gene, designated ctsRΔGly, rendered mutants with phenotypes and protein expression profiles identical to those of strain AK01. The expression levels of CtsR, ClpC and ClpP proteins were significantly higher in ctsRΔGly mutants than in the wt strain, indicative of the CtsRΔGly protein being inactive. Further evidence that the CtsRΔGly protein lacks its repressor function came from the finding that the Clp proteins in the mutant were not further induced upon heat shock, and that HHP tolerance of a ctsR deletion strain was as high as that of a ctsRΔGly mutant. The high HHP tolerance possibly results from the increased expression of the clp genes in the absence of (active) CtsR repressor. Importantly, the strains expressing CtsRΔGly show significantly attenuated virulence compared with the wt strain; however, no indication of disregulation of PrfA in the mutant strains was found. Our data highlight an important regulatory role of the glycine-rich region of CtsR in stress resistance and virulence.

Binding properties and adhesion-mediating regions of the major sheath protein of Treponema denticola ATCC 35405

There is growing evidence that a number of oral Treponema species, in particular Treponema denticola, are associated with the progression of human periodontal disease. The major sheath (or surface) protein (Msp) of T. denticola is implicated in adhesion of bacteria to host cells and tissue proteins and is likely to be an important virulence factor. However, the binding regions of the Msp are not known. We have purified from Escherichia coli recombinant Msp (rMsp) polypeptides corresponding to the following: full-length Msp (rMsp) minus 13 N-terminal amino acid (aa) residues, an amino-terminal fragment (rN-Msp, 189 aa residues), a 57-aa residue segment from the central region (rV-Msp), and a C-terminal fragment (rC-Msp, 272 aa residues). rMsp (530 aa residues) bound to immobilized fibronectin, keratin, laminin, collagen type 1, fibrinogen, hyaluronic acid, and heparin. The N- and V-region polypeptides, but not rC-Msp, also bound to these substrates. Binding of rMsp to fibronectin was targeted to the N-terminal heparin I/fibrin I domain. Antibodies to the N-region or V-region polypeptides, but not antibodies to the rC-Msp fragment, blocked adhesion of T. denticola ATCC 35405 cells to a range of host protein molecules. These results suggest that the N-terminal half of Msp carries epitopes that are surface exposed and that are involved in mediating adhesion. Binding of rMsp onto the cell surface of low-level fibronectin-binding Treponema isolates conferred a 10-fold increase in fibronectin binding. This confirms that Msp functions autonomously as an adhesin and raises the possibility that phenotypic complementation of virulence functions might occur within mixed populations of Treponema species.

PILZ Protein Structure and Interactions with PILB and the FIMX EAL Domain: Implications for Control of Type IV Pilus Biogenesis

The PilZ protein was originally identified as necessary for type IV pilus (T4P) biogenesis. Since then, a large and diverse family of bacterial PilZ homology domains have been identified, some of which have been implicated in signaling pathways that control important processes, including motility, virulence and biofilm formation. Furthermore, many PilZ homology domains, though not PilZ itself, have been shown to bind the important bacterial second messenger bis(3`-> 5`)cyclic diGMP (c-diGMP). The crystal structures of the PilZ orthologs from Xanthomonas axonopodis pv Citri (PilZ(XAC1133), this work) and from Xanthomonas campestris pv campestris (XC1028) present significant structural differences to other PilZ homologs that explain its failure to bind c-diGMP. NMR analysis of PilZ(XAC1133) shows that these structural differences are maintained in solution. In spite of their emerging importance in bacterial signaling, the means by which NZ proteins regulate specific processes is not clear. In this study, we show that PilZ(XAC1133) binds to PilB, an ATPase required for TV polymerization, and to the EAL domain of FiMX(XAC2398), which regulates TV biogenesis and localization in other bacterial species. These interactions were confirmed in NMR, two-hybrid and far-Western blot assays and are the first interactions observed between any PilZ domain and a target protein. While we were unable to detect phosphodiesterase activity for FimXX(AC2398) in vitro, we show that it binds c-diGMP both in the presence and in the absence of PilZ(XAC1133). Site-directed mutagenesis studies for conserved and exposed residues suggest that PilZ(XAC1133) interactions with FimX(XAC2398) and PilB(XAC3239) are mediated through a hydrophobic surface and an unstructured C-terminal extension conserved only in PilZ orthologs. The FimX-PilZ-PilB interactions involve a full set of ""degenerate"" GGDEF, EAL and PilZ domains and provide the first evidence of the means by which PilZ orthologs and FimX interact directly with the TP4 machinery. (C) 2009 Elsevier Ltd. All rights reserved.

Identification of an Operon, Pil-Chp, That Controls Twitching Motility and Virulence in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is an important phytopathogenic bacterium that causes many serious plant diseases, including Pierce`s disease of grapevines. Disease manifestation by X. fastidiosa is associated with the expression of several factors, including the type IV pili that are required for twitching motility. We provide evidence that an operon, named Pil-Chp, with genes homologous to those found in chemotaxis systems, regulates twitching motility. Transposon insertion into the pilL gene of the operon resulted in loss of twitching motility (pilL is homologous to cheA genes encoding kinases). The X. fastidiosa mutant maintained the type IV pili, indicating that the disrupted pilL or downstream operon genes are involved in pili function, and not biogenesis. The mutated X. fastidiosa produced less biofilm than wild-type cells, indicating that the operon contributes to biofilm formation. Finally, in planta the mutant produced delayed and less severe disease, indicating that the Pil-Chp operon contributes to the virulence of X. fastidiosa, presumably through its role in twitching motility.

Expression of the sigma35 and cry2AB genes involved in Bacillus thuringiensis virulence

Muitos genes estão envolvidos nos mecanismos de esporulação da bactéria Bacillus thuringiensis. A regulação e expressão desses genes resultam em uma produção massiva da proteína Cry, responsável pela morte das larvas de muitos insetos. Neste trabalho monitorou-se a expressão de genes de Bacillus thuringiensis, ao longo de três fases de seu desenvolvimento. Foram construídos macroarrays de DNA dos genes selecionados, cujas seqüências estão disponibilizadas no GenBank. Estes genes foram hibridizados com cDNAs obtidos de B. thuringiensis kurstaki HD-1. As sondas de cDNA foram sintetizadas a partir da transcrição reversa do RNA da bactéria, extraído durante as fases de crescimento logarítmico, estacionária e esporulativa, marcadas com 33PadCTP. A expressão diferencial encontrada foi significativa para dois genes de B.thuringiensis, um relacionado aos fatores sigma (sigma35) e outro ao gene cry (cry2Ab). Detectaram-se diferenças entre as médias de expressão do fator sigma e do gene cry2Ab. Os valores máximos de expressão diferencial foram obtidos para o gene codificador do fator sigma35 na fase log e na fase esporulativa. Na análise de médias observou-se expressão do gene cry2Ab apenas na fase log; no entanto, de forma bem mais baixa quando comparado com a expressão de sigma35, nas três fases.

Identification of a gene encoding adaptin-like protein in the Paracoccidioides brasiliensis genome by random amplified polymorphic DNA analysis

Paracoccidioides brasiliensis isolates are not homogeneous in their patterns of pathogenicity in animals and adhesion to epithelial cells. During this investigation, genotypic differences were observed between two samples of P. brasiliensis strain 18 yeast phase (Pbl 8) previously cultured many times, one taken before (Pb18a) and the other after (Pb18b) animal inoculation. Random amplified polymorphic DNA analysis using the primer OPJ4 distinguished Pb18b from Pbl Ba by one 308 bp DNA fragment, which after cloning and sequencing was shown to encode a polypeptide sequence homologous to the protein beta-adaptin. It is suggested, by comparison to other micro-organisms, that this protein might play an important role in the virulence of P. brasiliensis. This result demonstrates the influence of in vitro subculturing on the genotype of this organism.

Identification of Rv3852 as a nucleoid-associated protein in Mycobacterium tuberculosis

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

Salmonella enterica serovar typhimurium colonizing the lumen of the chicken intestine grows slowly and upregulates a unique set of virulence and metabolism genes

The pattern of global gene expression in Salmonella enterica serovar Typhimurium bacteria harvested from the chicken intestinal lumen (cecum) was compared with that of a late-log-phase LB broth culture using a whole-genome microarray. Levels of transcription, translation, and cell division in vivo were lower than those in vitro. S. Typhimurium appeared to be using carbon sources, such as propionate, 1,2-propanediol, and ethanolamine, in addition to melibiose and ascorbate, the latter possibly transformed to D-xylulose. Amino acid starvation appeared to be a factor during colonization. Bacteria in the lumen were non- or weakly motile and nonchemotactic but showed upregulation of a number of fimbrial and Salmonella pathogenicity island 3 (SPI-3) and 5 genes, suggesting a close physical association with the host during colonization. S. Typhimurium bacteria harvested from the cecal mucosa showed an expression profile similar to that of bacteria from the intestinal lumen, except that levels of transcription, translation, and cell division were higher and glucose may also have been used as a carbon source. © 2011, American Society for Microbiology.

Paracoccidoides brasiliensis 30 kDa Adhesin: Identification as a 14-3-3 Protein, Cloning and Subcellular Localization in Infection Models

Paracoccidoides brasiliensis adhesion to lung epithelial cells is considered an essential event for the establishment of infection and different proteins participate in this process. One of these proteins is a 30 kDa adhesin, pI 4.9 that was described as a laminin ligand in previous studies, and it was more highly expressed in more virulent P. brasiliensis isolates. This protein may contribute to the virulence of this important fungal pathogen. Using Edman degradation and mass spectrometry analysis, this 30 kDa adhesin was identified as a 14-3-3 protein. These proteins are a conserved group of small acidic proteins involved in a variety of processes in eukaryotic organisms. However, the exact function of these proteins in some processes remains unknown. Thus, the goal of the present study was to characterize the role of this protein during the interaction between the fungus and its host. To achieve this goal, we cloned, expressed the 14-3-3 protein in a heterologous system and determined its subcellular localization in in vitro and in vivo infection models. Immunocytochemical analysis revealed the ubiquitous distribution of this protein in the yeast form of P. brasiliensis, with some concentration in the cytoplasm. Additionally, this 14-3-3 protein was also present in P. brasiliensis cells at the sites of infection in C57BL/6 mice intratracheally infected with P. brasiliensis yeast cells for 72 h (acute infections) and 30 days (chronic infection). An apparent increase in the levels of the 14-3-3 protein in the cell wall of the fungus was also noted during the interaction between P. brasiliensis and A549 cells, suggesting that this protein may be involved in host-parasite interactions, since inhibition assays with the protein and this antibody decreased P. brasiliensis adhesion to A549 epithelial cells. Our data may lead to a better understanding of P. brasiliensis interactions with host tissues and paracoccidioidomycosis pathogenesis. © 2013 Silva et al.