Quinoxaline, its derivatives and applications: a state of the art review

Quinoxaline derivatives are an important class of heterocycle compounds, where N replaces some carbon atoms in the ring of naphthalene. Its molecular formula is C8H6N2, formed by the fusion of two aromatic rings, benzene and pyrazine. It is rare in natural state, but their synthesis is easy to perform. In this review the State of the Art will be presented, which includes a summary of the progress made over the past years in the knowledge of the structure and mechanism of the quinoxaline and quinoxaline derivatives, associated medical and biomedical value as well as industrial value. Modifying quinoxaline structure it is possible to obtain a wide variety of biomedical applications, namely antimicrobial activities and chronic and metabolic diseases treatment.

Synthesis, characterization and applications of new schiff base fluorescent chemosensors for metal and DNA interactions: conventional and "green" approaches

Dissertação apresentada para a obtenção do Grau de Doutor em Química Sustentável, especialidade de Química-Física Inorgânica, pela Universidade Nova de Lisboa, Faculdade de Ciências e Tecnologia

The use of forensic polycyclic aromatic hydrocarbon signatures and Compound Ratio Analysis Techniques (CORAT) for the source characterisation of petrogenic/pyrogenic environmental releases.

This study utilised recent developments in forensic aromatic hydrocarbon fingerprint analysis to characterise and identify specific biogenic, pyrogenic and petrogenic contamination. The fingerprinting and data interpretation techniques discussed include the recognition of: The distribution patterns of hydrocarbons (alkylated naphthalene, phenanthrene, dibenzothiophene, fluorene, chrysene and phenol isomers), • Analysis of “source-specific marker” compounds (individual saturated hydrocarbons, including n-alkanes (n-C5 through 0-C40) • Selected benzene, toluene, ethylbenzene and xylene isomers (BTEX), • The recalcitrant isoprenoids; pristane and phytane and • The determination of diagnostic ratios of specific petroleum / non-petroleum constituents, and the application of various statistical and numerical analysis tools. An unknown sample from the Irish Environmental Protection Agency (EPA) for origin characterisation was subjected to analysis by gas chromatography utilising both flame ionisation and mass spectral detection techniques in comparison to known reference materials. The percentage of the individual Polycyclic Aromatic Hydrocarbons (PAIIs) and biomarker concentrations in the unknown sample were normalised to the sum of the analytes and the results were compared with the corresponding results with a range of reference materials. In addition, to the determination of conventional diagnostic PAH and biomarker ratios, a number of “source-specific markers” isomeric PAHs within the same alkylation levels were determined, and their relative abundance ratios were computed in order to definitively identify and differentiate the various sources. Statistical logarithmic star plots were generated from both sets of data to give a pictorial representation of the comparison between the unknown sample and reference products. The study successfully characterised the unknown sample as being contaminated with a “coal tar” and clearly demonstrates the future role of compound ratio analysis (CORAT) in the identification of possible source contaminants.

On the use of reporter bacteria for measuring availability of organic contaminants

Natural environments are constantly challenged by the release of hydrophobic organic contaminants, which represent a threat for both the ecosystem and human health. Despite a substantial degradation by naturally occurring micro-organisms, a non negligible fraction of these pollutants tend to persist in soil and sediments due to their reduced accessibility to microbial degraders. This lack of 'bioavailability' is acknowledged as a key parameter for the natural and stimulated clean-up (bioremediation) of contaminated sites. We developed a bacterial bioreporter that responds to the presence of polyaromatic hydrocarbons (PAHs) by the production of the green fluorescent protein (GFP), based on the PAH-degrading bacterium Burkholderia sartisoli. We showed in this study that the bacterial biosensor B. sartisoli strain RP037 was faithfully reporting the degradation of naphthalene and phenanthrene (two PAHs of low molecular weight) via the production of GFP. What is more, the magnitude of GFP induction was influenced by change in the PAH flux triggered by a variety of physico-chemical parameters, such as the contact surface between the pollutant and the aqueous suspension. Further experiments permitted to test the influence of dissolved organic matter, which is an important component of natural habitats and can interact with organic pollutants. In addition, we tested the influence of two types of biosurfactants (tensio-active agents produced by living organisms) on phenanthrene's degradation by RP037. Interestingly, the surfactant's effects on the biodegradation rate appeared to depend on the type of biosurfactant and probably on the type of bacterial strain. Finally, we tagged B. sartisoli strain RP037 with a constitutively expressed mCherry fluorescent protein. The presence of mCherry allowed us to visualize the bacteria in complex samples even when GFP production was not induced. The new strain RP037-mChe embedded in a gel patch was used to detect PAH fluxes from a point source, such as a non-aqueous liquid or particles of contaminated soil. In parallel, we also developed and tested a so-called multiwell bacterial biosensor platform, which permitted the simultaneous use of four different reporter strains for the detection of major crude oil components (e.g., saturated hydrocarbons, mono- and polyaromatics) in aqueous samples. We specifically constructed the strain B. sartisoli RP007 (pPROBE-phn-luxAB) for the detection of naphthalene and phenanthrene. It was equipped with a reporter plasmid similar to the one in strain RP037, except that the gfp gene was replaced by the genes luxAB, which encoded the bacterial luciferase. The strain was implemented in the biosensor platform and detected an equivalent naphthalene concentration in oil spilled-sea water. We also cloned the gene for the transcriptional activator AlkS and the operator/promoter region of the operon alkSB1GHJ from the alkane-degrader bacterium Alcanivorax borkumensis strain SK2 in order to construct a new bacterial biosensor with higher sensitivity towards long-chain alkanes. However, the resulting strain showed no increased light emission in presence of tetradecane (C14), while it still efficiently reported low concentrations of octane (C8). RÉSUMÉ : Les écosystèmes naturels sont constamment exposés à nombre de contaminants organiques hydrophobes (COHs) d'origine industrielle, agricole ou même naturelle. Les COHs menacent à la fois l'environnement, le bien-être des espèces animales et végétales et la santé humaine, mais ils peuvent être dégradés par des micro-organismes tels que les bactéries et les champignons, qui peuvent être capables des les transformer en produits inoffensifs comme le gaz carbonique et l'eau. La biodégradation des COHs est cependant fréquemment limitée par leur pauvre disponibilité envers les organismes qui les dégradent. Ainsi, bien que la biodégradation opère partiellement, les COHs persistent dans l'environnement à de faibles concentrations qui potentiellement peuvent encore causer des effets toxiques chroniques. Puisque la plupart des COHs peuvent être métabolisés par l'activité microbienne, leur persistance a généralement pour origine des contraintes physico-chimiques plutôt que biologiques. Par exemple, leur solubilité dans l'eau très limitée réduit leur prise par des consommateurs potentiels. De plus, l'adsorption à la matière organique et la séquestration dans les micropores du sol participent à réduire leur disponibilité envers les microbes. Les processus de biodisponibilité, c'est-à-dire les processus qui gouvernent la dissolution et la prise de polluants par les organismes vivants, sont généralement perçus comme des paramètres clés pour la dépollution (bioremédiation) naturelle et stimulée des sites contaminés. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAPs) sont un modèle de COH produits par les activités aussi bien humaines que naturelles, et listés comme des contaminants chroniques de l'air, des sols et des sédiments. Ils peuvent être dégradés par un vaste nombre d'espèces bactériennes mais leur taux de biodégradation est souvent limité par les contraintes mentionnées ci-dessus. Afin de comprendre les processus de biodisponibilité pour les cellules bactériennes, nous avons décidé d'utiliser les bactéries elles-mêmes pour détecter et rapporter les flux de COH. Ceci a été réalisé par l'application d'une stratégie de conception visant à produire des bactéries `biocapteurs-rapporteurs', qui littéralement s'allument lorsqu'elles détectent un composé cible pour lequel elles ont été conçues. En premier lieu, nous nous sommes concentrés sur Burkholderia sartisoli (souche RP007), une bactérie isolée du sol et consommatrice de HAP .Cette souche a servi de base à la construction d'un circuit génétique permettant la formation de la protéine autofluorescente GFP dès que les cellules détectent le naphtalène ou le phénanthrène, deux HAP de faible masse moléculaire. En effet, nous avons pu montrer que la bactérie obtenue, la souche RP037 de B. sartisoli, produit une fluorescence GFP grandissante lors d'une exposition en culture liquide à du phénanthrène sous forme cristalline (0.5 mg par ml de milieu de culture). Nous avons découvert que pour une induction optimale il était nécessaire de fournir aux cellules une source additionnelle de carbone sous la forme d'acétate, ou sinon seul un nombre limité de cellules deviennent induites. Malgré cela, le phénanthrène a induit une réponse très hétérogène au sein de la population de cellules, avec quelques cellules pauvrement induites tandis que d'autres l'étaient très fortement. La raison de cette hétérogénéité extrême, même dans des cultures liquides mélangées, reste pour le moment incertaine. Plus important, nous avons pu montrer que l'amplitude de l'induction de GFP dépendait de paramètres physiques affectant le flux de phénanthrène aux cellules, tels que : la surface de contact entre le phénanthrène solide et la phase aqueuse ; l'ajout de surfactant ; le scellement de phénanthrène à l'intérieur de billes de polymères (Model Polymer Release System) ; la dissolution du phénanthrène dans un fluide gras immiscible à l'eau. Nous en avons conclu que la souche RP037 détecte convenablement des flux de phénantrène et nous avons proposé une relation entre le transfert de masse de phénanthrène et la production de GFP. Nous avons par la suite utilisé la souche afin d'examiner l'effet de plusieurs paramètres chimiques connus dans la littérature pour influencer la biodisponibilité des HAP. Premièrement, les acides humiques. Quelques rapports font état que la disponibilité des HAP pourrait être augmentée par la présence de matière organique dissoute. Nous avons mesuré l'induction de GFP comme fonction de l'exposition des cellules RP037 au phénanthrène ou au naphtalène en présence ou absence d'acides humiques dans la culture. Nous avons testé des concentrations d'acides humiques de 0.1 et 10 mg/L, tandis que le phénanthrène était ajouté via l'heptamethylnonane (HMN), un liquide non aqueux, ce qui au préalable avait produit le plus haut flux constant de phénanthrène aux cellules. De plus, nous avons utilisé des tests en phase gazeuse avec des concentrations d'acides humiques de 0.1, 10 et 1000 mg/L mais avec du naphtalène. Contrairement à ce que décrit la littérature, nos résultats ont indiqué que dans ces conditions l'expression de GFP en fonction de l'exposition au phénanthrène dans des cultures en croissance de la souche RP037 n'était pas modifiée par la présence d'acides humiques. D'un autre côté, le test en phase gazeuse avec du naphtalène a montré que 1000 mg/L d'acides humiques abaissent légèrement mais significativement la production de GFP dans les cellules de RP037. Nous avons conclu qu'il n'y a pas d'effet général des acides humiques sur la disponibilité des HAP pour les bactéries. Par la suite, nous nous sommes demandé si des biosurfactants modifieraient la disponibilité du phénanthrène pour les bactéries. Les surfactants sont souvent décrits dans la littérature comme des moyens d'accroître la biodisponibilité des COHs. Les surfactants sont des agents tensio-actifs qui augmentent la solubilité apparente de COH en les dissolvant à l'intérieur de micelles. Nous avons ainsi testé si des biosurfactants (des surfactants produits par des organismes vivants) peuvent être utilisé pour augmenter la biodisponibilité du phénanthrène pour la souche B. sartisoli RP037. Premièrement, nous avons tenté d'obtenir des biosurfactants produits par une autre bactérie vivant en co-culture avec les biocapteurs bactériens. Deuxièmement, nous avons utilisé des biosurfactants purifiés. La co-cultivation en présence de la bactérie productrice de lipopeptide Pseudomonas putida souche PCL1445 a augmenté l'expression de GFP induite par le phénanthrène chez B. sartisoli en comparaison des cultures simples, mais cet effet n'était pas significativement différent lorsque la souche RP037 était co-cultivée avec un mutant de P. putida ne produisant pas de lipopeptides. L'ajout de lipopeptides partiellement purifiés dans la culture de RP037 a résulté en une réduction de la tension de surface, mais n'a pas provoqué de changement dans l'expression de GFP. D'un autre côté, l'ajout d'une solution commerciale de rhamnolipides (un autre type de biosurfactants produits par Pseudomonas spp.) a facilité la dégradation du phénanthrène par la souche RP037 et induit une expression de GFP élevée dans une plus grande proportion de cellules. Nous avons ainsi conclu que les effets des biosurfactants sont mesurables à l'aide de la souche biocapteur, mais que ceux-ci sont dépendants du type de surfactant utilisé conjointement avec le phénanthrène. La question suivante que nous avons abordée était si les tests utilisant des biocapteurs peuvent être améliorés de manière à ce que les flux de HAP provenant de matériel contaminé soient détectés. Les tests en milieu liquide avec des échantillons de sol ne fournissant pas de mesures, et sachant que les concentrations de HAP dans l'eau sont en général extrêmement basses, nous avons conçu des tests de diffusion dans lesquels nous pouvons étudier l'induction par les HAPs en fonction de la distance aux cellules. Le biocapteur bactérien B. sartisoli souche RP037 a été marqué avec une seconde protéine fluorescente (mCherry), qui est constitutivement exprimée dans les cellules et leur confère une fluorescence rouge/rose. La souche résultante RP037-mChe témoigne d'une fluorescence rouge constitutive mais n'induit la fluorescence verte qu'en présence de naphtalène ou de phénanthrène. La présence d'un marqueur fluorescent constitutif nous permet de visualiser les biocapteurs bactériens plus facilement parmi des particules de sol. Un test de diffusion a été conçu en préparant un gel fait d'une suspension de cellules mélangées à 0.5 % d'agarose. Des bandes de gel de dimensions 0.5 x 2 cm x 1 mm ont été montées dans des chambres d'incubation et exposées à des sources de HAP (soit dissouts dans du HMN ou en tant que matériel solide, puis appliqués à une extrémité de la bande). En utilisant ce montage expérimental, le naphtalène ou le phénanthrène (dissouts dans du HMN à une concentration de 2.5 µg/µl) ont induit un gradient d'intensité de fluorescence GFP après 24 heures d'incubation, tandis que la fluorescence mCherry demeurait comparable. Un sol contaminé par des HAPs (provenant d'un ancien site de production de gaz) a induit la production de GFP à un niveau comparable à celui du naphtalène. Des biocapteurs bactériens individuels ont également détecté un flux de phénanthrène dans un gel contenant des particules de sol amendées avec 1 et 10 mg/g de phénanthrène. Ceci a montré que le test de diffusion peut être utilisé pour mesurer des flux de HAP provenant de matériel contaminé. D'un autre côté, la sensibilité est encore très basse pour plusieurs sols contaminés, et l'autofluorescence de certains échantillons rend difficile l'identification de la réponse de la GFP chez les cellules. Pour terminer, un des points majeurs de ce travail a été la production et la validation d'une plateforme multi-puits de biocapteurs bactériens, qui a permis l'emploi simultané de plusieurs souches différentes de biocapteurs pour la détection des constituants principaux du pétrole. Pour cela nous avons choisi les alcanes linéaires, les composés mono-aromatiques, les biphényls et les composés poly-aromatiques. De plus, nous avons utilisé un capteur pour la génotoxicité afin de détecter la `toxicité globale' dans des échantillons aqueux. Plusieurs efforts d'ingénierie ont été investis de manière à compléter ce set. En premier lieu, chaque souche a été équipée avec soit gfp, soit luxAB en tant que signal rapporteur. Deuxièmement, puisqu'aucune souche de biocapteur n'était disponible pour les HAP ou pour les alcanes à longues chaînes, nous avons spécifiquement construit deux nouveaux biocapteurs. L'un d'eux est également basé sur B. sartisoli RP007, que nous avons équipé avec le plasmide pPROBE-phn-luxAB pour la détection du naphtalène et du phénanthrène mais avec production de luciférase bactérienne. Un autre est un nouveau biocapteur bactérien pour les alcanes. Bien que nous possédions une souche Escherichia coli DHS α (pGEc74, pJAMA7) détectant les alcanes courts de manière satisfaisante, la présence des alcanes à longues chaînes n'était pas rapportée efficacement. Nous avons cloné le gène de l'activateur transcriptionnel A1kS ainsi que la région opérateur/promoteur de l'opéron alkSB1GHJ chez la bactérie dégradant les alcanes Alcanivorax borkumensis souche SK2, afin de construire un nouveau biocapteur bactérien bénéficiant d'une sensibilité accrue envers les alcanes à longues chaînes. Cependant, la souche résultante E. coli DHSα (pAlk3} n'a pas montré d'émission de lumière augmentée en présence de tétradécane (C14), tandis qu'elle rapportait toujours efficacement de basses concentrations d'octane (C8). De manière surprenante, l'utilisation de A. borkumensis en tant que souche hôte pour le nouveau plasmide rapporteur basé sur la GFP a totalement supprimé la sensibilité pour l'octane, tandis que la détection de tétradécane n'était pas accrue. Cet aspect devra être résolu dans de futurs travaux. Pour calibrer la plateforme de biocapteurs, nous avons simulé une fuite de pétrole en mer dans une bouteille en verre ouverte de 5L contenant 2L d'eau de mer contaminée avec 20 ml (1%) de pétrole brut. La phase aqueuse a été échantillonée à intervalles réguliers après la fuite durant une période allant jusqu'à une semaine tandis que les principaux contaminants pétroliers étaient mesurés via les biocapteurs. L'émission de bioluminescence a été mesurée de manière à déterminer la réponse des biocapteurs et une calibration intégrée faite avec des inducteurs types a servi à calculer des concentrations d'équivalents inducteurs dans l'échantillon. E. coli a été utilisée en tant que souche hôte pour la plupart des spécificités des biocapteurs, à l'exception de la détection du naphtalène et du phénanthrène pour lesquels nous avons utilisé B. sartisoli. Cette souche, cependant, peut être employée plus ou moins selon la même procédure. Il est intéressant de noter que le pétrole répandu a produit une apparition séquentielle de composés dissouts dans la phase aqueuse, ceux-ci .étant détectables par les biocapteurs. Ce profil contenait d'abord les alcanes à courtes chaînes et les BTEX (c'est-à dire benzène, toluène, éthylbenzène et xylènes), apparaissant entre des minutes et des heures après que le pétrole a été versé. Leurs concentrations aqueuses ont par la suite fortement décru dans l'eau échantillonnée après 24 heures, à cause de la volatilisation ou de la biodégradation. Après quelques jours d'incubation, ces composés sont devenus indétectables. Les HAPs, en revanche, sont apparus plus tard que les alcanes et les BTEX, et leur concentration a augmenté de pair avec un temps d'incubation prolongé. Aucun signal significatif n'a été mis en évidence avec le biocapteur pour le biphényl ou pour la génotoxicité. Ceci démontre l'utilité de ces biocapteurs, spécifiquement pour la détection des composés pétroliers, comprenant les alcanes à courtes chaînes, les BTEX et les HAPs légers.

Development of a novel headspace sorptive extraction method to study the aging of volatile compounds in spent handgun cartridges

Estimating the time since the last discharge of firearms and/or spent cartridges may be a useful piece of information in forensic firearm-related cases. The current approach consists of studying the diffusion of selected volatile organic compounds (such as naphthalene) released during the shooting using solid phase micro-extraction (SPME). However, this technique works poorly on handgun car-tridges because the extracted quantities quickly fall below the limit of detection. In order to find more effective solutions and further investigate the aging of organic gunshot residue after the discharge of handgun cartridges, an extensive study was carried out in this work using a novel approach based on high capacity headspace sorptive extraction (HSSE). By adopting this technique, for the first time 51 gunshot residue (GSR) volatile organic compounds could be simultaneously detected from fired handgun cartridge cases. Application to aged specimens showed that many of those compounds presented significant and complementary aging profiles. Compound-to-compound ratios were also tested and proved to be beneficial both in reducing the variability of the aging curves and in enlarging the time window useful in a forensic casework perspective. The obtained results were thus particularly promising for the development of a new complete forensic dating methodology.

Clara cells drive eosinophil accumulation in allergic asthma.

Development of allergic asthma is a complex process involving immune, neuronal and tissue cells. In the lung, Clara cells represent a major part of the "immunomodulatory barrier" of the airway epithelium. To understand the contribution of these cells to the inflammatory outcome of asthma, disease development was assessed using an adjuvant-free ovalbumin model. Mice were sensitised with subcutaneous injections of 10 μg endotoxin-free ovalbumin in conjunction with naphthalene-induced Clara cell depletion. Clara epithelial cell depletion in the lung strongly reduced eosinophil influx, which correlated with decreased eotaxin levels and, moreover, diminished the T-helper cell type 2 inflammatory response, including interleukin (IL)-4, IL-5 and IL-13. In contrast, airway hyperresponsiveness was increased. Further investigation revealed Clara cells as the principal source of eotaxin in the lung. These findings are the first to show that Clara airway epithelial cells substantially contribute to the infiltration of eotaxin-responsive CCR3+ immune cells and augment the allergic immune response in the lung. The present study identifies Clara cells as a potential therapeutic target in inflammatory lung diseases such as allergic asthma.

Development of a multistrain bacterial bioreporter platform for the monitoring of hydrocarbon contaminants in marine environments.

Petroleum hydrocarbons are common contaminants in marine and freshwater aquatic habitats, often occurring as a result of oil spillage. Rapid and reliable on-site tools for measuring the bioavailable hydrocarbon fractions, i.e., those that are most likely to cause toxic effects or are available for biodegradation, would assist in assessing potential ecological damage and following the progress of cleanup operations. Here we examined the suitability of a set of different rapid bioassays (2-3 h) using bacteria expressing the LuxAB luciferase to measure the presence of short-chain linear alkanes, monoaromatic and polyaromatic compounds, biphenyls, and DNA-damaging agents in seawater after a laboratory-scale oil spill. Five independent spills of 20 mL of NSO-1 crude oil with 2 L of seawater (North Sea or Mediterranean Sea) were carried out in 5 L glass flasks for periods of up to 10 days. Bioassays readily detected ephemeral concentrations of short-chain alkanes and BTEX (i.e., benzene, toluene, ethylbenzene, and xylenes) in the seawater within minutes to hours after the spill, increasing to a maximum of up to 80 muM within 6-24 h, after which they decreased to low or undetectable levels. The strong decrease in short-chain alkanes and BTEX may have been due to their volatilization or biodegradation, which was supported by changes in the microbial community composition. Two- and three-ring PAHs appeared in the seawater phase after 24 h with a concentration up to 1 muM naphthalene equivalents and remained above 0.5 muM for the duration of the experiment. DNA-damage-sensitive bioreporters did not produce any signal with the oil-spilled aqueous-phase samples, whereas bioassays for (hydroxy)biphenyls showed occasional responses. Chemical analysis for alkanes and PAHs in contaminated seawater samples supported the bioassay data, but did not show the typical ephemeral peaks observed with the bioassays. We conclude that bacterium-based bioassays can be a suitable alternative for rapid on-site quantitative measurement of hydrocarbons in seawater.

Bioreporters: gfp versus lux revisited and single-cell response.

Genetically engineered organisms expressing spectroscopically active reporter molecules in response to chemical effectors display great potential as living transducers in sensing applications. Green fluorescent protein (gfp gene) bioreporters have distinct advantages over luminescent couterparts (lux gene), including applicability at the single-cell level, but are typically less sensitive. Here we describe a gfp-bearing bioreporter that is sensitive to naphthalene (a poorly water soluble pollutant behaving like a large class of hydrophobic compounds), is suitable for use in chemical assays and bioavailability studies, and has detection limits comparable to lux-bearing bioreporters for higher efficiency detection strategies. Simultaneously, we find that the exploitation of population response data from single-cell analysis is not an algorithmic conduit to enhanced signal detection and hence lower effector detection limits, as normally assumed. The assay reported functions to equal effect with or without biocide.

Pollution stress on aquatic microbial communities

Thousands of chemical compounds enter the natural environment but many have unknown effects and consequences, in particular at low concentrations. This thesis work contributes to our understanding of pollution effects by using bacteria as test organisms. Bacteria are important for this question because some of them degrade and transform pollutants into less harmful compounds, but secondly because they themselves can be inhibited in their reproduction by exposure to toxic compounds. When inhibitory effects occur this may change the composition of the microbial com¬munity in the long run, leading to altered or diminished ecosystem services by those communities. As a result chemicals of anthropogenic origin may accumulate and per¬sist in the environment, and finally, affect higher organisms as well. In addition to acquiring basic understanding of pollutant effects at low concentrations on bacterial communities an applied goal of this thesis work was to develop bacteria-based tests to screen new organic chemicals for toxicity and biodégradation. In the first part of this work we developed a flow cytometry-based assay on SYT09 plus ethidium-bromide or propidium-iodide stained cells of Pseudomonas ûuorescens exposed or not to a variety of pollutants under oligotrophic growth conditions. Flow cytometry (FC) allows fast and accurate counting of bacterial cells under simul¬taneous assessment of their physiological state, in particular in combination with different fluorescent dyes. Here we employed FC and fluorescent dyes to monitor the effect that pollutants may exert on Pseudomonas ûuorescens SV3. First we designed an oligotrophic growth test, which enabled us to follow population growth at low densities (104 - 10 7 cells per ml) using 0.1 mM sodium acetate as carbon source. Cells in the oligotrophic milieu were then exposed or not to a variety of common pollutants, such as 2-chlorobiphenyl (2CBP), naphthalene (NAH), 4-chlorophenol (4CP), tetradecane (TD), mercury chloride (HgCl2) or benzene, in different dosages. Exposed culture samples were stained with SYT09 (green fluorescent dye binding nucleic acids, generally staining all cells) in combination with propidium iodide (PI) or ethidium bromide (EB), both dyes being membrane integrity indicators. We ob- served that most of the tested compounds decreased population growth in a dosage- dependent manner. SYT09/PI or SYT09/EB staining then revealed that chemical exposure led to arisal of subpopulations of live and injured or dead cells. By modeling population growth on the total cell numbers in population or only the subpopulation of live cells we inferred that even in stressed populations live cells multiply at rates no different to unexposed controls. The net decrease in population growth would thus be a consequence of more and more cells being not able to multiply at all, rather than all cells multiplying at slower rates. In addition, the proportion of injured cells correlated to the compound dosage. We concluded that the oligotrophic test may be useful to asses toxicity of unknown chemicals on a variety of model bacteria. Mul¬tiple tests can be run in parallel and effects are rapidly measured within a period of 8 hours. Interestingly, in the same exposure tests with P. fluorescens SV3 we observed that some chemicals which did not lead to a reduction of net population growth rates did cause measurable effects on live cells. This was mainly observed in cells within the live subpopulation as an increase of the EB fluorescence signal. We showed that SYT09/EB is a more useful combination of dyes than SYT09/PI because PI fluorescence tend to increase only when cells are effectively dead, but not so much in live cells (less then twofold). In contrast, EB geometric mean fluorescence in live cells increased up to eightfold after exposure to toxic compounds. All compounds even at the lowest concentration caused a measurable increase in EB geometric mean fluorescence especially after 2 h incubation time. This effect was found to be transient for cells exposed to 2CBP and 4CP, but chronic for cells incubated with TD and NAH (ultimately leading to cell death). In order to understand the mechanism underlying the observed effects we used known membrane or energy uncouplers. The pattern of EB signal increase in chemical-exposed populations resembled mostly that of EDTA, although EB fluorescence in EDTA-treated or pasteurized cells was even higher than after exposure to the four test chemicals. We conclude that the ability of cells to efflux EB under equilibrium conditions is an appropriate measure for the potential of a chemical to exert toxicity. Since most bacterial species possess efflux systems for EB that all require cellular energy, our test should be more widely relevant to infer toxicity effects of chemical exposure on the physiological status of the bacterial cell. To better understand the effect of toxicant exposure on efflux defense systems, we studied 2-hydroxybiphenyl toxicity to Pseudomonas azeiaica HBP1. We showed that 2-HBP exerts toxicity even to P. azelaica HBP1, but only at concentrations higher than 0.5 mM. Above this concentration transient loss of membrane polarization and integrity occurred, which we conclude from staining of growing cells with fluorescent dyes. Cells finally recover and resume growth on 2HBP. The high resistance of P. azelaica HBP1 to 2-HBP was found to be the result of an efficient MexABOprM- type efflux pump system counteracting passive influx of this compound into the membrane and cellular interior. Mutants with disrupted mexA, mexB and oprM genes did no longer grow on 2-HBP at concentrations above 100 μΜ, whereas below this concentration we found 2-HBP-concentration dependent decrease of growth rate. The MexAB-OprM system in P. azeiaica HBP1 is indeed an efflux pump for ethidium bromide as well. By introducing gfp reporter fusions responsive to intracellular 2- HBP concentrations into HBP1 wild-type or the mutants we demonstrated that 2HBP enters into the cells in a similar way. In contrast, the reporter system in the wild-type cells does not react to 2-HBP at an outside concentration of 2.4 μΜ, whereas in mutant cells it does. This suggests that wild-type cells pump 2-HBP to the outside very effectively preventing accumulation of 2-HBP. 2HBP metabolism, therefore, is not efficient enough to lower the intracellular concentration and prevent toxicity. We conclude that P. azelaica HBP1 resistance to 2-HBP is mainly due to an efficient efflux system and that 2HBP in high concentrations exerts narcotic effects on the bacterial membrane. In the part of this thesis, we investigated the possibilities of bacteria to degrade pollutants at low concentrations (1 mg per L and below). As test components we used 2-hydroxybiphenyl, antibiotics and a variety of fragrances, many of which are known to be difficult to biodegrade. By using accurate counting of low numbers of bacterial cells we could demonstrate that specific growth on these compounds is possible. We demonstrated the accuracy of FC counting at low cell numbers (down to 103 bacterial cells per ml). Then we tested whether bacterial population growth could be specifically monitored at the expense of low substrate concentrations, us¬ing P. azelaica HBP1. A perfect relationship was found between growth rate, yield and 2-HBP concentrations in the range of 0.1 up to 5 mg per L. Mixing P. azelaica within sludge, however, suggested that growth yields in a mixed community can be much lower than in pure culture, perhaps because of loss of metabolic intermediates. We then isolated new strains from activated sludge using 2-HBP or antibiotics (Nal, AMP, SMX) at low concentrations (0.1-1 mg per L) as sole carbon and energy sub¬strate and PAO microdishes. The purified strains were then examined for growth on their respective substrate, which interestingly, showed that all strains can not with¬stand higher than 1 or 10 mg per L concentrations of target substrate. Thus, bacteria must exist that contribute to compound degradation at low pollutant concentrations but are inhibited at higher concentrations. Finally we tested whether specific biomass growth (in number of cells) at the expense of pollutants can also be detected with communities as starting material. Hereto, we focused on a number of fragrance chemicals and measured community biomass increase by flow cytometry cell counting on two distinct starter communities: (i) diluted Lake Geneva water, and dilute activated sludge from a wastewater treatment plant. We observed that most of the test compounds indeed resulted in significant biomass increase in the starter community compared to a no-carbon added control, but activated sludge and lake Geneva water strongly differed (almost mutually ex¬clusive) in their capacity to degrade the test chemicals. In two cases for activated sludge the same type of microbial community developed upon compound exposure, as concluded from transcription fragment length polymorphism analysis on community purified and PCR amplified 16S rRNA gene fragments. To properly test compound biodegradability it is thus important to use starter communities of different origin. We conclude that FC counting can be a valuable tool to screen chemicals for their biodegradability and toxicity. - Des milliers de produits chimiques sont libérés dans l'environnement mais beaucoup ont des effets inconnus, en particulier à basses concentrations. Ce travail de thèse contribue à notre comprehension des effets de la pollution en utilisant des bacteries comme des organismes-tests. Les bacteries sont importantes pour etudier cette ques¬tion car certaines d'entre elles peuvent degrader ou transformer les polluants, mais également parce qu'elles-mmes peuvent tre inhibees dans leur reproduction après avoit ete exposees à ces composes toxiques. Quand des effets inhibiteurs ont lieu, la composition de la communauté microbienne peut tre changee à long terme, ce qui mène à une reduction du service d'ecosystème offert par ces communautés. En consequence, après leur liberation dans l'environnement, les produits chimiques d'origine anthropogenique peuvent soit s'y accumuler et per¬sister, exerant ainsi des effets encore inconnus sur les organismes vivants. En plus d'acquérir des connaissances de base sur les effets des polluants à basses concentra¬tions sur les communautés microbiennes, un but applique de cette thèse était de développer des tests bases sur les bacteries afin d'identifier de nouveau composes pour leur toxicité ou leur biodégradation. Dans la première partie de ce travail, nous avons developpe un test base sur la cytometrie de flux (FC) sur des cellules de Pseudomonas fluorescens colorees par du bromure d'ethidium ou de l'iodure de propidium et exposees ou non à une palette de polluants sous des conditions de croissance oligotrophique. La cytometrie de flux est une technique qui connaît de nombreuses applications dans la microbiologie environ¬nementale. Cela est principalement du au fait qu'elle permet un comptage rapide et precis ainsi que l'évaluation de l'état physiologique, en particulier lorsqu'elle est combinée h des colorations fluorescentes. Ici, nous avons utilise la technique FC et des colorants fluorescents afin de mesurer l'effet que peuvent exercer certains pollu¬ants sur Pseudomonas ûuorescens SV3 . D'abord nous avons conu des tests oligo- trophiques qui nous permettent de suivre la croissance complète de cellules en culture h des densites faibles (104 -10 7 cellules par ml), sur de l'acetate de sodium à 0.1 mM, en presence ou absence de produits chimiques (2-chlorobiphenyl (2CBP), naphthalène (NAH), 4-chlorophenol (4CP), tetradecane (TD), chlorure de mercure(II) (HgCl2)) à différentes concentrations. Afin de montrer le devenir des bacteries tant au niveau de la cellule individuelle que celui de la population globale, après exposition à des series de composes chimiques, nous avons compte les cellules colorees avec du SYT09 (col¬orant fluorescent vert des acides nucléiques pour la discrimination des cellules par rapport au bruit de fond) en combinaison avec l'iodure de propidium (PI) ou le bromure d'ethidium (EB), indicateurs de l'intégrité de la membrane cellulaire avec FC. Nous avons observe que de nombreux composes testes avaient un effet sur la croissance bacterienne, resultant en une baisse du taux de reproduction de la pop¬ulation. En outre, la double coloration que nous avons utilisee dans cette etude SYT09/PI ou SYT09/EB a montre que les produits chimiques testes induisaient une reponse heterogène des cellules dans la population, divisant celle-ci en sous- populations "saine", "endommagee" ou "morte". Les nombres de cellules à partir du comptage et de la proportion de celles "saines" et "endommagees/mortes" ont ensuite ete utilises pour modeliser la croissance de P. ûuorescens SV3 exposee aux produits chimiques. La reduction nette dans la croissance de population est une consequence du fait que de plus en plus de cellules sont incapables de se reproduire, plutt que du fait d'une croissance plus lente de l'ensemble de la population. De plus, la proportion de cellules endommagees est correllee au dosage du compose chimique. Les résultats obtenus nous ont permis de conclure que le test oligotrophique que nous avons developpe peut tre utilise pour l'évaluation de la toxicité de produits chimiques sur différents modèles bacteriens. Des tests multiples peuvent tre lances en parallèle et les effets sont mesures en l'espace de huit heures. Par ailleurs, nous en déduisons que les produits chimiques exercént un effet sur la croissance des cellules de P. ûuorescens SV3, qui est heterogène parmi les cellules dans la population et depend du produit chimique. Il est intéressant de noter que dans les mmes tests d'exposition avec P. ûuorescens SV3, nous avons observe que certains composes qui n'ont pas conduit à une reduction du taux de la croissance nette de la population, ont cause des effets mesurables sur les cellule saines. Ceci a ete essentiellement observe dans la portion "saine" des cellules en tant qu'augmentation du signal de la fluorescence de 1ΈΒ. D'abord nous avons montre que SYT09/EB était une com¬binaison de colorants plus utile que celle de SYT09/PI parce que la fluorescence du PI a tendance à augmenter uniquement lorsque les cellules sont effectivement mortes, et non pas dans les cellules saines (moins de deux fois plus). Par opposi¬tion, la fluorescence moyenne de l'EB dans les cellules saines augmente jusqu'à huit fois plus après exposition aux composes toxiques. Tous les composes, mme aux plus basses concentrations, induisent une augmentation mesurable de la fluorescence moy¬enne de 1ΈΒ, plus particulièrement après deux heures d'incubation. Cet effet s'est revele tre transitoire pour les cellules exposees aux 2CNP et 4CP, mais est chro¬nique pour les cellules incubees avec le TD et le NAH (entranant la mort cellulaire). Afin de comprendre les mécanismes qui sous-tendent les effets observes, nous avons utilise des decoupleurs d'energie ou de membrane. L'augmentation du signal EB dans les populations causee par des produits chimiques ressemblait à celle exerce par le chelateur des ions divalents EDTA. Cependant, les intensités du signal EB des cellules exposees aux produits chimiques testees n'ont jamais atteint les valeurs des cellules traitees avec l'EDTA ou pasteurises. Nous en concluons que le test oli- gotrophique utilisant la coloration (SYT09/)EB des cellules exposees ou non à un produit chimique est utile afin d'evaluer l'effet toxique exerce par les polluants sur la physiologie bacterienne. Afin de mieux comprendre la reaction d'un système de defense par pompe à efflux après exposition à une toxine, nous avons étudié la toxicité du 2-hydroxybiphenyl (2-HBP) sur Pseudomonas azeiaica HBP1. Nous avons montre que le 2-HBP exerce une toxicité mme sur HBP1, mais uniquement à des concentrations supérieures à 0.5 mM. Au-dessus de cette concentration, des pertes transitoires d'intégrité et de polarization membranaire ont lieu, comme cela nous a ete montre par coloration des cellules en croissance. Les cellules sont finalement capables de se rétablir et de reprendre leur croissance sur 2-HBP. La forte resistance de P. azeiaica HBP1 h 2-HBP physiologie bacterienne s'est revele tre le résultat d'un système de pompe h efflux de type MexABOprM qui contre-balance l'influx passif de ce compose h travers la membrane. Nous avons montre, en construisant des mutants avec des insertions dans les gènes mexA, mexB and oprM et des fusions avec le gène rapporteur gfp, que l'altération de n'importe quelle partie du système d'efflux conduisait à accroître l'accumulation de 2-HBP dans la cellule, en comparaison avec la souche sauvage HBP1, provoquant une diminution de la resistance au 2-HBP ainsi qu'une baisse du taux de reproduction des cellules. Des systèmes d'efflux similaires sont répandus chez de nombreuses espèces bactériennes. Ils seraient responsables de la resistance aux produits chimiques tels que les colorants fluorescents (bromure d'ethidium) et des antibiotiques. Nous concluons que la resistance de P. azelaica HBP1 à 2-HBP est principalement due à un système d'efflux efficace et que 2-HBP, à des concentrations elevees, exerce un effet deletère sur la membrane bacterienne. En se basant sur le comptage des cellules avec la FC, nous avons developpe ensuite une methode pour evaluer la biodegradabilite de polluants tels que le 2-HBP ainsi que les antibiotiques (acide nalidixique (Nal), ampicilline (AMP) ou sulfamethoxazole (SMX)) à de faibles concentrations lmg par L et moins), par le suivi de la croissance spécifique sur le compose de cultures microbiennes pures et mixtes. En utilisant un comptage precis de faibles quantités de cellules nous avons pu demontrer que la croissance spécifique sur ces composes est possible. Nous avons pu illustrer la precision du comptage par cytometrie de flux à faible quantité de cellules (jusqu'à 10 3 cellules par ml). Ensuite, nous avons teste s'il était possible de suivre dynamiquement la croissance de la population de cellules sur faibles concentrations de substrats, en utilisant P. azelaica HBP1. Une relation parfaite a ete trouvee entre le taux de croissance, le rendement et les concentrations de 2-HBP (entre 0.1 et 5 mg par L). En mélangeant HBP1 à de la boue active, nous avons pu montrer que le rendement en communauté mixtes pouvait tre bien inférieur qu'en culture pure. Ceci étant peut tre le résultat d'une perte d'intermédiaires métaboliques. Nous avons ensuite isole de nouvelles souches à partir de la boue active en utilisant le 2-HBP ou des antibiotiques (Nal, AMP, SMX) h basses concentrations (0.1-1 mg par L) comme seules sources de carbone et d'energie. En combinaison avec ceci, nous avons également utilise des microplaques PAO. Les souches purifiees ont ensuite ete examinees pour leurs croissances sur leurs substrats respectifs. De faon intéressante, toutes ces souches ont montre qu'elles ne pouvaient pas survivre à des concentrations de substrats supérieures à 1 ou 10 mg par L. Ainsi, il existe des bacteries qui contribuent à la degradation de composes à basses concentrations de polluant mais sont inhibes lorsque ces concentrations deviennent plus hautes. Finalement, nous avons cherche à savoir s'il est possible de detecter une croissance spécifique à une biomasse au depend d'un polluant, en partant d'une communauté microbienne. Ainsi, nous nous sommes concentre sur certains composes et avons mesure l'augmentation de la biomasse d'une communauté grce à la cytometrie de flux. Nous avons compte deux communautés de depart distinctes: (i) une dilution d'eau du Lac Léman, et une dilution de boue active d'une station d'épuration. Nous avons observe que la plupart des composes testes ont entrane une augmentation de la biomasse de depart par rapport au control sans addition de source de carbone. Néanmoins, les échantillons du lac Léman et de la station d'épuration différaient largement (s'excluant mutuellement l'un l'autre) dans leur capacité à degrader les composes chimiques. Dans deux cas provenant de la station d'épuration, le mme type de communauté microbienne s'est developpe après exposition aux composes, comme l'a démontré l'analyse TRFLP sur les fragments d'ARN 16S purifie de la communauté et amplifie par PCR. Afin de tester correctement la biodegradabilite d'un compose, il est donc important d'utiliser des communautés de depart de différentes origines Nous en concluons que le comptage par cytometrie de flux peut tre un outil de grande utilité pour mettre en valeur la biodegradabillite et la toxicité des composes chimiques.

Double-tagged fluorescent bacterial bioreporter for the study of polycyclic aromatic hydrocarbon diffusion and bioavailability.

Bacterial degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), ubiquitous contaminants from oil and coal, is typically limited by poor accessibility of the contaminant to the bacteria. In order to measure PAH availability in complex systems, we designed a number of diffusion-based assays with a double-tagged bacterial reporter strain Burkholderia sartisoli RP037-mChe. The reporter strain is capable of mineralizing phenanthrene (PHE) and induces the expression of enhanced green fluorescent protein (eGFP) as a function of the PAH flux to the cell. At the same time, it produces a second autofluorescent protein (mCherry) in constitutive manner. Quantitative epifluorescence imaging was deployed in order to record reporter signals as a function of PAH availability. The reporter strain expressed eGFP proportionally to dosages of naphthalene or PHE in batch liquid cultures. To detect PAH diffusion from solid materials the reporter cells were embedded in 2 cm-sized agarose gel patches, and fluorescence was recorded over time for both markers as a function of distance to the PAH source. eGFP fluorescence gradients measured on known amounts of naphthalene or PHE served as calibration for quantifying PAH availability from contaminated soils. To detect reporter gene expression at even smaller diffusion distances, we mixed and immobilized cells with contaminated soils in an agarose gel. eGFP fluorescence measurements confirmed gel patch diffusion results that exposure to 2-3 mg lampblack soil gave four times higher expression than to material contaminated with 10 or 1 (mg PHE) g(-1).

Reversible and irreversible pollutant-induced bacterial cellular stress effects measured by ethidium bromide uptake and efflux.

Chemical pollution is known to affect microbial community composition but it is poorly understood how toxic compounds influence physiology of single cells that may lay at the basis of loss of reproductive fitness. Here we analyze physiological disturbances of a variety of chemical pollutants at single cell level using the bacterium Pseudomonas fluorescens in an oligotrophic growth assay. As a proxy for physiological disturbance we measured changes in geometric mean ethidium bromide (EB) fluorescence intensities in subpopulations of live and dividing cells exposed or not exposed to different dosages of tetradecane, 4-chlorophenol, 2-chlorobiphenyl, naphthalene, benzene, mercury chloride, or water-dissolved oil fractions. Because ethidium bromide efflux is an energy-dependent process any disturbance in cellular energy generation is visible as an increased cytoplasmic fluorescence. Interestingly, all pollutants even at the lowest dosage of 1 nmol/mL culture produced significantly increased ethidium bromide fluorescence compared to nonexposed controls. Ethidium bromide fluorescence intensities increased upon pollutant exposure dosage up to a saturation level, and were weakly (r(2) = 0.3905) inversely correlated to the proportion of live cells at that time point in culture. Temporal increase in EB fluorescence of growing cells is indicative for toxic but reversible effects. Cells displaying high continued EB fluorescence levels experience constant and permanent damage, and no longer contribute to population growth. The procedure developed here using bacterial ethidium bromide efflux pump activity may be a useful complement to screen sublethal toxicity effects of chemicals.

Dynamic, auxin-responsive plasma membrane-to-nucleus movement of Arabidopsis BRX.

In Arabidopsis, interplay between nuclear auxin perception and trans-cellular polar auxin transport determines the transcriptional auxin response. In brevis radix (brx) mutants, this response is impaired, probably indirectly because of disturbed crosstalk between the auxin and brassinosteroid pathways. Here we provide evidence that BRX protein is plasma membrane-associated, but translocates to the nucleus upon auxin treatment to modulate cellular growth, possibly in conjunction with NGATHA class B3 domain-type transcription factors. Application of the polar auxin transport inhibitor naphthalene phthalamic acid (NPA) resulted in increased BRX abundance at the plasma membrane. Thus, nuclear translocation of BRX could depend on cellular auxin concentration or on auxin flux. Supporting this idea, NPA treatment of wild-type roots phenocopied the brx root meristem phenotype. Moreover, BRX is constitutively turned over by the proteasome pathway in the nucleus. However, a stabilized C-terminal BRX fragment significantly rescued the brx root growth phenotype and triggered a hypocotyl gain-of-function phenotype, similar to strong overexpressors of full length BRX. Therefore, although BRX activity is required in the nucleus, excess activity interferes with normal development. Finally, similar to the PIN-FORMED 1 (PIN1) auxin efflux carrier, BRX is polarly localized in vascular cells and subject to endocytic recycling. Expression of BRX under control of the PIN1 promoter fully rescued the brx short root phenotype, suggesting that the two genes act in the same tissues. Collectively, our results suggest that BRX might provide a contextual readout to synchronize cellular growth with the auxin concentration gradient across the root tip.

Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition.

Matrix sublimation has demonstrated to be a powerful approach for high-resolution matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI) imaging of lipids, providing very homogeneous solvent-free deposition. This work presents a comprehensive study aiming to evaluate current and novel matrix candidates for high spatial resolution MALDI imaging mass spectrometry of lipids from tissue section after deposition by sublimation. For this purpose, 12 matrices including 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), sinapinic acid (SA), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), 2,6-dihydroxyacetphenone (DHA), 2',4',6'-trihydroxyacetophenone (THAP), 3-hydroxypicolinic acid (3-HPA), 1,8-bis(dimethylamino)naphthalene (DMAN), 1,8,9-anthracentriol (DIT), 1,5-diaminonapthalene (DAN), p-nitroaniline (NIT), 9-aminoacridine (9-AA), and 2-mercaptobenzothiazole (MBT) were investigated for lipid detection efficiency in both positive and negative ionization modes, matrix interferences, and stability under vacuum. For the most relevant matrices, ion maps of the different lipid species were obtained from tissue sections at high spatial resolution and the detected peaks were characterized by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight/time-of-flight (MALDI-TOF/TOF) mass spectrometry. First proposed for imaging mass spectrometry (IMS) after sublimation, DAN has demonstrated to be of high efficiency providing rich lipid signatures in both positive and negative polarities with high vacuum stability and sub-20 μm resolution capacity. Ion images from adult mouse brain were generated with a 10 μm scanning resolution. Furthermore, ion images from adult mouse brain and whole-body fish tissue sections were also acquired in both polarity modes from the same tissue section at 100 μm spatial resolution. Sublimation of DAN represents an interesting approach to improve information with respect to currently employed matrices providing a deeper analysis of the lipidome by IMS.

Unlike PAHs from Exxon Valdez crude oil, PAHs from Gulf of Alaska coals are not readily bioavailable.

In the wake of the 1989 Exxon Valdez oil spill, spatially and temporally spill-correlated biological effects consistent with polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) exposure were observed. Some works have proposed that confounding sources from local source rocks, prominently coals, are the provenance of the PAHs. Representative coal deposits along the southeast Alaskan coast (Kulthieth Formation) were sampled and fully characterized chemically and geologically. The coals have variable but high total organic carbon content technically classifying as coals and coaly shale, and highly varying PAH contents. Even for coals with high PAH content (approximately 4000 ppm total PAHs), a PAH-sensitive bacterial biosensor demonstrates nondetectable bioavailability as quantified, based on naphthalene as a test calibrant. These results are consistent with studies indicating that materials such as coals strongly diminish the bioavailability of hydrophobic organic compounds and support previous work suggesting that hydrocarbons associated with the regional background in northern Gulf of Alaska marine sediments are not appreciably bioavailable.

Characterization of volatile organic gunshot residues in fired handgun cartridges by headspace sorptive extraction

In forensic investigation of firearm-related cases, determination of the residual amount of volatile compounds remaining inside a cartridge could be useful in estimating the time since its discharge. Published approaches are based on following the decrease of selected target compounds as a function of time by using solid phase micro-extraction (SPME). Naphthalene, as well as an unidentified decomposition product of nitrocellulose (referred to as "TEA2"), are usually employed for this purpose. However, reliability can be brought into question given their high volatility and the low reproducibility of their extracted quantities. In order to identify alternatives and therefore develop improved dating methods, an extensive study on the composition and variability of volatile residues in nine different types of cartridges was carried out. Analysis was performed using headspace sorptive extraction (HSSE), which is a more exhaustive technique compared to SPME. 166 compounds were identified (several of which for the first time), and it was observed that the final compositional characteristics of each residue were strongly dependent on its source. Variability of single identified compounds within and between different types of cartridge, as well as their evolution over time, was also studied. Many explosion products containing up to 4 aromatic rings were found to be globally present in high proportions amongst residues. 27 of them (excluding naphthalene) also presented detectable decreases during the first 24 h. Therefore, they could be used as complementary target analytes in future dating methods.