Identification and characterization of a caspase-2 activating complex

Résumé Les caspases sont des protéases essentielles lors de l'induction de l'apoptose ou pour la maturation de certaines cytokines. Elles peuvent être divisées en deux groupes: les caspases initiatrices, qui sont les premières activées lors d'un signal pro-apoptotique, et les caspases effectrices, qui sont activées par les caspases initiatrices et sont responsables du clivage et de la dégradation des substrats cellulaires. Les caspases initiatrices sont activées dans des complexes de haut poids moléculaire: l'apoptosome pour la caspase-9 et le DISC pour la caspase-8. La caspase-2 est également une caspase initiatrice qui contient un domaine CARD. Cependant son mécanisme d'activation n'est pas encore connu. Lors de cette étude, nous avons découvert et caractérisé le complexe qui permet l'activation de la caspase-2. Ce complexe, appelé le PIDDosome, est composé de PIDD/LRDD, de la protéine adaptatrice RAIDD et de la protéase caspase-2. L'expression forcée de PIDD induit l'activation constitutive de la caspase-2. Cela entraîne la mort ou la sensibilisation à la mort des cellules selon la lignée étudiée. Cet effet est expliqué par une perte du potentiel de membrane de la mitochondrie, certainement dû à un effet direct de la caspase-2. Peu de choses sont connues sur PIDD: c'est une protéine contenant un domaine DD qui peut être induite par p53. Nous avons caractérisé PIDD et montré qu'elle est exprimée de façon ubiquitaire. PIDD est constitutivement auto-clivée environ au milieu de la protéine, ce qui génère deux fragments qui restent liés l'un à l'autre. Le fragment N-terminal a une activité régulatrice et le C-terminal une activité effectrice. De plus, PIDD peut se déplacer entre le cytoplasme et le noyau. Enfin, nous avons découvert que PIDD est également impliquée dans l'induction de NF¬ -κB en réponse à des dommages à l'ADN. PIDD est responsable de la modification par sumo de NEMO, étape nécessaire à l'induction de NF-κB après des dommages à l'ADN. Ainsi PIDD semble être à l'intersection de la décision que prend la cellule entre survivre et réparer les dommages, ou entrer en apoptose. Summary Caspases are a family of proteases that fulfill varied and often critical roles in mammalian apoptosis or proteolytic activation of cytokines. Caspases can be divided into two sub-groups: initiator caspases, which are the first activated after a pro-apoptotic signal, and effector caspases, which are activated by initiator caspases and that are responsible for the cleavage and degradation of cellular components. Initiator caspases are activated in high molecular weight platforms such as the apoptosome for caspase-9 or the DISC for caspase-8. Caspase-2 is a CARD-containing initiator caspase whose mechanism of activation was not yet known. In this study we have identified an activating platform for caspase-2. This high molecular weight complex, called the PIDDosome, is composed of PIDD/LRDD, the adaptor protein RAIDD and caspase-2. Constitutive expression of PIDD led to constitutive activation of caspase-2, which in some cell lines was sufficient to induce cell death while in others it merely sensitizes. Active caspase-2 was found to disturb directly the mitochondria by inducing a partial loss of the transmembrane potential. Very little was known on PIDD. It can be induce by p53 and inhibition of its expression by antisense oligonucleotides diminishes p53-dependent apoptosis. We decided to further characterize PIDD function and expression. PIDD possesses seven LRR, two Zu5 domains and one DD. It is ubiquitously expressed and appears to be constitutively cleaved by auto- processing into two main fragments equal in size. The two fragments remain bound to one another and constitute a regulatory N-terminal fragment and an active C-terminal fragment. In addition, PIDD can shuttle between the cytoplasm and the nucleus. Finally, investigating the possible relevance of new interaction partners, we found that PIDD is implicated in DNA damage-induced NF- κB. PIDD binds to RIP1 and to NEMO. In response to DNA damage, PIDD translocates to the nucleus and mediates sumo- modification of NEMO, a necessary step in DNA damage-induced NF-κB. All together these results raise the possibility that PIDD acts as a molecular switch between proliferation and repair, and apoptosis following DNA damage.

GENETIC AND BIOCHEMICAL ANALYSIS OF THE TESTIS-SPECIFIC ZINC FINGER PROTEIN CTCFL/BORIS

Abstract en FrançaisCTCFL a d'abord été identifié comme un paralogue de la protéine ubiquitaire CTCF en raison de sa forte homologie entre leurs onze « zinc fingers », un domaine de liaison à l'ADN. Parmi ses nombreux rôles, la liaison des zinc fingers de CTCF à la région de contrôle de l'empreinte (ICR) maternelle non-méthylée Igf2/H19, contrôle l'expression empreinte (monoallélique) de H19 et IGF2 dans les cellules somatiques. La méthylation de l'ICR Igf2/H19 paternelle est nécessaire à l'expression empreinte de ces deux gènes. Bien que le mécanisme par lequel l'ICR est méthylé soit mal compris, il est connu que l'établissement de la méthylation se produit pendant le développement des cellules germinales mâles et que les ADN méthyltransférases de novo DNMT3A et DNMT3L sont essentiels. Par conséquent, CTCFL fournit un bon candidat pour un rôle dans la méthylation de l'ICR paternelle Igf2/H19 en raison de son expression restreinte à certains types de cellules où la méthylation de l'ICR a lieu (spermatogonies et spermatocytes) ainsi qu'en raison sa capacité à lier les ICR lgf2/HÎ9 dans ces cellules. Les premiers travaux expérimentaux de cette thèse portent sur le rôle possible des mutations de CTCFL chez les patients atteints du syndrome de Silver-Russell (SRS), où une diminution de la méthylation de l'ICR IGF2/H19 a été observée chez 60% d'entre eux. Admettant que CTCFL pourrait être muté chez ces patients, j'ai examiné les mutations possibles de CTCFL chez 35 d'entre eux par séquençage de l'ADN et analyse du nombre de copies d'exons. N'ayant trouvé aucune mutation chez ces patients, cela suggère que les mutations de CTCFL ne sont pas associées au SRS. Les travaux expérimentaux suivants ont porté sur les modifications post-traductionnelles de CTCFL par la protéine SU MO « small ubiquitin-like modifier » (SUMO). La modification de protéines par SU MO change les interactions avec d'autres molécules (ADN ou protéines). Comme CTCFL régule sans doute l'expression d'un certain nombre de gènes dans le cancer et que plusieurs facteurs de transcription sont régulés par SUMO, j'ai mené des expériences pour déterminer si CTCFL est sumoylé. En effet, j'ai observé que CTCFL est sumoylated in vitro et in vivo et j'ai déterminé les deux résidus d'attachement de SUMO aux lysines 181 et 645. Utilisant les mutants de CTCFL K181R et K645R ne pouvant pas être sumoylated, j'ai évalué les conséquences fonctionnelles de la modification par SUMO. Je n'ai trouvé aucun changement significatif dans la localisation subcellulaire, la demi-vie ou la liaison à l'ADN, mais ai constaté que la sumoylation module à la fois {'activation CTCFL-dépendante et la répression de l'expression génique. Il s'agit de la première modification post-traductionnelle décrite pour CTCFL et les conséquences possibles de cette modification sont discutées pour le cancer et les testicules normaux. Avec cette thèse, j'espère avoir ajouté des résultats importants à l'étude de CTCFL et donné quelques idées pour de futures recherches.AbstractJeremiah Bernier-Latmani, Institute of Pathology, University of Lausanne, CHUVCTCFL was first identified as a paralog of the ubiquitous protein CTCF because of high homology between their respective eleven zinc fingers, a DNA binding domain. Among its many roles, CTCF zinc finger-mediated binding to the unmethylated maternal Igf2/H19 imprinting control region (ICR), controls the imprinted (monoallelic) expression of Igf2 and H19 in somatic cells. Methylation of the paternal Igf2/H19 ICR is necessary for the imprinted expression of the two genes. Although the mechanism by which the ICR is methylated is incompletely understood, it is known that establishment of methylation occurs during male germ cell development and the de novo DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3L are essential. Therefore, CTCFL provided a good candidate to play a role in methylation of the paternal Igf2/H19 ICR because of its restricted expression to cell types where ICR methylation takes place (spermatogonia and spermatocytes) and its ability to bind the Igf2/H19 ICR in these cells. The first experimental work of this thesis investigated the possible role of CTCFL mutations in Silver-Russell syndrome (SRS) patients, where it has been observed that 60% of the patients have reduced methylation of the IGF2/HÎ9 ICR. Reasoning that CTCFL could be mutated in these patients, I screened 35 patients for mutations in CTCFL by DNA sequencing and exon copy number analysis, I did not find any mutations in these patients suggesting that mutations of CTCFL are not associated with SRS. The next experimental work of my thesis focused on posttranslational modification of CTCFL by small ubiquitin-like modifier (SUMO) protein. SUMO modification of proteins changes the interactions with other molecules (DNA or protein). As CTCFL arguably regulates the expression of a number of genes in cancer and many transcription factors are regulated by SUMO, I conducted experiments to assess whether CTCFL is sumoylated. I found that CTCFL is sumoylated in vitro and in vivo and determined the two residues of SUMO attachment to be lysines 181 and 645. Using K181R, K645R mutated CTCFL- which cannot be detected to be sumoylated-1 assessed the functional consequences of SUMO modification. I found no significant changes in subcellular localization, half-life or DNA binding, but found that sumoylation modulates both CTCFL-dependent activation and repression of gene expression. This is the first posttranslational modification described for CTCFL and possible consequences of this modification are discussed in both cancer and normal testis. With this thesis, I hope I have added important findings to the study of CTCFL and provide some ideas for future research.

Impacto do sistema de microirrigacao no ambiente - salinidade

Trata-se do quinto estudo de monitorização e avaliação do impacto do sistema de rega gota a gota no meio ambiente encomendado pela ACDI/VOCA (Agricultural Cooperative Development International et Volunteers in Overseas Cooperative Assistance). Foram colhidas 45 amostras de solos e 29 de águas, nas parcelas dos agricultores beneficiários dos projectos financiados pela referida ONG na ilha de Santiago. Essas amostras foram analisadas no Laboratório de Análise de Solos, Águas e Plantas (LASAP) do INIDA para determinar o pH, a condutividade eléctrica (ECW), o cálcio (Ca) e magnésio (Mg) com objectivo de avaliar o grau de salinidade dos solos. 58 % dos solos analisados são considerados sem efeito salino ou muito pouco salino podendo receber a maioria das hortícola, mesmo as mais sensíveis aos sais e 11% só poderão receber culturas que toleram um alto grau de salinidade, nomeadamente beterraba, espargos, espinafres, repolho, tamareira, entre outras. os valores de condutividade eléctrica, encontrados em Achada Baleia (Egídio) , Baía e Cassunda, correspondem a solos classificados entre forte a muito fortemente salinos onde somente culturas altamente tolerantes aos sais atingem produções aceitáveis. As amostras de água, que ano passado, foram classificadas de boa para rega, aumentaram em média cerca de 40 mS/cm no valor condutividade eléctrica. Em termos médios, enquanto que no solo a quantidade de sais diminuiu ligeiramente, na água houve um aumento global do teor de sal. O valor máximo da condutividade eléctrica do solo encontrado no presente trabalho é de longe superior ao do ano passado para uma diferença de 1,77 mS/cm.

Role of the ubiquitin system in regulating ion transport.

Ion channels and transporters play a critical role in ion and fluid homeostasis and thus in normal animal physiology and pathology. Tight regulation of these transmembrane proteins is therefore essential. In recent years, many studies have focused their attention on the role of the ubiquitin system in regulating ion channels and transporters, initialed by the discoveries of the role of this system in processing of Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator (CFTR), and in regulating endocytosis of the epithelial Na(+) channel (ENaC) by the Nedd4 family of ubiquitin ligases (mainly Nedd4-2). In this review, we discuss the role of the ubiquitin system in ER Associated Degradation (ERAD) of ion channels, and in the regulation of endocytosis and lysosomal sorting of ion channels and transporters, focusing primarily in mammalian cells. We also briefly discuss the role of ubiquitin like molecules (such as SUMO) in such regulation, for which much less is known so far.

La paciente embarazada: repercusión en la cavidad bucal y consideraciones respecto al tratamiento odontológico

El embarazo conlleva una serie de cambios orgánicos, fisiológicos (del sistema cardiovascular y gastrointestinal, de la función pulmonar, hematológicos...) y de conducta que pueden repercutir en la cavidad bucal. El granuloma gravídico se considera una entidad patológica propia del embarazo. Podremos observar también en las pacientes gestantes un aumento en la incidencia de caries, asociado fundamentalmente a un incremento de Jos factores locales cariogénicos (descuido de la higiene bucal, cambio de Jos hábitos dietéticos y horarios...), y un posible empeoramiento de la patología gingival y periodontal asociado a las variaciones hormonales que acompañan al embarazo y a factores locales irritativos. El segundo trimestre de gestación será el momento ideal para llevar a cabo cualquier tratamiento dental rutinario. Deberemos ir con sumo cuidado en lo que se refiere a la administración de fármacos (penicilina, eritromicina, cefalosporinas de primera generación, paracetamol y lidocaína con vasoconstrictor se consideran fármacos de prescripción segura durante el embarazo) y la realización de radiografías dentales (es imprescindible colocar un delantal plomado a la paciente).

Educar des del testimoni: quan l'altre esdevé un referent

El encuentro personal ineludible que precisa todo hecho educativo puede tener múltiples presencias y ausencias que harán que la experiencia de cada persona se viva con una cromática distinta, dejando huellas mas o menos delimitadas y de mayor o menor calado sobre 10 que uno es y vive. Cualquier persona que se quiera educadora deberia tomarse el tiempo suficiente para contemplar el mundo y sus testigos, y para contemplarse a la vez a si mismo como testigo de su propia existencia tanto en relación con sus formas de presencia como en sus silencios en el decir, el hacer y el experenciar (que no experimentar). Éste quiere ser el motivo de reflexión que pretendo abrir desde estas lineas. Atreverse a afirmar que nuestro mundo esta falto de referentes podria inducirnos a pensar en un futuro educativo sin vinculos de tradición ni de cultura, en un presente que seria el vacio entre pasado y futuro, un presente sin anclajes ni raices. El maestro, testigo de referencia para sus alumnos, deberia de ser la mirada de transmisión cultural desde una relación de connotacion provocativamente educativa. Pero jcomo puede un maestro convertirse en testigo de referencia cuando 61 mismo, a menudo, no dispone de la significacion de sus propios referentes? ¿Que puede testimoniarse desde la ausencia de la búsqueda de identidad? El testigo -que en el caso del educador tiene la responsabilidad para con las nuevas generaciones- deberia haber vivido, experienciado y aprendido a significar cuanto quiere o puede o no quiere o no puede testimoniar. Y no se trata de justificar. Lo que uno ama de verdad es siempre injustificable, Únicamente puede vivirse y a 10 sumo transmitirse luego desde 10 que uno es. Identidad, mimesis y testimonio son las gravitaciones que orientan la relación educativa que sugiero. No se trata de buscar el acuerdo ni del discipulo ni del estudiante ni del alumno ni de 10s niños y jovenes de quienes cuidamos. Uno debe estar en posesion de cuanto quiere transmitir; el dialogo empieza con esta pasión.

Suorituskyvyn menestyksellinen ohjaaminen organisaatiossa

Henkilöstö on yrityksen yksi tärkeimmistä menestystekijöistä ja siksi on tärkeää, että työntekijät ovat sitoutuneita, motivoituneita ja toimivat tehokkaasti. Työn tavoitteena on kehittää organisaatioiden käyttöön suorituskyvyn menestyksellisen ohjaamisen työkalu, jolla voidaan mitata työmotivaation ja toiminnan tehokkuuden taustalla olevia tekijöitä. Kirjallisuudesta, aiemmista tutkimuksista ja haastatteluista selvisi viisi osa-aluetta, jotka vaikuttavat positiivisesti henkilöstön toiminnan tehokkuuteen, työmotivaation ja sitoutumiseen. Osa-alueet ovat tavoitteiden asettaminen, viestintä, henkilöstön vaikutusmahdollisuudet, palkitseminen ja motivointi sekä koulutukseen ja työympäristöön liittyvät tekijät. Jokaisen osa-alueen alle on kerätty kysymyksiä, jotka ovat jaettu kahteen osaan: avainkysymykset ja omavalinnaiset kysymykset. Avainkysymykset ovat sellaisia, joita suositellaan otettavaksi mukaan mittaukseen ja omavalinnaisten kysymysten valinta jää organisaation itsensä päätettäväksi. Näin saadaan organisaatioille mahdollisuus räätälöidä työkalu tarpeisiinsa ja strategiaan sopiviksi. Tutkimukseen empiirinen aineisto kerättiin haastattelemalla. Osallistuneista organisaatioista kaksi oli julkiselta sektorilta ja kuusi yksityiseltä sektorilta. Yksityisen sektorin yritykset koostuvat pienistä, keskisuurista ja suurista yrityksistä. Haastatteluilla kerättiin tietoa työkalun toteutusta ja sisältöä varten. SUMO-kartoituksesta saatuja mittaustuloksia organisaatio voi hyödyntää monella eri tavalla. Esimerkiksi organisaatio voi nähdä osa-alueiden ja toiminnan tehokkuuden kehitystarpeita sekä kuinka henkilöstön toimintaa voidaan tehostaa. Suorituskyvyn mittausjärjestelmän käytöllä on myös positiivisia vaikutuksia mittausosa-alueisiin.

Suorituskyvyn menestyksellinen ohjaaminen organisaatiossa

Henkilöstö on yrityksen yksi tärkeimmistä menestystekijöistä ja siksi on tärkeää, että työntekijät ovat sitoutuneita, motivoituneita ja toimivat tehokkaasti. Työn tavoitteena on kehittää organisaatioiden käyttöön suorituskyvyn menestyksellisen ohjaamisen työkalu, jolla voidaan mitata työmotivaation ja toiminnan tehokkuuden taustalla olevia tekijöitä. Kirjallisuudesta, aiemmista tutkimuksista ja haastatteluista selvisi viisi osa-aluetta, jotka vaikuttavat positiivisesti henkilöstön toiminnan tehokkuuteen, työmotivaation ja sitoutumiseen. Osa-alueet ovat tavoitteiden asettaminen, viestintä, henkilöstön vaikutusmahdollisuudet, palkitseminen ja motivointi sekä koulutukseen ja työympäristöön liittyvät tekijät. Jokaisen osa-alueen alle on kerätty kysymyksiä, jotka ovat jaettu kahteen osaan: avainkysymykset ja omavalinnaiset kysymykset. Avainkysymykset ovat sellaisia, joita suositellaan otettavaksi mukaan mittaukseen ja omavalinnaisten kysymysten valinta jää organisaation itsensä päätettäväksi. Näin saadaan organisaatioille mahdollisuus räätälöidä työkalu tarpeisiinsa ja strategiaan sopiviksi. Tutkimukseen empiirinen aineisto kerättiin haastattelemalla. Osallistuneista organisaatioista kaksi oli julkiselta sektorilta ja kuusi yksityiseltä sektorilta. Yksityisen sektorin yritykset koostuvat pienistä, keskisuurista ja suurista yrityksistä. Haastatteluilla kerättiin tietoa työkalun toteutusta ja sisältöä varten. SUMO-kartoituksesta saatuja mittaustuloksia organisaatio voi hyödyntää monella eri tavalla. Esimerkiksi organisaatio voi nähdä osa-alueiden ja toiminnan tehokkuuden kehitystarpeita sekä kuinka henkilöstön toimintaa voidaan tehostaa. Suorituskyvyn mittausjärjestelmän käytöllä on myös positiivisia vaikutuksia mittausosa-alueisiin.

The Smc5/6 complex is required for dissolution of DNA-mediated sister chromatid linkages

Mitotic chromosome segregation requires the removal of physical connections between sister chromatids. In addition to cohesin and topological entrapments, sister chromatid separation can be prevented by the presence of chromosome junctions or ongoing DNA replication. We will collectively refer to them as DNA-mediated linkages. Although this type of structures has been documented in different DNA replication and repair mutants, there is no known essential mechanism ensuring their timely removal before mitosis. Here, we show that the dissolution of these connections is an active process that requires the Smc5/6 complex, together with Mms21, its associated SUMO-ligase. Failure to remove DNA-mediated linkages causes gross chromosome missegregation in anaphase. Moreover, we show that Smc5/6 is capable to dissolve them in metaphase-arrested cells, thus restoring chromosome resolution and segregation. We propose that Smc5/6 has an essential role in the removal of DNA-mediated linkages to prevent chromosome missegregation and aneuploidy.

Regulation of recombination at yeast nuclear pores controls repair and triplet repeat stability.

Secondary structure-forming DNA sequences such as CAG repeats interfere with replication and repair, provoking fork stalling, chromosome fragility, and recombination. In budding yeast, we found that expanded CAG repeats are more likely than unexpanded repeats to localize to the nuclear periphery. This positioning is transient, occurs in late S phase, requires replication, and is associated with decreased subnuclear mobility of the locus. In contrast to persistent double-stranded breaks, expanded CAG repeats at the nuclear envelope associate with pores but not with the inner nuclear membrane protein Mps3. Relocation requires Nup84 and the Slx5/8 SUMO-dependent ubiquitin ligase but not Rad51, Mec1, or Tel1. Importantly, the presence of the Nup84 pore subcomplex and Slx5/8 suppresses CAG repeat fragility and instability. Repeat instability in nup84, slx5, or slx8 mutant cells arises through aberrant homologous recombination and is distinct from instability arising from the loss of ligase 4-dependent end-joining. Genetic and physical analysis of Rad52 sumoylation and binding at the CAG tract suggests that Slx5/8 targets sumoylated Rad52 for degradation at the pore to facilitate recovery from acute replication stress by promoting replication fork restart. We thereby confirmed that the relocation of damage to nuclear pores plays an important role in a naturally occurring repair process.

Efeito da radiação gama sobre o perfil sensorial de suco de laranja

O trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de doses de radiações sobre as características sensoriais do suco fresco de laranja variedade 'Pêra' (Citrus sinensis L) conservado sob refrigeração. Utilizou-se amostras de suco de laranja refrigerado (controle) e suco de laranja refrigerado irradiado com 1,5 e 3,0kGy por hora (Cobalto60), armazenadas a 4ºC por 1, 7, 14 e 21 dias a 4ºC. Para a análise sensorial realizou-se a Análise Descritiva Quantitativa, na qual provadores selecionados e treinados avaliaram a aparência, aroma, sabor e textura oral dos sucos. As doses de radiação alteraram características de aparência como cor, brilho e grumosidade. As amostras de suco irradiados apresentaram coloração amarelo mais claro, maior brilho e menor grumosidade que o suco controle. Os sucos irradiados apresentaram também maior intensidade de aroma cozido, passado e artificial, gosto ácido, amargo, sabor cozido, de sumo, passado e de laranja artificial. As doses de radiação utilizadas alteraram as características de corpo e adstringência. A cor e a grumosidade do suco não irradiado intensificaram-se com o tempo de armazenamento. Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que a irradiação do suco promoveu alterações nas características sensoriais.

Suorituskyvyn johtaminen metalliteollisuuden yrityksessä

Tutkimuksen tavoitteena on selvittää, mitkä tekijät ovat tärkeimpiä yrityksen suorituskyvyn johtamisessa metalliteollisuusyrityksessä. Tavoitteena on myös löytää tekijät, joilla henkilökunta saadaan motivoitua ja sitoutettua yrityksen toimintaan. Lisäksi tavoitteena on saada selvitettyä kohdeyrityksen suorituskyvyn johtamisen nykytila. Tutkimus on empiirinen tutkimus, jossa käytetään kvantitatiivista eli määrällistä analyysia. Tutkimuksen teoreettisessa osuudessa tarkastellaan tutkimuksen aihetta perehtymällä aikaisempiin tutkimuksiin ja kirjallisuuteen. Kohdeyrityksen nykytilan kartoituksessa käytettiin valmista SUMO-kartoitusta, joka mittaa työmotivaation ja toiminnan tehostumisen taustalla vaikuttavia tekijöitä. Suorituskyvyn menestyksellinen johtaminen metalliteollisuusyrityksessä vaatii toimivaa suorituskyvyn mittaamisjärjestelmää, jota analysoimalla pystytään tekemään päätöksiä tulevaisuuden toimenpiteistä. Suorituskyvyn mittaaminen pitäisi lisäksi kytkeä palkitsemiseen. Työntekijöiden työmotivaatioon ja sitoutumiseen voidaan vaikuttaa monella tapaa. Työmotivaatioon ja sitoutumiseen vaikuttavat työntekijöiden vaikutus- ja koulutusmahdollisuudet sekä palkitseminen, viestintä ja tavoitteet. Näiden tekijöiden luomisessa johtaminen on avainasemassa.

La monnaie en droit : nature d'une abstraction outre fondée : essai dialectique et logique sur la dualité dans la catégoricité juridique et sur l'abstraction d'hérédité monétaire

"Thèse présentée à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de Docteur en droit (LL.D.)"

Interactions protéiques et relation dynamique entre phosphorylation / sumoylation / ubiquitination des protéines TIF1α, β et PML: détection in vivo par BRET

Trois protéines de la famille TRIM (Motif TRIpartite), TIF1α, β (Transcriptional Intermediary Factor 1) et PML (ProMyelocytic Leukaemia¬), font l’objet de cette étude. TIF1α est connu comme un coactivateur des récepteurs nucléaires et TIF1β comme le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc dont le prototype étudié ici est ZNF74. PML possède divers rôles dont le plus caractérisé est celui d’être l’organisateur principal et essentiel des PML-NBs (PML-Nuclear Bodies), des macrostructures nucléaires très dynamiques regroupant et coordonnant plus de 40 protéines. Il est à noter que la fonction de TIF1α, β et PML est régulée par une modification post-traductionnelle, la sumoylation, qui implique le couplage covalent de la petite protéine SUMO (Small Ubiquitin like MOdifier) à des lysines de ces trois protéines cibles. Cette thèse propose de développer des méthodes utilisant le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfert) afin de détecter dans des cellules vivantes et en temps réel des interactions non-covalentes de protéines nucléaires mais aussi leur couplage covalent à SUMO. En effet, le BRET n’a jamais été exploré jusqu’alors pour étudier les interactions non-covalentes et covalentes de protéines nucléaires. L’étude de l’interaction de protéines transcriptionnellement actives est parfois difficile par des méthodes classiques du fait de leur grande propension à agréger (famille TRIM) ou de leur association à la matrice nucléaire (ZNF74). L’homo et l’hétérodimérisation de TIF1α, β ainsi que leur interaction avec ZNF74 sont ici testées sur des protéines entières dans des cellules vivantes de mammifères répondant aux résultats conflictuels de la littérature et démontrant que le BRET peut être avantageusement utilisé comme alternative aux essais plus classiques basés sur la transcription. Du fait de l’hétérodimérisation confirmée de TIF1α et β, le premier article présenté ouvre la possibilité d’une relation étroite entre les récepteurs nucléaires et les protéines KRAB- multidoigt de zinc. Des études précédentes ont démontré que la sumoylation de PML est impliquée dans sa dégradation induite par l’As2O3 et dépendante de RNF4, une E3 ubiquitine ligase ayant pour substrat des chaînes de SUMO (polySUMO). Dans le second article, grâce au développement d’une nouvelle application du BRET pour la détection d’interactions covalentes et non-covalentes avec SUMO (BRETSUMO), nous établissons un nouveau lien entre la sumoylation de PML et sa dégradation. Nous confirmons que le recrutement de RNF4 dépend de SUMO mais démontrons également l’implication du SBD (Sumo Binding Domain) de PML dans sa dégradation induite par l’As2O3 et/ou RNF4. De plus, nous démontrons que des sérines, au sein du SBD de PML, qui sont connues comme des cibles de phosphorylation par la voie de la kinase CK2, régulent les interactions non-covalentes de ce SBD mettant en évidence, pour la première fois, que les interactions avec un SBD peuvent dépendre d’un évènement de phosphorylation (“SBD phospho-switch”). Nos résultats nous amènent à proposer l’hypothèse que le recrutement de PML sumoylé au niveau des PML-NBs via son SBD, favorise le recrutement d’une autre activité E3 ubiquitine ligase, outre celle de RNF4, PML étant lui-même un potentiel candidat. Ceci suggère l’existence d’une nouvelle relation dynamique entre phosphorylation, sumoylation et ubiquitination de PML. Finalement, il est suggéré que PML est dégradé par deux voies différentes dépendantes de l’ubiquitine et du protéasome; la voie de CK2 et la voie de RNF4. Enfin une étude sur la sumoylation de TIF1β est également présentée en annexe. Cette étude caractérise les 6 lysines cibles de SUMO sur TIF1β et démontre que la sumoylation est nécessaire à l’activité répressive de TIF1β mais n’est pas impliquée dans son homodimérisation ou son interaction avec la boîte KRAB. La sumoylation est cependant nécessaire au recrutement d’histones déacétylases, dépendante de son homodimérisation et de l’intégrité du domaine PHD. Alors que l’on ne connaît pas de régulateur physiologique de la sumoylation outre les enzymes directement impliquées dans la machinerie de sumoylation, nous mettons en évidence que la sumoylation de TIF1β est positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB et suggérons que ces facteurs transcriptionnels recrutent TIF1β à l’ADN au niveau de promoteur et augmentent son activité répressive en favorisant sa sumoylation.

Régulation de l'activité transcriptionnelle du récepteur nucléaire FXR par la ghréline et les modifications post-traductionnelles

Le récepteur X des farnésoïdes (FXR) fait partie de la superfamille des récepteurs nucléaires et agit comme un facteur de transcription suite à la liaison d’un ligand spécifique. Le récepteur FXR, activé par les acides biliaires, joue un rôle essentiel dans le métabolisme des lipides et du glucose en plus de réguler l’homéostasie des acides biliaires. Notre laboratoire a récemment mis en évidence une nouvelle voie de régulation du récepteur PPARγ en réponse au récepteur de la ghréline. En effet, la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de PPARγ via une cascade de signalisation impliquant les kinases Erk1/2 et Akt, supportant un rôle périphérique de la ghréline dans les pathologies associées au syndrome métabolique. Il est de plus en plus reconnu que la cascade métabolique impliquant PPARγ fait également intervenir un autre récepteur nucléaire, FXR. Dans ce travail, nous montrons que la ghréline induit l’activation transcriptionnelle de FXR de manière dose-dépendante et induit également la phosphorylation du récepteur sur ses résidus sérine. En utilisant des constructions tronquées ABC et CDEF de FXR, nous avons démontré que la ghréline régule l’activité de FXR via les domaines d’activation AF-1 et AF-2. L’effet de la ghréline et du ligand sélectif GW4064 sur l’induction de FXR est additif. De plus, nous avons démontré que FXR est la cible d’une autre modification post-traductionnelle, soit la sumoylation. En effet, FXR est un substrat cellulaire des protéines SUMO-1 et SUMO-3 et la sumoylation du récepteur est ligand-indépendante. SUMO-1 et SUMO-3 induisent l’activation transcriptionnelle de FXR de façon dose-dépendante. Nos résultats indiquent que la lysine 122 est le site prédominant de sumoylation par SUMO-1, quoiqu’un mécanisme de coopération semble exister entre les différents sites de sumoylation de FXR. Avec son rôle émergeant dans plusieurs voies du métabolisme lipidique, l’identification de modulateurs de FXR s’avère être une approche fort prometteuse pour faire face à plusieurs pathologies associées au syndrome métabolique et au diabète de type 2.