Homogneous time resolved fluorescence: a new technique for detection and quantifications of infliximab in autoimmune patients

RESUMO:As terapias biológicas revolucionaram o tratamento das doenças autoimunes nos últimos anos. Tipicamente têm como alvos mediadores importantes no mecanismo das doenças. Os antagonistas do fator de necrose tumoral-α (TNF-α) são um grupo de agentes biológicos muito prescrito, pois estão indicados no tratamento de doenças imuno-mediadas comuns, tais como artrite reumatoide, artrite idiopática juvenil, artrite psoriática, espondilite anquilosante, doença de Crohn e colite ulcerosa. Com o uso frequente de inibidores do TNF-α, tem-se tornado evidente que estes agentes têm um potencial imunogénico importante, que pode comprometer o prognóstico a longo prazo dos doentes cronicamente tratados. A produção de anticorpos anti-fármaco parece causar falência terapêutica secundária em muitos doentes. Um dos efeitos dos anticorpos anti-fármaco é o aumento da eliminação do fármaco. A eliminação do fármaco, por sua vez, varia entre indivíduos, refletindo diferentes perfis farmacocinéticos. A determinação dos níveis séricos mínimos do agente anti-TNF-α é assim muito informativa e pode auxiliar nas decisões terapêuticas. Contudo, os testes imunológicos para determinar as concentrações séricas do fármaco não estão facilmente disponíveis na prática clínica. De forma a investigar uma nova técnica potencialmente fidedigna e prática para a deteção e quantificação dos agentes biológicos anti-TNF-α, foi testada a técnica por HTRF (homogeneous time-resolved fluorescence resonance energy transfer) para a determinação de concentrações séricas de infliximab. Apesar de apresentar algumas limitações relacionadas com as condições de leitura da fluorescência, esta técnica provou obter resultados próximos das concentrações obtidas por ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) bridging. Adicionalmente, tem a vantagem de ser de execução muito mais fácil e rápida. Deste modo, a técnica por HTRF poderá ser otimizada e tornar-se uma valiosa ferramenta laboratorial para orientar as decisões terapêuticas em doentes autoimunes com falência da terapêutica anti-TNF-α.--------- ABSTRACT: Biologic therapies revolutionized the treatment of autoimmune diseases in the last years. Typically, they target important disease mediators. Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) antagonists constitute a very prescribed group of biologic agents as they are indicated for the treatment of common immune-mediated diseases, such as rheumatoid arthritis, juvenile idiopathic arthritis, psoriatic arthritis, ankylosing spondylitis, Crohn’s disease and ulcerative colitis. With the increasing use of TNF-α inhibitors it has been noticed that they have an important immunogenic potential that can compromise long-term outcomes in chronically treated patients. The production of anti-drug antibodies seems to cause secondary therapeutic failure in many patients. One of the effects of anti-drug antibodies is the enhancement of drug clearance. Drug clearance, in turn, varies among individuals, reflecting different pharmacokinetic profiles. Determination of serum anti-TNF-α drug trough levels is though very informative and could support treatment decisions. However, immunologic assays to determine drug serum concentrations are not readily available in clinical practice. In order to investigate a potentially reliable and practical new technique for detection and quantification of anti-TNF-α biologic agents, homogeneous time-resolved fluorescence resonance energy transfer (HTRF) technique was tested for determination of serum infliximab concentrations. Although presenting some limitations related with fluorescence reading conditions, this technique proved to give results close to the concentrations obtained by the widely used bridging enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In addition, it has the advantage of being much easier and faster to perform. Thus, HTRF technique can be optimized and become a valuable laboratorial tool to guide treatment decisions in autoimmune patients with anti-TNF-α therapy failure.

Tratamento da amebíase intestinal por meio de pequenas quantidades diárias de etofamida, usadas em esquemas de curta duração

Por meio da etofamida, trataram os autores 40 indivíduos acometidos de amebíase intestinal e representados por crianças e adultos de ambos os sexos. Os esquemas posológicos recomendados para os componentes de dois grupos de 20 elementos foram os seguintes: A) 100 mg três vezes em 24 horas, durante cinco dias; B) 100 mg, cinco vezes em 24 horas, durante três dias. Foi expressiva a percentagem global de 90% de curas obtidas, mas a administração de maior quantidade diária da droga, durante período mais curto, mostrou-se dotada de melhor efetividade e possibilitou a eliminação da parasitose de todas as pessoas medicadas. O estudo que efetuaram, correspondente à amebíase intestinal assintomática, oligossintomática ou aparente como colite crônica, deixou patente a eficácia do remédio usado, que praticamente não causou distúrbios colaterais e pode ser prescrito segundo planejamentos singelos e executáveis com facilidade.

Caso fatal de balantidíase intestinal

Caso fatal de balantidíase em mulher desnutrida de 63 anos, criadora de porcos, da zona rural de Uberaba. A doença evoluiu em oito dias com disenteria, náusea e vômitos, culminando em óbito por enterorragia. A necropsia constatou-se colite ulcerada causada por B. coli, facilmente identificado ao exame histológico do intestino grosso.

Avaliação do potencial anti-inflamatório, antioxidante e antimicrobiano de extratos de segurelha, salsa e coentros

Recentemente tem-se observado um crescente interesse pelo uso de plantas aromáticas, devido às inúmeras propriedades benéficas que lhes têm sido associadas, e a sua aplicação em diversas indústrias, como a indústria alimentar e farmacêutica. Este estudo incidiu sob três ervas aromáticas utilizadas comummente em Portugal: coentros, salsa e segurelha. O objetivo do mesmo foi contribuir para um melhor conhecimento das propriedades bioativas das plantas estudadas, através da determinação do seu teor em compostos fenólicos totais e em flavonoides, e avaliação das suas atividades antioxidante, antimicrobiana e anti-inflamatória. A atividade antioxidante foi determinada através de diferentes tipos de ensaios, nomeadamente avaliação da capacidade redutora, com os ensaios FRAP e CUPRAC, avaliação da capacidade de sequestro do radical DPPH• e avaliação da capacidade de sequestro do radical anião superóxido. A atividade antimicrobiana foi determinada utilizando três estirpes microbianas, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Candida albicans. Por sua vez, a ação anti-inflamatória foi determinada através de ensaios in-vivo apenas para a segurelha, utilizando dois modelos, um para a inflamação aguda (modelo de edema da pata induzido pela carragenina) e outro para a inflamação crónica (modelo da colite ulcerativa). Os resultados demonstraram que todos os extratos de plantas aromáticas possuem atividade antioxidante, sendo que o extrato de segurelha foi aquele que apresentou um maior teor de compostos fenólicos e flavonoides, bem como o que demonstrou possuir uma maior atividade antioxidante relativamente aos restantes extratos estudados, o que sugere o envolvimento destes compostos neste tipo de atividade antioxidante. Entre o extrato de coentros e salsa, o extracto de coentros apresentou um teor em compostos fenólicos e uma actividade antioxidante significativamente superior relativamente ao extracto de salsa. O extrato de segurelha foi o único que apresentou ação antimicrobiana, o que poderá indicar que os compostos fenólicos se encontram também interligados com esta propriedade. A atividade anti-inflamatória foi determinada apenas para o extrato de segurelha, sendo que se observou que este possui efeitos benéficos para a inflamação aguda e crónica, o que poderá estar novamente relacionado com o seu teor em fenóis e flavonoides. O efeito anti-inflamatório observado com o extrato de segurelha no modelo de colite pode ser muito útil do ponto de vista de profilaxia pois o extrato foi administrado aos animais logo a seguir à indução da colite e os resultados demonstram haver uma diminuição significativa da extensão e violência dos sinais da inflamação crónica observados no grupo controlo positivo.

The role of nonhematopoietic MHC class II expression in immune responses and tolerance

Si les rôles fonctionnels de diverses cellules immunitaires infiltrant des tissus enflammés sont assez bien compris, par contre, étonnamment, on connaît bien moins la capacité des cellules non hématopoïétiques résidant dans des tissus, à moduler l'activité biologique des cellules immunitaires immigrantes, et donc le résultat de la réponse immunitaire. La présentation des antigènes, dans le contexte des molécules du CMH de classe II (CMHII) à la surface des cellules présentatrices d'antigènes (CPA) professionnelles à une sous- population de lymphocytes T, est cruciale pour le développement des réponses immunitaires protectives spécifiques de l'antigène. En général, l'expression de CMHII est réservée aux CPAs. Toutefois, au cours des pathologies inflammatoires spécifiques d'organe, telles que l'auto-immunité ou la maladie inflammatoire de l'intestin, l'expression de CMHII est également induite par la cytokine interféron (IFN)-y sur des cellules non hématopoïétiques qui résident dans des tissus enflammés. Les conséquences de ce phénomène sont encore peu comprises. Dans cette étude, nous avons utilisé une souche de souris génétiquement modifiées, qui n'a pas la capacité d'induire l'expression de CMHII sur les cellules non hématopoïétiques, mais a maintenu la régulation normale d'expression de CMHII sur les cellules hématopoïétiques. Nous avons appliqué ces souris à différents modèles d'inflammation intestinale et à un modèle de maladie qui imite la maladie auto-immune de l'inflammation du muscle cardiaque (myocardite) chez l'homme. Nous avons pu montrer que, au cours de l'inflammation intestinale, l'expression du CMHII nonhématopoïétique, ou encore l'expression du CMHII par les cellules épithéliales de l'intestin, confère une protection contre la maladie, en réduisant les cellules immunitaires inflammatoires et en augmentant les cellules Τ régulatrices anti-inflammatoires. Ces résultats pourraient expliquer l'échec des traitements d'anti-IFN-γ dans les maladies intestinales inflammatoires chez l'homme. En revanche, dans la myocardite auto-immune, nos résultats indiquent que la présentation d'antigènes par les cellules non hématopoïétiques du coeur est nécessaire pour l'apparition de la pathologie cardiaque, comme nos souris sont résistantes à la maladie. Toutefois, cela n'est pas dû à un défaut d'activation des lymphocytes T, car les lymphocytes Τ des souris mutantes sont parfaitement capables de promouvoir la maladie après le transfert adoptif dans des animaux de type naturel. Nos résultats suggèrent que, durant les maladies inflammatoires spécifiques d'organe, la présentation d'antigène par des cellules non hématopoïétiques module et contribue au résultat de la réponse immunitaire d'une manière opposée, conférant soit la protection contre la maladie ou sa promotion. Nos résultats pourraient ouvrir la voie à des thérapies qui prennent en compte la contribution de la présentation d'antigènes par les cellules non hématopoïétiques, au cours des maladies inflammatoires spécifiques d'organe. - Les molécules du CMH de classe II (CMHII) sont fondamentales pour la présentation des antigènes aux lymphocytes Τ CD4+, car elles permettent le développement des réponses immunitaires spécifiques de l'antigène. Il est largement admis que l'expression de CMHII est réservée aux cellules présentatrices d'antigènes (CPA). Cependant, dans des conditions inflammatoires, l'expression de CMHII est en principe également induite par l'interféron (IFN)-y sur les cellules non hématopoïétiques, telles que les cellules épithéliales et les cardiomyocytes. Une controverse existe jusqu'à présent au sujet de la fonction de cette présentation d'antigènes non professionnelle, pour savoir si elle favorise la tolérance ou l'immunité dépendante des lymphocytes Τ in vivo. Pour répondre à cette question, nous avons testé des souris qui ne sont pas capables d'induire l'expression du CMHII sur les cellules non hématopoïétiques (souris PIV-/- K14 CIITA Tg) parmi différents modèles murins de pathologies inflammatoires, à savoir les modèles de vaccination pour induire des réponses spécifiques d'antigènes des lymphocytes B, plusieurs modèles de colite et un modèle de myocardite auto-immune expérimental (EAM). Pour cela, nous avons administré à ces souris un modèle de colite atténuée, induite par une infection chronique à Helicobacter hepaticus et par l'administration d'anticorps monoclonaux bloquant le récepteur de l'interleukine (IL)-10 (anti-IL-10R). Dans ce système, nous avons pu observer que l'expression abrogée de CMHII a aggravé la colite bactérienne, soit par les cellules non hématopoïétiques, soit exclusivement par les cellules épithéliales intestinales (CEI) dans un autre modèle murin (souris plV_fl/fl vil-Cre Tg). Ce phénotype du côlon a été associé à une augmentation des fréquences de cellules immunitaires innées, de lymphocytes Th1 CD4+, et d'expression des cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires, y compris l'IFN-γ. Notamment, l'expression défectueuse de CMHII non hématopoïétique a également réduit les cellules Τ régulatrices (Treg) Forkhead box P3 (FoxP3)+, sans influencer les fréquences des cellules innées lymphoïdes et des cellules Th17. Ces résultats suggèrent un rôle tolérogène de CEIs CMHII+ qui contribue à l'homéostasie immunitaire intestinale. En revanche, dans le modèle d'EAM, les souris ayant subi une ablation de CMHII non hématopoïétique étaient résistantes à l'induction de la maladie, alors que la progression de la pathologie cardiaque, dans les souris de type naturel ou hétérozygotes, a été accompagnée par une régulation positive de l'expression de CMHII du myocarde. Cependant, l'inflammation cardiaque pourrait être transférée de manière adoptive depuis des souris amorcées PIV-/- K14 CIITA Tg vers des souris de type naturel, indiquant l'absence de défaut intrinsèque d'amorçage des cellules T CD4+ dans notre modèle de souris. Ces observations impliquent un rôle à jouer pour des cellules CMHII+ non hématopoïétiques résidentes du coeur, dans la promotion active de ΙΈΑΜ. En conclusion, nos résultats, provenant de diverses pathologies inflammatoires spécifiques d'organes, suggèrent un rôle complexe et divergent, soit tolérogène, soit immunogène/ pathologique, pour l'expression de CMHII non hématopoïétique au cours des pathologies inflammatoires. L'expression non professionnelle de CMHII semble influencer le résultat des réponses immunitaires en fonction de différents facteurs, tels que le tissu cible, le(s) type(s) de cellule(s) non hématopoïétique(s) participante(s) et l'origine de l'inflammation. Nos résultats pourraient potentiellement ouvrir la voie à des applications thérapeutiques, qui tiennent compte de la contribution de la présentation d'antigènes par des CPAs non professionnelles, au cours de l'inflammation spécifique d'organe. - MHC class II (MHCII) molecules are fundamental for the presentation of antigens to CD4+ Τ cells, allowing the development of antigen-specific immune responses. It is widely accepted that MHCII expression is restricted to antigen-presenting cells (APC). However, under inflammatory conditions, MHCII expression is typically also induced by interferon (IFN)-y on nonhematopoietic cells such as epithelial cells and cardiomyocytes. So far, it remains controversial whether this nonprofessional antigen-presentation function promotes CD4+ Τ cell-dependent tolerance or immunity in vivo. To address this issue, we utilised mice which lack inducible MHCII expression on nonhematopoietic cells (pIV-/- K14 CIITA Tg mice) in different mouse models of inflammatory pathologies, namely immunisation models to induce antigen-specific Β cell responses, various colitis models and a model of experimental autoimmune myocarditis (EAM). In an attenuated model of colitis induced by chronic Helicobacter hepaticus infection and treatment with anti-interleukin (IL)-10 receptor (anti-IL-10R) monoclonal blocking antibody, we observed that abrogated MHCII expression by nonhematopoietic cells or, in an alternative tamoxifen-inducible mouse model (plV_fl/fl vil-Cre Tg mice), exclusively by intestinal epithelial cells (IEC), exacerbated bacterial-driven colitis, which was associated with increased colonic frequencies of innate immune cells, CD4+ Th1 cells and expression of proinflammatory cytokines and chemokines, including IFN-γ. Notably, defective nonhematopoietic MHCII expression also resulted in reduced Forkhead box P3 (FoxP3)+ regulatory Τ (Treg) cells without influencing innate lymphoid cell (ILC) and Th17 cell frequencies. These findings suggest a tolerogenic role of MHClT lECs to contribute to intestinal immune homeostasis. In contrast, in the EAM model, mice ablated of nonhematopoietic MHCII were resistant to disease induction, whereas progression of cardiac pathology in WT and heterozygous control mice was accompanied by upregulation of myocardial MHCII expression. However, cardiac inflammation could be adoptively transferred from primed pIV-/- K14 CIITA Tg mice into WT mice, indicating no intrinsic defect of CD4+ Τ activation in our mouse model. These observations imply a role for MHCIT heart-resident nonhematopoietic cells in actively promoting EAM. In conclusion, our findings from different organ-specific inflammatory pathologies suggest a complex and diverging role - either tolerogenic or immunogenic/ pathologic - for nonhematopoietic MHCII expression during inflammatory pathologies: Nonprofessional MHCII expression appears to influence the outcome of immune responses depending on 7 factors such as the target tissue, participating non hematopoietic cell type(s) and the origin of inflammation. Our findings may potentially open the way to therapeutic applications taking into account the contribution of antigen presentation by nonprofessional, tissue-resident APCs during organ-specific inflammation.

Processos de enfrentamento do estresse e sintomas depressivos em pacientes portadores de retocolite ulcerativa idiopática

Neste estudo se investigou as formas de enfrentamento do estresse e a presença dos sintomas depressivos em 100 indivíduos portadores de retocolite ulcerativa idiopática (RCUI), usuários do Ambulatório de Doenças Inflamatórias do HCFMUSP, que foram comparados com 100 indivíduos acompanhantes de pacientes de outra unidade da mesma instituição, isentos da doença. A metodologia consistiu de aplicar aos dois grupos o Inventário de Estratégias de Enfrentamento de Folkman e Lazarus e o Inventário de Depressão de Beck. As estratégias de enfrentamento mais utilizadas pelo grupo de doentes foram Suporte Social (47%) e Reavaliação Positiva (40%), e no grupo controle ocorreu predomínio da estratégia Reavaliação Positiva (52%). Quanto ao transtorno de humor, 71% dos portadores de RCUI não apresentavam sintomas depressivos (contra 78% do grupo controle), 9% apresentavam disforia (contra 9% do grupo controle) e 20% sintomas depressivos (contra 13% do grupo controle).

Role of the epithelial sodium channel (ENaC) and its regulator CAP1/Prss8 in colon

Dans les cellules épithéliales sensibles à l'aldostérone, le canal sodique épithélial (ENaC) joue un rôle critique dans le contrôle de l'équilibre sodique, le volume sanguin, et la pression sanguine. Le rôle d'ENaC est bien caractérisé dans le rein et les poumons, cependant le rôle d'ENaC et son régulateur positif la protéase activatrice de canal 1 (CAP1 /Prss8) sur le transport sodique dans le côlon reste en grande partie inconnu. Nous avons étudié l'importance d'ENaC et de CAPMPrss8 dans le côlon. Les souris déficientes pour la sous- unité aENaC (souris ScnnlaKO) dans les cellules superficielles intestinales étaient viables et ne montraient pas de létalité embryonnaire ou postnatale. Sous diète normale (RS) ou pauvre en sodium (LS), la différence de potentiel rectale sensible à l'amiloride (APDamii) était drastiquement diminuée et son rythme circadien atténué. Sous diète normale (RS) ou diète riche en sodium (HS) ou fort chargement de potassium, le sodium et le potassium plasmatique et urinaire n'étaient pas significativement changé. Cependant, sous LS, les souris Senni aK0 perdaient des quantités significativement augmentées de sodium dans leurs fèces, accompagnées par de très hauts taux d'aldostérone plasmatique et une rétention urinaire en sodium augmentée. Les souris déficientes en CAPl/PmS (Prss8K0) dans les cellules superficielles intestinales étaient viables et ne montraient pas de létalité embryonnaire ou postnatale. Sous diètes RS et HS cependant, les souris Prss8KO montraient une diminution significative du APDamil dans l'après-midi, mais le rythme circadien était maintenu. Sous diète LS, la perte de sodium par les fèces était accompagnée par des niveaux d'aldostérone plasmatiques plus élevés. Par conséquent, nous avons identifié la protéase activatrice de canal CAP 1 IPrss8 comme un régulateur important d'ENaC dans le côlon in vivo. De plus, nous étudions l'importance d'ENaC et de CAPIIPrss8 dans les conditions pathologiques comme les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI). Le résultat préliminaire out montre qu'une déficience d'Prss8 mènait à la détérioration de la colite induite par le DSS comparé aux modèles contrôles respectifs. En résumé, l'étude a montré que sous restriction de sel, l'absence d'ENaC dans Pépithélium de surface du côlon était compensée par 1'activation du système rénine-angiotensine- aldostérone (RAAS) dans le rein. Ceci a mené à un pseudohypoaldostéronisme de type I spécifique au côlon avec résistance aux minéralocorticoïdes sans signe d'altération de rétention de potassium. - In aldosterone-responsive epithelial cells of kidney and colon, the epithelial sodium channel (ENaC) plays a critical role in the control of sodium balance, blood volume, and blood pressure. The role of ENaC is well characterized in kidney and lung, whereas role of ENaC and its positive regulator channel-activating protease 1 (CAPl/PrasS) on sodium transport in colon is largely unknown. We have investigated the importance of ENaC and CAPI/Prss8 in colon for sodium and potassium balance. Mice lacking the aENaC subunit (Scnnla mice) in intestinal superficial cells were viable and did not show any fetal or perinatal lethality. Under regular (RS) or low salt (LS) diet, the amiloride sensitive rectal potential difference (APDamii) was drastically decreased and its circadian rhythm blunted. Under regular salt (RS) or high salt (HS) diets or under potassium loading, plasma and urinary sodium and potassium were not significantly changed. However, upon LS, the ScnnlaK0 mice lost significant amounts of sodium in their feces, accompanied by very high plasma aldosterone and increased urinary sodium retention. Mice lacking the CAPl/PrasS (Prss8K0) in intestinal superficial cells were viable and did not show any fetal or perinatal lethality. Upon RS and HS diets, however, Prss8K0 exhibited a significantly reduced APDamii in the afternoon, but its circadian rhythm was maintained. Upon LS diet, sodium loss through feces was accompanied by higher plasma aldosterone levels. Thus, we have identified the channel-activating protease CAPl/Prss8 as an important in vivo regulator of ENaC in colon. Furthermore, we are investigating the importance of ENaC and CAPI/Prss8 in pathological conditions like inflammatory bowel disease (IBD). Preliminary data showed that PmS-deficiency led to worsening of DSS-induced colitis as compared to their respective controls. Overall, the present study has shown that under salt restriction, the absence of ENaC in colonic surface epithelium was compensated by the activation of renin-angiotensin- aldosterone (RAAS) system in the kidney. This led to a colon specific pseudohypoaldosteroni sm type 1 with mineralocorticoid resistance without evidence of impaired potassium retention.

Phenotypical analysis of mice deficient for the channel activating protease CAP2

Channel activating proteases (CAP) are membrane-bound serine proteases that have been identified as in vitro activators of the epithelial sodium channel (ENaC). Two of them are mainly studied in the laboratory. CAP1/Prss8 was previously shown implicated in colonic sodium homeostasis in vivo. In the first part of this thesis, we generated and characterized mice deficient for CAP2/Tmprss4. The mice are healthy and viable, and they do not show any obvious phenotype. We investigated ENaC activity and expression under regular and sodium- deficient diet, and we could demonstrate that CAP2 is not a major regulator of sodium homeostasis in vivo. We next studied whether CAP2 is implicated in potassium homeostasis. We detected a strong gender-dependency when CAP2 knock-out mice were put under a potassium-deficient diet. We showed in male mice an implication of CAP2 in the regulation of the colonic H+, K+- ATPase, and we propose an implication of membrane-associated progesterone receptors and their binding partners, as well as a possible cleavage-mediated glucocorticoid receptor signalling. We studied the possible interaction between CAPI and CAP2 by generating and characterizing two different mouse study groups, displaying different hypomorphic mutations in the CAPI gene, and deficient for CAP2. We demonstrate that balanced expression of CAPI and CAP2 is required for maintainance of skin integrity and for normal placental development. As CAPI knock-out embryos die due to a placental failure, the additional combined deletion of CAP2 resulted in survival until birth. We could evidence that CAPI and CAP2 are implicated in the same signalling pathway as proposed in cancer studies at the level of the placenta, implicating integrin a5, ERK, AKT, E- and N-cadherin. Furthermore, we investigated whether CAPI is implicated in the pathogenesis and susceptibility to experimental chronic colitis in a mutant rat model. By giving CAPI mutant rats Dextran sodium sulfate, we induced chronic inflammation of the colon, and we highlighted the protective role of CAPI at the histopathological and clinical levels. In conclusion, we showed that CAP2 is not a major regulator of ENaC-mediated sodium homeostasis in vivo, but rather a regulator of potassium homeostasis in a gender-dependent manner implicating the colonic H+, K+-ATPase, membrane progesterone receptors, and the glucocorticoid receptor. We have investigated whether CAPI and CAP2 interact at the functional level, and we show that a balanced expression of CAPI and CAP2 is required in the skin, but also in the placenta. Imbalanced expression of CAPI and CAP2 leads to impaired EMT-associated signalling. We have studied whether CAPI is implicated in the pathogenesis and susceptibility to chronic colitis, and we demonstrated the protective role of CAPI in distal colon. -- Les protéases activatrices de canal (CAP) sont des protéases à serine attachées à la membrane qui ont été identifiées comme activateurs in vitro du canal sodique épithélial (ENaC). Deux de ces protéases sont principalement étudiées dans le laboratoire. CAP1/Prss8 a été identifié préalablement comme impliqué dans l'homéostasie du sodium in vivo au niveau du côlon. Dans la première partie de cette thèse, nous avons généré et caractérisé des souris déficientes pour CAP2/Tmprss4. Les souris sont en bonne santé et viables, et elles ne présentent pas de phénotype visible. Nous avons étudié l'activité et l'expression d'ENaC sous diète normale et déficiente en sodium, et nous avons démontré que CAP2 n'est pas un régulateur essentiel de l'homéostasie sodique in vivo. Nous avons ensuite étudié si CAP2 est impliqué dans l'homéostasie du potassium. Nous avons détecté une forte dépendance du sexe lorsque les souris knock-out pour CAP2 étaient placées sous diète déficiente en potassium. Nous avons démontré dans les souris mâles une implication de CAP2 dans la régulation de la H+, K+- ATPase colonique, des récepteurs membranaires à la progestérone et de leur partenaires de liaison, ainsi que dans la possible signalisation médiée par le clivage du récepteur aux glucocorticoïdes. Nous avons étudié l'interaction possible entre CAPI et CAP2 en générant et en caractérisant deux groupes d'étude de souris différents, porteurs de différentes mutations hypomorphiques dans le gène de CAPI, et déficients pour CAP2. Nous avons pu montrer qu'une expression équilibrée de CAPI et CAP2 est requise pour le maintien de l'intégrité de la peau et pour le développement normal du placenta. Les embryons knock-out pour CAPI meurent suite à une défaillance placentaire, et la délétion additionnelle et combinée de CAP2 permet la survie jusqu'à la naissance. Nous supposons que CAPI et CAP2 sont impliqués dans la même voie de signalisation au niveau du placenta que celle proposée dans les études de cancer, impliquant l'intégrine a5, ERK, AKT, E- et N-cadhérine. De plus, nous avons étudié si CAPI est impliqué dans la pathogenèse et la susceptibilité de colite chronique expérimentale dans un modèle de rat mutant. En administrant aux rats mutants pour CAPI du Dextran sodium sulfate, nous avons induit une inflammation chronique du côlon, et nous avons pu mettre en évidence le rôle protecteur de CAPI au niveau histopathologique et au niveau clinique. En conclusion, nous avons démontré que CAP2 n'est pas un régulateur essentiel de l'homéostasie sodique médiée par ENaC in vivo, mais plutôt de l'homéostasie potassique d'une manière dépendante du sexe et impliquant la H+, K+-ATPase colonique, les récepteurs membranaires à la progestérone et le récepteur aux glucocorticoïdes. Nous avons étudié si CAPI et CAP2 interagissent au niveau fonctionnel, et nous avons montré qu'une expression équilibrée entre CAPI et CAP2 est requise dans la peau et le placenta. L'expression déséquilibrée de CAPI et CAP2 mène à une altération de la signalisation associée à l'EMT. Nous avons étudié si CAPI est impliqué dans la pathogenèse et la susceptibilité de colite chronique expérimentale, et nous avons démontré le rôle protecteur de CAPI dans le côlon distal.

Repercussões histopatológicas da colostomia no coto colônico distal desfuncionalizado: estudo experimental em ratos

O objetivo deste trabalho foi evidenciar as repercussões histopatológicas da colostomia no segmento desfuncionalizado e, dessa forma, criar um modelo experimental da colite de derivação fecal (CO). Foram utilizados 65 ratos, adultos, da raça Wistar, com peso variando de 220 a 300 g. Os animais foram divididos em 13 grupos, contendo cinco ratos. Do grupo 1 ao grupo 12, os animais foram submetidos a laparotomia mediana, sendo realizada uma colostomia terminal tipo boca única, e observados, por períodos variados de tempo, com o máximo de cem dias. Os animais, após serem mortos, foram necropsiados e retirado o segmento co1ônico desfuncionalizado para a avaliação histopatológica. Essa avaliação consistia de uma análise quantitativa, através da medida da espessura da mucosa colônica, e de uma análise qualitativa, mediante avaliação subjetiva: da presença de infiltrado inflamatório agudo ou crônico na lâmina própria; das alterações na arquitetura das criptas colônicas; da presença de hiperplasia folicular linfóide e de linfócitos na luz dos vasos da submucosa; e da presença de eosinófilos na luz intestinal. No grupo 12, após o 100° dia de pós-operatório (OPO), foi realizada a reconstrução do trânsito intestinal, e, após trinta dias, o cólon descendente foi retirado para a análise histopatológica. O método de Tukey e o teste "t" de Student foram utilizados como parte da análise dos resultados. Verificou-se uma redução estatisticamente significante da espessura da mucosa colônica a partir do 4000PO. Concluiu-se que a colostomia desfuncionalizante realizada em ratos reproduziu alterações histopatológicas compatíveis com a colite de derivação, e que estas mostraram-se reversíveis após a reconstrução do trânsito intestinal.

Avaliação do número de células caliciformes nas criptas da mucosa colônica com e sem trânsito intestinal

OBJETIVO: Medir a espessura das criptas e quantificar o número de células caliciformes comparando a mucosa cólica com e sem trânsito intestinal, relacionando-as ao tempo de exclusão. MÉTODOS: Sessenta ratos Wistar, foram distribuídos em três grupos com 20 animais segundo a operação final para a retirada dos cólons, realizadas em seis, 12 ou 18 semanas. Em cada grupo, 15 animais foram submetidos à derivação do trânsito por colostomia proximal no cólon esquerdo e fístula mucosa distal e cinco apenas à laparotomia (controle). Os cólons com e sem trânsito fecal foram removidos, processados, submetidos a cortes histológicos corados pela hematoxilina-eosina. A altura das criptas colônicas e o número de células caliciformes foram mensurados por morfometria computadorizada. Foram utilizados os testes t de Student e Kruskal-Wallis para comparação e análise de variância, estabelecendo-se nível de significância de 5% (p<0,05). RESULTADOS: A altura das criptas diminui nos segmentos sem trânsito fecal (p=0,0001), reduzindo entre seis e 12 semanas de exclusão (p=0,0003), estabilizando-se após este período. O número de células caliciformes nas criptas é menor nos segmentos sem trânsito após 12 e 18 semanas (p=0,0001), porém aumenta com o decorrer do tempo de exclusão (p=0,04) CONCLUSÃO: A exclusão do trânsito intestinal diminui a espessura das criptas colônicas e o número de células caliciformes nos segmentos sem trânsito. Existe aumento do número de células caliciformes com o decorrer do tempo de exclusão.

Avaliação da patogenicidade de amostras de Brachyspira pilosicoli através de técnicas histopatológicas convencionais e por imuno-histoquímica

O presente trabalho avaliou diferenças de patoge-nicidade entre 19 cepas de Brachyspira pilosicoli isoladas de casos de diarréia em suínos no Estado do Rio Grande do Sul, usando um modelo de infecção oral de pintos de um dia. Os animais foram inoculados com uma suspensão de bactérias vivas, 21 dias após foram sacrificados e os cecos examinados por histopatologia através da hematoxilina-eosina, coloração pela prata e a imuno-histoquímica usando um anticorpo policlonal anti-Brachyspira pilosicoli. Com o uso das técnicas da prata e da imuno-histoquímica, respectivamente, 21,59% e 70,96% dos pintos mostraram colonização do epitélio do ceco por B. pilosicoli. Houve diferenças no tipo de colonização, ocorrendo aderência contínua, focal ou presença de bactérias livres na luz intestinal. A imuno-histoquímica foi considerada superior para a avaliação da colonização intestinal, pois foi capaz de detectar 49,37% de animais colonizados a mais do que com o uso da coloração pela prata. Em três cepas foram observadas figuras alongadas dentro do citoplasma das células epiteliais cecais de aves inoculadas.

Avaliação da patogenicidade de amostras de Brachyspira pilosicoli através de técnicas histopatológicas convencionais e por imunohistoquímica.

O presente trabalho objetivou avaliar diferenças na patogenicidade de 19 cepas de B. pilosicoli isoladas de casos de diarréia em suínos no Estado do Rio Grande do Sul. Foi utiliza o modelo experimental em pintos de um dia, que possui boa eficiência quando usado para a infecção oral com a B. pilosicoli, pois permite a consistente colonização cecal dos animais inoculados. Através dessa infecção experimental, buscou-se estabelecer diferenças de patogenicidade entre cepas de referência da B. pilosicoli e cepas dessa espécie isoladas previamente de casos de diarréia em leitões no Rio Grande do Sul. Foram inoculadas 21 cepas de origem suína e duas cepas controle (uma a referência da espécie, P43/6/78 e um isolado humano, P16). Os animais foram inoculados por via oral com uma suspensão de bactérias vivas multiplicadas em meio líquido, num inóculo de 0,8 mL contendo 1x106 espiroquetas na fase logarítmica de crescimento. Decorridos 21 dias após a infecção experimental, os animais foram sacrificados e os cecos fixados em formalina 10% tamponada, processados para exame histológico e os cortes examinados através da coloração pela prata e com uma técnica imunohistoquímica. Com o uso da coloração pela prata, 65% dos animais mostraram colonização pela B. pilosicoli do epitélio do cecal. Houve diferenças no tipo de colonização, consistindo de aderência contínua, aderência focal ou presença de bactérias livres na luz intestinal. Com a técnica de imunohistoquímica, 76,2% das cepas mostraram colonização. Dessa forma, concluiu-se que a imunohistoquímica foi superior à coloração pela prata para a avaliação da colonização intestinal dos pintos, pois foi capaz de detectar 11,2% de cepas colonizadoras a mais do que a coloração pela prata Um segundo experimento visou avaliar a transmissão horizontal da infecção por B. pilosicoli. Para tal, foram mantidos em contato na mesma gaiola, pintos inoculados com a bactéria e animais chamados “contatos”, não inoculados. Com o uso da coloração pela prata, 23,8 % apresentaram-se positivos e, pela imunohistoquímica, 54,2 % foram positivos. Aqui também a imunohistoquímica revelou-se mais eficiente do que a coloração pela prata. Como conclusão desse experimento, as cepas de campo analisadas mostraram alta capacidade de difusão horizontal. Um achado inesperado foi a presença de figuras elongadas dentro do citoplasma das células epiteliais cecais entre alguns animais inoculados. Essas estavam presentes em 33,3 % das cepas, quando analisadas através da coloração pela prata. Pelos dados obtidos, não foi possível concluir que as figuras fossem Brachyspira pilosicoli, pois poderia tratar-se de outra bactéria intracelular ou artefato. Entretanto, como recentemente (no ano de 2003) foi realizado o primeiro registro por microscopia eletrônica de um achado de Brachyspira spp. intracelular, esse achado poderia significar uma alta capacidade invasiva entre as cepas analisadas. Novos estudos serão realizados e, caso comprovado, esse fato poderia auxiliar em muito o entendimento da patogenia da infecção pela B. pilosicoli, pouco clara até o momento.

Repercussões histopatológicas da colostomia no coto colônico distal desfuncionalizado: estudo experimental em ratos

O objetivo deste trabalho foi evidenciar as repercussões histopatológicas da colostomia no segmento desfuncionalizado e, dessa forma, criar um modelo experimental da colite de derivação fecal (CO). Foram utilizados 65 ratos, adultos, da raça Wistar, com peso variando de 220 a 300 g. Os animais foram divididos em 13 grupos, contendo cinco ratos. Do grupo 1 ao grupo 12, os animais foram submetidos a laparotomia mediana, sendo realizada uma colostomia terminal tipo boca única, e observados, por períodos variados de tempo, com o máximo de cem dias. Os animais, após serem mortos, foram necropsiados e retirado o segmento co1ônico desfuncionalizado para a avaliação histopatológica. Essa avaliação consistia de uma análise quantitativa, através da medida da espessura da mucosa colônica, e de uma análise qualitativa, mediante avaliação subjetiva: da presença de infiltrado inflamatório agudo ou crônico na lâmina própria; das alterações na arquitetura das criptas colônicas; da presença de hiperplasia folicular linfóide e de linfócitos na luz dos vasos da submucosa; e da presença de eosinófilos na luz intestinal. No grupo 12, após o 100° dia de pós-operatório (OPO), foi realizada a reconstrução do trânsito intestinal, e, após trinta dias, o cólon descendente foi retirado para a análise histopatológica. O método de Tukey e o teste "t" de Student foram utilizados como parte da análise dos resultados. Verificou-se uma redução estatisticamente significante da espessura da mucosa colônica a partir do 4000PO. Concluiu-se que a colostomia desfuncionalizante realizada em ratos reproduziu alterações histopatológicas compatíveis com a colite de derivação, e que estas mostraram-se reversíveis após a reconstrução do trânsito intestinal

Efeito de glucanas do fungo Caripia montagnei em modelo de inflamação intestinal induzida por tnbs em ratos Wistar e em células de carcinoma de cólon humano HT-29

Compounds derived from fungi has been the subject of many studies in order to broaden the knowledge of their bioactive potential. Polysaccharides from Caripia montagnei have been described to possess anti-inflammatory and antioxidant properties. In this study, glucans extracted from Caripia montagnei mushroom were chemically characterized and their effects evaluated at different doses and intervals of treatment. It was also described their action on colonic injury in the model of colitis induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), and its action on cells of the human colon carcinoma (HT-29). Compounds extracted of C. montagnei contain high level of carbohydrates (96%), low content of phenolic compounds (1.5%) and low contamination with proteins (2.5%). The (FT-IR) and (NMR) analysis showed that polysaccharides from this species of mushroom are composed of α- and β-glucans. The colonic damage was evaluated by macroscopic, histological, biochemical and immunologic analyses. The results showed a reduction of colonic lesions in all groups treated with the glucans of Caripia montagnei (GCM). GCM significantly reduced the levels of IL-6 (50 and 75 mg/kg, p < 0.05), a major inflammatory cytokine. Biochemical analyses showed that such glucans acted on reducing levels of alkaline phosphatase (75 mg/kg, p < 0.01), nitric oxide (p < 0.001), and myeloperoxidase (p < 0.001). These results were confirmed microscopically by the reduction of cellular infiltration. The increase of catalase activity suggest a protective effect of GCM on colonic tissue, confirming their anti-inflammatory potential. GCM displayed cytostatic activity against HT-29 cells, causing accumulation of cells in G1 phase, blocking the cycle cell progression. Those glucans also showed ability to modulate the adhesion of HT-29 cells to Matrigel® and reduced the oxidative stress. The antiproliferative activity against HT-29 cells displayed by GCM (p <0.001) can be attributed to its cytostatic activity and induction of apoptosis by GCM

Efeito de extratos da alga marinha caulerpa mexicana em modelos de inflamação em murinos

The regulation of the inflammatory response is essential to maintain homeostasis. Several studies have been performed to search new drugs that can contribute to avoiding or minimizing an excessive inflammatory process. The aim of this study was to evaluate the effect of extracts of green algae Caulerpa mexican in models of inflammation. In mice, the model of peritonitis induced inflammatory zymosan pretreatment of mice with aqueous and methanol extracts of C. mexican was able to reduce cell migration to the peritoneal cavity. Treatment of mice with extracts of C. mexican also reduced the ear edema induced by xylene and exerted inhibitory action on the migration of leukocytes in inflammation-induced zymosan the air pouch, and timedependent for the extracts tested in the model of ulcerative colitis induced by DSS 3%, the extract methanol, but not the aqueous C. mexican, significantly reduced the clinical symptoms of colitis, as well as the production of proinflammatory cytokines in the culture of mouse colon, in the histological analysis there was a slight reduction of inflammation in the intestinal mucosa. We concluded that the administration of the extracts resulted in the reduction of cell migration to different sites as well as reducing the edema formation induced by chemical irritant. This study demonstrates for the first time the antiinflammatory effect of aqueous and methanolic extracts from green marine algae Caulerpa mexican