Aspectos toxicológicos do bissulfito e outros agentes tóxicos sobre a síntese de glicerol-3-fosfato desidrogenase citoplasmática de levedura de panificação

A síntese de glicerol-3-fosfato desidrogenase intracelular (EC 1.1.1.8) foi investigada a partir de fermento de panificação em cultivos submersos, contendo glicose ou glicerol como únicas fontes de carbono. Agentes inibitórios da via glicolítica, do ciclo de Krebs e da Cadeia Respiratória inibiram a síntese da enzima quando adicionados em baixas concentrações até 7,5 x 10-4 mol/L. A repressão exercida pela glicose sobre a síntese da glicerol-3-fosfato desidrogenase em meio YP-glicose foi reduzida, com a adição de produtos de fermentação e de bissulfito de sódio. Observou-se aumentos de 22-110% na síntese da enzima. Entretanto, em meio YP-glicerol, a adição de bissulfito de sódio 0,06 % (p/v) reduziu a síntese da enzima em 29%, enquanto, o acetaldeído 0,012 % (v/v) estimulou a síntese de glicerol-3-fosfato desidrogenase em 12%. Palavras-chave: fermento de panificação; glicerol-3-fosfato desidrogenase; inibidores.

Isolamento e seleção de fungos filamentosos termofílicos produtores de celulases, xilanases e celobiose desidrogenase com potencial para sacarificação do bagaço de cana-de-açúcar

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Imobilização da enzima álcool desidrogenase em suportes alginato-quitosana e glioxil-agarose

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)

Dinâmica de metabólitos secundários em variedades de Casearia sylvestris e estudos iniciais de biologia molecular relacionados aos genes das enzimas GGPP sintase e Chiquimato desidrogenase (DHS)

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Fipronil na bioenergética de mitocôndrias isoladas de figado de rato

Pós-graduação em Ciência Animal - FMVA

Avaliação das concentrações séricas de lactato, creatina quinase, aspartato aminotransferase, lactato desidrogenase, parâmetros clínicos e hematológicos de equinos Quarto de Milha submetidos à prova de laço em dupla

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Polimosfismo genético da glicose-6-fosfato desidrogenase na população da região de Araraquara-SP

The most important role played by the enzyme Glucose- 6-Phosphate Dehydrogenase (G6PD) in erythrocyte metabolism is in generating energy and reducing power used to protect the cell against oxidative attack. G6PD deficiency is the erythroenzymopathy that most frequently causes hemolytic anemia, and more than 130 molecular variants have already been identified. The aim of this study was to analyze the genetic mutations in the G6PD-deficient adult males in the population of the region of Araraquara, São Paulo State. Out of 5087 male blood donors, 89 were deficient for G6PD, as confirmed by assaying the enzyme activity and electrophoresis on cellulose acetate. Thus, a frequency of 1.75% of G6PD-deficient patients was found, this value being similar to other investigations in São Paulo state. Molecular analysis was performed by amplification of genomic DNA with specific primers and digestion with restriction enzymes. In 96.6% of the patients, the G6PD A¯ variant was observed, with mutations at residues 376(A→G) and 202(G→A). Mean G6PD specific activity among the patients was 1.31 IU.g Hb-1.min-1 at 37ºC, that is 10.8% of the normal activity of the G6PD B enzyme. The variant forms G6PD A¯ 680(G→T) and 968(T→C) were not found. In 3.4% of the deficient individuals, the G6PD Mediterranean variant was found, with a mutation at 563(C→T). In these cases, mean enzymatic activity was 0.25 IU.g Hb-1.min-1 at 37ºC, or 2.1% of the enzymatic activity of G6PD B. The use of traditional techniques, allied to the identification of the different molecular variants, is important for the understanding of the structural and functional properties and hemolytic behavior of the red blood cells of the patient.

Atividade da catalase e da lactato desidrogenase em tilápias submetidas a estresse de confinamento: efeito da cor do ambiente

Avaliaram-se os efeitos da cor do ambiente sobre o crescimento e a atividade da enzima antioxidante catalase (CAT) e da lactato desidrogenase (LDH) em tilápias do Nilo (n=24; 36,2±3,6g). Oito exemplares foram mortos para determinação da atividade basal das enzimas e os demais permaneceram isolados durante 14 dias sob espectro de luz branca ou azul (n=8 peixes/tratamento). A seguir os peixes foram submetidos a um estresse diário de confinamento de 90 minutos (15° ao 28° dia) e pesados semanalmente para cálculo da taxa de crescimento específico (TCE). A TCE negativa confirmou que o confinamento provocou estresse nos peixes, independentemente da cor do ambiente. O aumento da atividade da LDH no músculo vermelho dos peixes mantidos sob luz branca ou azul indicou mudança do metabolismo aeróbio para anaeróbio. O estresse reduziu a atividade da CAT no músculo branco dos peixes mantidos sob a luz branca ou azul. Na musculatura vermelha, esta redução ocorreu apenas nos animais mantidos sob a luz branca. O confinamento aumenta os processos metabólicos anaeróbios e é adequado para estudos sobre os efeitos do estresse. O espectro de luz azul não evita a redução do crescimento e a demanda energética anaeróbia em situações de estresse, mas preserva a atividade da CAT, contribuindo para o bem-estar da tilápia.

Desenvolvimento de uma plataforma modelo para a busca de ligantes com potencial leishmanicida baseado na inibição seletiva da enzima diidroorotato desidrogenase

As doenças tropicais negligenciadas (DTNs) causam um imenso sofrimento para a pessoa acometida e em muitos casos podem levar o indivíduo a morte. Elas representam um obstáculo devastador para a saúde e continuam a ser um sério impedimento para a redução da pobreza e desenvolvimento socioeconômico. Das 17 doenças desse grupo, a leishmaniose, incluindo a leishmaniose cutânea, tem grande destaque devido sua alta incidência, os gastos para o tratamento e as complicações geradas em processos de coinfecção. Ainda mais agravante, os investimentos direcionados ao controle, combate e principalmente a inovação em novos produtos é ainda muito limitado. Atualmente, a academia tem um importante papel na luta contra essas doenças através da busca de novos alvos terapêuticos e também de novas moléculas com potencial terapêutico. É nesse contexto que esse projeto teve como meta a implantação de uma plataforma para a identificação de moléculas com atividade leishmanicida. Como alvo terapêutico, optamos pela utilização da enzima diidroorotato desidrogenase de Leishmania Viannia braziliensis (LbDHODH), enzima de extrema importância na síntese de novo de nucleotídeos de pirimidina, cuja principal função é converter o diidroorotato em orotato. Esta enzima foi clonada, expressa e purificada com sucesso em nosso laboratório. Os estudos permitiram que a enzima fosse caracterizada cineticamente e estruturalmente via cristalografia de raios- X. Os primeiros ensaios inibitórios foram realizados com o orotato, produto da catálise e inibidor natural da enzima. O potencial inibitório do orotato foi mensurado através da estimativa do IC50 e a interação proteína-ligante foi caracterizada através de estudos cristalográficos. Estratégias in silico e in vitro foram utilizadas na busca de ligantes, através das quais foram identificados inibidores para a enzima LbDHODH. Ensaios de validação cruzada, utilizando a enzima homóloga humana, permitiram identificar os ligantes com maior índice de seletividade que tiveram seu potencial leishmanicida avaliado in vitro contra as formas promastigota e amastigota de Leishmania braziliensis. A realização do presente projeto permitiu a identificação de uma classe de ligantes que apresentam atividade seletiva contra LbDHODH e que será utilizada no planejamento de futuras gerações de moléculas com atividade terapêutica para o tratamento da leishmaniose. Além disso, a plataforma de ensaios otimizada permitirá a avaliação de novos grupos de moléculas como uma importante estratégia na busca por novos tratamentos contra a leishmaniose

Filogenia molecular das enzimas isocitrato liase e malato sintase e sua evolução em Viridiplanta

The plant metabolism consists of a complex network of physical and chemical events resulting in photosynthesis, respiration, synthesis and degradation of organic compounds. This is only possible due to the different kinds of responses to many environmental variations that a plant could be subject through evolution, leading also to conquering new surroundings. The glyoxylate cycle is a metabolic pathway found in glyoxysomes plant, which has unique role in the seedling establishment. Considered as a variation of the citric acid cycle, it uses an acetyl coenzyme A molecule, derived from lipids beta-oxidation to synthesize compounds which are used in carbohydrate synthesis. The Malate synthase (MLS) and Isocitrate lyase (ICL) enzyme of this cycle are unique and essential in regulating the biosynthesis of carbohydrates. Because of the absence of decarboxylation steps as rate-limiting steps, detailed studies of molecular phylogeny and evolution of these proteins enables the elucidation of the effects of this route presence in the evolutionary processes involved in their distribution across the genome from different plant species. Therefore, the aim of this study was to establish a relationship between the molecular evolution of the characteristics of enzymes from the glyoxylate cycle (isocitrate lyase and malate synthase) and their molecular phylogeny, among green plants (Viridiplantae). For this, amino acid and nucleotide sequences were used, from online repositories as UniProt and Genbank. Sequences were aligned and then subjected to an analysis of the best-fit substitution models. The phylogeny was rebuilt by distance methods (neighbor-joining) and discrete methods (maximum likelihood, maximum parsimony and Bayesian analysis). The identification of structural patterns in the evolution of the enzymes was made through homology modeling and structure prediction from protein sequences. Based on comparative analyzes of in silico models and from the results of phylogenetic inferences, both enzymes show significant structure conservation and their topologies in agreement with two processes of selection and specialization of the genes. Thus, confirming the relevance of new studies to elucidate the plant metabolism from an evolutionary perspective

Physiological and biochemical characterization of the assai palm (Euterpe oleracea Mart.) during seed germination and seedling growth under aerobic and anaerobic conditions

Physiological and biochemical aspects of assai palm during seed germination and early seedling growth were investigated. Seeds collected from plants growing in flooded and upland forests were used to determine the influence of normoxic (aerobic) and anoxic (anaerobic) conditions in germination and the initial and average time of development in the roots and shoots. After 75 days, seedlings germinated under normoxia were transferred to trays and submitted to flooding. Seed reserves (lipids, proteins, soluble sugars and starch) were monitored for quiescent and germinated seeds maintained under normoxic and anoxic conditions, as well as after 5, 10 and 20 days of seedling growth. Alcohol dehydrogenase (ADH) activity was quantified in roots and leaves of seedlings without or with flooding (partial and total). Seeds were not able to germinate under anoxia. Different strategies of storage mobilization of lipids, proteins, soluble sugars and starch were observed in seeds of each environment. ADH activity was induced by anoxia, with the highest level observed in the leaves. This study showed that, under normoxic conditions, the best developmental performance of assai palm seeds, from flooded or upland forest areas, during germination was associated with primary metabolites mobilization and seedling flooding tolerance with increased ADH activity. We conclude that the assai palm is well adapted to the anoxic conditions provoked by flooding.

Screening of Trypanosoma cruzi glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase enzyme inhibitors

The inhibitory activity of crude extracts of Meliaceae and Rutaceae plants on glycosomal glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gGAPDH) enzyme from Trypanosoma cruzi was evaluated at 100 μg/mL. Forty-six extracts were tested and fifteen of them showed significant inhibitory activity (IA % > 50). The majority of the assayed extracts of Meliaceae plants (Cedrela fissilis, Cipadessa fruticosa and Trichilia ramalhoi) showed high ability to inhibit the enzymatic activity. The fractionation of the hexane extract from branches of C. fruticosa led to the isolation of three flavonoids: flavone, 7-methoxyflavone and 3',4',5',5,7-pentamethoxyflavone. The two last compounds showed high ability to inhibit the gGAPDH activity. Therefore, the assayed Meliaceae species could be considered as a promising source of lead compounds against Chagas' disease.

Caracterização molecular de três espécies de Trachycephalus (Anura: Hylidae) : investigando potenciais híbridos interespecíficos

Animais híbridos representam um desafio à taxonomia e sistemática, pois correspondem a unidades evolutivas geralmente sem clara delimitação morfológica, comportamental e genética. Híbridos podem ser morfologicamente intermediários aos parentais ou, devido à introgressão e retrocruzamentos, suas características podem se misturar tornando difícil sua identificação. Uma das formas de identificação de híbridos é por meio de ferramentas de biologia molecular, que ao utilizarem marcadores de DNA mitocondrial (herança exclusiva materna) e DNA nuclear (herança materna e paterna), permitem a comparação entre informações genéticas. Além da hibridização existem outras fontes de conflito entre dados moleculares provenientes do DNA mitocondrial e DNA nuclear, como por exemplo a retenção de polimorfismos ancentrais. Em localidades do Espírito Santo, Brasil, foram coletados indivíduos de morfologia distinta de Trachycephalus mesophaeus e T. nigromaculatus, que são as únicas espécies do gênero conhecidas nesse estado. Porém, estudos piloto usando o gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (COI) agruparam esses espécimes com amostras de T. typhonius. Devido a estas incongruências, foram sequenciados fragmentos de dois genes mitocondriais - COI e Nicotinamida Desidrogenase subunidade 2 (ND2) e um exon nuclear (tirosinase) de 173 indivíduos de Trachycephalus, de forma a esclarecer as identificações taxonômicas e investigar a correspondência entre caracteres morfológicos e genéticos nesta linhagem, na sua área de ocorrência As filogenias moleculares, divergências genéticas, redes de haplótipos e polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) confirmaram as três espécies acima mencionadas como linhagens evolutivas distintas e revelaram mais sete indivíduos potencialmente híbridos, mas morfologicamente assinalados a T. mesophaeus, T. nigromaculatus ou T. typhonius.. Devido à taxa de evolução lenta da tirosinase, as espécies mais recentes T. typhonius e T. nigromaculatus parecem não terem sido sorteadas completamente nesse gene. Já T. mesophaeus, que é a espécie mais antiga das três, foi recuperada inequivocamente em todas as análises. De forma inédita, as análises moleculares evidenciaram a ocorrência de introgressão bidirecional entre T. nigromaculatus e T. typhonius e entre T. nigromaculatus e T. mesophaeus, sendo que há indícios de indivíduos F1 (cruzamentos entre espécies parentais puras gerando híbridos). A utilização do gene ND2 mostrou-se mais eficiente do que o gene COI nas filogenias e, apesar da tirosinase ser um gene nuclear de evolução lenta, contribuiu para a identificação de incongruências citonucleares. Nossos resultados mostram que a história filogenética de Trachycephalus é complexa e que o uso de marcadores nucleares de evolução mais rápida e ampliação dessas análises para outras espécies do gênero podem revelar mais eventos de hibridização.

Parâmetros químicos e biológicos indicadores de qualidade de solo sob cultivo de braquiárias e soja no oeste paulista

Na avaliação da qualidade de solo têm-se buscado diferentes parâmetros químicos e biológicos que possam ser utilizados como indicadores. Nesse sentido, este trabalho avaliou e correlacionou parâmetros biológicos e de fertilida­de em solos provenientes de dois sistemas de cultivo empregados na região Oeste de São Paulo, buscando selecionar indicadores químicos e biológicos de qualidade. Amostras de solos (latossolos e argissolos) de áreas sob cultivo de pastagens (braquiárias) e de cultivo de soja foram coletadas em sete municípios da região, em 2006, sendo avaliadas quanto à fertilidade, nodulação de soja, atividade das enzimas desidrogenase e fosfatase e densidade populacional de bactérias termorresistentes. A maioria dos solos avaliados apresentou baixa fertilidade. Os resultados encontrados demonstraram que a nodulação ocorreu em todos os solos avaliados, porém foi maior nos locais com predominância de Argissolos. O crescimento de soja foi satisfatório em todos os locais. O manejo do solo sob soja não teve efeito significativo sobre os indicadores biológicos avaliados, mas em alguns locais houve melhoria do padrão de fertilidade. A atividade da enzima desidrogenase apresentou correlação positiva com a maioria dos indicadores de fertilidade avaliados, demonstrando que essa enzima é um bom indicador de qualidade para a avaliação desses solos.

Bioquímica da esquistossomose mansônica: V - atividade mitocondrial em fígados e rins de sagüis (Callitrix penicillata) infestados pelo Schistosoma mansoni

Foram estudadas mitocôndrias isoladas de fígados e rins de sagüis (Callitrix penicillata) infestados pela inoculação de 200 cercárias e entre 80 e 100 dias de infecção, nos aspectos relativos às suas atividades respiratórias endógenas, bem como frente ao succinato e ao alfa ceto glutarato de sódio. Cada experiência foi acompanhada de controle, usando-se mitocôndrias isoladas de fígados e rins de animais não infectados. As medidas das atividades respiratórias foram efetuadas polarograficamente e expressas em microlitros de oxigênio consumidos por miligrama de proteínas totais por minuto. Os resultados mostraram que as respirações endógenas das mitocôndrias isoladas dos animais infectados foram sempre maiores do que aquelas observadas nos controles. Detectou-se um estímulo para o fígado de 217% e para o rim de 84%. O succinato de sódio estimulou em 85% a respiração das mitocôndrias dos fígados dos animais controles, enquanto a inibiu de 39% nos infectados. Com referência aos rins, este mesmo substrato estimulou a referida respiração tanto nos controles quanto nos infectados, em 89% e 94% respectivamente. O alfa ceto glutarato estimulou as mitocôndrias hepáticas isoladas dos controles em 48% e as renais em 84%. Nos animais esquistossomóticos ou ele não modificou a capacidade respiratória mitocondrial como se observou para o rim, ou a inibiu de 58%, no caso do fígado. Os dados obtidos sugerem que o fígado sofre muito mais, em termos bioquímicos, com a esquistossomose mansônica do que os rins, pelo menos em nossas condições experimentais. As atividades do sistema enzimático succinato desidrogenase e do complexo alfa ceto glutarato desidrogenase permitiram identificar bioquimicamente, em nossos animais esquistossomóticos, vários graus de lesão celular, principalmente hepáticos, que vão desde os mais simples, decorrentes de modificações da físico-química dos sistemas de membranas, até os mais graves, tipo necrose.