Fonctions de l'oncoprotéine LMO2 déterminées par ses interactions protéiques

La leucémie lymphoïde représente environ 30% des cas de cancer chez l’enfant. Elle est souvent causée par des réarrangements chromosomiques impliquant des gènes encodant des facteurs de transcription, qui contrôlent des programmes génétiques complexes. Par exemple, LMO2 (LIM-only 2) est un facteur de transcription oncogénique fréquemment exprimé de façon aberrante dans les leucémies lymphoblastiques aigues des cellules T (T-ALL). Dans l’hématopoïèse normale, LMO2 est essentiel à la génération des cellules souches hématopoïétiques à l’origine de toutes les cellules sanguines. D’ailleurs, certaines cellules leucémiques possèdent des propriétés normalement réservées aux cellules souches hématopoïétiques. Ainsi, l’étude de la fonction de LMO2 dans les cellules souches hématopoïétiques peut être pertinente autant dans le contexte hématopoïétique normal que leucémique. Afin de mettre en évidence de nouvelles fonctions moléculaires pour LMO2, j’ai choisi d’identifier les protéines qui s’y associent. En plus de ses partenaires connus, j’ai identifié plusieurs protéines de transcription/remodelage de la chromatine, en accord avec son rôle transcriptionnel. Plusieurs nouvelles fonctions potentielles ont été révélées, indiquant que cette protéine adaptatrice pourrait faire partie de complexes non transcriptionnels, régulant d’autres processus cellulaires. Les oncogènes comme LMO2 pourraient être des régulateurs à large spectre. Particulièrement, j’ai identifié des interactions entre LMO2 et des protéines de réplication de l’ADN. J’ai montré que LMO2 contrôle la réplication de l’ADN dans les cellules hématopoïétiques, et possiblement durant la leucémogenèse, indépendamment de son rôle transcriptionnel. Ensemble, ces études ont donc permis de révéler de nouvelles fonctions pour LMO2, et pourraient servir de paradigme pour d’autres facteurs de transcription oncogéniques, particulièrement aux autres protéines de la famille LMO, qui sont aussi des oncogènes puissants.

Identification de facteurs nucléaires modifiant l'activité des cellules souches hématopoïétiques

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont rares, mais indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang, un tissu en constant renouvellement. Deux caractéristiques principales les définissent; la propriété d’auto-renouvellement (AR), ou la capacité de préserver leur identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, ce potentiel de différentiation leur permettant de générer toutes les lignée hématopoïétiques. De par leurs attributs, les CSH sont utilisée en thérapie cellulaire dans le domaine de la transplantation. Une organisation tissulaire hiérarchique est aussi préservée dans la leucémie, ou cancer du sang, une masse tumorale hétérogène devant être maintenue par une fraction de cellules au potentiel prolifératif illimité, les cellules souches leucémiques (CSL). Les travaux présentés dans ce manuscrit visent à explorer les bases moléculaires de l’AR, encore mal définies. Certains membres de la famille des facteurs de transcription à homéodomaine HOX sont impliqués dans la régulation de l’hématopoïèse normale, et leur dérégulation peut contribuer à la transformation leucémique. En particulier, la surexpression du gène Hoxb4 dans les CSH influence leur destin cellulaire, favorisant des divisions d’auto-renouvellement et leur expansion en culture et in vivo. En général, les CSH s’épuisent rapidement lorsque maintenue hors de leur niche ex vivo. Différents facteurs interagissent avec les HOX et modulent leur liaison à l’ADN, dont la famille des protéines TALE (Three Amino acid Loop Extension), comme MEIS1 et PBX1. En utilisant une stratégie de surexpression combinée de Hoxb4 et d’un anti-sens de Pbx1 dans les CSH, générant ainsi des cellules Hoxb4hiPbx1lo, il est possible de majorer encore d’avantage leur potentiel d’AR et leur expansion in vitro. Les CSH Hoxb4hiPbx1lo demeurent fonctionnellement intactes malgré une modulation extrême de leur destin cellulaire en culture. Les niveaux d’expressions de facteurs nucléaires, seules ou en combinaison, peuvent donc s’avérer des déterminants majeurs du destin des CSH. Afin d’identifier d’autres facteurs nucléaires potentiellement impliqués dans le processus d’AR des CSH, une stratégie permettant d’évaluer simultanément plusieurs gènes candidats a été élaborée. Les progrès réalisés en termes de purification des CSH et de leur culture en micro-puits ont facilité la mise au point d’un crible en RNAi (interférence de l’ARN), mesurant l’impact fonctionnel d’une diminution des niveaux de transcrits d’un gène cible sur l’activité des CSH. Les candidats sélectionnés pour cette étude font partie du grand groupe des modificateurs de la chromatine, plus précisément la famille des histones déméthylases (HDM) contenant un domaine catalytique Jumonji. Ce choix repose sur la fonction régulatrice de plusieurs membres de complexes méthyl-transférases sur l’AR des CSH, dont l’histone méthyl-transférases MLL (Mixed Lineage Leukemia). Cette stratégie a aussi été utilisée dans le laboratoire pour étudier le rôle de facteurs d’asymétrie sur le destin des CSH, en collaboration. Ces études ont permis d’identifier à la fois des régulateurs positifs et négatifs de l’activité des CSH. Entre autre, une diminution de l’expression du gène codant pour JARID1B, une HDM de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4), augmente l’activité des CSH et s’accompagne d’une activation des gènes Hox. En conclusion, divers déterminants nucléaires, dont les facteurs de transcription et les modificateurs de la chromatine peuvent influencer le destin des CSH. Les mécanismes sous-jacents et l’identification d’autres modulateurs de l’AR demeurent des voies à explorer, pouvant contribuer éventuellement aux stratégies d’expansion des CSH ex vivo, et l’identification de cibles thérapeutiques contre les CSL. Mots-clés : cellules souches hématopoïétiques, Hoxb4, Pbx1, auto-renouvellement, histone déméthylases, RNAi

Étude des effets du phénotype de sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse sur les fonctions hématopoïétiques

L’irradiation (IR) est utilisée dans le traitement de plusieurs cancers et désordres hématologiques, en particulier dans les protocoles de conditionnement précédents les transplantations de moelle osseuse. L’emploi de doses réduites d’IR semble favoriser le succès de la prise de greffe. Cette observation soulève un point de plus en plus discuté dans la littérature, soit l’importance de l’intégrité du microenvironnement pour la transplantation et le bon fonctionnement de l’hématopoïèse. L’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse in vitro. Ce mécanisme de défense cellulaire entraînant un arrêt de prolifération permanent est également observé in vivo dans différents systèmes, mais n’a pas encore été étudié dans le contexte de la niche hématopoïétique. Les travaux présentés dans cette thèse ont pour objectif de déterminer si l’IR induit la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse et si une telle induction altère les fonctions hématopoïétiques. Nos résultats ont permis de démontrer pour la première fois qu’une IR corporelle totale induit effectivement la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse. En outre, cette altération du microenvironnement affecte la lymphopoïèse B de façon Ink4a/Arf-dépendante (1er article). De plus, les modifications systémiques qui résultent de l’IR compromettent l’homéostasie osseuse en augmentant la résorption de l’os, sans toutefois diminuer la formation de celui-ci (2e article). Ces données nous permettent de mieux comprendre les effets de la sénescence des cellules stromales de la moelle osseuse sur les fonctions hématopoïétiques. Par ailleurs, elles suggèrent que l’emploi de drogues et/ou de procédés n’induisant pas la sénescence des cellules stromales de l’os offrirait un meilleur pronostic à long terme pour les patients.

Caractérisation cytogénétique et moléculaire des translocations chromosomiques dans la phase blastique de la leucémie myéloïde chronique

La leucémie myéloïde chronique (LMC) est un modèle d’évolution tumorale dans les cancers humains. Le processus d’évolution de la LMC de la phase chronique (PC) à la phase blastique (PB) est caractérisé par un arrêt de différenciation et l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement incontrôlé d’une cellule souche ou d’un progéniteur hématopoïétique. La LMC en PB est associée à la présence d’anomalies génétiques additionnelles à la fusion BCR-ABL1 qui résulte de la translocation chromosomique t(9;22). Contrairement aux patients en PC, les patients en PB de la LMC n’obtiennent pas une réponse moléculaire complète à long terme avec 1’Imatinib mesylate, un inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK) BCR-ABL1. De plus, les ITKs de deuxième et troisième générations sont moins efficaces en PB de la LMC lorsque les cellules leucémiques ont acquis une résistance au traitement indépendante des mutations de BCR-ABL1. Les mécanismes moléculaires des voies de signalisation impliquées dans la progression de la LMC en PB ne sont pas entièrement élucidés. Le but de notre travail est de caractériser de nouvelles anomalies génétiques dans la PB de la LMC. Nous avons identifié en cytogénétique, quatre nouvelles translocations chromosomiques : t(1;21)(p36;q22), t(7;17)(p15;q22), t(8;17)(q11;q22) et t(2;12)(q31;p13) dans les cellules leucémiques de patients en PB de la LMC résistants au traitement. En utilisant des techniques d'hybridation in situ en fluorescence, de RT-PCR et de séquençage, nous avons délimité les régions à investiguer au niveau des points de cassure et identifié un réarrangement de plusieurs gènes codant pour des facteurs de transcription importants lors de l’hématopoïèse tels que RUNX1, ETV6, PRDM16 et HOXA. L’altération de ces gènes pourrait expliquer l’arrêt de différenciation et/ou l’acquisition de la capacité d’autorenouvellement caractéristiques de la LMC en PB. Nous avons identifié les fusions RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA, MSI2-SOX17 et ETV6-HOXD11, respectivement associées aux translocations chromosomiques t(1;21), t(7;17), t(8;17) et t(2;12). Ces fusions génèrent différents transcrits alternatifs qui maintiennent et altèrent le cadre ouvert de lecture. L’analyse des séquences des transcrits chimériques identifiés dans ce projet, incluant RUNX1-PRDM16, MSI2-HOXA9, MSI2-HOXA10, MSI2-HOXA11 et ETV6-HOXD11, nous a permis de prédire les domaines fonctionnels potentiellement présents au niveau des protéines chimériques prédites. Les transcrits de fusion qui respectent le cadre ouvert de lecture peuvent générer des domaines fonctionnels des deux partenaires. C’est le cas des deux transcrits identifiés pour la fusion RUNX1-PRDM16 où le domaine de liaison à l’ADN RHD (Runt homology domain) de RUNX1 est fusionné avec la quasi-totalité des domaines de PRDM16. Les transcrits de fusion qui ne respectent pas le cadre ouvert de lecture donnent des formes tronquées des transcrits RUNX1, MSI2 et ETV6. La juxtaposition des régions promotrices de ces derniers en 5’ de leurs partenaires entraîne l’activation de la forme courte oncogénique de PRDM16 dans la t(1;21) ou de différents gènes HOXA/D dans les t(7;17) et t(2;12), ainsi que l’expression aberrante d’un nouveau transcrit alternatif de SOX17 dans la t(8;17). Notre étude nous a permis d’identifier de nouveaux gènes de fusion et/ou une activation de gènes qui pourraient coopérer avec la fusion BCR-ABL1 dans la progression de la LMC et être impliqués dans la résistance au traitement de la LMC en phase avancée. La caractérisation des événements génétiques associés à la transformation blastique de la LMC est essentielle pour l’investigation des voies moléculaires impliquées dans cette phase de la maladie. Investiguer la résistance au traitement de ces patients pourrait aussi contribuer à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans cette leucémie.

Caractérisation du rôle et des mécanismes d’action des gènes Hoxa dans l’hématopoïèse adulte

Chez les humains, un large pourcentage de leucémies myéloïdes et lymphoïdes exprime des gènes Homéobox (Hox) de façon aberrante, principalement ceux du groupe des gènes Hoxa. Cette dérégulation de l’expression des gènes Hox peut provenir directement des translocations impliquant des gènes Hox ou indirectement par d’autres protéines ayant un potentiel oncogénique. De plus, plusieurs études indiquent que les gènes Hox jouent un rôle essentiel dans l'initiation de diverses leucémies. Comprendre le fonctionnement des gènes Hox dans l'hématopoïèse normale est donc une condition préalable pour élucider leurs fonctions dans les leucémies, ce qui pourrait éventuellement conduire à l’élaboration de nouveaux traitements contre cette maladie. Plusieurs études ont tenté d’élucider les rôles exacts des gènes Hox dans l'hématopoïèse via l’utilisation de souris mutantes pour un seul gène Hox. Or, en raison du phénomène de redondance fonctionnelle chez cette famille de gènes, ces études ont été peu concluantes. Il a été précédemment démontré que dans une population de cellules enrichies en cellules souches hématopoïétiques (CSH), les gènes du cluster Hoxa sont plus exprimés que les gènes Hox des autres clusters. Aussi, il a été établi que les gènes du cluster Hoxb sont non essentiels à l’hématopoïèse définitive puisque les CSH mutantes pour les gènes Hoxb1-9 conservent leur potentiel de reconstitution à long terme. En nous basant sur ces données, nous avons émis l'hypothèse suivante : les gènes Hoxa sont essentiels pour l'hématopoïèse normale adulte. Pour tester notre hypothèse, nous avons choisi d’utiliser un modèle de souris comportant une délétion pour l’ensemble des gènes Hoxa. Dans le cadre de cette recherche, nous avons démontré que les CSH, les progéniteurs primitifs et les progéniteurs des cellules B sont particulièrement sensibles au niveau d'expression des gènes Hoxa. Plus particulièrement, une baisse de la survie et une différenciation prématurée semblent être à l’origine de la perte des CSH Hoxa-/- dans la moelle osseuse. L’analyse du profil transcriptionnel des CSH par séquençage de l'ARN a révélé que les gènes Hoxa sont capables de réguler un vaste réseau de gènes impliqués dans divers processus biologiques. En effet, les gènes Hoxa régulent l’expression de plusieurs gènes codant pour des récepteurs de cytokine. De plus, les gènes Hoxa influencent l’expression de gènes jouant une fonction dans l’architecture de la niche hématopoïétique. L’expression de plusieurs molécules d’adhésion est aussi modulée par les gènes Hoxa, ce qui peut affecter la relation des CSH avec la niche hématopoïétique. L’ensemble de ces résultats démontre que les gènes Hoxa sont d'importants régulateurs de l'hématopoïèse adulte puisqu’ils sont nécessaires au maintien des CSH et des progéniteurs grâce à leurs effets sur plusieurs processus biologiques comme l'apoptose, le cycle cellulaire et les interactions avec la niche.

Expression des histones déméthylases dans les cellules hématopoïétiques humaines et les leucémies aiguës

L’importance des modificateurs de la chromatine dans la régulation de l’hématopoïèse et des hémopathies malignes est illustrée par l’histone méthyltransférase Mixed-Lineage Leukemia (MLL) qui est essentielle au maintien des cellules souches hématopoïétiques (CSH) et dont le gène correspondant, MLL, est réarrangé dans plus de 70% des leucémies du nourrisson. Les histones déméthylases (HDM), récemment découvertes, sont aussi impliquées dans le destin des CSH et des hémopathies malignes. Le but de ce projet est d’étudier l’expression des HDM dans les cellules hématopoïétiques normales et leucémiques afin d’identifier de potentiels régulateurs de leur destin. Nous avons réalisé un profil d'expression génique des HDM par qRT-PCR et par séquençage du transcriptome (RNA-seq) dans des cellules de sang de cordon (cellules CD34+ enrichies en CSH et cellules différenciées) et des cellules de leucémie aiguë myéloïde (LAM) avec réarrangement MLL. Les deux techniques montrent une expression différentielle des HDM entre les populations cellulaires. KDM5B et KDM1A sont surexprimés dans les cellules CD34+ par rapport aux cellules différenciées. De plus, KDM4A et PADI2 sont surexprimés dans les cellules leucémiques par rapport aux cellules normales. Des études fonctionnelles permettront de déterminer si la modulation de ces candidats peut être utilisée dans des stratégies d’expansion des CSH, ou comme cible thérapeutique anti-leucémique. Nous avons aussi développé et validé un nouveau test diagnostique pour détecter les mutations de GATA2 qui code pour un facteur de transcription clé de l’hématopoïèse impliqué dans les LAM. Ces travaux soulignent l’importance des facteurs nucléaires dans la régulation de l’hématopoïèse normale et leucémique.

Effet du stress prolifératif sur la fonction des cellules souches hématopoïétiques : rôles des gènes Scl, E2A et Heb

Le système hématopoïétique est un tissu en constant renouvellement et les cellules souches hématopoïétiques (CSHs) sont indispensables pour soutenir la production des cellules matures du sang. Deux fonctions définissent les CSHs; la propriété d’auto-renouvellement, soit la capacité de préserver l’identité cellulaire suivant une division, et la multipotence, le potentiel de différenciation permettant de générer toutes les lignées hématopoïétiques. Chez l’adulte, la majorité des CSHs sont quiescentes et l’altération de cet état corrèle avec une diminution du potentiel de reconstitution des CSHs, suggérant que la quiescence protège les fonctions des CSHs. La quiescence est un état réversible et dynamique et les réseaux génétiques le contrôlant restent peu connus. Un nombre croissant d’évidences suggère que si à l’état d’homéostasie il y a une certaine redondance entre les gènes impliqués dans ces réseaux de contrôle, leurs rôles spécifiques sont révélés en situation de stress. La famille des bHLHs (basic helix-loop-helix) inclue différentes classes des protéines dont ceux qui sont tissu-spécifiques comme SCL, et les protéines E, comme E12/E47 et HEB. Certains bHLHs sont proposés êtres important pour la fonction des cellules souches, mais cela ne fait pas l’unanimité, car selon le contexte cellulaire, il y a redondance entre ces facteurs. La question reste donc entière, y a-t-il un rôle redondant entre les bHLHs d’une même classe pour la fonction à long-terme des CSHs? Les travaux présentés dans cette thèse visaient dans un premier temps à explorer le lien encore mal compris entre la quiescence et la fonction des CSHs en mesurant leurs facultés suite à un stress prolifératif intense et dans un deuxième temps, investiguer l’importance et la spécificité de trois gènes pour la fonction des CSHs adultes, soit Scl/Tal1, E2a/Tcf3 et Heb/Tcf12. Pour répondre à ces questions, une approche cellulaire (stress prolifératif) a été combinée avec une approche génétique (invalidation génique). Plus précisément, la résistance des CSHs au stress prolifératif a été étudiée en utilisant deux tests fonctionnels quantitatifs optimisés, soit un traitement basé sur le 5-fluorouracil, une drogue de chimiothérapie, et la transplantation sérielle en nombre limite. Dans la mesure où la fonction d’un réseau génique ne peut être révélée que par une perturbation intrinsèque, trois modèles de souris, i.e. Scl+/-, E2a+/- et Heb+/- ont été utilisés. Ceci a permis de révéler que l’adaptation des CSHs au stress prolifératif et le retour à l’équilibre est strictement contrôlé par les niveaux de Scl, lesquels règlent le métabolisme cellulaire des CSHs en maintenant l’expression de gènes ribosomaux à un niveau basal. D’autre part, bien que les composantes du réseau puissent paraître redondants à l’équilibre, mes travaux montrent qu’en situation de stress prolifératif, les niveaux de Heb restreignent la prolifération excessive des CSHs en induisant la sénescence et que cette fonction ne peut pas être compensée par E2a. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse montrent que les CSHs peuvent tolérer un stress prolifératif intense ainsi que des dommages à l’ADN non-réparés, tout en maintenant leur capacité de reconstituer l’hématopoïèse à long-terme. Cela implique cependant que leur métabolisme revienne au niveau de base, soit celui trouvé à l’état d’homéostasie. Par contre, avec l’augmentation du nombre de division cellulaire les CSHs atteignent éventuellement une limite d’expansion et entrent en sénescence.

Rôle du facteur de transcription Gfi1b au cours de l’hématopoïèse précoce

Le facteur de transcription Growth factor independent 1b (GFI1b) est impliqué à différents stades dans la régulation de l'hématopoïèse. Il est notamment fortement exprimé dans les cellules souches hématopoïétiques et au cours de la différenciation des cellules des lignées érythroïdes et mégacaryocytaires. Grâce à un modèle de délétion conditionnelle chez la souris par le système CreLox, nous avons montré que l'absence de GFI1b entraîne une prolifération de cellules mégacaryocytaires incapables de produire des plaquettes. Notre étude ne permet pas de confirmer formellement la prolifération des cellules souches dans la moelle osseuse précédemment observée par notre équipe dans un autre modèle murin. En revanche, les souris GFI1b "knockout" présentent une augmentation des cellules souches circulantes dans le sang périphérique. Une analyse moléculaire préliminaire montre que GFI1b pourrait influer sur la régulation par le cycle circadien de la mobilisation de ces cellules dans le sang. Finalement, notre étude des effets biologiques de la délétion de GFI1b dans le compartiment hématopoïétique des souris adultes nous a permis de définir de façon plus précise le rôle de GFI1b dans l'hématopoïèse et de confirmer son rôle majeur dans la régulation de la mégacaryopoïèse et la production de plaquettes matures.

The role of Ken&Barbie in JAK/STAT signalling during development of Drosophila melanogaster

Cell-cell interactions during embryonic development are crucial in the co-ordination of growth, differentiation and maintenance of many different cell types. To achieve this co-ordination each cell must properly translate signals received from neighbouring cells, into spatially and temporally appropriate developmental responses. A surprisingly limited number of signal pathways are responsible for the differentiation of enormous variety of cell types. As a result, pathways are frequently 'reused' during development. Thus, in mammals the JAK/STAT pathway is required during early embryogenesis, mammary gland formation, hematopoiesis and, finally, plays a pivotal role in immune response. In the canonical way, the JAK/STAT pathway is represented by a transmembrane receptor associated with a Janus kinase (JAK), which upon stimulation by an extra-cellular ligand, phosphorylates itself, the receptor and, finally, the signal transducer and activator of transcription (STAT) molecules. Phosphorylated STATs dimerise and translocate to the nucleus where they activate transcription of target genes. The JAK/STAT pathway has been conserved throughout evolution, and all known components are present in the genome of Drosophila melanogaster. Besides hematopoietic and immunity functions, the pathway is also required during development for processes including embryonic segmentation, tracheal morphogenesis, posterior spiracle formation etc. This study describes Drosophila Ken&Barbie (Ken) as a selective regulator of JAK/STAT signalling. ken mutations identified in a screen for modulators of an eye overgrowth phenotype, caused by over-expression of the pathway ligand unpaired, also interact genetically with the pathway receptor domeless (dome) and the transcription factor stat92E. Over-expression of Ken can phenocopy developmental defects known to be caused by the loss of JAK/STAT signalling. These genetic interactions suggest that Ken may function as a negative regulator of the pathway. Ken has C-terminal Zn-finger domain, presumably for DNA binding, and N-terminal BTB/POZ domain, often found in transcriptional repressors. Using EGFP-fused construct expressed in vivo revealed nuclear accumulation of Ken. Therefore, it is proposed that Ken may act as a suppresser of STAT92E target genes. An in vitro assay, termed SELEX, determined that Ken specifically binds to a DNA sequence, with the essential for DNA recognition core overlapping that of STAT92E. This interesting observation suggests that not all STAT92E sites may also allow Ken binding. Strikingly, when effects of ectopic Ken on the expression of putative JAK/STAT pathway target genes were examined, only a subset of the genes tested, namely vvl, trh and kni, were down-regulated by Ken, whereas some others, such as eve and fj, appeared to be unresponsive. Further analysis of vvl, one of the genes susceptible to ectopic Ken, was undertaken. In the developing hindgut, expression of vvl is JAK/STAT pathway dependent, but remains repressed in the posterior spiracles, despite the stimulation of STAT92E by Upd in their primordia. Importantly, ken is also expressed in the developing posterior spiracles. Strikingly, up-regulation of vvl is observed in these tissues in ken mutant embryos. These imply that while ectopic Ken is sufficient to repress the expression of vvl in the hindgut, endogenous Ken is also necessary to prevent its activation in the posterior spiracles. It is therefore conceivable that ectopic vvl expression in the posterior spiracles of the ken mutants may be the result of de-repression of endogenous STAT92E activity. Another consequence of these observations is a fine balance that must exist between STAT92E and Ken activities. Apparently, endogenous level of Ken is sufficient to repress vvl, but not other, as yet unidentified, JAK/STAT pathway targets, whose presumable activation by STAT92E is required for posterior spiracle development as the embryos mutant for dome, the receptor of the pathway, show severe spiracle defects. These defects are also observed in the embryos mis-expressing Ken. Though it is possible that the posterior spiracle phenotype caused by higher levels of Ken results from a JAK/STAT pathway independent activity, it seems to be more likely that Ken acts in a dosage dependent manner, and extra Ken is able to further antagonise JAK/STAT pathway target genes. While STAT92E binding sites required for target gene expression have been poorly characterised, the existence of genome data allows the prediction of candidate STAT92E sites present in target genes promoters to be attempted. When a 6kb region containing the putative regulatory domains flanking the vvl locus are examined, only a single potential STAT92E binding site located 825bp upstream of the translational start can be detected. Strikingly, this site also includes a perfect Ken binding sequence. Such an in silico observation, though consistent with both Ken DNA binding assay in vitro and regulation of STAT92E target genes in vivo, however, requires further analysis. The JAK/STAT pathway is implicated in a variety of processes during embryonic and larval development as well as in imago. In each case, stimulation of the same transcription factor results in different developmental outcomes. While many potential mechanisms have been proposed and demonstrated to explain such pleiotropy, the present study indicates that Ken may represent another mechanism, with which signal transduction pathways are controlled. Ken selectively down-regulates a subset of potential target genes and so modifies the transcriptional profile generated by activated STAT92E - a mechanism, which may be partially responsible for differences in the morphogenetic processes elicited by JAK/STAT signalling during development.

MicroRNAs Modulate Hematopoietic Lineage Differentiation

MicroRNAs (miRNAs), an abundant class of ~22 nucleotide non-coding RNAs, are thought to play an important regulatory role in animal and plant development at the posttranscriptional level. Many miRNAs cloned from mouse bone marrow cells are differentially regulated in various hematopoietic lineages, suggesting that they might influence hematopoietic lineage differentiation. Some human miRNAs are linked to leukemias: the miR-15a/miR-16 locus is frequently deleted or down-regulated in patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia and miR-142 is at a translocation site found in a case of aggressive B-cell leukemia. miR-181, a miRNA upregulated only in the B cell lineage of mouse bone marrow cells, promotes B cell differentiation and inhibits production of CD8⁺ T cells when expressed in hematopoietic stem/progenitor cells. In contrast miR-142s inhibits production of both CD4⁺ and CD8⁺ T cells and does not affect B cells. Collectively, these results indicate that microRNAs are components of the molecular circuitry controlling mouse hematopoiesis and suggest that other microRNAs have similar regulatory roles during other facets of vertebrate development.

Hematopoietic stem cells, overview and pathways implied on their self-renewal mechanisms

Blood tissue is composed approximately in 45% by cells and its derivatives, with a life span of around 120 days for erythrocytes and 3 years for certain type of lymphocytes. This lost is compensated with the hematopoietic system activity and the presence of an immature primitive cell population known as Hematopoietic Stem Cells (HSCs) which perform the hematopoiesis, a process that is active from the beginning of the fetal life and produces near to 2 x 1011 eritrocytes and 1010 white blood cells per day (1). Hematopoietic Stem Cells are capable of both self-renewal and differentiation into multiple lineages, are located in a particular niche and are identified by their own cell surface markers, as the CD34 antigen. Recently it has been possible to advance in the understanding of self-renewal, differentiation and proliferation processes and in the involvement of the signaling pathways Hedgehog, Notch and Wnt. Studying the influence of these mechanisms on in vivo and in vitro behavior and the basic biology of HSCs, has given valuable tools for the generation of alternative therapies for hematologic disorders as leukemias.

A novel variant on chromosome 7q22.3 associated with mean platelet volume, counts, and function

Mean platelet volume (MPV) and platelet count (PLT) are highly heritable and tightly regulated traits. We performed a genome-wide association study for MPV and identified one SNP, rs342293, as having highly significant and reproducible association with MPV (per-G allele effect 0.016 +/- 0.001 log fL; P < 1.08 x 10(-24)) and PLT (per-G effect -4.55 +/- 0.80 10(9)/L; P < 7.19 x 10(-8)) in 8586 healthy subjects. Whole-genome expression analysis in the 1-MB region showed a significant association with platelet transcript levels for PIK3CG (n = 35; P = .047). The G allele at rs342293 was also associated with decreased binding of annexin V to platelets activated with collagen-related peptide (n = 84; P = .003). The region 7q22.3 identifies the first QTL influencing platelet volume, counts, and function in healthy subjects. Notably, the association signal maps to a chromosome region implicated in myeloid malignancies, indicating this site as an important regulatory site for hematopoiesis. The identification of loci regulating MPV by this and other studies will increase our insight in the processes of megakaryopoiesis and proplatelet formation, and it may aid the identification of genes that are somatically mutated in essential thrombocytosis. (Blood. 2009; 113: 3831-3837)

Neurokinin-B transcription in erythroid cells - Direct activation by the hematopoietic transcription factor GATA-1

The GATA family of transcription factors establishes genetic networks that control developmental processes including hematopoiesis, vasculogenesis, and cardiogenesis. We found that GATA-1 strongly activates transcription of the Tac-2 gene, which encodes proneurokinin-B, a precursor of neurokinin-B (NK-B). Neurokinins function through G protein-coupled transmembrane receptors to mediate diverse physiological responses including pain perception and the control of vascular tone. Whereas an elevated level of NK-B was implicated in pregnancy-associated pre-eclampsia ( Page, N. M., Woods, R. J., Gardiner, S. M., Lomthaisong, K., Gladwell, R. T., Butlin, D. J., Manyonda, I. T., and Lowry, P. J. ( 2000) Nature 405, 797 - 800), the regulation of NK-B synthesis and function are poorly understood. Tac-2 was expressed in normal murine erythroid cells and was induced upon ex vivo erythropoiesis. An estrogen receptor fusion to GATA-1 (ER-GATA-1) and endogenous GATA-1 both occupied a region of Tac-2 intron-7, which contains two conserved GATA motifs. Genetic complementation analysis in GATA-1-null G1E cells revealed that endogenous GATA-2 occupied the same region of intron-7, and expression of ER-GATA-1 displaced GATA-2 and activated Tac-2 transcription. Erythroid cells did not express neurokinin receptors, whereas aortic and yolk sac endothelial cells differentially expressed neurokinin receptor subtypes. Since NK-B induced cAMP accumulation in yolk sac endothelial cells, these results suggest a new mode of vascular regulation in which GATA-1 controls NK-B synthesis in erythroid cells.

Estudo clínico-laboratorial e histopatológico de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi com diferentes graus de manifestação física

Canine Visceral Leishmania (CVL) is an important zoonotic disease that has a world wide distribution and has a large impact on public health on the American Continent, especially in Brazil, where the nature of endemic diseases in humans affects a large part of the nation. The influence of the prevalence of CVL in the increased rate of human cases in endemic areas and in the unleashing of epidemic outbreaks shows the need for a more profound understanding, that would generate significant advances in the current measures used to control the reservoirs of sickness that are practiced by the Programa Nacional de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral. The present work describes and compares the clinical-laboratorial and histopathological findings of twenty-three dogs that were naturally infected by Leishmania chagasi, from endemic areas in metropolitan Natal, Rio Grande do Norte, Brazil. These animals, that were selected and given physical and serological exams (IFI and ELISA rK-39), were classified according to the degree of clinical severity and had blood samples drawn (whole blood and serum) for a complete hemogram and a coagulogram to be done as well as biochemical tests for kidney and liver function. The confirmation of infection by L. chagasi was done after the euthanasia of the animals, through the direct demonstration of the parasite in the impression of the spleen and liver crowned with GIEMSA and through a cultivation by means of NNN/Schneider. According to the clinical evaluation, the animals were classified as asymptomatic (7), oligosymptomatic (7) and polysymptomatic (9). Among the animals that were chosen to be autopsied, there were 2 asymptomatic, 3 oligosymptomatic and 3 polysymptomatic, for the purpose of studying their histopathology, having collected fragments of the spleen, liver, kidneys and skin and were fixed in 10% tamponed formol. The comparison between the average parameters of the clinical-laboratory tested animals in the groups was done through the Student t test (a<0.05). The main clinical signals observed were lymphadenomegaly, alopecy, dermatitis, exfoliation, cutaneous ulcers, onicogriphosis and emaciation. The main clinical-laboratorial alterations established, mainly in the polysymptomatic group, were anemia, hyperproteinemia, hyperglobulinemia, alterations in the albumin/globulin ratio and increased ALT activity. Renal alterations were not verified (urea and creatinine levels were normal). Thrombocytopenia was observed in three clinical groups. However, the other indicators of coagulation function (TAP and TTPA) did not have abnormal variations. There were inflammatory infiltrations and leishmania amastigotes in the skin of polysymptomatic dogs, however, they were not found in the skin of asymptomatic animals. Hypertrophy and hyperplasia of the phagocyte mononuclear system, leishmania amastigote parasites were found in the macrophages, extramedullary hematopoiesis and degenerative alterations were detected in the spleen and liver of 8 of the animals submitted to histopathological exams. In accord with these results, it was demonstrated that the expected alterations in the hematological and biochemical parameters in function of their viscerotropic nature of CVL are mainly observed in the more advanced stages of the disease. The absence of inflammatory infiltration and parasite load in the skin suggest that infected animals without symptoms may have an importance irrelevant to the infectiousness of the vector

Diuron exposure induces systemic and organ-specific toxicity following acute and sub-chronic exposure in male Wistar rats

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)